CN114622000A

CN114622000A - 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法

Info

Publication number: CN114622000A
Application number: CN202011466123.6A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 杜琛; 廖逸群; 许晔; 周淑娟; 宋甲宝
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN114622000B; WO2022126721A1

Abstract

本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测靶核酸序列的方法，所述方法能够以高特异性同时检测多种靶核酸序列在样品中的存在。此外，本申请还提供了一种探针组，和包含一种或多种所述探针组的试剂盒，所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。

Description

一种高特异性的检测靶核酸序列的方法

技术领域

背景技术

实时荧光PCR是核酸检测的一种常用方法，其操作简便，应用广泛，同时作为一种闭管检测模式，扩增产物污染机会低，利用多重实时PCR可在单个反应管内同时检测多个靶序列，不仅检测效率提高，成本也进一步降低。

实时荧光PCR的检测原理基于荧光标记的寡核苷酸探针特异地与引物之间的靶序列结合，能避免引物二聚体等非特异扩增产生的干扰信号，确保检测结果的特异性。在多重实时PCR中，使用不同荧光基团标记与靶序列特异结合的探针，就可以通过检测探针的不同荧光信号识别相应的靶序列。在检测模式选择上，实时检测模式除扩增外无其他步骤，简便直接，但此种模式能检测的最大靶序列数目受限于荧光实时PCR仪器的荧光检测通道数，一般不超过6个。另一种检测模式是扩增后的熔解曲线分析，该模式是在扩增后增加一个变温过程，可检测的最大靶序列数目等于在荧光检测通道数目的基础上增加了探针与靶序列之间的熔点这个维度，相对于实时检测模式大大提高。

现阶段，无论采用何种检测模式，基于荧光探针检测的多重实时PCR都存在一些问题，一方面，荧光标记探针的制备涉及复杂的化学修饰和纯化过程，其成本大大高于非标记探针，其中，双标记探针(或多标记探针)的成本又高于单标记探针，内部标记探针的成本高于末端标记探针，因此，使用多个荧光标记探针就会导致成本增加。另一方面，在多重实时PCR中，多个荧光标记探针共存使反应体系的背景荧光增加，引起检测信号的水平降低，而最终导致多重实时PCR检测灵敏度的下降。

CN108823287A公开了一种检测靶核酸序列的多重实时PCR检测系统，其特点是使用的检测探针数目少于靶序列。上述多重实时PCR检测系统，采用了一种独特的检测体系，即针对每一个靶序列，都设计一个非荧光标记的靶序列特异的媒介子探针，多个媒介子探针上的媒介子序列可以和同一条荧光检测探针结合并延伸，并且延伸产物具有不同的熔点。由于每种媒介子探针对应一种靶序列，这些靶序列实际上通过一个荧光探针实现了同时检测。但是，本申请发明人注意到，在某些情况下，通过该方法获得的检测结果中可能会出现非特异性信号(即非特异性熔解峰)，这在一定程度上可能影响结果的判读。因此，需要对该多重实时PCR检测系统和检测方法进行改进，在不影响检测灵敏度的情况下进一步减少甚至消除非特异性信号(即非特异性熔解峰)的产生。

发明内容

在PCR扩增后的探针熔解曲线分析方法中，非特异性信号(即非特异性熔解峰)通常是由于下述原因而导致的：检测探针与非目标序列非特异性结合，使得检测探针发出了信号(例如，自淬灭荧光探针与非目标核酸分子非特异性结合，使得其携带的荧光基团与淬灭基团分开，并因此发出荧光)。为了减少此类非特异性信号的产生，通常可对检测探针进行改造，例如在检测探针上设计发夹结构，以抑制检测探针与非目标核酸分子的非特异性结合。然而，已发现，在CN108823287A描述的方法中，使用具有发夹结构的检测探针在某些情况下并不能完全消除非特异性信号。为解决这一问题，本申请的发明人通过大量的实验和创造性劳动，首次发现通过对媒介子探针进行独特设计，可以进一步减少(甚至消除)非特异性信号，并且甚至在一定程度上提升阳性信号的强度，由此完成了本发明。

因此，在一个方面，本申请提供了一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：

(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；

并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；

优选地，所述至少一种媒介子探针具有选自下列的特征：

(i)所述媒介子探针在其靶特异性序列的下游或3'端还包含第一发夹形成序列，所述第一发夹形成序列与所述媒介子探针的媒介子序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列形成发夹结构；

(ii)所述媒介子探针在其媒介子序列的上游或5'端还包含第二发夹形成序列，所述第二发夹形成序列与所述媒介子探针的靶特异性序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列形成发夹结构；

(iii)所述媒介子探针在其媒介子序列的上游或5'端还包含第三发夹形成序列，且在其靶特异性序列的下游或3'端还包含第四发夹形成序列，且所述第三发夹形成序列或其部分与所述第四发夹形成序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序列形成发夹结构；

并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；

(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；

(3)提供m种检测探针，并且在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触，其中，m为大于0的整数，

并且，每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，

每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，

(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；

(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。

在某些实施方案中，m为小于n且大于0的整数。在此类实施方案中，所使用的检测探针的数目少于媒介子探针的数目。因此，至少一种检测探针包含两种或更多种捕获序列。在某些实施方案中，m等于n。在此类实施方案中，所使用的检测探针的数目等于媒介子探针的数目。因此，检测探针可以是与媒介子探针一一对应的。

在某些实施方案中，m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数(例如，m为1、2、3、4、5或6)；优选地，当m≥2时，所述m种检测探针各自标记有不同的报告基团。

在某些实施方案中，步骤(1)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针；并且，步骤(3)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针。

在某些实施方案中，至少1种、至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少10种，至少20种，至少30种，至少40种，至少45种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)。

在某些实施方案中，每一种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)。

在某些实施方案中，所述第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度各自独立地为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。

在某些实施方案中，所述m种检测探针包含相同的报告基团；并且，在步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据所获得的熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在。

在某些实施方案中，所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同；并且，在步骤(5)中，在对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线；随后，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在。

在某些实施方案中，其中，m＝1，并且n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数)。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：

(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；例如，所述至少一种媒介子探针具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；

(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与一种检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

