CN109988865B - 一种检测呼吸道病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种检测呼吸道病毒的方法，所述方法能够同时检测多种呼吸道病毒在样品中的存在或水平。此外，本申请还提供了一种探针组和包含一种或多种所述探针组的试剂盒，所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。此外，本申请还提供了一种试剂盒，其能够在一轮反应中同时检测多种呼吸道病毒在样品中的存在或水平。

Description

一种检测呼吸道病毒的方法

技术领域

本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测呼吸道病毒的方法，所述方法能够同时检测多种(例如2、5、10、15、19或更多种)呼吸道病毒在样品中的存在或水平。此外，本申请还提供了一种探针组，和包含一种或多种所述探针组的试剂盒，所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。此外，本申请还提供了一种试剂盒，其能够在一轮反应中同时检测多种(例如2、5、10、15、19或更多种)呼吸道病毒在样品中的存在或水平。

背景技术

呼吸道病毒的种类繁多，并且通过常规方法难以鉴定其种类。目前，检测呼吸道病毒的方法主要包括，病毒培养鉴定、免疫血清学分析和病毒核酸检测。病毒核酸检测相对于病毒培养鉴定和免疫血清学分析而言，具备检测快速、操作简便、特异性好等显著优点。因此，国内外大量文献和专利均已报道，采用病毒核酸检测方法来鉴定呼吸道病毒的种类。在此基础上，大部分呼吸道病毒核酸检测方法都会采用多重PCR扩增技术来提高检测方法的灵敏度。

美国专利申请US 6015664 A中公开了一种基于传统多重PCR扩增和线性反向探针杂交检测技术的核酸检测方法，其能够同时检测7种呼吸道病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型和副流感病毒III型)。然而，传统多重PCR扩增法需要在同一PCR体系中加入大量引物序列，容易产生大量的引物二聚体，影响PCR扩增和后续检测的灵敏度和准确性。线性反向探针杂交检测技术也具有检测操作步骤繁琐、检测耗时长、以及PCR产物污染风险高等局限性。

Merante等(Journal of Clinical Virology.2007；4(Suppl.1):S31-S35)描述了一种基于多重PCR和液相芯片技术的核酸检测方法，其能够同时检测18种呼吸道病毒基。与线性反向探针杂交技术相比，液相芯片技术改进了用于固定捕获探针的载体，从而提高了杂交效率、缩短了杂交时间、并简化了繁琐的洗涤步骤。但是，液相芯片技术依然需要在PCR扩增结束后对PCR产物进行开管检测，增加了PCR产物的污染风险。另外，液相芯片技术需要流式细胞仪作为检测仪器，这显著提高了检测成本。

Poritz等(PLoS One.2011；6(10):e26047)描述了一种基于巢式多重PCR扩增和微流控芯片检测技术的核酸检测方法，其能够同时检测17种呼吸道病毒和3种呼吸道细菌的基因组，并被命名为FilmArray呼吸道症候群检测系统。FilmArray检测系统采用巢式PCR技术来提高多重PCR的灵敏度和特异性。同时，微流控芯片技术的引入大幅度缩短了PCR扩增时间。FilmArray检测系统虽然实现了对20种呼吸道病原体的闭管状态检测，但是其需要在系统中集成12个PCR反应体系，并且每个PCR反应体系实际只检测一到两个病原体核酸序列。另外，FilmArray检测系统本质上是基于POCT检测技术，其具有检测通量较低、检测成本较高的局限性。

中国专利申请CN 105936945 A中公开了一种基于传统多重PCR扩增和四色实时荧光检测技术的核酸检测方法，其能够同时检测4重呼吸道病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人偏肺病毒)。实时荧光PCR技术作为新兴的呼吸道病毒核酸检测技术，具备灵敏度度高、特异性好、操作简便和PCR产物污染风险小的优点。但是受到目前实时荧光PCR仪检测荧光通道数量的限制，该方法只能在一个PCR反应中检测4种不同的病毒，难以满足种类繁多的呼吸道病毒群的检测需求。

综上所述，虽然已报道了多种鉴定呼吸道病毒的核酸检测方法，但是它们各自都具有一定的局限性。因此，仍然需要开发一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的高通量呼吸道病毒核酸检测方法。

实时PCR是用于检测核酸的一种常用方法，其操作简便，应用广泛。并且，通过利用多重实时PCR，可在单个反应管内同时检测多个靶序列，这不仅提高了检测效率，也降低了成本。

在实时PCR方法中，可通过使用荧光标记的寡核苷酸探针来对靶序列进行检测。一般而言，荧光标记的探针特异性地与用于PCR扩增的两条引物之间的靶序列结合，以避免由引物二聚体的非特异性扩增而导致的干扰信号，提高检测结果的特异性。对于多重实时PCR而言，当使用多种靶序列特异性的寡核苷酸探针时，可使用不同的荧光基团标记每一个寡核苷酸探针，由此，通过检测每一个探针所携带的独特荧光信号，可以检测每一个探针所特异性识别的靶序列。在实时PCR方法中，可通过两种模式来对靶序列进行检测，即，实时检测模式和扩增后的熔解曲线分析(也称为post-PCR MCA模式)。在实时检测模式中，靶序列的检测和PCR扩增同时进行，无需进行额外的步骤。因此，实时检测模式简便直接。但是，这种模式在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目受限于实时PCR仪器的荧光检测通道的数目，一般不超过6个。在MCA模式中，需要在PCR扩增后进行一个额外的步骤，即，分析由探针与靶序列构成的双链体的熔点。MCA模式可通过荧光颜色和/或熔点来识别或区分靶序列。因此，MCA模式虽然相对较为繁琐(即，增加了一个额外的步骤)，但其在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目有所提高。

然而，基于荧光探针检测的多重实时PCR也存在一些问题。首先，荧光探针的制备涉及复杂的化学修饰和纯化过程，其成本大大高于非标记探针。因此，多个荧光探针的使用会导致检测成本的增加。其次，在多重实时PCR法中，多个荧光探针的共存会使反应体系的背景荧光增加，这进而可导致检测灵敏度的下降。因此，需要对多重实时PCR法进行改进，以期通过尽可能少的荧光探针来检测尽可能多的靶序列。

Faltin等人(Clinical Chemistry 2012,58(11):1546-1556)描述了一种基于“媒介子探针”的实时PCR检测方法。在传统的实时PCR检测方法中，针对每一个靶序列，均需要使用一个靶序列特异的荧光探针。然而，在Faltin等人报道的方法中，针对每一个靶序列，需要使用两个探针：一个非荧光标记的靶序列特异的媒介子探针，以及另一个不与靶序列结合的荧光标记的探针(荧光探针)；其中，媒介子探针由位于3'-端的靶特异性序列和位于5'-端的标签序列(媒介子)组成；荧光探针由包含媒介子杂交位点的3'-端单链序列以及包含淬灭基团和荧光基团的、具有发夹结构的5'-端序列构成，淬灭基团和荧光基团均位于发夹结构的臂上且相互靠近，从而发生荧光淬灭。在PCR过程中，媒介子探针通过靶特异性序列与靶序列结合，并且其5'-端的标签序列(媒介子)保持单链游离状态；随后，媒介子探针在具有5'-核酸酶活性的DNA聚合酶的作用下发生酶切，释放出带有3'-OH的媒介子。随后，释放的媒介子结合至荧光探针中的媒介子杂交位点，并被聚合酶延伸，导致标记有淬灭基团的序列被切除或被置换，进而造成荧光基团与淬灭基团的分离，引起荧光强度的增加。

Faltin等人描述的方法的特点在于，荧光信号的产生依赖于两个探针：媒介子探针和荧光探针；其中，媒介子探针用作杂交探针，本身是非荧光标记的；荧光探针用于产生荧光信号，其与媒介子特异性结合，但不与靶序列结合。在该方法中，荧光探针可被用作通用探针。例如，当使用单重实时PCR来检测多个靶序列时，可以使用各自携带独特的靶特异性序列但含有相同的媒介子序列的多个媒介子探针以及一个相同的荧光探针来分别进行PCR反应。此外，对于多重实时PCR而言，当无需识别或区分每一个靶序列时，也可以使用具有相同媒介子序列的多个媒介子探针和一个荧光探针来实现多个靶序列的筛查。与传统的实时PCR方法相比，Faltin等人的方法可以使用一个通用的荧光探针来对多个靶序列进行检测，而无需针对每一个靶序列合成一个独特的荧光探针，这显著降低了检测成本。

然而，Faltin等人的方法也存在着明显的缺陷。特别地，当将Faltin等人的方法用于进行需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列都需要设计一个携带靶特异性序列的媒介子探针和一个对应的、带有独特荧光信号的荧光探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时PCR相比，Faltin等人的方法需要使用双倍数目的探针。相应地，整个反应体系变得更为复杂，检测成本也变得更高。例如，Faltin等人公开了同时检测HPV18和人类ACTB基因的双重PCR法，其中使用了2条媒介子探针和2条荧光探针；相比之下，传统的双重实时PCR法仅需要使用2条荧光探针。类似的例子还见于Wadle S等人(Biotechniques 2016,61(3):123-8)，其中描述了一个五重PCR体系，该体系共使用了5条媒介子探针和5条荧光报告探针。相比之下，传统的五重实时PCR法仅需要使用5条荧光探针。在这种情况下，与传统多重实时PCR相比，Faltin等人的方法更加复杂，并且成本高昂。

US 2013/0109588 A1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时PCR测定，其与Faltin等人的方法类似，通过两条探针(PTO探针，其对应于媒介子探针；和CTO探针，其对应于荧光探针)来实现对靶序列的检测。相应地，US 2013/0109588 A1的方法具有与Faltin等人的方法相似的优点和缺点。特别地，当将该专利申请中描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计一条PTO探针和一条CTO探针；即，使用双倍数目的探针。例如，该专利申请描述了同时检测奈瑟氏淋球菌和金黄色葡萄球菌的双重实时PCR，其中即使用了2条PTO探针和2条CTO探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时PCR相比，US 2013/0109588 A1的方法更加复杂，并且成本高昂。

US 2014/0057264 A1公开了另一种使用两个探针的实时PCR方法。在该方法中，荧光信号是因标记探针的切割而产生的，因此，该方法仅能用于实时检测模式，而不能用于MCA模式。此外，与Faltin等人的方法类似，当将US 2014/0057264 A1中描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计两条探针，这导致反应体系更加复杂，并且成本高昂。

US 2015/0072887 A1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时PCR测定，其通过3条探针来实现对靶序列的检测。然而，当将该专利申请描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计3条探针，这导致反应体系更加复杂，并且成本高昂。类似的使用3条探针的实时PCR测定还公开于US 2015/0167060A1和US2016/0060690A1中。然而，这些方法与US 2015/0072887A1中公开的方法类似，在用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，比传统实时PCR法更复杂且成本更高。

总的来说，与传统实时PCR法相比，使用两条或三条探针的经改良的实时PCR方法(例如Faltin等人的方法)在实施单重实时PCR或者无需识别或区分每一个靶序列的多重实时PCR时，具有显著的优点：即，可使用携带相同媒介子序列但不同靶特异性序列的多条媒介子探针以及一条通用的荧光探针，从而可显著降低检测成本。但是，当实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，这些经改良的实时PCR方法就需要使用双倍乃至三倍数目的探针，反而比传统实时PCR法更加复杂，成本更高。

在本申请中，发明人开发了一种新的实时PCR测定方法，其能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来对样品中的每一个靶序列进行区分和鉴定。在此基础上，本申请的发明人开发了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的高通量呼吸道病毒核酸检测方法。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”是指待检测的目标核酸序列。在本申请中，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”具有相同的含义，并且可互换使用。

如本文中所使用的，术语“媒介子探针”是指，从5'至3'方向含有媒介子序列(mediator sequence)和靶向序列(targeting sequence；即，靶特异性序列)的单链核酸分子。在本申请中，媒介子序列不含与靶核酸序列互补的序列，靶特异性序列包含与靶核酸序列互补的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，媒介子探针通过靶特异性序列与靶核酸序列杂交或退火(即，形成双链结构)，并且媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交，而处于游离状态(即，保持单链结构)。

如本文中所使用的，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”是指，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，能够与靶核酸序列选择性/特异性杂交或退火的序列，其包含与靶核酸序列互补的序列。在本申请中，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”具有相同的含义，并且可互换使用。易于理解的是，靶向序列或靶特异性序列对于靶核酸序列是特异性的。换言之，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，靶向序列或靶特异性序列仅与特定的靶核酸序列杂交或退火，而不与其他的核酸序列杂交或退火。

如本文中所使用的，术语“媒介子序列”是指，媒介子探针中不与靶核酸序列互补的一段寡核苷酸序列，其位于靶特异性序列的上游(5'端)。在本申请中，针对每一种靶核酸序列，设计或提供一条独特的媒介子探针，其具有独特的媒介子序列(换言之，所使用的所有媒介子探针中的媒介子序列彼此不同)；由此，每一种靶核酸序列与一条独特的媒介子探针(独特的媒介子序列)相对应。因此，通过检测所述独特的媒介子序列，可以检测与之相对应的靶核酸序列。

如本文中所使用的，术语“上游寡核苷酸序列”是指，包含与靶核酸序列互补的序列的一段寡核苷酸序列，其在允许核酸杂交(或退火)或扩增的条件下，能够与靶核酸序列杂交(或退火)，并且，当与靶核酸序列杂交时，其位于媒介子探针的上游。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。例如，在本申请中，上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列各自包含与靶核酸序列互补(例如实质上互补或完全互补)的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列将选择性地/特异性地与靶核酸序列杂交或退火。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。例如，在本申请中，媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，媒介子序列不与靶核酸序列杂交或退火，无法形成双链体，而是处于游离状态(即，保持单链结构)。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，“允许核酸杂交的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，并且可通过常规的方法来确定。例如，具有互补序列的两条核酸分子可在合适的杂交条件下发生杂交。此类杂交条件可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的pH值、成分和离子强度等，并且可根据互补的两条核酸分子的长度和GC含量来确定。例如，当互补的两条核酸分子的长度相对较短和/或GC含量相对较低时，可采用低严紧的杂交条件。当互补的两条核酸分子的长度相对较长和/或GC含量相对较高时，可采用高严紧的杂交条件。此类杂交条件是本领域技术人员熟知的，并且可参见例如Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；和M.L.M.Anderson,Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag New YorkInc.N.Y.(1999)。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。相应地，表述“允许核酸杂交的条件”和“允许核酸退火的条件”也具有相同的含义，并且可互换使用。

如本文中所使用的，表述“允许核酸扩增的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，允许核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)以一条核酸链为模板合成另一条核酸链，并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的，并且可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的pH值、成分、浓度和离子强度等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。在本发明的方法中，“允许核酸扩增的条件”优选地为核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的工作条件。

如本文中所使用的，表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，允许核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)以一条核酸链为模板延伸另一条核酸链(例如引物或探针)，并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的，并且可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的pH值、成分、浓度和离子强度等等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如Joseph Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001))。在本发明的方法中，“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”优选地为核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的工作条件。在本申请中，表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”和“允许核酸延伸的条件”具有相同的含义，并且可互换使用。

如本文中所使用的，表述“允许切割媒介子探针的条件”是指，允许具有5'核酸酶活性的酶切割杂交至靶核酸序列上的媒介子探针，并释放出含有媒介子序列或其部分的核酸片段的条件。在本发明的方法中，允许切割媒介子探针的条件优选地为具有5'核酸酶活性的酶的工作条件。例如，当使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时，允许切割媒介子探针的条件可以为所述核酸聚合酶的工作条件。

各种酶的工作条件可由本领域技术人员通过常规方法确定，并且通常可涉及下列因素：温度，缓冲液的pH值，成分，浓度，离子强度等。备选地，可使用酶的制造商所推荐的条件。

如本文中所使用的，术语“核酸变性”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，双链核酸分子解离为单链的过程。表述“允许核酸变性的条件”是指，使得双链核酸分子解离为单链的条件。此类条件可由本领域技术人员常规地确定(参见例如JosephSambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。例如，可通过加热，碱处理，尿素处理，酶促方法(例如使用解旋酶的方法)等常规技术来使核酸变性。在本申请中，优选地，在加热的条件下使核酸变性。例如，可通过加热至80-105℃，从而使核酸变性。

如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与后者相比，前者位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。

如本文中所使用的，术语“荧光探针”是指携带荧光基团、且能够产生荧光信号的一段寡核苷酸。在本申请中，荧光探针被用作检测探针。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m值)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m值就越高。因此，通过检测双链体的T_m值，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m值”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请中，发明人开发了一种新的实时PCR测定方法，其能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来对样品中的多种靶序列进行区分和鉴定。在此基础上，本申请的发明人开发了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的、能够同时检测多种呼吸道病毒的方法和试剂盒。例如，本发明的方法和试剂盒能够同时检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种呼吸道病毒。

检测方法

因此，在一个方面，本发明提供了一种检测至少两种呼吸道病毒在样品中的存在的方法，其包括以下步骤：

(1)在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针接触，其中，

(i)所述第一上游寡核苷酸序列包含与第一靶核酸序列互补的序列；并且，所述第一媒介子探针从5'至3'方向包含第一媒介子序列和第一靶特异性序列，其中，所述第一媒介子序列包含不与第一靶核酸序列互补的序列，并且，所述第一靶特异性序列包含与第一靶核酸序列互补的序列；并且，当与第一靶核酸序列杂交时，第一上游寡核苷酸序列位于第一靶特异性序列的上游；其中，所述第一靶核酸序列是第一呼吸道病毒特异性的，优选地，为第一呼吸道病毒的基因组序列或其特异性片段；

(ii)所述第二上游寡核苷酸序列包含与第二靶核酸序列互补的序列；并且，所述第二媒介子探针从5'至3'方向包含第二媒介子序列和第二靶特异性序列，其中，所述第二媒介子序列包含不与第二靶核酸序列互补的序列，并且，所述第二靶特异性序列包含与第二靶核酸序列互补的序列；并且，当与第二靶核酸序列杂交时，第二上游寡核苷酸序列位于第二靶特异性序列的上游；其中，所述第二靶核酸序列是第二呼吸道病毒特异性的，优选地，为第二呼吸道病毒的基因组序列或其特异性片段；并且，

(iii)所述第一媒介子序列与所述第二媒介子序列不同；并且，

(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；

(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，

所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；

(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列是否存在于所述样品中，从而确定所述第一呼吸道病毒和第二呼吸道病毒是否存在于所述样品中。

在本发明的方法中，由于第一靶核酸序列是第一呼吸道病毒特异性的，并且第二靶核酸序列分别是第二呼吸道病毒特异性的，因此，可通过检测第一靶核酸序列和第二靶核酸序列的存在来确定第一呼吸道病毒和第二呼吸道病毒的存在。

如本文中所使用的，表述“某靶核酸序列是某病原体(例如某病毒)特异性的”是指，所述靶核酸序列是所述病原体所特有的，而不存在于其他生物体(例如所述病原体的宿主或其他病原体)中。换言之，仅能在所述病原体(例如所述病毒)中检测到所述靶核酸序列，由此，所述靶核酸序列的存在即代表着所述病原体的存在，反之亦然。此类靶核酸序列的一个典型实例是所述病原体(例如所述病毒)的基因组序列或其特异性片段。如本文中所使用的，表述“病原体/病毒的基因组序列的特异性片段”具有类似的含义，即，所述片段是所述病原体/病毒或其基因组特有的。此类特异性片段可以是非编码序列(例如，不编码任何RNA或蛋白)，或者编码序列(例如，能够被转录或翻译)，或者二者的组合，只要其是病原体/病毒特异性的即可。

可通过各种熟知的方法来确定某一核酸序列或者某一片段是否是病原体/病毒特异性的。例如，可以通过在公共数据库(例如NCBI数据库)中对所述核酸序列进行Blast检索，从而确定所述核酸序列是否是某一病原体/病毒特有的(特异性的)。

在本发明的方法中，由于第一靶核酸序列是第一呼吸道病毒特异性的，因此，各自包含与第一靶核酸序列互补的序列的第一上游寡核苷酸序列和第一靶特异性序列也只能够与所述第一呼吸道病毒的特异性序列(即，第一靶核酸序列)特异性退火或杂交。因此，第一上游寡核苷酸序列和第一靶特异性序列也被认为是第一呼吸道病毒特异性的。类似地，第二上游寡核苷酸序列和第二靶特异性序列也被认为是第二呼吸道病毒特异性的。

在本发明方法的步骤(1)中，由于所述第一上游寡核苷酸序列包含与第一靶核酸序列互补的序列，并且所述第一靶特异性序列包含与第一靶核酸序列互补的序列，因此，当存在第一靶核酸序列时，所述第一上游寡核苷酸序列和所述第一媒介子探针都与所述第一靶核酸序列杂交。类似地，由于所述第二上游寡核苷酸序列包含与第二靶核酸序列互补的序列，并且所述第二靶特异性序列包含与第二靶核酸序列互补的序列，因此，当存在第二靶核酸序列时，所述第二上游寡核苷酸序列和所述第二媒介子探针都与所述第二靶核酸序列杂交。

在本发明方法的步骤(2)中，当存在第一靶核酸序列时，所述第一上游寡核苷酸序列和所述第一媒介子探针都与所述第一靶核酸序列杂交。进一步，由于所述第一媒介子序列包含不与第一靶核酸序列互补的序列，因此，第一媒介子探针中的第一媒介子序列处于游离状态，而不与第一靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，第一媒介子序列或其部分会因第一上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第一靶核酸序列杂交的第一媒介子探针上切割下来，形成第一媒介子片段。类似地，当存在第二靶核酸序列时，第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针都与第二靶核酸序列杂交，并且第二媒介子探针中的第二媒介子序列处于游离状态，而不与第二靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，第二媒介子序列或其部分会因第二上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第二靶核酸序列杂交的第二媒介子探针上切割下来，形成第二媒介子片段。

在本发明方法的步骤(3)中，当存在第一媒介子片段时，由于第一媒介子片段包含第一媒介子序列或其部分，且检测探针包含与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，因此，所述第一媒介子片段与所述检测探针杂交。类似地，当存在第二媒介子片段时，由于第二媒介子片段包含第二媒介子序列或其部分，且检测探针包含与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，因此，所述第二媒介子片段与所述检测探针杂交。

在本发明方法的步骤(4)中，当存在第一媒介子片段时，由于所述第一媒介子片段与所述检测探针杂交，并且所述检测探针包含额外的序列(例如，模板序列)，因此，核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第一媒介子片段，形成第一双链体。类似地，当存在第二媒介子片段时，由于所述第二媒介子片段与所述检测探针杂交，并且所述检测探针包含额外的序列(例如，模板序列)，因此，核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第二媒介子片段，形成第二双链体。

在本发明方法的步骤(5)中，当存在第一双链体时，可检测到与第一双链体对应的熔解峰。因此，可通过与第一双链体对应的熔解峰的存在或不存在，确定第一靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如，当检测到或未检测到与第一双链体对应的熔解峰时，确定第一靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中；进一步，由于第一靶核酸序列是第一呼吸道病毒特异性的，因此，可确定第一呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。类似地，可通过与第二双链体对应的熔解峰的存在或不存在，确定第二靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如，当检测到或未检测到与第二双链体对应的熔解峰时，确定第二靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中；进一步，由于第二靶核酸序列是第二呼吸道病毒特异性的，因此，可确定第二呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。

特别地，在本发明的方法中，由于所使用的第一媒介子序列与第二媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段与第二媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体在结构(序列)上也不同于包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体。相应地，第一双链体将具有与第二双链体不同的熔点(T_m值)。因此，在熔解曲线分析中，第一双链体显示出与第二双链体不同的熔解峰。由此，通过检测第一双链体或第二双链体的熔解峰，可判断第一靶核酸序列或第二靶核酸序列在样品中的存在。

另外，由于第一媒介子序列、第二媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一双链体与第二双链体各自的熔点(T_m值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一双链体或第二双链体的熔点(T_m值)的熔解峰，可判断第一靶核酸序列或第二靶核酸序列在样品中的存在。

基于与上述相同的原理，通过设计更多的媒介子探针，本发明的方法可用于同时检测更多的靶核酸序列，从而例如，可用于检测更多的呼吸道病毒。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针之外，还在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与第三上游寡核苷酸序列和第三媒介子探针接触，其中，

所述第三上游寡核苷酸序列包含与第三靶核酸序列互补的序列；并且，所述第三媒介子探针从5'至3'方向包含第三媒介子序列和第三靶特异性序列，其中，所述第三媒介子序列包含不与第三靶核酸序列互补的序列，并且，所述第三靶特异性序列包含与第三靶核酸序列互补的序列；其中，所述第三靶核酸序列是第三呼吸道病毒特异性的，优选地，为第三呼吸道病毒的基因组序列或其特异性片段；

并且，当与第三靶核酸序列杂交时，第三上游寡核苷酸序列位于第三靶特异性序列的上游；并且，所述第三媒介子序列与所述第一和第二媒介子序列不同；

并且，在步骤(3)中，所使用的检测探针还包含与第三媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列，其位于所述模板序列的下游。

在此类实施方案中，在步骤(1)中，当存在第三靶核酸序列时，所述第三上游寡核苷酸序列和所述第三媒介子探针与所述第三靶核酸序列杂交。进一步，在步骤(2)中，当存在第三靶核酸序列时，第三媒介子序列或其部分因第三上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第三靶核酸序列杂交的第三媒介子探针上切割下来，形成第三媒介子片段。进一步，在步骤(3)和(4)中，当存在第三媒介子片段时，所述第三媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第三媒介子片段，形成第三双链体。更进一步，在步骤(5)中，当检测到或未检测到与第三双链体对应的熔解峰时，确定第三靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。再进一步，由于第三靶核酸序列是第三呼吸道病毒特异性的，因此，可确定第三呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。

类似地，在本发明的方法中，由于所使用的第一、第二和第三媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段、第二媒介子片段和第三媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地，所述第一、第二和第三双链体具有彼此不同的熔点(T_m值)。因此，在熔解曲线分析中，所述第一、第二和第三双链体显示出彼此可区分的三个熔解峰。由此，通过检测第一、第二和第三双链体的熔解峰，可判断第一、第二和第三靶核酸序列在样品中的存在。

另外，由于第一、第二、和第三媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一、第二和第三双链体各自的熔点(T_m值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二或第三双链体的熔点(T_m值)的熔解峰，可判断第一、第二或第三靶核酸序列在样品中的存在。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列、第二媒介子探针、第三上游寡核苷酸序列和第三媒介子探针之外，还将所述样品与第四上游寡核苷酸序列和第四媒介子探针接触，其中，

所述第四上游寡核苷酸序列包含与第四靶核酸序列互补的序列；并且，所述第四媒介子探针从5'至3'方向包含第四媒介子序列和第四靶特异性序列，其中，所述第四媒介子序列包含不与第四靶核酸序列互补的序列，并且，所述第四靶特异性序列包含与第四靶核酸序列互补的序列；其中，所述第四靶核酸序列是第四呼吸道病毒特异性的，优选地，为第四呼吸道病毒的基因组序列或其特异性片段；

并且，当与第四靶核酸序列杂交时，第四上游寡核苷酸序列位于第四靶特异性序列的上游；并且，所述第四媒介子序列与所述第一、第二和第三媒介子序列不同；

并且，在步骤(3)中，所使用的检测探针还包含与第四媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列，其位于所述模板序列的下游。

在此类实施方案中，在步骤(1)中，当存在第四靶核酸序列时，所述第四上游寡核苷酸序列和所述第四媒介子探针与所述第四靶核酸序列杂交。进一步，在步骤(2)中，当存在第四靶核酸序列时，第四媒介子序列或其部分因第四上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第四靶核酸序列杂交的第四媒介子探针上切割下来，形成第四媒介子片段。进一步，在步骤(3)和(4)中，当存在第四媒介子片段时，所述第四媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第四媒介子片段，形成第四双链体。更进一步，在步骤(5)中，当检测到或未检测到与第四双链体对应的熔解峰时，确定第四靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。再进一步，由于第四靶核酸序列是第四呼吸道病毒特异性的，因此，可确定第四呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。

类似地，在本发明的方法中，由于所使用的第一、第二、第三和第四媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段、第二媒介子片段、第三媒介子片段和第四媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体、包含第四媒介子片段的延伸产物和检测探针的第四双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地，所述第一、第二、第三和第四双链体具有彼此不同的熔点(T_m值)。因此，在熔解曲线分析中，所述第一、第二、第三和第四双链体显示出彼此可区分的四个熔解峰。由此，通过检测第一、第二、第三和第四双链体的熔解峰，可判断第一、第二、第三和第四靶核酸序列在样品中的存在。

另外，由于第一、第二、第三和第四媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一、第二、第三和第四双链体各自的熔点(T_m值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二、第三或第四双链体的熔点(T_m值)的熔解峰，可判断第一、第二、第三或第四靶核酸序列在样品中的存在。

类似地，可使用更多的上游寡核苷酸序列和更多的媒介子探针来实施本发明的方法。例如，在某些实施方案中，可使用至少5种上游寡核苷酸序列、至少5种媒介子探针以及一种检测探针来实施本发明的方法，其中，

每一种上游寡核苷酸序列包含与一种靶核酸序列互补的序列；并且，

每一种媒介子探针从5'至3'方向包含一种媒介子序列和一种靶特异性序列，其中，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与一种靶核酸序列互补的序列；由此，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列和媒介子探针均能够与该靶核酸序列杂交；并且，当与该靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，每一种靶核酸序列各自特异于一种呼吸道病毒；并且，