在本申请的方法中，样品可以是任何待检测的样品。在某些实施方案中，所述样品包含或是DNA，或RNA，或核酸的混合物。在某些实施方案中，所述靶核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶核酸序列是单链的或双链的。在某些实施方案中，所述样品或靶核酸序列获自选自下列的来源：原核生物，真核生物，病毒或类病毒。

在某些实施方案中，所述媒介子探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，所述媒介子探针的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-140nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。

在某些实施方案中，所述媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。

不受理论限制，本申请发明人认为，尽管检测探针已被设计为具有稳定的发夹结构，但媒介子探针与检测探针仍然可能发生非特异性结合，这可使得检测探针的发夹结构被打开，导致其所携带的荧光基团与淬灭基团发生分离，进而导致非特异性信号的产生。因此，通过对媒介子探针进行改造(即，在其靶特异性序列的下游或3'端添加第一发夹形成序列、或者在其媒介子序列的上游或5'端添加第二发夹形成序列、或者在其媒介子序列的上游或5'端添加第三发夹形成序列，且在其靶特异性序列的下游或3'端添加第四发夹形成序列)，使媒介子探针自身能够形成发夹结构(借助于媒介子序列和第一发夹形成序列之间的碱基互补配对、或者第二发夹形成序列和靶特异性序列之间的碱基互补配对、或者第三发夹形成序列和第四发夹形成序列之间的碱基互补配对)，可进一步降低甚至消除媒介子探针与检测探针的非特异性结合，从而进一步降低甚至消除非特异性信号的产生。因此，在本申请的方法中，第一、第二、第三或第四发夹形成序列可以为任意的长度，而不受限制，只要其能够使媒介子探针形成发夹结构即可。然而，易于理解，如果第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度太短，那么媒介子探针所形成的发夹结构的稳定性将会下降，这可能影响(例如增加)媒介子探针与检测探针的非特异性结合。反之，如果第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度太长，那么媒介子探针所形成的发夹结构的稳定性将会增加，这可能影响(例如减少)媒介子探针与靶核酸序列的特异性结合。因此，本领域技术人员可以根据实际需要，确定第一、第二、第三或第四发夹形成序列的最佳长度。在某些实施方案中，所述第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度各自独立地为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。

此外，还有意外发现：除了降低非特异性信号之外，具有发夹结构的媒介子探针可能带来额外的潜在益处：能够增强阳性信号的强度，提高检测的灵敏度。不受理论限制，本申请发明人认为，具有发夹结构的媒介子探针的使用，降低了媒介子探针与检测探针的非特异性结合，这使得有反应体系中有更多的检测探针能够与切割下来的媒介子片段结合，从而针对同一阳性样品，可产生更强的阳性信号。

在某些实施方案中，所述媒介子探针的靶特异性序列与第一发夹形成序列之间还含有连接体。在某些实施方案中，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)。

在某些实施方案中，所述媒介子探针的第二发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体。在某些实施方案中，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)。

在某些实施方案中，所述媒介子探针的第三发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体。在某些实施方案中，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)。

在某些实施方案中，所述媒介子探针的靶特异性序列与第四发夹形成序列之间还含有连接体。在某些实施方案中，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)。

在某些实施方案中，所述第一发夹形成序列与所述媒介子序列完全互补或部分互补。在某些实施方案中，所述媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列形成发夹结构，其中，所述发夹结构的臂具有平末端(即，不具有悬突)，或者所述臂具有5’悬突(例如，其5’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)，或者所述臂具有3’悬突(例如，其3’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)。

在某些实施方案中，所述臂由完全互补的第一发夹形成序列与媒介子序列构成。由此，所述臂是对称的或具有平末端。在某些实施方案中，所述臂由部分互补的第一发夹形成序列与媒介子序列构成。由此，所述臂是非对称的或具有5’或3’悬突。

在某些实施方案中，所述第一发夹形成序列与所述媒介子序列的长度相同。在此类实施方案中，所述臂可具有平末端。

在某些实施方案中，所述第一发夹形成序列与所述媒介子序列的长度不同。例如，所述第一发夹形成序列的长度与所述媒介子序列的长度可相差1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在此类实施方案中，所述臂可具有5’或3’悬突。在某些实施方案中，所述第一发夹形成序列的长度比所述媒介子序列的长度多1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在某些实施方案中，所述媒介子序列的长度比所述第一发夹形成序列的长度多1-10nt，例如1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。

在某些实施方案中，所述第二发夹形成序列与所述靶特异性序列完全互补或部分互补。在某些实施方案中，所述媒介子探针能够通过所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列形成发夹结构，其中，所述发夹结构的臂具有平末端(即，不具有悬突)，或者所述臂具有5’悬突(例如，其5’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)，或者所述臂具有3’悬突(例如，其3’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)。

在某些实施方案中，所述臂由完全互补的第二发夹形成序列与靶特异性序列构成。由此，所述臂是对称的或具有平末端。在某些实施方案中，所述臂由部分互补的第二发夹形成序列与靶特异性序列构成。由此，所述臂是非对称的或具有5’或3’悬突。

在某些实施方案中，所述第二发夹形成序列与所述靶特异性序列的长度相同。在此类实施方案中，所述臂可具有平末端。

在某些实施方案中，所述第二发夹形成序列与所述靶特异性序列的长度不同。例如，所述第二发夹形成序列的长度与所述靶特异性序列的长度可相差1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在此类实施方案中，所述臂可具有5’或3’悬突。在某些实施方案中，所述第二发夹形成序列的长度比所述靶特异性序列的长度多1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在某些实施方案中，所述靶特异性序列的长度比所述第二发夹形成序列的长度多1-10nt，例如1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。

在某些实施方案中，所述第三发夹形成序列与所述第四发夹形成序列完全互补或部分互补。在某些实施方案中，所述媒介子探针能够通过所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序列形成发夹结构，其中，所述发夹结构的臂具有平末端(即，不具有悬突)，或者所述臂具有5’悬突(例如，其5’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)，或者所述臂具有3’悬突(例如，其3’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)。

在某些实施方案中，所述臂由完全互补的第三发夹形成序列与第四发夹形成序列构成。由此，所述臂是对称的或具有平末端。在某些实施方案中，所述臂由部分互补的第三发夹形成序列与第四发夹形成序列构成。由此，所述臂是非对称的或具有5’或3’悬突。