所述检测探针包含模板序列，以及位于所述模板序列的下游、且分别与每一种媒介子探针中的媒介子序列或其部分互补的多个序列。在此类实施方案中，本发明的方法可用于同时检测至少5种靶核酸序列。

在某些实施方案中，本发明的方法可使用至少6种上游寡核苷酸序列、至少6种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少7种上游寡核苷酸序列、至少7种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少8种上游寡核苷酸序列、至少8种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少9种上游寡核苷酸序列、至少9种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少10种上游寡核苷酸序列、至少10种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少12种上游寡核苷酸序列、至少12种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少15种上游寡核苷酸序列、至少15种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少20种上游寡核苷酸序列、至少20种媒介子探针以及一种检测探针；其中，所述上游寡核苷酸序列、媒介子探针以及检测探针如上文所定义。在此类实施方案中，本发明的方法可用于同时检测至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少19种、或至少20种靶核酸序列或呼吸道病毒。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种检测n种呼吸道病毒在样品中的存在的方法，其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：

(1)针对待检测的每一种呼吸道病毒，确定至少一种特异于该呼吸道病毒的靶核酸序列；然后，针对每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；

(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；

(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；

(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定每一种靶核酸序列是否存在于所述样品中，并进而确定与每一种靶核酸序列对应的呼吸道病毒是否存在于所述样品中。

在此类实施方案的步骤(1)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列(即，包含与该靶核酸序列互补的序列的上游寡核苷酸序列)，以及与该靶核酸序列对应的媒介子探针(即，其靶特异性序列包含与该靶核酸序列互补的序列的媒介子探针)都与该靶核酸序列杂交。

进一步，在此类实施方案的步骤(2)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列以及媒介子探针都与该靶核酸序列杂交，但是所述媒介子探针中的媒介子序列处于游离状态，而不与该靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，所述媒介子探针(与该靶核酸序列对应的媒介子探针)中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来，形成与该靶核酸序列对应的媒介子片段。

进一步，在此类实施方案的步骤(3)和(4)中，当存在与某一种靶核酸序列对应的媒介子片段时，所述媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸所述媒介子片段，形成与所述靶核酸序列对应的双链体。更进一步，在此类实施方案的步骤(5)中，当检测到或未检测到与某一种靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时，确定所述靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中，并进而确定与所述靶核酸序列相对应的呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。

特别地，在此类实施方案中，由于所使用的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同，因此，所形成的每一种媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，由媒介子片段的延伸产物和检测探针构成的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列)。相应地，每一种双链体具有彼此不同的熔点(T_m值)。因此，在熔解曲线分析中，每一种双链体显示出彼此不同的熔解峰。由此，通过检测某一种双链体的熔解峰，可判断与该双链体对应的靶核酸序列在样品中的存在。

另外，由于每一种媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算每一种双链体各自的熔点(T_m值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有某一种双链体的熔点(T_m值)的熔解峰，可判断与该双链体对应的靶核酸序列在样品中的存在。

以上针对本发明方法的基本原理进行了简要概述，现参照本发明方法的各个步骤，对本发明方法进行详细的阐释和举例说明。

关于步骤(1)和(2)

在本发明的方法中，样品中的特异于呼吸道病毒的靶核酸序列(例如第一或第二靶核酸序列；如果存在的话)首先与对应的上游寡核苷酸序列(例如第一或第二上游寡核苷酸序列)和对应的媒介子探针(例如第一或第二媒介子探针)杂交。

在本发明的方法中，样品可以是任何待检测的样品。例如，在某些优选的实施方案中，样品包含或是DNA(例如基因组DNA或cDNA)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是RNA(例如mRNA)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是核酸的混合物(例如DNA的混合物，RNA的混合物，或者DNA和RNA的混合物)。在某些优选的实施方案中，待检测的样品为获自受试者的样品，例如，鼻腔分泌物，鼻或咽拭样，肺泡灌洗液，痰液等。在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。

在本发明的方法中，待检测的靶核酸序列不受限于其序列组成或长度。例如，所述靶核酸序列可以是DNA(例如基因组DNA或cDNA)或RNA分子(例如mRNA)。此外，待检测的靶核酸序列可以是单链的或双链的。

当待检测的样品或靶核酸序列为mRNA时，优选地，在进行本发明的方法之前，进行逆转录反应，以获得与所述mRNA互补的cDNA。关于逆转录反应的详细描述可参见例如，Joseph Sam-brook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。

待检测的样品或靶核酸序列可获自任何来源。在本发明的方法中，待检测的样品是含有或怀疑含有呼吸道病毒的样品。如本文中所使用的，术语“呼吸道病毒”是指，能够感染呼吸道的任何病毒，其包括但不限于，甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒(例如鼻病毒B)、腺病毒(例如腺病毒B)、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E，或其任何组合。易于理解，在本发明的方法中，所述呼吸道病毒并不限于所描述的类型，而可以是任意种类的呼吸道病毒，包括DNA病毒和RNA病毒。待检测的样品或靶核酸序列还可以是任何形式的核酸序列，例如基因组序列，人工分离或片段化的序列，合成的序列等。

在本发明的某些实施方案中，媒介子探针可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，媒介子探针不受其长度的限制。例如，媒介子探针的长度可以为15-1000nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。例如，媒介子探针的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。媒介子探针中的靶特异性序列可以是任何长度，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，媒介子探针中的靶特异性序列的长度可以为10-500nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt。例如，媒介子探针中的靶特异性序列的长度可以为10-140nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。媒介子探针中的媒介子序列可以是任何长度，只要其能够与检测探针特异性杂交并进行延伸。例如，媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt，例如5-10nt，8-50nt，8-15nt，15-20nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。在某些优选的实施方案中，媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)，并且，媒介子序列的长度为5-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)。

在某些优选的实施方案中，媒介子探针具有3'-OH末端。在某些优选的实施方案中，媒介子探针的3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如媒介子探针)的3'-末端。例如，可通过对媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰，以封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭媒介子探针的3'-末端。

在本发明的某些实施方案中，上游寡核苷酸序列可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，上游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，上游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在本发明的方法中，允许核酸杂交的条件可由本领域技术人员常规地确定。例如，可根据待检测的靶核酸序列、所使用的上游寡核苷酸序列、媒介子探针中的靶特异性序列确定合适的杂交条件。在本发明的某些实施方案中，所述允许核酸杂交的条件是这样的严紧条件，其使得上游寡核苷酸序列以及媒介子探针中的靶特异性序列通过碱基互补配对与对应的靶核酸序列杂交，并且，媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交。在某些优选的实施方案中，在高严紧条件下，将样品与各种上游寡核苷酸序列和各种媒介子探针接触。

在本发明的方法中，在将样品与各种上游寡核苷酸序列和各种媒介子探针接触后，需要诱导媒介子探针的切割，以释放含有媒介子序列或其部分的片段(即，媒介子片段)。在一般情况下，可使用具有5'核酸酶活性的酶，利用与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸序列或其延伸产物，诱导与靶核酸序列杂交的媒介子探针的切割。特别地，在步骤(1)中，当媒介子探针与靶核酸序列接触时，其所包含的靶特异性序列与靶核酸序列杂交并形成双链结构，而媒介子序列不与靶核酸序列杂交，保持单链结构。因此，可利用具有5'核酸酶活性的酶来切割这种包含双链结构和单链结构的寡核苷酸，并释放具有单链结构的片段。

易于理解，在本发明的方法中，在允许核酸杂交的条件下，上游寡核苷酸序列和媒介子探针将与靶核酸序列的同一条链杂交，且上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游，从而可诱导媒介子探针的切割。在本发明的某些实施方案中，可通过两种方式来诱导媒介子探针的切割：(A)不依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式；和(B)依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式。特别地，在上游寡核苷酸序列和媒介子探针与靶核酸序列杂交后，如果上游寡核苷酸序列和媒介子探针足够接近，使得具有5'核酸酶活性的酶能够诱导对媒介子探针的切割，那么所述酶将结合至上游寡核苷酸序列，并切割媒介子探针，而无需进行延伸反应(即，方式A)。相反地，在与靶核酸序列杂交后，如果上游寡核苷酸序列远离媒介子探针，那么先使用核酸聚合酶，以靶核酸序列为模板，催化上游寡核苷酸序列的延伸，随后具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并切割媒介子探针(即，方式B)。

因此，在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游邻近。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针，而无需进行延伸反应。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针，其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的，术语“邻近”意欲表示，两条核酸序列彼此相邻，形成缺口。在某些优选的实施方案中，邻近的两条核酸序列(例如，上游寡核苷酸序列和媒介子探针)相距不超过30nt，例如不超过20nt，例如不超过15nt，例如不超过10nt，例如不超过5nt，例如4nt，3nt，2nt，1nt。

在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针，而无需进行延伸反应。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针，其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。在某些优选的实施方案中，所述部分重叠的序列的长度为1-10nt，例如1-5nt，或1-3nt。

在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游远端。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列被核酸聚合酶延伸，随后所产生的延伸产物诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的引物，其用于起始延伸反应，并以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的，术语“远端”意欲表示，两条核酸序列彼此远离，例如相距至少30nt，至少50nt，至少80nt，至少100nt或更长。

因此，在某些优选的实施方案中，所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。所述引物适合于以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。所述探针适合于以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。

利用上游寡核苷酸来诱导切割下游寡核苷酸(下游探针)的各种方法是本领域技术人员已知的，并且可用于本发明。关于此类方法的详细描述可参见例如，美国专利5,210,015,5,487,972,5,691,142,5,994,069和7,381,532，以及美国申请US 2008/0241838。

在某些实施方案中，媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列与靶特异性序列的连接处(即，与靶核酸杂交的序列和不与靶核酸杂交的序列的连接处)。在此类实施方案中，酶对媒介子探针的切割将释放出包含完整媒介子序列的片段。在某些实施方案中，媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列的3'-末端区域内(即，位于媒介子序列的3'-末端的上游，且例如距离媒介子序列的3'-末端数个核苷酸，例如1-3个核苷酸)。在此类实施方案中，酶对媒介子探针的切割将释放出包含媒介子序列的一部分(5'-末端部分)的片段。因此，在本发明的某些实施方案中，媒介子片段包含完整的媒介子序列，或者媒介子序列的一部分(5'-末端部分)，例如包含媒介子序列的5'-末端的至少5nt，至少8nt，至少10nt，至少20nt，至少30nt，至少40nt，至少50nt，例如5-50nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。

在本申请中，可使用各种具有5'核酸酶活性的酶来实施本发明的方法。在某些优选的实施方案中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'外切核酸酶活性的酶。在某些优选的实施方案中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)。在某些实施方案中，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶的使用是特别有利的，因为所述聚合酶既能够以靶核酸序列为模板，催化上游寡核苷酸序列的延伸，而且能够诱导媒介子探针的切割。

在某些优选的实施方案中，具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，其可获自各种细菌物种，例如，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermusantranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermusrubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotogamaritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。特别优选地，所述具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶为Taq聚合酶。

备选地，在步骤(2)中，可使用两种不同的酶：核酸聚合酶和具有5'核酸酶活性的酶。在此类实施方案中，核酸聚合酶用于以靶核酸序列为模板催化上游寡核苷酸序列的延伸，且具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并催化媒介子探针的切割。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)和/或(2)中，还将样品与特异于靶核酸序列的下游寡核苷酸序列(或下游引物)接触。在某些实施方案中，核酸聚合酶和下游寡核苷酸序列(或下游引物)的使用是特别有利的。特别地，核酸聚合酶能够以靶核酸序列为模板，以上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列为引物，产生额外的靶核酸序列，从而可提高本发明方法的灵敏度。

因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了上文所定义的上游寡核苷酸序列和媒介子探针之外，针对待检测的每一种靶核酸序列，还提供一种下游寡核苷酸序列；其中，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游；

然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列接触。

在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列分别用作上游引物和下游引物，用于扩增靶核酸序列。因此，易于理解的是，上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列分别靶向两条互补链中的不同链。因此，当靶核酸序列为双链分子时，上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序分别与靶核酸序列的不同链(正义链和反义链)互补；而当靶核酸序列为单链分子时，上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序分别与靶核酸序列及其互补序列互补，从而可用于实现对靶核酸序列的扩增。然而，在本申请中，为了简便起见，在描述上游寡核苷酸序列/下游寡核苷酸序列与靶核酸序列的关系时，均统称为“与靶核酸序列互补”，而不再详细区分靶核酸序列的正义链和反义链，也不再详细区分靶核酸序列及其互补序列。然而，本领域技术人员能够正确理解，上游寡核苷酸序列/下游寡核苷酸序列与靶核酸序列的互补关系和位置关系。

例如，当本发明的方法用于检测分别特异于第一和第二呼吸道病毒的第一和第二靶核酸序列时，可提供第一和第二下游寡核苷酸序列，其分别包含与第一和第二靶核酸序列互补的序列。类似地，可针对特异于第三呼吸道病毒的第三靶核酸序列提供第三下游寡核苷酸序列，其包含与第三靶核酸序列互补的序列。还可针对特异于第四呼吸道病毒的第四靶核酸序列提供第四下游寡核苷酸序列，其包含与第四靶核酸序列互补的序列。

进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，将步骤(1)的产物与核酸聚合酶(特别优选地，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶)接触。在进一步优选的实施方案中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。在此类实施方案中，核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物，对靶核酸序列进行扩增。并且，在靶核酸的扩增过程中，核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性，诱导对杂交至靶核酸序列的媒介子探针的切割，从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。可使用各种具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶来实施本发明的方法，特别是上文所描述的那些核酸聚合酶。在本申请中，特别优选地，所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如模板依赖性DNA聚合酶)。

在本发明的某些实施方案中，下游寡核苷酸序列可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，下游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，下游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些优选的实施方案中，以对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些优选的实施方案中，以不对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用不等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些实施方案中，上游寡核苷酸序列相对于下游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。在某些实施方案中，下游寡核苷酸序列相对于上游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。

在某些优选的实施方案中，以三步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，每一轮的核酸扩增需要经过三个步骤：在第一温度下进行核酸变性，在第二温度下进行核酸退火，以及在第三温度下进行核酸延伸。在某些优选的实施方案中，以两步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，每一轮的核酸扩增需要经过两个步骤：在第一温度下进行核酸变性，以及在第二温度下进行核酸退火和延伸。适合于进行核酸变性、核酸退火和核酸延伸的温度可由本领域技术人员通过常规方法容易地确定(参见例如，Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。