在某些实施方案中，所述第三发夹形成序列与所述第四发夹形成序列的长度相同。在此类实施方案中，所述臂可具有平末端。

在某些实施方案中，所述第三发夹形成序列与所述第四发夹形成序列的长度不同。例如，所述第三发夹形成序列的长度与所述第四发夹形成序列的长度可相差1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在此类实施方案中，所述臂可具有5’或3’悬突。在某些实施方案中，所述第三发夹形成序列的长度比所述第四发夹形成序列的长度多1-10nt，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。在某些实施方案中，所述第四发夹形成序列的长度比所述第三发夹形成序列的长度多1-10nt，例如1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10nt。

在某些实施方案中，所述媒介子探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的。在某些优选的实施方案中，媒介子探针的3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如媒介子探针)的3'-末端。例如，可通过对媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰，以封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭媒介子探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述上游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本申请的方法中，上游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。在某些实施方案中，所述上游寡核苷酸序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述上游寡核苷酸序列在与靶核酸序列杂交后，位于媒介子探针的上游远端，或位于媒介子探针的上游邻近，或与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列。

在某些实施方案中，所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，所述具有5'核酸酶活性的酶切割与靶核酸序列杂交的媒介子探针，并释放出包含完整媒介子序列或者媒介子序列的一部分(5'-末端部分)的媒介子片段。

在某些实施方案中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)。

在某些实施方案中，所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌：Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermusantranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些优选地实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶催化上游寡核苷酸序列的延伸，并诱导媒介子探针的切割。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用核酸聚合酶以靶核酸序列为模板催化上游寡核苷酸序列的延伸，并且随后，所述具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并催化媒介子探针的切割。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)和/或(2)中，还将样品与特异于靶核酸序列的下游寡核苷酸序列(或下游引物)接触。在某些实施方案中，核酸聚合酶和下游寡核苷酸序列(或下游引物)的使用是特别有利的。特别地，核酸聚合酶能够以靶核酸序列为模板，以上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列为引物，产生额外的靶核酸序列，从而可提高本发明方法的灵敏度。

因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了上文所定义的所述上游寡核苷酸序列和媒介子探针之外，针对待检测的每一种靶核酸序列，还提供一种下游寡核苷酸序列；其中，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列接触。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。

在某些实施方案中所述下游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本申请的方法中，下游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。在某些实施方案中，所述下游寡核苷酸序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，步骤(1)中提供的所有上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，除了所述上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列之外，还提供一种通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针、下游寡核苷酸序列和通用引物接触。

在某些优选的实施方案中，所述相同的寡核苷酸序列的长度为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。相应地，所述通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在本发明的某些实施方案中，通用引物可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，通用引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本申请的方法中，通用引物不受其长度的限制，只要其能够与上游和下游寡核苷酸序列中包含的所述相同的寡核苷酸序列特异性杂交。例如，通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在某些实施方案中，所述检测探针包含多种捕获序列；并且，所述多种捕获序列以相邻的方式、以间隔有连接序列的方式，或者以重叠的方式排列。

在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-1000nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

检测探针中的捕获序列可以是任何长度，只要其能够与媒介子片段特异性杂交。在某些实施方案中，所述检测探针中的捕获序列的长度为10-500nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt。

检测探针中的模板序列可以是任何长度，只要其能够用作延伸媒介子片段的模板。在某些实施方案中，所述检测探针中的模板序列的长度为1-900nt，例如1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt。

在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如检测探针)的3'-末端。例如，可通过对检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰，以封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述检测探针具有修饰或不具有修饰。例如，所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。在某些优选的实施方案中，所述检测探针是线性的。在某些优选的实施方案中，所述检测探针具有发夹结构。发夹结构可以是天然的，也可以是人工引入的。

在某些实施方案中，在步骤(4)中，在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，所述核酸聚合酶以检测探针为模板，对杂交至检测探针的媒介子片段进行延伸，并由此形成双链体。

在某些实施方案中，步骤(2)中，所使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶，并且与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。

在某些实施方案中，其中，步骤(1)-(5)通过包含下述步骤(I)-(VII)的方案来进行：

(I)提供m种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述下游寡核苷酸序列如上所定义，并且所述通用引物如上所定义；

(II)将待检测的样品与上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次；和

(VII)对前一步骤的产物进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，将所述样品与所述上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(VI)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(II)中，将所述样品与所述上游寡核苷酸序列，媒介子探针，下游寡核苷酸序列和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，将所述样品与所述上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，核酸聚合酶，以及通用引物混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(VI)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(II)中，将所述样品与所述上游寡核苷酸序列，媒介子探针，下游寡核苷酸序列和所述检测探针，核酸聚合酶，以及通用引物混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。

在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)。

在某些实施方案中，重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次。在某些实施方案中，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。

在某些实施方案中，在步骤(VII)中，对步骤(VI)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。

在某些实施方案中，对所获得的曲线进行求导，从而获得步骤(VI)的产物的熔解曲线。

在某些实施方案中，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于所述熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在；随后，通过媒介子片段中的媒介子序列与靶核酸序列的对应关系，确定与所述媒介子片段对应的靶核酸序列的存在。

在另一个方面，本申请提供了一种探针组(probe set)，其包含一种检测探针，以及一种或多种(例如至少两种)的媒介子探针，其中，

所述媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与一种靶核酸序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；优选地，所述至少一种媒介子探针具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；和

所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些实施方案中，所述探针组包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针。

在某些实施方案中，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)。

在某些实施方案中，所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。

在某些实施方案中，所有媒介子探针各自靶向不同的靶核酸序列。

易于理解的是，此类探针组可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于探针组中的媒介子探针和检测探针。因此，在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的媒介子探针。在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的检测探针。

在另一个方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含一种或多种如前所定义的探针组。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。

在某些实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列。

在某些实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同。

在某些实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。

在某些实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。

易于理解的是，此类试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于试剂盒中的媒介子探针和检测探针。并且，此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。

例如，在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含如上文所定义的上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含，用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、或其任何组合。此类试剂可由本领域技术人员常规地确定，并且包括但不限于，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白(Single StrandDNA-Binding Protein，SSB)、或其任何组合。