在本发明的方法中，所使用的媒介子探针与靶核酸序列通常是一一对应的。换言之，针对每一种待检测的靶核酸序列，提供了一种独特的媒介子探针。然而，易于理解的是，上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列与靶核酸序列之间并不需要是一一对应的。例如，在某些情况下，所检测的样品为DNA文库，并且文库中的所有片段的一端或者两端均包含相同的接头。在此情况下，可以使用相同的上游寡核苷酸序列来进行延伸，或者，可使用相同的上游寡核苷酸序列和/或下游寡核苷酸序列来进行扩增，并进而诱导媒介子探针的切割。因此，在本发明的方法中，针对不同的靶核酸序列，可以使用相同或者不同的上游寡核苷酸序列；和/或，可以使用相同或者不同的下游寡核苷酸序列。例如，第一、第二、第三和第四上游寡核苷酸序列可以是相同或不同的。第一、第二、第三和第四下游寡核苷酸序列也可以是相同或不同的。

此外，当在步骤(2)中使用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时，还可采用HANDS策略来提高核酸扩增的效率(参见例如Nucleic Acids Research,1997,25(16):3235-3241)。例如，在某些优选的实施方案中，可在所有的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列的5'端引入一段相同的寡核苷酸序列，随后利用与所述相同的寡核苷酸序列互补的通用引物(优选地，其用量通常远远大于上游和下游寡核苷酸序列的用量)来进行扩增。

因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，所提供的所有上游寡核苷酸序列(例如，第一、第二、第三和第四上游寡核苷酸序列)和下游寡核苷酸序列(例如，第一、第二、第三和第四下游寡核苷酸序列)在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列，并且，还提供一种通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针、下游寡核苷酸序列和通用引物接触。在某些优选的实施方案中，所述相同的寡核苷酸序列的长度为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。相应地，所述通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。随后，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，将步骤(1)的产物与核酸聚合酶(特别优选地，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶)接触。在进一步优选的实施方案中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。在此类实施方案中，核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物，对靶核酸序列进行初步扩增，获得初步扩增的产物；随后，利用通用引物对初步扩增的产物进行再次扩增。并且，在整个扩增过程中，核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性，切割杂交至靶核酸序列或初步扩增的产物的媒介子探针，从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。

在本发明的某些实施方案中，通用引物可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，通用引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，通用引物不受其长度的限制，只要其能够与上游和下游寡核苷酸序列中包含的所述相同的寡核苷酸序列特异性杂交。例如，通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

关于步骤(3)和(4)

在步骤(2)中，具有5'核酸酶活性的酶对杂交至靶核酸序列的媒介子探针进行切割，释放出含有媒介子序列或其部分的媒介子片段，其随后在步骤(3)中与检测探针发生杂交。在本申请中，检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列。由此，在步骤(4)中，在核酸聚合酶的作用下，检测探针用作模板，用于延伸媒介子片段；而媒介子片段用作引物，用于起始延伸反应；并且在延伸反应结束后，媒介子片段的延伸产物与检测探针杂交在一起，形成核酸双链体。

在本发明的方法中，检测探针包含与多个媒介子序列或其部分互补的多个捕获序列(例如，与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，与第三媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列，和/或与第四媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列)。易于理解的是，各个捕获序列可以以任何顺序排列。例如，第一捕获序列可以位于第二捕获序列的上游(5'端)或下游(3'端)。例如，检测探针可以从3'至5'方向依次包含，第一捕获序列和第二捕获序列；或者，第二捕获序列和第一捕获序列。类似地，检测探针可以以任何排列顺序包含其他捕获序列(例如，第一、第二、第三、第四捕获序列)。

此外，各个捕获序列可以以任何方式排列。例如各个捕获序列可以以相邻的方式或以间隔有连接序列的方式排列。例如，第一捕获序列可以和第二捕获序列相邻排列；或者，二者之间可间隔有连接序列(在本文中也简称为“接头”)；或者，二者之间可存在重叠。类似地，检测探针可以以任何排列方式包含其他捕获序列(例如，第一、第二、第三、第四捕获序列)。

在某些情况下，以重叠的方式排列各个捕获序列是特别有利的。在此类实施方案中，可对多个媒介子序列进行设计，以使不同的媒介子序列包含重叠序列。例如，可以设计第一媒介子序列和第二媒介子序列，使得第一媒介子序列的3'末端部分具有与第二媒介子序列的5'末端部分相同的序列。相应地，在检测探针中，与第一媒介子序列互补的第一捕获序列的5'末端部分具有与第二媒介子序列互补的第二捕获序列的3'末端部分相同的序列。由此，检测探针可以以3'至5'方向包含第一捕获序列和第二捕获序列，并且二者可以以重叠的方式进行排列。在此情况下，重叠的序列即为第一和第二捕获序列共有的相同序列或其部分。通过以重叠的方式排列捕获序列，可使得检测探针在预定的长度内包含更多个捕获序列，从而可以与更多个媒介子片段杂交。换言之，通过以重叠的方式排列捕获序列，单个检测探针可以与更多个媒介子探针组合使用。

如上文所描述的，在本发明的方法中，单个检测探针与至少2个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)媒介子探针组合使用。因此，在某些优选的实施方案中，单个检测探针的用量相对于单个媒介子探针是过量的(例如，过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍)。此类实施方案在某些情况下是有利的，因为整个反应体系包含足够的检测探针与释放的媒介子片段杂交，介导媒介子片段延伸，并形成双链体。

如上文所描述的，媒介子片段可含有完整的媒介子序列或其部分。当媒介子片段包含有完整的媒介子序列时，所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列互补的序列。当媒介子片段包含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)时，所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列的部分(5'-末端部分)互补的序列，或者，与完整的媒介子序列互补的序列。在某些优选的实施方案中，所述检测探针包含与所述媒介子序列互补的序列。此类检测探针在某些情况下是特别有利的，因为其既能够与含有完整的媒介子序列的媒介子片段杂交，也能够与含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)的媒介子片段杂交。然而，应当理解的是，所述检测探针也可包含仅与媒介子片段的一部分(通常为3'-末端部分)互补的序列，只要检测探针能够与媒介子片段稳定地杂交，并起始延伸反应。

此外，除了捕获序列和模板序列之外，检测探针还可在3'端(即，在捕获序列的下游)包含额外的序列。所述额外的序列通常包含不与媒介子片段互补的序列，不参与和媒介子片段的杂交。

根据本发明，检测探针中的模板序列可以包含任何序列，并且，其位于各个捕获序列的上游(5'端)，从而可用作模板用于延伸媒介子片段。在某些优选的实施方案中，所述模板序列包含与媒介子探针(媒介子序列和靶特异性序列)不互补的序列。此类模板序列在某些情况下是特别有利的，因为其可以提高媒介子片段与检测探针的杂交特异性，避免媒介子片段杂交至不期望的位置，从而避免产生不期望的双链体。

在本发明的某些实施方案中，检测探针可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，检测探针不受其长度的限制。例如，检测探针的长度可以为15-1000nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。检测探针中的捕获序列可以是任何长度，只要其能够与媒介子片段特异性杂交。例如，检测探针中的捕获序列的长度可以为10-500nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt。检测探针中的模板序列可以是任何长度，只要其能够用作延伸媒介子片段的模板。例如，检测探针中的模板序列的长度可以为1-900nt，例如1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt。在某些优选的实施方案中，检测探针中的捕获序列的长度为10-200nt(例如，10-190nt，10-180nt，10-150nt，10-140nt，10-130nt，10-120nt，10-100nt，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)，并且，模板序列的长度为5-200nt(例如，10-190nt，10-180nt，10-150nt，10-140nt，10-130nt，10-120nt，10-100nt，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)。

在某些优选的实施方案中，检测探针具有3'-OH末端。在某些优选的实施方案中，检测探针的3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如检测探针)的3'-末端。例如，可通过对检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰，以封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在本发明的方法中，媒介子片段与检测探针杂交，并由此起始核酸聚合酶的延伸反应。虽然未被切割的媒介子探针也能够通过媒介子序列与检测探针杂交，但是媒介子探针还包含靶特异性序列，其位于媒介子序列下游并且不与检测探针杂交(即，处于游离状态)，从而核酸聚合酶不能延伸与检测探针杂交的媒介子探针。

如上文所描述的，检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。

此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。

然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。

因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。

在本发明的方法中，所述报告基团和淬灭基团可以是本领域已知的任何合适的基团或分子，其具体实例包括但不限于Cy2^TM(506),YO-PRO^TM-l(509),YOYO^TM-l(509),Calcein(517),FITC(518),FluorX^TM(519),Alexa^TM(520),Rhodamine 110(520),Oregon Green^TM500(522),Oregon Green^TM488(524),RiboGreen^TM(525),Rhodamine Green^TM(527),Rhodamine123(529),Magnesium Green^TM(531),Calcium Green^TM(533),TO-PRO^TM-l(533),TOTOl(533),JOE(548),BODIPY530/550(550),Dil(565),BODIPY TMR(568),BODIPY558/568(568),BODIPY564/570(570),Cy3^TM(570),Alexa^TM546(570),TRITC(572),MagnesiumOrange^TM(575),Phycoerythrin R&B(575),Rhodamine Phalloidin(575),CalciumOrange^TM(576),PyroninY(580),Rhodamine B(580),TAMRA(582),Rhodamine Red^TM(590),Cy3.5^TM(596),ROX(608),Calcium Crimson^TM(615),Alexa^TM594(615),Texas Red(615),Nile Red(628),YO-PRO^TM-3(631),YOYO^TM-3(631),R-phycocyanin(642),C-Phycocyanin(648),TO-PRO^TM-3(660),T0T03(660),DiD DilC(5)(665),Cy5^TM(670),Thiadicarbocyanine(671),Cy5.5(694),HEX(556),TET(536),Biosearch Blue(447),CALFluor Gold540(544),CAL Fluor Orange 560(559),CAL Fluor Red 590(591),CAL FluorRed 610(610),CAL Fluor Red 635(637),FAM(520),Fluorescein(520),Fluorescein-C3(520),Pulsar 650(566),Quasar 570(667),Quasar670(705)，和Quasar 705(610)。括号中的数字表示最大发射波长，单位为nm。

此外，报告基团和淬灭基团的各种合适配对是本领域已知的，参见例如Pesce etal.,editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971)；White etal.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,Color AND Constitution of OiganicMolecules(Academic Press,New York,1976)；Bishop,editor,Indicators(PeigamonPress,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)；Haugland,R.P.,Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals,6th Edition(Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996)；美国专利3,996,345和4,351,760。

在某些优选的实施方案中，所述报告基团为荧光基团。在此类实施方案中，报告基团发出的信号即为荧光，并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如，能够吸收所述荧光的另一荧光分子，或者能够淬灭所述荧光的淬灭剂)。在某些优选的实施方案中，所述荧光基团包括但不限于各种荧光分子，例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。在某些优选的实施方案中，所述淬灭基团包括但不限于各种淬灭剂，例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

在本发明的方法中，还可以对检测探针进行修饰，例如使其具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性。例如，可在检测探针的主链中引入抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在本发明的方法中，检测探针可以是线性的，或者可具有发夹结构。在某些优选的实施方案中，所述检测探针是线性的。在某些优选的实施方案中，所述检测探针具有发夹结构。发夹结构可以是天然的，也可以是人工引入的。此外，可使用本领域中的常规方法来构建具有发夹结构的检测探针。例如，可通过在检测探针的2个末端(5'端和3'端)添加互补的2段寡核苷酸序列，从而使得检测探针可形成发夹结构。在此类实施方案中，互补的2段寡核苷酸序列构成发夹结构的臂(茎)。发夹结构的臂可具有任何期望的长度，例如臂的长度可以是2-15nt，例如3-7nt，4-9nt，5-10nt，6-12nt。

此外，在本发明的方法中，步骤(3)中的“杂交”、“核酸杂交”以及“允许核酸杂交的条件”可如上文所定义。

使用步骤(3)的产物和核酸聚合酶来进行步骤(4)。在步骤(4)中，在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，核酸聚合酶将以检测探针为模板，对杂交至检测探针的媒介子片段进行延伸，并由此形成双链体。

如上文所详细描述的，每一种媒介子探针各自包含独特的媒介子序列，并且在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，释放出包含独特的媒介子序列或其部分的媒介子片段。随后，每一种媒介子片段杂交至检测探针的不同位置(即，与对应的媒介子序列或其部分互补的捕获序列)，被核酸聚合酶延伸，并与检测探针一起形成双链体。由此，针对每一种媒介子探针，当存在其对应的靶序列时，在步骤(4)中将产生一种独特的双链体，其包含检测探针(作为一条链)和对应于该媒介子探针的媒介子片段的延伸产物(作为另一条链)。因此，步骤(4)中所产生的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列)，因而具有彼此不同的T_m值，并在熔解曲线分析中显示出彼此不同的熔解峰。

在某些优选的实施方案中，步骤(4)中所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)。在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，其可获自各种细菌物种，例如，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcusliteralis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermusruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermusthermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。特别优选地，所述模板依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶，并且与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。在某些优选的实施方案中，步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶是不同的。

例如，在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用第一核酸聚合酶来催化上游寡核苷酸序列的延伸，并且使用具有5'核酸酶活性的酶来催化媒介子探针的切割，随后在步骤(4)中使用第二核酸聚合酶来催化媒介子片段的延伸。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用具有5'核酸酶活性的第一核酸聚合酶来催化上游寡核苷酸序列的延伸以及媒介子探针的切割，随后在步骤(4)中使用第二核酸聚合酶来催化媒介子片段的延伸。然而，特别优选地，在步骤(2)和(4)中使用相同的酶。例如，可使用具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)，在步骤(2)中催化上游寡核苷酸序列的延伸和媒介子探针的切割，并且在步骤(4)中催化媒介子片段的延伸。

在本发明的方法中，可根据需要，重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段，用于后续的步骤(即，步骤(3)-(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(3)-(5)。

在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体，用于后续的步骤(即，步骤(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(5)。

在某些优选的实施方案中，本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行：

(a)提供一种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义；

(b)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；

(c)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(d)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(e)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(f)任选地，重复步骤(c)-(e)一次或多次。

在此类实施方案中，在步骤(c)中，样品中的所有核酸分子将解离为单链状态；随后，在步骤(d)中，互补的核酸分子(例如，上游寡核苷酸序列与靶核酸序列或下游寡核苷酸序列的延伸产物，下游寡核苷酸序列与靶核酸序列或上游寡核苷酸序列的延伸产物，媒介子探针与靶核酸序列或其扩增产物，媒介子探针或因媒介子探针的切割而产生的媒介子片段与检测探针，通用引物与上游/下游寡核苷酸序列或上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物)将退火或杂交在一起，形成双链体；随后，在步骤(e)中，具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶将延伸杂交至靶核酸序列的上游/下游寡核苷酸序列，切割杂交至靶核酸序列的媒介子探针的游离5'末端，延伸杂交至检测探针的媒介子片段，延伸杂交至上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物的通用引物。由此，通过步骤(c)-(e)的循环，可实现靶核酸序列的扩增，媒介子探针的切割，以及含有检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体的形成，从而完成本发明方法的步骤(1)-(4)。

易于理解的是，核酸聚合酶不会延伸杂交至检测探针的媒介子探针，因为位于媒介子探针3'端的靶特异性序列不能与检测探针杂交，处于游离状态。此外，优选地，媒介子探针的3'端是封闭的，从而可避免媒介子探针的不期望的延伸，例如避免杂交至靶核酸序列或检测探针的媒介子探针的延伸。

步骤(c)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(c)中，在80-105℃(例如，80-85℃，85-90℃，90-95℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃，101℃，102℃，103℃，104℃，或105℃)的温度下温育步骤(b)的产物，从而使核酸变性。在某些优选的实施方案中，在步骤(c)中，温育步骤(b)的产物10s-5min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

步骤(d)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(d)中，在35-70℃(例如，35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃)的温度下温育步骤(c)的产物，从而允许核酸退火或杂交。在某些优选的实施方案中，在步骤(d)中，温育步骤(c)的产物10s-5min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

步骤(e)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(e)中，在35-85℃(例如，35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃)的温度下温育步骤(d)的产物，从而允许核酸延伸。在某些优选的实施方案中，在步骤(e)中，温育步骤(d)的产物10s-30min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。

在某些实施方案中，可在不同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在不同的温度下进行核酸的退火和延伸。在某些实施方案中，可在相同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在相同的温度下进行核酸的退火和延伸。在此情况下，可将步骤(d)和(e)合并为一个步骤。

在本发明的方法中，可重复步骤(c)-(e)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次。在某些情况下，步骤(c)-(e)的多次重复是有利的，因为其能够扩增靶核酸序列，提高检测的灵敏度。然而，易于理解的是，当重复步骤(c)-(e)一次或次时，每一个循环的步骤(c)-(e)所使用的条件不必是相同的。例如，可使用一种条件来进行前5个循环的步骤(c)-(e)，随后使用另一种条件来进行剩余循环的步骤(c)-(e)。

步骤(5)

在根据本发明方法的步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述每一种靶核酸序列是否存在于所述样品中。

如上文所论述的，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，可对步骤(4)的产物进行逐渐的升温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(4)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。

在某些实施方案中，可对步骤(4)的产物进行逐渐的降温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(4)的产物从75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)逐渐降温至45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。降温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，降温的速率可以为：每步骤降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。

随后，可对获得的曲线进行求导，从而获得步骤(4)的产物的熔解曲线。根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，可确定对应于该熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在。随后，通过媒介子片段中的媒介子序列与靶核酸序列的对应关系，可确定与所述媒介子片段对应的靶核酸序列的存在，并进而可确定与所述靶核酸序列对应的呼吸道病毒的存在。

例如，当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第一媒介子片段延伸产物的第一双链体的熔解峰时，可确定第一靶核酸序列/第一呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。类似地，当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第二媒介子片段延伸产物的第二双链体的熔解峰时，可确定第二靶核酸序列/第二呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第三媒介子片段延伸产物的第三双链体的熔解峰时，可确定第三靶核酸序列/第三呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第四媒介子片段延伸产物的第四双链体的熔解峰时，可确定第四靶核酸序列/第四呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。由此，本发明的方法通过使用一种检测探针和至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)媒介子探针，即可实现对至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)靶核酸序列/呼吸道病毒的同时检测(多重检测)。

不拘于理论限制，熔解曲线分析的分辨率或精度可达到0.5℃或更高。换言之，熔解曲线分析能够区分熔点相差仅0.5℃或更低(例如0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃)的两个熔解峰。因此，在本发明方法的某些实施方案中，任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为至少0.5℃(例如，通过设计第一媒介子序列、第二媒介子序列以及检测探针的序列)，从而所述任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)可通过熔解曲线分析来区分和辨别。然而，出于便于区分和辨别的目的，两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)的更大的熔点差异在某些情况下是优选的。因此，在本发明方法的某些实施方案中，两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为任何期望的值(例如至少0.5℃，至少1℃，至少2℃，至少3℃，至少4℃，至少5℃，至少8℃，至少10℃，至少15℃，或至少20℃)，只要所述熔点差异能够通过熔解曲线分析来区分和辨别即可。

一种或多种检测探针的同时使用

在上文描述的方法中，使用了一种检测探针即实现了对多种靶核酸序列/呼吸道病毒的多重检测。然而，易于理解的是，本发明的方法并不限于所使用的检测探针的数目。本发明的方法可以使用一种或多种检测探针(例如，至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，或更多种检测探针)。并且，基于与上述相同的原理，针对每一种检测探针可设计至少两种或更多种(例如，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种，9种，10种，11种，12种，13种，14种，15种，16种，17种，18种，19种，20种，或更多种检测探针)的媒介子探针，由此，本发明的方法能够用于同时检测多种靶核酸序列/呼吸道病毒的存在，并且本发明方法能够同时检测的靶核酸序列/呼吸道病毒的最大数目远远超过了所使用的检测探针的数目，等于针对每一种检测探针设计的媒介子探针的数目之和(即，所使用的全部媒介子探针的数目)。此外，易于理解的是，针对每一种靶核酸序列/呼吸道病毒，可以设计一种或多种媒介子探针。因此，本发明方法能够同时检测的靶核酸序列/呼吸道病毒的实际数目可以等于或小于所使用的全部媒介子探针的数目，而仍然大于所使用的检测探针的数目。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种检测n种靶核酸序列/呼吸道病毒在样品中的存在的方法，其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：

(1)针对待检测的每一种呼吸道病毒，确定至少一种特异于该呼吸道病毒的靶核酸序列；然后，针对每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；

(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；

(3)提供m种检测探针，并且在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触，其中，

m为小于n且大于0的整数，并且

每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含多种(例如至少n种)捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的每一种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，

每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，

(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；

(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定每一种靶核酸序列是否存在于所述样品中，并进而确定与每一种靶核酸序列对应的呼吸道病毒是否存在于所述样品中。

在此类实施方案的步骤(1)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列(即，包含与该靶核酸序列互补的序列的上游寡核苷酸序列)，以及与该靶核酸序列对应的媒介子探针(即，其靶特异性序列包含与该靶核酸序列互补的序列的媒介子探针)都与该靶核酸序列杂交。

进一步，在此类实施方案的步骤(2)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列以及媒介子探针都与该靶核酸序列杂交，但是所述媒介子探针中的媒介子序列处于游离状态，而不与该靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，所述媒介子探针(与该靶核酸序列对应的媒介子探针)中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来，形成与该靶核酸序列对应的媒介子片段。

进一步，在此类实施方案的步骤(3)和(4)中，当存在与某一种靶核酸序列对应的媒介子片段时，所述媒介子片段与互补的检测探针(即，含有与该媒介子片段中的媒介子序列或其部分互补的捕获序列的检测探针)杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述互补的检测探针为模板，延伸所述媒介子片段，形成与所述靶核酸序列对应的双链体。

更进一步，在此类实施方案的步骤(5)中，当检测到或未检测到与某一种靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时，确定所述靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中，并进而确定与所述靶核酸序列相对应的呼吸道病毒存在于或不存在于所述样品中。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，针对待检测的每一种呼吸道病毒，确定一种(或多种)特异于该呼吸道病毒的靶核酸序列，并且相应地，提供各自针对于一种靶核酸序列的n种(或更多种)媒介子探针；随后，在步骤(3)中，所述m种检测探针包含n种(或更多种)捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种(或更多种)媒介子探针的媒介子序列或部分互补；由此，步骤(2)中产生的任一种媒介子片段都能够与至少一种检测探针(其包含与该媒介子片段中的媒介子序列或其部分互补的捕获序列)杂交，并形成双链体，用于后续的延伸和检测。在某些示例性实施方案中，所述m种检测探针包含n种捕获序列，其分别与n种媒介子探针的媒介子序列或部分互补。

在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针彼此之间不包含相同的捕获序列。在此情况下，针对每一种媒介子探针，有且仅有一种检测探针(其包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交，并且在延伸反应后，仅产生一种双链体。随后，通过在步骤(5)中检测该双链体的存在，可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。

在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针彼此之间可以包含相同的捕获序列。在此情况下，针对每一种媒介子探针，可能存在一种或多种的检测探针(其都包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交，并且在延伸反应后，产生一种或多种的双链体。随后，通过在步骤(5)中检测所述一种或多种的双链体的存在，可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。

在此类实施方案的步骤(5)中，可通过双链体的熔点和/或检测探针中的报告基团来对双链体进行区分和辨别。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针包含相同的报告基团。在此情况下，可对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在，进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同。在此情况下，当对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，可分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线。随后，可根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在，进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。

在某些示例性实施方案中，可使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种检测探针(也即，m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数)。在某些示例性实施方案中，可使用1-10种检测探针(也即，m为1-10的整数；例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。进一步优选地，所使用的检测探针各自标记有不同的报告基团。

例如，在某些示例性实施方案中，本发明的方法可使用第一和第二检测探针，其分别标记有第一报告基团和第二报告基团。由此，在步骤(5)中，分别实时监测第一报告基团和第二报告基团的信号随温度的变化，从而获得第一熔解曲线和第二熔解曲线。随后，根据第一(或第二)熔解曲线中的熔解峰，可判断包含第一(或第二)检测探针的双链体的存在，并进而确定对应于与第一(或第二)检测探针杂交的媒介子片段的靶核酸序列的存在。

在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针；以及，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针。由此，本发明的方法可实现对多种靶核酸序列的同时检测(多重检测)，其中可检测的靶核酸序列的最大数目等于所使用的媒介子探针的数目。

例如，在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用1种检测探针和2-6种(例如2，3，4，5或6种)媒介子探针，实现了对2-6种(例如2，3，4，5或6种)呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用2种检测探针和3-12种(例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12种)媒介子探针，实现了对3-12种呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用3种检测探针和4-18种(例如5-10种)媒介子探针，实现了对4-18种(例如5-10种)呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用4种检测探针和5-24种(例如6-12种)媒介子探针，实现了对5-24种(例如6-12种)呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用5种检测探针和6-30种(例如8-15种)媒介子探针，实现了对6-30种(例如8-15种)呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用6种检测探针和7-36种(例如10-18种)媒介子探针，实现了对7-36种(例如10-18种)呼吸道病毒的同时检测。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用7种检测探针和8-42种(例如12-20种)媒介子探针，实现了对8-42种(例如12-20种，例如19种)呼吸道病毒的同时检测。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:2所示的检测探针，如SEQ ID NO:12所示的检测探针，如SEQ ID NO:20所示的检测探针，如SEQID NO:31所示的检测探针，如SEQ ID NO:40所示的检测探针，如SEQ ID NO:50所示的检测探针，如SEQ ID NO:60所示的检测探针，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的媒介子探针包含：如SEQ ID NO:5所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:8所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:11所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:15所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:16所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:19所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:23所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:26所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:27所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:30所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:34所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:36所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:39所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:43所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:46所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:49所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:53所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:56所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:59所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:63所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:66所示的媒介子探针，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：如SEQ IDNO:3所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:6所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:9所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:13所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:17所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:21所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:24所示的上游寡核苷酸，如SEQ IDNO:28所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:32所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:35所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:37所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:41所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:44所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:47所示的上游寡核苷酸，如SEQ IDNO:51所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:54所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:57所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:61所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:64所示的上游寡核苷酸，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，本发明的方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：如SEQ ID NO:4所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:7所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:10所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:14所示的下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:18所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:22所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:25所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:29所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:33所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:38所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:42所示的下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:45所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:48所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:52所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:55所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:58所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:62所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:65所示的下游寡核苷酸，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:2所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:5、8和11所示的3种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:3、6和9所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:4、7和10所示的3种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测甲型流感病毒、鼻病毒B和/或乙型呼吸道合胞病毒。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:12所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:15、16和19所示的3种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:13、9和17所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:14、10和18所示的3种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒和/或腺病毒B。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:20所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:23、26、27和30所示的4种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:21、24和28所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:22、25和29所示的3种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测博卡病毒、人偏肺病毒和/或副流感病毒III型。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:31所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:34、36和39所示的3种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:32、35和37所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:33和38所示的2种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测轮状病毒、肠道病毒和/或副流感病毒I型。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:40所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:43、46和49所示的3种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:41、44和47所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:42、45和48所示的3种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测副流感病毒II型、冠状病毒NL63和/或冠状病毒229E。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:50所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:53、56和59所示的3种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:51、54和57所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:52、55和58所示的3种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1和/或冠状病毒SARS。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：如SEQ ID NO:60所示的检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：分别如SEQ ID NO:63和66所示的2种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:61和64所示的2种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:62和65所示的2种下游寡核苷酸。此类实施方案例如可用于检测人核糖核酸酶P(用作对照)和/或副流感病毒IV型。

在某些示例性实施方案中，本发明方法所使用的检测探针包含：分别如SEQ IDNO:2、12、20、31、40、50和60所示的7种检测探针，并且，所使用的媒介子探针包含：如SEQ IDNO:5、8、11、15、16、19、23、26、27、30、34、36、39、43、46、49、53、56、59、63和66所示的21种媒介子探针。优选地，本发明方法所使用的上游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:3、6、9、13、17、21、24、28、32、35、37、41、44、47、51、54、57、61和64所示的19种上游寡核苷酸。更优选地，本发明方法还使用下游寡核苷酸，并且所使用的下游寡核苷酸包含：分别如SEQ ID NO:4、7、10、14、18、22、25、29、33、38、42、45、48、52、55、58、62和65所示的18种下游寡核苷酸。更优选地，所述方法还使用通用引物(例如，如SEQ ID NO:1所示的通用引物)。此类实施方案例如可用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒B、腺病毒B、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E，或其任何组合。

还易于理解的是，针对使用一种检测探针的方法而详细描述的各种技术特征同样可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。例如，上文针对待检测的样品、靶核酸序列、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、检测探针、允许核酸杂交的条件、允许切割媒介子探针的条件、具有5'核酸酶活性的酶、允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件、核酸聚合酶、熔解曲线分析、步骤的重复等所作的各种详细描述均可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的使用两种或更多种检测探针的方法可涉及如上文所详细描述的任一项或多项技术特征，或所述技术特征的任何组合。

例如，如上文所描述的，可根据需要，重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段，用于后续的步骤(即，步骤(3)-(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(3)-(5)。

在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体，用于后续的步骤(即，步骤(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(5)。

在某些优选的实施方案中，本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行：

(a)提供m种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义；

(b)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；

(c)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(d)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(e)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(f)任选地，重复步骤(c)-(e)一次或多次。