本领域技术人员基于本申请所详细描述的原理，可对本发明技术方案的各种技术特征进行修饰、替换或组合，而不背离本发明的精神和范围。所有此类技术方案以及其变形都涵盖在本申请的权利要求书或其等同物的范围内。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“媒介子探针”是指，从5'至3'方向含有媒介子序列(mediator sequence)和靶向序列(targeting sequence；即，靶特异性序列)的单链核酸分子，其任选地还可在靶向序列的下游或3’端包含第一发夹形成序列，或者在媒介子序列的上游或5'端包含第二发夹形成序列，或者在媒介子序列的上游或5'端包含第三发夹形成序列，且在靶特异性序列的下游或3'端包含第四发夹形成序列。当媒介子探针含有第一、第二、第三或第四发夹形成序列时，媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列、或者所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列、或者所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序列形成发夹结构。在本申请中，媒介子序列不含与靶核酸序列互补的序列，靶特异性序列包含与靶核酸序列互补的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，媒介子探针通过靶特异性序列与靶核酸序列杂交或退火(即，形成双链结构)，并且媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交。

如本文中所使用的，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”是指，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，能够与靶核酸序列选择性/特异性杂交或退火的序列，其包含与靶核酸序列互补的序列。在本申请中，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”具有相同的含义，并且可互换使用。易于理解的是，靶向序列或靶特异性序列对于靶核酸序列是特异性的。换言之，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，靶向序列或靶特异性序列仅与特定的靶核酸序列杂交或退火，而不与其他的核酸序列杂交或退火。

如本文中所使用的，术语“媒介子序列”是指，媒介子探针中不与靶核酸序列互补的一段寡核苷酸序列，其位于靶特异性序列的上游(5'端)。在本申请中，针对每一种靶核酸序列，设计或提供一条独特的媒介子探针，其具有独特的媒介子序列(换言之，所使用的所有媒介子探针中的媒介子序列彼此不同)；由此，每一种靶核酸序列与一条独特的媒介子探针(独特的媒介子序列)相对应。因此，通过检测所述独特的媒介子序列，可以检测与之相对应的靶核酸序列。

如本文中所使用的，术语“上游寡核苷酸序列”是指，包含与靶核酸序列互补的序列的一段寡核苷酸序列，其在允许核酸杂交(或退火)或扩增的条件下，能够与靶核酸序列杂交(或退火)，并且，当与靶核酸序列杂交时，其位于媒介子探针的上游。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。

如本文中所使用的，术语“检测探针”标记有报告基团和淬灭基团。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(Tm值)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的Tm值就越高。因此，通过检测双链体的Tm值，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“Tm值”具有相同的含义，并且可互换使用。

发明的有益效果

本申请的方法能够有效降低(甚至消除)使用媒介子探针和检测探针的多重实时PCR检测方法的非特异性信号，显著提高了所述检测方法的特异性。此外，本申请的方法还能够一定程度的提升阳性信号的强度，提高了检测的灵敏度。因此，本申请的方法是特别有利的，特别适合用于靶核酸序列的多重检测。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了本发明三种发夹媒介子探针的结构。其中，图1A显示了当媒介子探针含有媒介子序列、靶特异性序列和第一发夹形成序列时，在媒介子序列被剪切之前呈发夹结构。图1B显示了当媒介子探针含有媒介子序列、靶特异性序列和第二发夹形成序列时，在媒介子序列被剪切之前呈发夹结构。图1C显示了当媒介子探针含有媒介子序列、靶特异性序列、第三发夹形成序列和第四发夹形成序列时，在媒介子序列被剪切之前呈发夹结构。

图2示例性的显示了本发明系统的原理。图2A显示了当媒介子探针含有媒介子序列和靶特异性序列时，在媒介子序列被剪切之前呈线性结构，容易与检测探针非特异性结合。图2B显示了当媒介子探针含有媒介子序列、靶特异性序列和第一发夹形成序列时，在媒介子序列被剪切之前呈发夹结构，显著减少了与检测探针的非特异性结合。

图3显示了实施例1的反应体系的检测结果，其中，图3A为使使用线性媒介子探针的Gp8 wzx检测体系所产生的检测结果；图3B为使用发夹媒介子探针的Gp8 wzx检测体系所产生的检测结果；图3C为使用线性媒介子探针的O52 wzm检测体系所产生的检测结果；图3D为使用发夹媒介子探针的O52 wzm检测体系所产生的检测结果。并且，图中的实线表示以质粒(4份样品)为模板的检测结果；虚线表示以TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.5)为模板的检测结果(阴性对照)。

图4显示了Gp8 wzx检测体系的检测结果，其中，图4A为使用线性媒介子探针的检测结果；图4B为使用互补碱基数为6的发夹媒介子探针的检测结果；图4C为使用互补碱基数为8的发夹媒介子探针的检测结果；图4D为使用互补碱基数为10的发夹媒介子探针的检测结果。并且，图中的实线表示以大肠杆菌Gp8 wzx质粒为模板的检测结果；虚线表示以TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.5)为模板的检测结果(阴性对照)。

图5显示了实施例3的反应体系的检测结果，其中，图5A为使使用线性媒介子探针的检测体系；图5B为使用发夹媒介子探针的检测体系。并且，图中的实线表示以含有靶基因1-6的质粒为模板的检测结果；虚线表示以TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.5)为模板的检测结果(阴性对照)。

图6显示了实施例4的反应体系的检测结果，其中，图6A为使使用线性媒介子探针的检测体系；图6B为使用发夹媒介子探针的检测体系。并且，图中的实线表示以含有靶基因7-12的质粒为模板的检测结果；虚线表示以TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.5)为模板的检测结果(阴性对照)。

序列描述

本申请涉及的部分序列的信息如下：

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的生物化学、化学、分子生物学等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.发夹媒介子探针降低非特异熔解信号的可行性

为考察发夹媒介子探针是否可用于双探针实时PCR检测，本实施例分别使用线性媒介子探针和发夹媒介子探针进行对比，并且检测探针为同一个。

实验分别以大肠杆菌O抗原特异基因Gp8 wzx和O52 wzm为检测对象，每25μL PCR反应体系包括1×PCR buffer(致善生物科技有限公司,厦门)，7.0mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，3U Taq01酶(致善生物科技有限公司,厦门)，引物和探针(用量见表1)，以及5μL模板(阳性对照的模板分别为大肠杆菌Gp8 wzx质粒和O52 wzm质粒(10000copies/ul)，将如SEQ IDNO:56和SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列分别插入puc57载体的多克隆位点中，分别获得大肠杆菌Gp8wzx质粒和O52 wzm质粒；阴性对照的模板为TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH 8.5)。PCR反应程序为：50℃保温2min，95℃变性5min，然后95℃20s和60℃1min共40循环，60℃采集荧光，PCR完成后熔解分析的程序如下：35℃杂交延伸20min，然后95℃变性2min，45℃保温2min，随后按0.04℃/s的升温速率从45℃升温至95℃，并采集CY5通道的荧光信号。实验仪器为SLAN 96S实时PCR仪(宏石医疗科技有限公司，上海)，引物和探针均由上海生物工程有限公司合成。

反应A为Gp8 wzx单重检测体系，使用线性媒介子探针；反应B为Gp8 wzx单重检测体系，使用发夹媒介子探针。结果表明，反应A(图3A)的阴性对照(虚线)在52℃产生了明显的非特异熔解峰，而反应B(图3B)的阴性对照(虚线)无明显的非特异熔解峰。实验结果说明，发夹媒介子探针相比线性媒介子探针能够明显降低非特异熔解信号。反应C为O52 wzm单重检测体系，使用线性媒介子探针；反应D为O52 wzm单重检测体系，使用发夹媒介子探针。结果表明，反应C(图3C)的阴性对照(虚线)在阳性对照熔解峰对应熔点65℃处产生了非特熔解峰，即产生了假阳性信号，且45～50℃存在低温非特异信号，而反应D(图3D)阴性对照(虚线)无假阳性信号，45～50℃低温非特异信号也显著降低。并且，与反应C相比，阳性样本熔解峰信号提升。实验结果说明，发夹媒介子探针相比线性媒介子探针能够降低甚至几乎消除假阳性信号，并能够提升阳性样本熔解峰信号，有效减少非特异信号对检测体系结果判读的干扰。

表1.实施例1中所用引物和探针

注：斜体加下划线的碱基表示发夹媒介子探针相较于线性媒介子探针在3’端增加的序列。通用引物Tag在Gp8 wzx单重检测体系和O52 wzm单重检测体系均有使用。

实施例2.媒介子探针发夹结构互补碱基数考察

本实施例采用实施例1中描述的Gp8 wzx单重检测体系，考察线性媒介子探针和发夹结构互补碱基数分别为6，8，10个碱基的媒介子探针用于熔解曲线分析的可行性。反应体系组成与PCR反应条件均与实施例1相同，本实施例所使用的线性媒介子探针也与实施例1相同，发夹媒介子探针如表2所示。

检测结果如图4所示，线性媒介子探针(图4A)的阴性对照(虚线)在50℃左右出现了明显的非特异性信号，而无论发夹媒介子探针的互补碱基数为多少，与线性媒介子探针相比，发夹媒介子探针的非特异性信号均显著降低(图4B-3D)。当发夹结构互补碱基数小于等于8个碱基的时候(图4B和图4C)，随着发夹结构的增强，阴性对照(虚线)非特异熔解峰逐渐减弱，而阳性标本扩增曲线及熔解峰不受影响；当发夹结构互补碱基数大于8个碱基的时候(图4D)，随着发夹结构的增强，阴性对照非特异熔解峰继续减弱，但是阳性标本扩增曲线及熔解峰也受到了一定的影响。

表2.实施例2中所用发夹媒介子探针

注：斜体加下划线的碱基表示发夹媒介子探针相较于线性媒介子探针在3’端增加的序列。

实施例3.六重PCR熔解曲线分析检测体系

本实施例采用六重PCR熔解曲线分析体系，检测并区分6个不同的靶序列。以5种靶基因(靶基因1-5)和1个阳性质控基因(靶基因6)为检测对象。将如SEQ ID NO:58至SEQ IDNO:63所示的核苷酸序列分别插入puc57载体的多克隆位点中，分别获得含有靶基因1-6的质粒。本实施例共进行两个反应体系的检测，反应体系A为对照体系，使用6条线性媒介子探针和2条荧光探针。反应体系B为实验体系，使用4条线性媒介子探针、2条发夹媒介子探针和2条荧光探针，其中，4条线性媒介子探针分别对应的靶基因1、2、3和5，2条发夹媒介子探针对应阳性质控基因以及靶基因4。反应体系组成与PCR反应条件与实施例1相同，检测的模板为携带靶基因或质控基因的6个阳性质粒(浓度为1000copies/ul)。本实施例所使用的引物和探针具体如表3所示。

实验结果如图5所示，反应体系A(图5A)和反应体系B(图5B)对于每一个靶基因都检测出了相同T_m值的熔解峰，但是，反应体系B(具有发夹媒介子探针)的熔解峰信号整体上高于反应体系A(全部为线性媒介子探针)。并且，相比于反应体系A，反应体系B在45～50℃的非特异熔解信号明显降低。

表3.实施例3中所用的引物和探针

实施例4.六重PCR熔解曲线分析检测体系

本实施例采用六重PCR熔解曲线分析体系，检测并区分6个不同的微生物的靶基因。以靶基因7-12为检测对象。将如SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列分别插入puc57载体的多克隆位点中，分别获得含有靶基因7-12的质粒。

本实施例共进行两个反应体系的检测，反应体系A为对照体系，使用6条线性媒介子探针和2条荧光探针，反应体系B为实验体系，使用5条线性媒介子探针、1条发夹媒介子探针和2条荧光探针。反应体系组成与PCR反应条件与实施例1相同，熔解曲线分析体系使用ROX荧光通道。检测的模板为携带靶基因的6个阳性质粒(浓度为1000copies/ul)。本实施例所使用的引物和探针具体如表4所示。

实验结果如图6所示，反应体系A(图6A)和反应体系B(图6B)对于每一个靶基因都检测出了相同T_m值的熔解峰，但是，反应体系B(具有发夹媒介子探针)的熔解峰信号整体上高于反应体系A(全部为线性媒介子探针)。并且，相比于反应体系A，反应体系B在45～50℃的非特异熔解信号完全消除。

表4.实施例4中所用的引物和探针

注：斜体加下划线的碱基表示发夹媒介子探针相较于线性媒介子探针在3’端增加的序列。前面带有“+”的碱基为锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)修饰的碱基。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法