关于步骤(a)-(f)，其已详细描述于上文中。

任选的步骤(6)以及定量/半定量检测

本发明的方法既可用于呼吸道病毒类型的定性检测，又可用于呼吸道病毒载量的定量检测。易于理解，当某种呼吸道病毒在样品中的含量越高时，其特异性靶核酸序列的含量就越高，相应地，步骤(1)中，与所述靶核酸序列杂交的媒介子探针就越多；进而，步骤(2)中发生切割的媒介子探针也越多，释放的媒介子片段也越多；进而，步骤(3)和(4)中，与检测探针杂交的媒介子片段也越多，因延伸反应而产生的双链体也越多；进而，在步骤(5)中，能够进行溶解曲线分析的双链体也越多，所产生的信号也越强，所获得的熔解峰的高度也越高。因此，通过熔解峰的相对高度，可判断样品中的相应呼吸道病毒的含量/水平(定量或半定量检测)。因此，本发明的方法不仅可用于检测两种或更多种呼吸道病毒在样品中的存在，而且可用于检测所述两种或更多种呼吸道病毒在样品中的水平。

因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括下述步骤：

(6)根据熔解曲线分析的结果(特别是熔解曲线中的熔解峰的峰高)，确定与各个熔解峰对应的呼吸道病毒的水平。

探针组和试剂盒

在另一个方面，本发明提供了一种探针组(probe set)，其包含一种检测探针，以及至少两种的媒介子探针，其中，

所述媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与特异于一种呼吸道病毒的一种靶核酸序列或一种对照序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列或对照序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；和

所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些优选的实施方案中，所述探针组包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针。

易于理解的是，此类探针组可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于探针组中的媒介子探针和检测探针。因此，在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的媒介子探针。在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的检测探针。

在某些优选的实施方案中，所有媒介子探针各自靶向不同的靶核酸序列。在某些优选的实施方案中，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述不同的靶核酸序列各自可特异于相同或不同的呼吸道病毒。在某些优选的实施方案中，至少一条媒介子探针(或其所包含的靶特异性序列)靶向对照序列。在某些优选的实施方案中，所述对照序列为宿主特异性序列，例如人特异性序列。在某些优选的实施方案中，所述对照序列为人核糖核酸酶P的基因序列。

在某些优选的实施方案中，所述探针组包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种媒介子探针。优选地，所述媒介子探针(或其所包含的靶特异性序列)靶向2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种呼吸道病毒的特异性核酸序列。优选地，所述呼吸道病毒选自，甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒(例如鼻病毒B)、腺病毒(例如腺病毒B)、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E，或其任何组合。

在某些优选的实施方案中，所述探针组包含1种检测探针，以及2-6种(例如，2，3，4，5或6种)的媒介子探针。由此，所述探针组可用于同时检测2-6种(例如2，3，4，5或6种)呼吸道病毒。

在某些优选的实施方案中，所述探针组还包含，如上文所定义的上游寡核苷酸序列。例如，可针对每一种靶核酸序列和媒介子探针，提供一种上游寡核苷酸序列，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的上游。

在某些优选的实施方案中，所述探针组还包含，如上文所定义的下游寡核苷酸序列。例如，可针对每一种靶核酸序列和媒介子探针，提供一种下游寡核苷酸序列，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的下游。

在某些优选的实施方案中，所述探针组还包含，如上文所定义的通用引物。例如，在某些优选的实施方案中，所述的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列的5'端含有一段相同的寡核苷酸序列；由此，所述探针组可进一步包含通用引物，其具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列。

在某些优选的实施方案中，所述探针组还包含，如上文所定义的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述探针组还包含，如上文所定义的上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物。

在某些示例性实施方案中，所述探针组包含选自下列的检测探针：如SEQ ID NO:2所示的检测探针，如SEQ ID NO:12所示的检测探针，如SEQ ID NO:20所示的检测探针，如SEQ ID NO:31所示的检测探针，如SEQ ID NO:40所示的检测探针，如SEQ ID NO:50所示的检测探针，和如SEQ ID NO:60所示的检测探针。

在某些示例性实施方案中，所述探针组包含选自下列的媒介子探针：如SEQ IDNO:5所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:8所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:11所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:15所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:16所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:19所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:23所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:26所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:27所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:30所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:34所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:36所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:39所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:43所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:46所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:49所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:53所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:56所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:59所示的媒介子探针，如SEQ ID NO:63所示的媒介子探针，如SEQ IDNO:66所示的媒介子探针，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，所述探针组还包含选自下列的上游寡核苷酸：如SEQID NO:3所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:6所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:9所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:13所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:17所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:21所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:24所示的上游寡核苷酸，如SEQ IDNO:28所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:32所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:35所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:37所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:41所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:44所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:47所示的上游寡核苷酸，如SEQ IDNO:51所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:54所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:57所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:61所示的上游寡核苷酸，如SEQ ID NO:64所示的上游寡核苷酸，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，所述探针组还包含选自下列的下游寡核苷酸：如SEQID NO:4所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:7所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:10所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:14所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:18所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:22所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:25所示的下游寡核苷酸，如SEQID NO:29所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:33所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:38所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:42所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:45所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:48所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:52所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:55所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:58所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:62所示的下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:65所示的下游寡核苷酸，或其任何组合。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第一探针组)包含：如SEQ ID NO:2所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:5、8和11所示的3种媒介子探针。优选地，所述第一探针组还包含：分别如SEQ ID NO:3、6和9所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第一探针组还包含：分别如SEQ ID NO:4、7和10所示的3种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测甲型流感病毒、鼻病毒B和/或乙型呼吸道合胞病毒。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第二探针组)包含：如SEQ ID NO:12所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:15、16和19所示的3种媒介子探针。优选地，所述第二探针组还包含：分别如SEQ ID NO:13、9和17所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第二探针组还包含：分别如SEQ ID NO:14、10和18所示的3种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒和/或腺病毒B。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第三探针组)包含：如SEQ ID NO:20所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:23、26、27和30所示的4种媒介子探针。优选地，所述第三探针组还包含：分别如SEQ ID NO:21、24和28所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第三探针组还包含：分别如SEQ ID NO:22、25和29所示的3种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测博卡病毒、人偏肺病毒和/或副流感病毒III型。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第四探针组)包含：如SEQ ID NO:31所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:34、36和39所示的3种媒介子探针。优选地，所述第四探针组还包含：分别如SEQ ID NO:32、35和37所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第四探针组还包含：分别如SEQ ID NO:33和38所示的2种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测轮状病毒、肠道病毒和/或副流感病毒I型。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第五探针组)包含：如SEQ ID NO:40所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:43、46和49所示的3种媒介子探针。优选地，所述第五探针组还包含：分别如SEQ ID NO:41、44和47所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第五探针组还包含：分别如SEQ ID NO:42、45和48所示的3种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测副流感病毒II型、冠状病毒NL63和/或冠状病毒229E。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第六探针组)包含：如SEQ ID NO:50所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:53、56和59所示的3种媒介子探针。优选地，所述第六探针组还包含：分别如SEQ ID NO:51、54和57所示的3种上游寡核苷酸。更优选地，所述第六探针组还包含：分别如SEQ ID NO:52、55和58所示的3种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1和/或冠状病毒SARS。

在某些示例性实施方案中，所述探针组(为便于区分和描述，下文简称第七探针组)包含：如SEQ ID NO:60所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:63和66所示的2种媒介子探针。优选地，所述第七探针组还包含：分别如SEQ ID NO:61和64所示的2种上游寡核苷酸。更优选地，所述第七探针组还包含：分别如SEQ ID NO:62和65所示的2种下游寡核苷酸。此类探针组例如可用于检测人核糖核酸酶P(用作对照)和/或副流感病毒IV型。

在某些优选的实施方案中，本发明的探针组还包含通用引物(例如，如SEQ ID NO:1所示的通用引物)。例如，上文所描述的第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七探针组可包含如SEQ ID NO:1所示的通用引物。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含一种或多种如上文所定义的探针组。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针包含相同的报告基团。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针所包含的报告基团彼此不同。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含1-6种探针组。优选地，所述试剂盒中的所有检测探针所包含的报告基团彼此不同。进一步优选地，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同，并且，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含上文所描述的第一至第七探针组中的一种或多种，例如1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种。

本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含m种检测探针和n种媒介子探针，其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，m为小于n且大于0的整数，并且，

每一种媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与特异于一种呼吸道病毒的一种靶核酸序列或一种对照序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列或对照序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；和

每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含多种(例如至少n种)捕获序列，其分别与每一种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，

每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种检测探针(也即，m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数)。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含1-10种检测探针(也即，m为1-10的整数；例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。进一步优选地，所述检测探针各自标记有不同的报告基团。

在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针；以及，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针。由此，所述试剂盒可用于对多种靶核酸序列/呼吸道病毒进行同时检测，其中可检测的靶核酸序列/呼吸道病毒的最大数目等于所使用的媒介子探针的数目。

例如，在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含1种检测探针和2-6种(例如2，3，4，5或6种)媒介子探针，可用于对2-6种(例如2，3，4，5或6种)呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含2种检测探针和3-12种(例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12种)媒介子探针，可用于对3-12种呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含3种检测探针和4-18种(例如5-10种)媒介子探针，可用于对4-18种(例如5-10种)呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含4种检测探针和5-24种(例如6-12种)媒介子探针，可用于对5-24种(例如6-12种)呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含5种检测探针和6-30种(例如8-15种)媒介子探针，可用于对6-30种(例如8-15种)呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含6种检测探针和7-36种(例如10-18种)媒介子探针，可用于对7-36种(例如10-18种)呼吸道病毒进行同时检测。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含7种检测探针和8-42种(例如12-20种)媒介子探针，可用于对8-42种(例如12-20种，例如19种)呼吸道病毒进行同时检测。

易于理解的是，此类试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于试剂盒中的媒介子探针和检测探针。并且，此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。

例如，在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含如上文所定义的上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含，用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合。此类试剂可由本领域技术人员常规地确定，并且包括但不限于，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白(Single Strand DNA-Binding Protein，SSB)、或其任何组合。例如，用于进行逆转录的试剂包括但不限于，逆转录酶，逆转录酶的工作缓冲液，Oligo d(T)，dNTPs，不含核酸酶的水，RNase抑制剂，或其任何组合。

探针组的用途

本申请还涉及，如上文所定义的探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测所述呼吸道病毒在样品中的存在或水平，或者用于诊断受试者是否感染了所述呼吸道病毒。

易于理解的是，所述探针组或试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对呼吸道病毒、探针组、试剂盒、以及其所包含的各种组分(例如，媒介子探针、检测探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合)所详细描述的各种技术特征同样可应用于此。

本领域技术人员基于本申请所详细描述的原理，可对本发明技术方案的各种技术特征进行修饰、替换或组合，而不背离本发明的精神和范围。所有此类技术方案以及其变形都涵盖在本申请的权利要求书或其等同物的范围内。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明的方法、探针组和试剂盒能够在仅使用一种标记探针(即，检测探针)的情况下，实现对多种靶核酸序列/呼吸道病毒的同时检测(多重检测)。

(2)本发明的方法能够实现对多种靶核酸序列/呼吸道病毒的同时检测(多重检测)，并且能够同时检测靶核酸序列/呼吸道病毒的最大数目远远超出了所使用的标记探针(即，检测探针)的数目。

因此，本发明提供了一种简单、高效、低成本的多重检测法，其能够同时检测多种呼吸道病毒。本发明方法能够检测的靶核酸序列/呼吸道病毒的最大数目不受限于所使用的标记探针(即，检测探针)的数目。也即，本发明方法能够基于相对有限数目的标记探针(即，检测探针)实现对显著更多数量的靶核酸序列/呼吸道病毒的同时检测(多重检测)，这是特别有利的。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1示意性地描述了本发明方法的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。

图1A示意性地描述了使用1种检测探针和5种媒介子探针来检测5种靶核酸分子(其例如各自特异于一种呼吸道病毒)的示例性实施方案。在该实施方案中，提供一种自淬灭检测探针(其携带荧光基团和淬灭基团)，并且针对每一种靶核酸分子(T1-T5)，分别设计并提供一条上游引物(上游引物1-5)，一条下游引物(下游引物1-5)，以及一条媒介子探针(媒介子探针1-5)；其中，每一条媒介子探针各自包含一个独特的媒介子序列(媒介子序列1-5)，其能够与所述检测探针杂交。每一个媒介子序列与所述检测探针杂交的位置是独特的，但彼此可存在重叠区域。例如，如图1A所显示的，媒介子序列1在检测探针上的杂交位置与媒介子序列2存在重叠，媒介子序列4在检测探针上的杂交位置与媒介子序列5存在重叠，而媒介子序列3在检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠。在检测过程中，5种上游引物、5种下游引物、5种媒介子探针分别与各自对应的靶核酸分子杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物(上游引物1-5)的延伸导致对应的媒介子探针(媒介子探针1-5)被具有5'核酸酶活性的酶切割，从而释放出媒介子片段(媒介子片段1-5)；随后，媒介子片段1-5分别杂交至检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与检测探针一起形成了5种具有不同T_m值的双链体。由此，通过熔解曲线分析，可确定具有特定T_m值的双链体的存在，并进而可确定与该双链体对应的靶核酸分子的存在。因此，在本发明的方法中，可使用1种检测探针和5种媒介子探针实现对5种靶核酸分子(以及与之对应的5种呼吸道病毒)的检测。

图1B示意性地描述了使用2种检测探针和10种媒介子探针来检测10种靶核酸分子(T1-T10，其例如各自特异于一种呼吸道病毒)的示例性实施方案。在该实施方案中，提供两种自淬灭检测探针(第一和第二检测探针)，其各自携带不同的荧光基团(荧光基团1-2)和不同的淬灭基团(淬灭基团1-2)；并且针对每一种靶核酸分子(T1-T10)，分别设计并提供一条上游引物(上游引物1-10)，一条下游引物(下游引物1-10)，以及一条媒介子探针(媒介子探针1-10)；其中，每一条媒介子探针各自包含一个独特的媒介子序列(媒介子序列1-10)，并且媒介子序列1-5能够与第一检测探针杂交，媒介子序列6-10能够与第二检测探针杂交。每一个媒介子序列与检测探针杂交的位置是独特的，但彼此可存在重叠区域。例如，如图1B所显示的，媒介子序列1在第一检测探针上的杂交位置与媒介子序列2存在重叠，媒介子序列4在第一检测探针上的杂交位置与媒介子序列5存在重叠，媒介子序列3在第一检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠；媒介子序列6在第二检测探针上的杂交位置与媒介子序列7在重叠，媒介子序列9在第二检测探针上的杂交位置与媒介子序列10存在重叠，媒介子序列8在第二检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠。在检测过程中，10种上游引物、10种下游引物、10种媒介子探针分别与各自对应的靶核酸分子杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物(上游引物1-10)的延伸导致对应的媒介子探针(媒介子探针1-10)被具有5'核酸酶活性的酶切割，从而释放出媒介子片段(媒介子片段1-10)；随后，媒介子片段1-5分别杂交至第一检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与第一检测探针一起形成了5种具有不同T_m值的双链体。类似地，媒介子片段6-10分别杂交至第二检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生另外的5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与第二检测探针一起形成了另外5种具有不同T_m值的双链体。随后，分别利用第一和第二检测探针上的荧光基团(荧光基团1-2)进行熔解曲线分析，可确定具有特定T_m值的双链体的存在，并进而可确定与该双链体对应的靶核酸分子的存在。因此，在本发明的方法中，可使用2种检测探针和10种媒介子探针实现对10种靶核酸分子(以及与之对应的10种呼吸道病毒)的检测。