<130> IDC200365

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

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<400> 46

gcaagccctc acgtagcgaa aggtattgag ttagggaaat ca 42

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 47

gcaagccctc acgtagcgaa caaagaaacc ttggatttgc 40

<210> 48

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 48

tcatctcacc taacattgaa gaaagtatcc gtggttgtca tgt 43

<210> 49

<211> 62

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 49

cggcggagtg ggcacggaca gcgctggaca gtgtggaccc aagtgtcgca gcaaggccgc 60

cg 62

<210> 50

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 50

gcaagccctc acgtagcgaa ataatggtgg cggtcactta 40

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 51

gcaagccctc acgtagcgaa accatgccca accagatc 38

<210> 52

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 52

agcgctgtcc gtggggttct ttagatgaat tcaaaaaaga atttgcag 48

<210> 53

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 53

gcaagccctc acgtagcgaa tcgcttccag ttggtcca 38

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 54

gcaagccctc acgtagcgaa gcagtcagta tttctgggta ac 42

<210> 55

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 55

acacttgggt ccagtggtaa agctcatcaa gcgcgt 36

<210> 56

<211> 416

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gp8 wzx基因的插入片段

<400> 56

attattgtga tgttatctcc cattataata attccgtttg caattaaaaa tgtcggcatt 60

gatgaatatg gctattttgt acaagttaat ataatttatt cgtgtttgat atccatattc 120

actgcttctc tatcgggata ttttataaag agctatcttg agaaaaaatt atcctttcat 180

gatattttta taattcaatt gtttattaat ttgttctcca ctgcgatcat aggtatatat 240

atactgctaa gatttgatgt cgttgctccg tatatatttg ttgttgctat gctaactaat 300

actttaaatt tcgaatggtt ttttcatgca attggcgcac agaaacaatt attaataagg 360

aatttaatta taaaaacaat gtttgtaatt atagcaatat ttatcttaga agtata 416

<210> 57

<211> 416

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> O52 wzm基因的插入片段

<400> 57

ctatttggtt tttgcatatc ttcttaagca aggtggtcat gattacgtcc cattcctgtt 60

aactggactg atcccctgga tatggtttgg tcgcagcgtt agtcatgcgc aagggagtat 120

cattcaagga aagtacctaa tgaatcaggt acatatttct aagatattct tccctttgac 180

atttatattg caggatgcgt taaagcagat acttgtattt attctgctat ttattttttt 240

agtcttgtac ggctatgatt atactcttgg cttgctttgg attattccag tcatttttgt 300

tcagctatta ttaatagttg cattttcttt gatagtgtca atcattgttc cctttgtcag 360

agatttttca tttgtaattg aaaccggcct tcaaattatg atgttttgct caggta 416

<210> 58

<211> 544

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因1的插入片段

<400> 58

caatcaaata ttttctttat cggagttaat ttctcaatat agcatatata tcatggcgat 60

ttttgctttt tatacactta ataatttttt gatacaatac tctaaaggga ttgataaaat 120

aggtgtaacg gctatctctg gagtcataag tgcagcagtt atgctttcga tgaatatttt 180

attgttagtg gtattaaatt ggggactact aggttttttt atcgcaaata tttgtgggta 240

tgtcattcct tgtgtatata taatagtaaa actaaaatta tgggatttat ttgaacttaa 300

aattgataga tcgttacagt gggaaatgat atattatact ttacctttga ttttaaatac 360

tttaagttgg tgggttaata acacttcaga taggtatatt ataacagtaa ttataggtat 420

acaagctagt gcgattattt cagttgctta taagattcca caaatttttt ccacaattag 480

cgctatattc attcaatcgt ggcaaatatc tgcaataaaa attcaggaag aaaaagaagg 540

taac 544

<210> 59

<211> 566

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因2的插入片段

<400> 59

caattttatt attttcagag cgcttttttt ctagattcac ttctgcttat ggttttaccc 60

aagaatggtt tctaggttcc gtcaataact ttattttctg gttttttcca gctcttgtag 120

tagcgtggtt gtattatttt ttgtcaggta aaatttttag aacgtgtagt ttaacagttg 180

ttattgcttt aacagaatta attagaggct cagcaacggg gaggattgca gtatttctat 240

ttatcttatt tgttacctcg tcttggttac gtaagattat ttcgccaaag ttagtattta 300

taggtgttac tgtcctagga atttttgttg tatttctcca aaatgtagac ttcttagagc 360

ctattgtggt acagttactt ggtaaaaaaa tgacatttag caatcgtacc tatatctggt 420

cgaatgctgt gacagtaatt caaaagaatt tcgttggtct aggtttacaa tcatctgatt 480

atgtcattcg attgcttgga aatattaatg gttatttaca acctacggta acccacgccc 540

ataatgagtt tttacaagtt gctttt 566

<210> 60

<211> 451

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因3的插入片段

<400> 60

caaggattag tttatctgga attgcttaat ttttttctga tttactcaac tctaagagtg 60

agtaatattc aatttaacaa gactcattgg tcagtgtttt ttattttttt tatattagta 120

gttttatttg ctaatgcagg aattattaaa agtgtattca tttttcgaac tggagggtta 180

gtaagaggat cattagggtt tgtccatccg aattcactag gtctcatggc ttatgcaatt 240

acattaaata cattgtacgt ctttaacccc aatagataca aaattatttt ctactgcggt 300

cttcttatat ttaattattt tatatttgcc ataacggact ctagaacttc tttctcaata 360

agtttattga ttattttaag ttgttttatt tttgatttta gaggtattct atacaaggtt 420

gttaaaaatt catttattta tatagtaatt g 451

<210> 61

<211> 568

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因4的插入片段

<400> 61

aaaaataatg tttgcaggaa cattgatatt agcaggtgta ggtgttttat atttatattt 60

tccaaattta gttatagatt tttataataa aatatctcaa tcaacgacgg aaatcacgtt 120

ttctaaatcg tcatggtccc ataaagatat catatggaat tggcgtggat atgaaatgta 180

ctctgcctta aatcatttta aatcttcaac tttattagag caaattttag gaggaggatt 240

tggaacagtt ttatacatag gcgaatatgc gtatttggta agcgatttac cgtatcttct 300

ttttttacat aatggatatt tcactacttt acttgttttt ggtgttagtg gggtcatact 360

attcgtttta tgggtactta gtttatttag ttatagcaag tatgttaatg atacccaaga 420

ttcaaatttt ataaaaggtc ttgctgtggt tatattattt accacatatt ttgtaaatgg 480

tcctcttttt tctgtttcac aagccacctt cttgctttat tttgcacttt ttagtaataa 540

tcatggagaa ttagatgaag atttttaa 568

<210> 62

<211> 419

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因5的插入片段

<400> 62

tttagaaaaa tattgtatct agaaagacct gatatagtat atctgcacag tacttttgca 60

ggtgtagtag gcaggttagc ttctatgggt ttgtcgtgta aagtagtata caatcctcac 120

ggatggtctt ttaagatgga tgtttctaag attaagcaat tcgtttataa aaatattgaa 180

aagtttttgt cttatcttac agataagtat atattaatct ctaaatctga atatgaagcg 240

gctcaatctt taaaaatacc ccttaagaaa ttgactttag tgtataatgg agtagagatt 300

gatgaagatt ttaacgaaaa tcaaataaac gttttattac ccataaataa atatgttatt 360

gggatgattg gtcgtattag tgaacagaaa aatcctttct tttttgttga atttgcaaa 419

<210> 63

<211> 370

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因6的插入片段

<400> 63

tatcactggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggttgc 60

atcatgcagg taggacctgt tgataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 120

gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ctaaagaaga gttcatgacg 180

gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 240

acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 300

ccaaacaacc actcagacca tgtggatcca tacccttact tggcaaaatg gggcattagc 360

cgtgagcagt 370

<210> 64

<211> 354

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因7的插入片段

<400> 64

gagcggctgc gtgtagtcag cgaccaccat tttaaaaccc ctttataatc tgaggtttcc 60

gatgaaaaca gttatcagca aggcactaca tgcctttgaa cagtgcttcg gcgcatcccc 120

tgacatgctg atccgggcac cgggccgcgt taatctgatt ggcgaacaca cagattataa 180

cgacggtttt gttctgccgt gtgccattga tttcggcacc gtggcagccg cctcgcggcg 240

tgatgatcag aaggtctgcg tggtggctgc ggattatgat aatgatcgcg atgagtttga 300

tctctcacag ccgatcgaat accgcgataa taaattgtgg gcaaattata tccg 354

<210> 65

<211> 400

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因8的插入片段

<400> 65

gcgaacgcga tttccggcgc aggcgaaaag ggcgtgccgg gtctcgtcgc gacggccgtt 60

tcgtcgaatg gctcggttgc caatatcaat gcgatcaagt cgggcgctct ggagtccggc 120

tttacgcagt cagacgttgc ctattgggcc tataacggca ccggccttta tgatggcaag 180

ggcaaggtgg aagatttgcg ccttctggcg acgctttacc cggaaacgat ccatatcgtt 240

gcgcgtaagg atgcaaacat caaatcggtc gcagacctga aaggcaagcg cgtttcgctg 300

gatgagccgg gttctggcac catcgtcgat gcgcgtatcg ttcttgaagc ctacggcctc 360

acggaagacg atatcaaggc tgaacacctg aagccgggac 400

<210> 66

<211> 476

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因9的插入片段

<400> 66

gttgctggtg tacctcaggt tgcctacaca gtcttcatcg agggtgaaga tttggaagca 60

gcagtagcag agacgctcga aaaattgacc ttcccagtgt ttgtcaaacc tgctaacatg 120

gggtcatctg ttgggatttc taaagctgaa aatgaagcag agcttcgtgc agcgattgat 180

ttggctctca aatatgatag tcgtatcttg attgagcaag gtgtggttgc ccgagaaatc 240

gaggttggta tccttggcaa tacaaatgtc aaaacgactg atccaggtga agtagtcaaa 300

gatgtggcct tctatgacta tcaagccaag tacattgaca ataagattac catggacatc 360

ccagctcacg tgcctgcaga agtcatgacg caaatgcgtg cctatgcggc caaggccttc 420

cgtgccctcg gtggttgtgg tcttgcccgc tgtgatttct tcctgacaga ggatgg 476

<210> 67

<211> 370

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因10的插入片段

<400> 67

gctgaagaga ttgcgaaaga agtaggtatt gagttaggga aatcaagcgt tactcatttt 60

agtgatggag aaatccaaat taacattgaa gaaagtatcc gtggttgtca tgtatatgtt 120

attcaatcaa cgagtaatcc tgtaaaccag aatttaatgg aacttttgat catgattgat 180

gcgttgaaac gcgcttccgc agcaacaatt aatattgtta tgccttacta tggctatgca 240

cgtcaagacc gtaaagcaag aagtcgtgaa ccaatcacag cgaaattagt agcaaactta 300

atcgaaactg ctggtgcaac tagaatgatt acacttgata tgcatgcacc gcaaatccaa 360

ggtttctttg 370

<210> 68

<211> 368

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因11的插入片段

<400> 68

acgacaaaca ccataacaca tatgtaacta aattaaactc agcagttgaa ggaacagatt 60

tagaagctaa atcaatcgaa gaaattgttg ctaatttaga tagcgtacct tcagatattc 120

aaactgcagt acgtaataat ggtggcggtc acttaaacca ctcattattc tgggaattat 180

tatcaccaaa ttctgaagaa aaaggtgaag tagtagacaa aattaaagaa caatggggtt 240

ctttagatga attcaaaaaa gaatttgcag ataaagctgc tgcacgcttt ggatctggtt 300

gggcatggtt agtagtaaat aacggtcaat tagaaatcgt tactactcca aaccaagata 360

acccatta 368

<210> 69

<211> 423

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 靶基因12的插入片段

<400> 69

atgacatctt tttctcttgg cgcccacaat gcgagcgctt ccataattaa tttcatatta 60

cgcacggaaa cacgttcgct taacaaacgc tgcaaaactt cagatatacg ttgtaccgtg 120

gcatgtctga gcacttcttt aagtaaatca ggaaatttcg cttccagttg gtccagcata 180

tgttttgttt cctgaatacc gaaatattca ttgacgttgc gcgccagcgt caccgccaga 240

cagtggtaaa gctcatcaag cgcgttccgc aacacatagc caagctcccg gagtttctcc 300

ccctcttcat gcgttaccca gaaatactga ctgctacctt gctgatggat tgttggatta 360

ataccaaagg acacgacttc atcggaataa tttaccactc gcatcaaatc aaaatagacc 420

gta 423

Claims

1.一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：

其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；

优选地，所述至少一种媒介子探针具有选自下列的特征：

2.权利要求1的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(a)m为小于等于n且大于0的整数；

(b)m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数(例如，m为1、2、3、4、5或6)；优选地，当m≥2时，所述m种检测探针各自标记有不同的报告基团；