图2显示使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案，对含有乙型流感病毒的样品进行检测的结果。

图3显示使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案，对含有乙型呼吸道合胞病毒和腺病毒B的样品进行检测的结果。

图4显示使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案，对含有乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和副流感病毒III的样品进行检测的结果。

图5显示使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案，对含有19种呼吸道病毒的样品进行检测的结果。

序列信息

本申请所涉及的序列(SEQ ID NO:1-66)的信息提供于表1中。

表1：SEQ ID NO:1-66的序列信息

注：前面带有“+”的碱基为锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)修饰的碱基；并且，W、S、K、R、M、Y具有本领域公知的含义(即，W＝A或T；S＝G或C；K＝G或T；R＝A或G；M＝A或C；Y＝C或T)。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。

本申请实施例中所使用的检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸(上游引物)、下游寡核苷酸(下游引物)和通用引物的详细信息，以及它们的工作浓度和检测对象已概述于表1中。通过使用表1中提供的试剂(即，7种检测探针、21种媒介子探针、19种上游寡核苷酸(上游引物)、18种下游寡核苷酸(下游引物)和1种通用引物)，本发明的方法在只使用7种荧光探针(检测探针)的情况下，即能够对19种呼吸道病毒和1种对照序列进行同时检测(二十重检测)。所使用的荧光检测通道以及所检测的熔解峰的熔点概述于表2中。

在表1描述的各种检测探针和媒介子探针中，检测探针1和2标记有ROX和BHQ2，其荧光信号通过ROX通道进行检测；检测探针3和4标记有FAM和BHQ1，其荧光信号通过FAM通道进行检测；检测探针5和6标记有Cy5和BHQ2，其荧光信号通过Cy5通道进行检测；检测探针7标记有HEX和BHQ1，其荧光信号通过HEX通道进行检测。如SEQ ID NO:5、8和11所示的3种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针1结合，且分别用于检测甲型流感病毒、鼻病毒B和乙型呼吸道合胞病毒。如SEQ ID NO:15、16和19所示的3种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针2结合，且分别用于检测乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒和腺病毒B。分别如SEQ ID NO:23、26、27和30所示的4种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针3结合，且分别用于检测博卡病毒、人偏肺病毒和/或副流感病毒III型。分别如SEQID NO:34、36和39所示的3种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针4结合，且分别用于检测轮状病毒、肠道病毒和副流感病毒I型。分别如SEQ ID NO:43、46和49所示的3种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针5结合，且分别用于检测副流感病毒II型、冠状病毒NL63和冠状病毒229E。分别如SEQ ID NO:53、56和59所示的3种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针6结合，且分别用于检测冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1和/或冠状病毒SARS。分别如SEQ ID NO:63和66所示的2种媒介子探针中的媒介子序列各自能够与检测探针7结合，且分别用于检测人核糖核酸酶P(用作对照)和副流感病毒IV型。

表2：检测方案

实施例1.乙型流感病毒的检测

在本实施例中，使用表1中描述的试剂(7种检测探针、21种媒介子探针、19种上游引物、18种下游引物和1种通用引物)和表2中描述的检测方案，对含有乙型流感病毒的样品进行检测。

简言之，本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行实时PCR，所述PCR反应体系包括：1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH₄)₂SO₄,6.7μM EDTA和0.085mg/mL BSA)，6.0mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，2.0U的聚合酶TaqHS(Takara)，表1中描述的各种试剂(以指定的工作浓度使用)，以及5μL的乙型流感病毒cDNA和对照DNA(人RNase P基因)(二者的用量比例为约1:1)。实时PCR的反应条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和63℃，1min)。在PCR完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；40℃，2min；随后按0.4℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从40℃升温至95℃，并在此过程中采集ROX、FAM、HEX和Cy5通道的荧光信号。所使用的实验仪器为Bio-Rad CFX96实时PCR仪(Bio-Rad，美国)。检测结果如图2所示。

图2的结果显示，在ROX通道采集的荧光信号中，在73.3℃处观察到对应于乙型流感病毒的特征性熔解峰；在HEX通道采集的荧光信号中，在64.7℃处观察到对应于对照DNA的特征性熔解峰；并且，在FAM和Cy5通道采集的荧光信号中，未观察到任何熔解峰。该结果表明，所设计的检测体系可用于特异性检测乙型流感病毒，并且可准确区分乙型流感病毒与对照。

实施例2.乙型呼吸道合胞病毒和腺病毒B的检测

在本实施例中，使用表1中描述的试剂(7种检测探针、21种媒介子探针、19种上游引物、18种下游引物和1种通用引物)和表2中描述的检测方案，对含有乙型呼吸道合胞病毒和腺病毒B的样品进行检测。

简言之，本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行实时PCR，所述PCR反应体系包括：1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH₄)₂SO₄,6.7μM EDTA和0.085mg/mL BSA)，6.0mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，2.0U的聚合酶TaqHS(Takara)，表1中描述的各种试剂(以指定的工作浓度使用)，以及5μL的乙型呼吸道合胞病毒cDNA、腺病毒B的DNA和对照DNA(人RNase P基因)的混合物(三者的用量比例为约1:1:1)。实时PCR的反应条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和63℃，1min)。在PCR完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；40℃，2min；随后按0.4℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从40℃升温至95℃，并在此过程中采集ROX、FAM、HEX和Cy5通道的荧光信号。所使用的实验仪器为Bio-Rad CFX96实时PCR仪(Bio-Rad，美国)。检测结果如图3所示。

图3的结果显示，在ROX通道采集的荧光信号中，在66.8℃处观察到对应于乙型呼吸道合胞病毒的特征性熔解峰，且在85.5℃处观察到对应于腺病毒B的特征性熔解峰；在HEX通道采集的荧光信号中，在64.7℃处观察到对应于对照DNA的特征性熔解峰；并且，在FAM和Cy5通道采集的荧光信号中，未观察到任何熔解峰。该结果表明，所设计的检测体系可用于特异性检测乙型呼吸道合胞病毒和腺病毒B，并且可准确区分乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和对照。此外，根据乙型呼吸道合胞病毒和腺病毒B的特征性熔解峰的峰高，可以确定本实施例所使用的样品中乙型呼吸道合胞病毒的含量(cDNA拷贝数)接近于腺病毒B的含量(DNA拷贝数)。

实施例3.乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和副流感病毒III的检测

在本实施例中，使用表1中描述的试剂(7种检测探针、21种媒介子探针、19种上游引物、18种下游引物和1种通用引物)和表2中描述的检测方案，对含有乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和副流感病毒III的样品进行检测。

简言之，本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行实时PCR，所述PCR反应体系包括：1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH₄)₂SO₄,6.7μM EDTA和0.085mg/mL BSA)，6.0mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，2.0U的聚合酶TaqHS(Takara)，表1中描述的各种试剂(以指定的工作浓度使用)，以及5μL的乙型呼吸道合胞病毒cDNA、腺病毒B的DNA、副流感病毒III的cDNA和对照DNA(人RNase P基因)的混合物(四者的用量比例是3:1:1:3)。实时PCR的反应条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和63℃，1min)。在PCR完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；40℃，2min；随后按0.4℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从40℃升温至95℃，并在此过程中采集ROX、FAM、HEX和Cy5通道的荧光信号。所使用的实验仪器为Bio-Rad CFX96实时PCR仪(Bio-Rad，美国)。检测结果如图4所示。

图4的结果显示，在ROX通道采集的荧光信号中，在66.8℃处观察到对应于乙型呼吸道合胞病毒的特征性熔解峰，且在85.5℃处观察到对应于腺病毒B的特征性熔解峰；在FAM通道采集的荧光信号中，在70.0℃处观察到对应于副流感病毒III的特征性熔解峰，在HEX通道采集的荧光信号中，在64.7℃处观察到对应于对照DNA的特征性熔解峰；并且，在Cy5通道采集的荧光信号中，未观察到任何熔解峰。该结果表明，所设计的检测体系可用于特异性检测乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和副流感病毒III，并且可准确区分这三种病毒和对照。此外，根据乙型呼吸道合胞病毒、腺病毒B和副流感病毒III的特征性熔解峰的峰高，可以确定本实施例所使用的样品中乙型呼吸道合胞病毒的含量(cDNA拷贝数)显著高于腺病毒B的含量(DNA拷贝数)和副流感病毒III的含量(cDNA拷贝数)。

实施例4.二十重检测

在本实施例中，使用表1中描述的试剂(7种检测探针、21种媒介子探针、19种上游引物、18种下游引物和1种通用引物)和表2中描述的检测方案，对含有19种呼吸道病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒B、腺病毒B、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E)和对照DNA(人RNase P基因)的样品进行检测。

简言之，本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行实时PCR，所述PCR反应体系包括：1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH₄)₂SO₄,6.7μM EDTA和0.085mg/mL BSA)，6.0mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，2.0U的聚合酶TaqHS(Takara)，1中描述的各种试剂(以指定的工作浓度使用)，以及5μL的核酸混合物(其包含所述19种呼吸道病毒的基因组DNA(对于DNA病毒而言)或cDNA(对于RNA病毒而言)以及对照DNA(人RNase P基因))。实时PCR的反应条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和63℃，1min)。在PCR完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；40℃，2min；随后按0.4℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从40℃升温至95℃，并在此过程中采集ROX、FAM、HEX和Cy5通道的荧光信号。所使用的实验仪器为Bio-Rad CFX96实时PCR仪(Bio-Rad，美国)。检测结果如图5所示。

图5的结果显示，在ROX通道采集的荧光信号中，在56.2℃、60.8℃、66.8℃、73.3℃、78.7℃、85.5℃处，观察到分别对应于甲型流感病毒、鼻病毒B、乙型呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、腺病毒B的6个特征性熔解峰(峰1-6)；在Cy5通道采集的荧光信号中，在61.8℃、66.2℃、70.1℃、73.8℃、79.4℃、84.7℃处，观察到分别对应于副流感病毒II、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒SARS的6个特征性熔解峰(峰7-12)；在FAM通道采集的荧光信号中，在59.1℃、65.0℃、70.0℃、75.3℃、80.1℃、84.0℃处，观察到分别对应于博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒III、轮状病毒、肠道病毒、副流感病毒I的6个特征性熔解峰(峰12-18)；并且，在HEX通道采集的荧光信号中，在64.7℃和69.0℃处观察到分别对应于对照DNA和副流感病毒IV的特征性熔解峰(峰19-20)。该结果表明，所设计的检测体系可用于特异性检测所述19种呼吸道病毒，并且可准确区分这19种呼吸道病毒和对照。

这些实验结果表明，利用所设计的检测体系和试剂(特别是所设计的21条媒介子探针和7条荧光探针)，可在单次的测定中实现对20个靶序列(19种呼吸道病毒和1种对照)的同时检测和区分(即，二十重检测)。由此，本发明的方法和试剂盒可用于快速简便、灵敏特异、稳定可靠地对多种呼吸道病毒(例如，19种或更多种呼吸道病毒)进行同时检测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种检测呼吸道病毒的方法

<130> IDC170222

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用引物

<400> 1

gcaagccctc acgtagcgaa 20

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针1

<400> 2

cccggcttgt cacctgtcct agagagcgta gagcccagaa cgatttgccg gg 52

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型流感病毒上游引物

<400> 3

gcaagccctc acgtagcgaa catggartgg ctaaagacaa gacc 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型流感病毒下游引物

<400> 4

gcaagccctc acgtagcgaa agggcatttt ggakaaagcg tcta 44

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型流感病毒媒介子探针

<400> 5

ctcacacttc ttgcccagtg agcgaggact gcagcg 36

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒B上游引物

<400> 6

gcaagccctc acgtagcgaa cyagcctgcg tggc 34

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒B下游引物

<400> 7

gcaagccctc acgtagcgaa gaaacacgga cacccaaagt a 41

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒B媒介子探针

<400> 8

cctctcacac tcctccggcc cctgaatgyg gctaayc 37

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型/乙型呼吸道合胞病毒上游引物

<400> 9

gcaagccctc acgtagcgaa tgccaaggaa gcatgcaata aag 43

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型/乙型呼吸道合胞病毒下游引物

<400> 10

gcaagccctc acgtagcgaa tcaggtaata cagcaaaatc taaccaact 49

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乙型呼吸道合胞病毒媒介子探针

<400> 11

tcacacctct ctattcctta ctaaagatgt ctgatkggaa gtggtgg 47

<210> 12

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针2

<400> 12

cggcggagtg ggcacggaga gcgctggaca gtgtggaccc acgtctcgca gcaggccgcc 60

g 61

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乙型流感病毒上游引物

<400> 13

gcaagccctc acgtagcgaa gccatcggat cctcaattca ctc 43

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乙型流感病毒下游引物

<400> 14

gcaagccctc acgtagcgaa cggtgctctt gaccaaattg g 41

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乙型流感病毒媒介子探针

<400> 15

gcgctctccg tcgagcagct gaaactgcgg tgggag 36

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲型呼吸道合胞病毒媒介子探针

<400> 16

ctgtccagcg ctgctattgt gcactaaaga tatttggtgg gaagtagt 48

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 腺病毒B上游引物

<400> 17

gcaagccctc acgtagcgaa ggacaggayg cytcggagta c 41

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 腺病毒B下游引物

<400> 18

gcaagccctc acgtagcgaa aaatttgttc cccatactga agtaggt 47

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 腺病毒B媒介子探针

<400> 19

gtccacactg tctgtkgcac gggcgaactg c 31

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针3

<400> 20

aagcccaaaa aagagaacag tatcagtcac acggggctt 39

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 博卡病毒上游引物

<400> 21

gcaagccctc acgtagcgaa aaaagaaaag ggagtccaga aarag 45

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 博卡病毒下游引物

<400> 22

gcaagccctc acgtagcgaa gggtgttcct gaygatatga gc 42

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 博卡病毒媒介子探针

<400> 23

tactgttctc tttcacagra gcaggagccg cagcccga 38

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人偏肺病毒上游引物

<400> 24

gcaagccctc acgtagcgaa gcatgctata ttaaaagagt ctcagta 47

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人偏肺病毒下游引物

<400> 25

gcaagccctc acgtagcgaa cctatytcwg cagcatattt gtaatcag 48

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人偏肺病毒媒介子探针1

<400> 26

gactgatact gttcaacygc agtgacaccy tcatcattgc agcaag 46

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人偏肺病毒媒介子探针2

<400> 27

gactgatact gttcaacagc agtracaccc tcatcattgc aacaag 46

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅲ上游引物

<400> 28

gcaagccctc acgtagcgaa ggagcattgt gtcatctgtc 40

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅲ下游引物

<400> 29

gcaagccctc acgtagcgaa tgtatatccr gctgagagtg ttytg 45

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅲ媒介子探针

<400> 30

cgtgtgactg aatcgagagt samcccagtc ataacttact caacagcaac 50

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针4

<400> 31

gcgcgccagc ggacgaggct gtgcaccggt cggaggtggg ggcgcgc 47

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轮状病毒上游引物

<400> 32

gcaagccctc acgtagcgaa accatctwca crtraccctc tatgag 46

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轮状/肠道病毒下游引物

<400> 33

gcaagccctc acgtagcgaa ggtcacataa cgcccctata gc 42

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轮状病毒媒介子探针

<400> 34

cacagcctcg tagttaaaag ctaacactgt caaaaaccta aatg 44

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肠道病毒上游引物

<400> 35

gcaagccctc acgtagcgaa ccctgaatgc ggctaatcc 39

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肠道病毒媒介子探针

<400> 36

cggtgcacag tgtcgtaatg cgaaagtctg grgcggaacc 40

<210> 37

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅰ上游引物

<400> 37

gcaagccctc acgtagcgaa gtagcctmcc ttcggcacct ar 42

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅰ下游引物

<400> 38

gcaagccctc acgtagcgaa gaaaagacaa gttgtcaatg tctta 45

<210> 39

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅰ媒介子探针

<400> 39

ccacctccga ctgataggcc aaagattgtt gtcgagacwa ttccaa 46

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针5

<400> 40

gctgcaaaaa actcaacgat gtggaagtca gcagc 35

<210> 41

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅱ上游引物

<400> 41

gcaagccctc acgtagcgaa gcatttccaa tyttcaggac tatga 45

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅱ下游引物

<400> 42

gcaagccctc acgtagcgaa agttgtrgcr taatcttctt tytca 45

<210> 43

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅱ媒介子探针

<400> 43

catcgttgag ttgatggaat caatcgcaaa agctgttcag tcactgc 47

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒NL63上游引物

<400> 44

gcaagccctc acgtagcgaa attcagacaa cgttctgatg gtgtt 45

<210> 45

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒NL63下游引物

<400> 45

gcaagccctc acgtagcgaa gattacgttt gcgattacca agact 45

<210> 46

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒NL63媒介子探针

<400> 46

tccacatcgt tggttgctaa ggaaggtgct aaaactgtta atacc 45

<210> 47

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒229E上游引物

<400> 47

gcaagccctc acgtagcgaa agatggctac agtcaaatgg gct 43

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒229E下游引物

<400> 48

gcaagccctc acgtagcgaa ttacgaggta tcaccttcca aggtt 45

<210> 49

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒229E媒介子探针

<400> 49

tgacttccac aaccacaacg tggtcgtcag ggtagaatac cttaytc 47

<210> 50

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针6

<400> 50

ccggcgggga gggaccgtcg tggcaggagg agcagctcac caggccgccg g 51

<210> 51

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒OC43上游引物

<400> 51

gcaagccctc acgtagcgaa cgatgaggct attycgacta ggt 43

<210> 52

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒OC43下游引物

<400> 52

gcaagccctc acgtagcgaa atgtgcgcga agtagatctg g 41

<210> 53

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒OC43媒介子探针

<400> 53

ccacgacggt ggyacggtac tccctcaggg ttactatatt gaagg 45

<210> 54

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒HKU1上游引物

<400> 54

gcaagccctc acgtagcgaa tcctactayt caagaagcta tcc 43

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒HKU1下游引物

<400> 55

gcaagccctc acgtagcgaa gaacctggyc krctattaga agca 44

<210> 56

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒HKU1媒介子探针

<400> 56

cctcctgcca ctggtacgat tttgcctcaa ggctattatg ttgaaggctc 50

<210> 57

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒SARS上游引物

<400> 57

gcaagccctc acgtagcgaa ggtttcaaaa tgaattacca agtca 45

<210> 58

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒SARS下游引物

<400> 58

gcaagccctc acgtagcgaa aggtaggtta gtacccacag catct 45

<210> 59

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 冠状病毒SARS媒介子探针

<400> 59

cctggtgagc tcacgttcgt gcgtggattg gctttg 36

<210> 60

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测探针7

<400> 60

atcgccataa aagatagacc agagagagtc agagcggcga t 41

<210> 61

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖核酸酶P上游引物

<400> 61

gcaagccctc acgtagcgaa ggcggtgttt gcagatttg 39

<210> 62

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖核酸酶P下游引物

<400> 62

gcaagccctc acgtagcgaa gagcggctgt ctccacaagt 40

<210> 63

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖核酸酶P媒介子探针

<400> 63

ctctctctgg ttctgacctg aaggctctgc gcg 33

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅳ上游引物

<400> 64

gcaagccctc acgtagcgaa cttacaggcc acmtcaatgc ag 42

<210> 65

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅳ下游引物

<400> 65

gcaagccctc acgtagcgaa gtataatctg gcgggtctat tgcat 45

<210> 66

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒Ⅳ媒介子探针

<400> 66

tctgactctc tatgattgct gccagrgcyc cagatgc 37

Claims (68)

1.一种探针组(probe set)，其包含一种检测探针，以及至少两种的媒介子探针，其中，

所述媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与特异于一种呼吸道病毒的一种靶核酸序列或一种对照序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列或对照序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；和

所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

2.权利要求1的探针组，其中，所述探针组具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述探针组包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种媒介子探针；

(2)所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同；

(3)所有媒介子探针各自靶向不同的靶核酸序列；

(4)至少一条媒介子探针或其所包含的靶特异性序列靶向对照序列；

(5)所述呼吸道病毒选自，甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E，或其任何组合；

(6)所述探针组还包含上游寡核苷酸序列，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的上游；

(7)所述探针组还包含下游寡核苷酸序列，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的下游。

3.权利要求2的探针组，其中，所述媒介子探针或其所包含的靶特异性序列靶向2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种呼吸道病毒的特异性核酸序列。

4.权利要求2的探针组，其中，所述不同的靶核酸序列各自特异于相同或不同的呼吸道病毒。

5.权利要求2的探针组，其中，所述对照序列为宿主特异性序列。

6.权利要求2的探针组，其中，所述宿主特异性序列为人特异性序列。

7.权利要求2的探针组，其中，所述鼻病毒为鼻病毒B。

8.权利要求2的探针组，其中，所述腺病毒为腺病毒B。

9.权利要求2的探针组，其中，所述探针组针对每一种靶核酸序列和媒介子探针，提供一种上游寡核苷酸序列。

10.权利要求2的探针组，其中，所述探针组针对每一种靶核酸序列和媒介子探针，提供一种下游寡核苷酸序列。

11.权利要求2的探针组，其中，所述探针组包含所述上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列，并且所述的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列的5'端含有一段相同的寡核苷酸序列。

12.权利要求11的探针组，其中，所述探针组进一步包含通用引物，其具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列。

13.权利要求1-12任一项所述的探针组，其中，所述媒介子探针具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述媒介子探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(2)所述媒介子探针的长度为15-150nt；

(3)所述媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-140nt；

(4)所述媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt；和

(5)所述媒介子探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的；

和/或，

所述检测探针具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(2)所述检测探针的长度为15-1000nt；

(3)所述检测探针中的捕获序列的长度为10-500nt；

(4)所述检测探针中的模板序列的长度为1-900nt；

(5)所述检测探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的；

(6)所述检测探针为自淬灭探针；

(7)所述检测探针中的报告基团为荧光基团；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团；

(8)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性的抗性；

(9)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；和

(10)所述检测探针包含多种捕获序列；并且，所述多种捕获序列以相邻的方式、以间隔有连接序列的方式，或者以重叠的方式排列。

14.权利要求13的探针组，其中，所述媒介子探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或者140-150nt。

15.权利要求13的探针组，其中，所述媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，或者130-140nt。

16.权利要求13的探针组，其中，所述媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，或者130-140nt。

17.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，或者900-1000nt。

18.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针中的捕获序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，或者450-500nt。

19.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针中的模板序列的长度为1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，或者，800-900nt。

20.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。

21.权利要求20的探针组，其中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

22.权利要求13的探针组，其中，所述荧光基团选自ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar705，或其任何组合。

23.权利要求13的探针组，其中，所述淬灭基团选自DABCYL、BHQ、ECLIPSE、和TAMRA。

24.权利要求23的探针组，其中，所述BHQ为BHQ-1或者BHQ-2。

25.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针具有抵抗5'核酸酶活性的抗性。

26.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针具有抵抗5'至3'核酸外切酶活性的抗性。

27.权利要求13的探针组，其中，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰。

28.权利要求27的探针组，其中，所述修饰选自硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

29.权利要求2-12的探针组，其中，所述上游寡核苷酸序列具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述上游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(2)所述上游寡核苷酸序列的长度为15-150nt；

(3)所述上游寡核苷酸序列在与靶核酸序列杂交后，位于媒介子探针的上游远端，或位于媒介子探针的上游邻近，或与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列；和

(4)所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针；

和/或，

所述下游寡核苷酸序列具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述下游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和

(2)所述下游寡核苷酸序列的长度为15-150nt；

和/或，

所述通用引物具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述通用引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和

(2)所述通用引物的长度为8-50nt。

30.权利要求29的探针组，其中，所述通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

31.权利要求29的探针组，其中，所述上游寡核苷酸序列的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或者，140-150nt。

32.权利要求29的探针组，其中，所述下游寡核苷酸序列的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或者，140-150nt。

33.权利要求1的探针组，其中，所述探针组还包含如SEQ ID NO:1所示的通用引物。

34.权利要求1的探针组，其中，所述探针组为选自下列的探针组：

(1)第一探针组，其包含，如SEQ ID NO:2所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:5、8和11所示的3种媒介子探针；

(2)第二探针组，其包含，如SEQ ID NO:12所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:15、16和19所示的3种媒介子探针；

(3)第三探针组，其包含，如SEQ ID NO:20所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:23、26、27和30所示的4种媒介子探针；

(4)第四探针组，其包含，如SEQ ID NO:31所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:34、36和39所示的3种媒介子探针；

(5)第五探针组，其包含，如SEQ ID NO:40所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:43、46和49所示的3种媒介子探针；

(6)第六探针组，其包含，如SEQ ID NO:50所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:53、56和59所示的3种媒介子探针；

(7)第七探针组，其包含，如SEQ ID NO:60所示的检测探针，以及，分别如SEQ ID NO:63和66所示的2种媒介子探针。

35.权利要求34的探针组，其中，所述第一探针组还包含：分别如SEQ ID NO:3、6和9所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:4、7和10所示的3种下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:1所示的通用引物，或其任何组合。

36.权利要求34的探针组，其中，所述第二探针组还包含：分别如SEQ ID NO:13、9和17所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:14、10和18所示的3种下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:1所示的通用引物，或其任何组合。

37.权利要求34的探针组，其中，所述第三探针组还包含：分别如SEQ ID NO:21、24和28所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:22、25和29所示的3种下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:1所示的通用引物，或其任何组合。

38.权利要求34的探针组，其中，所述第四探针组还包含：分别如SEQ ID NO:32、35和37所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:33和38所示的2种下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:1所示的通用引物，或其任何组合。

39.权利要求34的探针组，其中，所述第五探针组还包含：分别如SEQ ID NO:41、44和47所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:42、45和48所示的3种下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:1所示的通用引物，或其任何组合。

40.权利要求34的探针组，其中，所述第六探针组还包含：分别如SEQ ID NO:51、54和57所示的3种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:52、55和58所示的3种下游寡核苷酸，如SEQ IDNO:1所示的通用引物，或其任何组合。

41.权利要求34的探针组，其中，所述第七探针组还包含：分别如SEQ ID NO:61和64所示的2种上游寡核苷酸，分别如SEQ ID NO:62和65所示的2种下游寡核苷酸，如SEQ ID NO:1所示的通用引物，或其任何组合。

42.一种试剂盒，其包含一种或多种如权利要求1-41任一项所定义的探针组。

43.权利要求42的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合。

44.权利要求42的试剂盒，其中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。

45.权利要求42的试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求34-41任一项中所定义的第一至第七探针组中的一种或多种。

46.一种试剂盒，其包含：m种检测探针和n种媒介子探针，其中，n为≥2的整数，m为小于n且大于0的整数，并且，

每一种媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与特异于一种呼吸道病毒的一种靶核酸序列或一种对照序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列或对照序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；和

每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含多种捕获序列，其分别与每一种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，

每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

47.权利要求46的试剂盒，其中，所述n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数。

48.权利要求46的试剂盒，其中，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列。

49.权利要求46的试剂盒，其中，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述试剂盒包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、8种、10种或更多种检测探针；

(2)所述试剂盒包含2种、3种、4种、5种、6种、8种、10种、15种、20种、25种、30种、35种、40种、45种或更多种媒介子探针；

(3)所述试剂盒还包含上游寡核苷酸，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的上游；

(4)所述试剂盒还包含下游寡核苷酸，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的下游；

(5)所述试剂盒还包含通用引物；

(6)所述检测探针如权利要求2-41任一项所定义；

(7)所述媒介子探针如权利要求2-41任一项所定义；和

(8)所述试剂盒还包含：具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合。

50.权利要求49的试剂盒，其中，所述上游寡核苷酸如权利要求2-41任一项所定义。

51.权利要求49的试剂盒，其中，所述下游寡核苷酸如权利要求2-41任一项所定义。

52.权利要求49的试剂盒，其中，所述通用引物如权利要求2-32任一项所定义。

53.权利要求42-52任一项所述的试剂盒，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述试剂盒中的所有媒介子探针的媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；

(2)所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

(3)所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同；

(4)所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团；

(5)所述试剂盒还包含：用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合；和

(6)所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶。

54.权利要求53的试剂盒，其中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'外切核酸酶活性的核酸聚合酶。

55.权利要求53的试剂盒，其中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。

56.权利要求53的试剂盒，其中，所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。

57.权利要求55的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌：Thermusaquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。

58.权利要求55的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

59.权利要求1-41任一项的探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测所述呼吸道病毒在样品中的存在或水平，或者用于诊断受试者是否感染了所述呼吸道病毒。

60.权利要求59的用途，其中，所述样品包含DNA，或RNA，或核酸的混合物。

61.权利要求59的用途，其中，所述靶核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶核酸序列是单链的或双链的。

62.权利要求59的用途，其中，所述样品为获自受试者的样品。

63.权利要求62的用途，其中，所述受试者的样品为鼻腔分泌物，鼻或咽拭样，肺泡灌洗液，或痰液。

64.权利要求62的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。

65.权利要求64的用途，其中所述哺乳动物为人。

66.权利要求59的用途，其中，所述呼吸道病毒选自，甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人偏肺病毒、肠道病毒、轮状病毒、博卡病毒、冠状病毒SARS、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E，和其任何组合。

67.权利要求66的用途，其中，所述鼻病毒为鼻病毒B。

68.权利要求66的用途，其中，所述腺病毒为腺病毒B。

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