(c)步骤(1)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针；并且，步骤(3)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针；

(d)至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少10种，至少20种，至少30种，至少40种，至少45种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；

(e)每一种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；

(f)所述第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度各自独立地为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；

(g)所述m种检测探针包含相同的报告基团；并且，在步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据所获得的熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在；

(h)所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同；并且，在步骤(5)中，在对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线；随后，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在；

(i)所述媒介子探针的靶特异性序列与第一发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

(j)所述媒介子探针的第二发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

(k)所述媒介子探针的第三发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

(l)所述媒介子探针的靶特异性序列与第四发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

(m)所述第一发夹形成序列与所述媒介子序列完全互补或部分互补；

(n)所述第二发夹形成序列与所述靶特异性序列完全互补或部分互补；

(o)所述第三发夹形成序列与所述第四发夹形成序列完全互补或部分互补；

(q)所述媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列、或者所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列、或者所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序列形成发夹结构，其中，所述发夹结构的臂具有平末端，或者所述臂具有5’悬突(例如，其5’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)，或者所述臂具有3’悬突(例如，其3’端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)。

3.权利要求1或2的方法，其中，m＝1，并且n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数)；

优选地，所述方法包括下述步骤：

其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；例如，所述至少一种媒介子探针具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；

4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(a)所述样品包含或是DNA，或RNA，或核酸的混合物；

(b)所述靶核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶核酸序列是单链的或双链的；

(c)所述样品或靶核酸序列获自选自下列的来源：原核生物，真核生物，病毒或类病毒。

(d)所述媒介子探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(e)所述媒介子探针的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(f)所述媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-140nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；

(g)所述媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；

(h)所述媒介子探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的；

(i)所述上游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(j)所述上游寡核苷酸序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(k)所述上游寡核苷酸序列在与靶核酸序列杂交后，位于媒介子探针的上游远端，或位于媒介子探针的上游邻近，或与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列；和

(l)所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(a)在步骤(2)中，所述具有5'核酸酶活性的酶切割与靶核酸序列杂交的媒介子探针，并释放出包含完整媒介子序列或者媒介子序列的一部分(5'-末端部分)的媒介子片段；

(b)所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)；

优选地，所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌：Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermusflavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcuslitoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcushorikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifexaeolieus；特别优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶；

优选地，在步骤(2)中，所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶催化上游寡核苷酸序列的延伸，并诱导媒介子探针的切割；

(c)在步骤(2)中，使用核酸聚合酶以靶核酸序列为模板催化上游寡核苷酸序列的延伸，并且随后，所述具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并催化媒介子探针的切割。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中，在步骤(1)中，除了所述上游寡核苷酸序列和媒介子探针之外，针对待检测的每一种靶核酸序列，还提供一种下游寡核苷酸序列；其中，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列接触；

优选地，在步骤(2)中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触；

优选地，所述下游寡核苷酸序列具有选自下列的一个或多个特征：

(a)所述下游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和

(b)所述下游寡核苷酸序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

优选地，步骤(1)中提供的所有上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列；

优选地，在步骤(1)中，除了所述上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列之外，还提供一种通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针、下游寡核苷酸序列和通用引物接触；

优选地，所述通用引物具有选自下列的一个或多个特征：

(a)所述通用引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和

(b)所述通用引物的长度为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述检测探针具有选自下列的一个或多个特征：

(a)所述检测探针包含多种捕获序列；并且，所述多种捕获序列以相邻的方式、以间隔有连接序列的方式，或者以重叠的方式排列；

(b)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(c)所述检测探针的长度为15-1000nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(d)所述检测探针中的捕获序列的长度为10-500nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt；

(e)所述检测探针中的模板序列的长度为1-900nt，例如1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt；

(f)所述检测探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的；

(g)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(h)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(i)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中，在步骤(4)中，在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，所述核酸聚合酶以检测探针为模板，对杂交至检测探针的媒介子片段进行延伸，并由此形成双链体；

优选地，步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶，并且与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中，步骤(1)-(4)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：

(I)提供m种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述下游寡核苷酸序列如权利要求6所定义，并且所述通用引物如权利要求6所定义；

(II)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中，在步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；

优选地，对所获得的曲线进行求导，从而获得步骤(4)的产物的熔解曲线；

优选地，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于所述熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在；随后，通过媒介子片段中的媒介子序列与靶核酸序列的对应关系，确定与所述媒介子片段对应的靶核酸序列的存在。

11.一种探针组(probe set)，其包含一种检测探针，以及一种或多种(例如至少两种)的媒介子探针，其中，

所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

优选地，所述探针组包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针；

优选地，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；

优选地，每一种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；

优选地，所述第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度各自独立地为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；

优选地，所述媒介子探针的靶特异性序列与第一发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

优选地，所述媒介子探针的第二发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

优选地，所述媒介子探针的第三发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

优选地，所述媒介子探针的靶特异性序列与第四发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；

优选地，所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同；

优选地，所有媒介子探针各自靶向不同的靶核酸序列；

优选地，所述媒介子探针如权利要求1、2和4所定义；和/或，所述检测探针如权利要求1和7所定义。

12.一种试剂盒，其包含一种或多种如权利要求11所定义的探针组；

优选地，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组；

优选地，所述试剂盒中的所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；

优选地，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

优选地，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同；

优选地，所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团；

优选地，所述试剂盒还包含：上游寡核苷酸序列(例如如权利要求1或4所定义的上游寡核苷酸序列)、下游寡核苷酸序列(例如如权利要求6所定义的下游寡核苷酸序列)、通用引物(例如如权利要求6所定义的通用引物)、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合；

优选地，所述试剂盒还包含：用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、或其任何组合。