CN117701557A - 基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法、探针组及试剂盒 - Google Patents

基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法、探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，所述媒介探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列的前端区域碱基上；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。本发明免去了媒介子以信号探针为模板的延伸步骤，从而显著缩短了检测的反应时间并降低了媒介探针及信号探针序列的设计难度。

Description

基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法、探针组及试剂盒
技术领域
本发明涉及基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法、探针组及试剂盒，属于核酸分子的多重检测领域。
背景技术
PCR技术作为核酸检测的一种常用方法，其操作简便，应用广泛。多重PCR其基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板对应部位，最终扩增出多条目的DNA片段。
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量的方法。检测作为荧光定量PCR被广泛应用，Taqman探针特异性地与PCR扩增的靶序列结合，可避免非特异性扩增导致的信号干扰，具有特异性高，重复性好等优点。但是，对于多重实时PCR而言，针对每一种靶序列，需使用不同的荧光基团标记相应的Taqman探针，因此，该方法在单轮/孔检测中能检测的最大靶标数目受限于实时PCR仪器的荧光通道的数目，一般不超过6个，导致该方法的检测通量较低。
熔解曲线分析(MCA)，是指在PCR扩增后通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线的步骤，以此来分析由探针与靶序列构成的双链体的熔点。MCA模式可通过荧光通道和熔解峰来识别靶序列，该模式虽然相对较为繁琐，但其在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目有所提高。
Faltin等人(Clinical Chemistry 2012,58(11):1546-1556)描述了一种基于“媒介探针”的实时PCR检测方法。该方法针对每一个靶序列设计了两种探针：媒介探针以及荧光探针；在PCR过程中，媒介探针通过靶序列特异性结合序列与靶序列结合；随后，媒介探针在DNA聚合酶的作用下发生酶切，释放出媒介子。随后，释放的媒介子结合至荧光探针中的媒介子杂交位点，并被聚合酶延伸，进而造成荧光基团与猝灭基团的分离，引起荧光强度的增加。
与Faltin等人的方法类似，US2013/0109588 A1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时荧光PCR测定方法，通过设计两条探针(PTO探针和CTO探针)来实现对靶序列的检测。当将该专利申请中描述的方法用于实施区分每个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计一条PTO探针和一条CTO探针，即使用双倍数目的探针。例如，该专利申请描述了同时检测奈瑟氏淋球菌和金黄色葡萄球菌的双重实时PCR，其中即使用了2条PTO探针和2条CTO探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单条荧光探针的传统多重PCR相比，该专利的方法更复杂，并且成本昂贵。针对每一个靶序列都需要设计一个携带靶核酸特异性结合序列的媒介探针和一个对应的、带有独特荧光信号的荧光探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时PCR相比，Faltin等人的方法需要使用双倍数目的探针。相应地，整个反应体系变得更为复杂，检测成本也变得更高。
Huang Q等人的研究(PNAS2022,119(9)e2110672119)及CN 108823287 B公开了一种可用于熔解曲线分析的实时PCR方法，该方法提供了一种发夹结构的检测探针(修饰有荧光基团和猝灭基团)，并且针对每一种靶序列，分别设计了一条媒介探针；其中，每一条媒介探针各自包含一个独特的媒介子序列，并可分别杂交至检测探针“Loop”区域的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生多种延伸产物；由于延伸产物具有不同的长度，由此可通过熔解曲线分析，并进而可确定与各个熔解峰对应的靶核酸的存在。因此，该方法可使用一种检测探针和多种媒介探针实现对多种靶核酸的检测。
总的来说，与传统实时PCR法相比，使用两条或三条探针的经改良的实时PCR方法(如Faltin等人的方法)在实施单重实时PCR时，需要使用双倍乃至三倍数目的探针，反而比传统实时PCR法更加复杂，成本更高。而改良后的多色熔解曲线检测方法(如CN 108823287B中的方法)，只需要一条通用的荧光探针及多条媒介探针就可实现对多种靶核酸的检测，但剪切后的媒介子序列与检测探针杂交后，需在核酸聚合酶作用下产生多种延伸产物，由于此“延伸”步骤(35℃下孵育10-30分钟)，导致检测时间较长，也使媒介探针及检测探针的设计更为复杂。
发明内容
本发明是提供一种探针组，在省略了媒介子序列与检测探针杂交后的延伸步骤的基础上，实现对多种靶核酸的检测。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，所述媒介探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列区域上；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；探针组内所有媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。
优选地，所述猝灭基团修饰于媒介探针第5-140位碱基上。
优选地，所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt；所述媒介子序列的长度为5-100nt。
优选地，所述信号探针为自猝灭探针，所述报告基团和猝灭基团相距大于或等于5-80nt。
本发明提供了一种试剂盒，包含上述的探针组。
优选地，试剂盒内所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；所有媒介探针所包含的媒介子序列彼此不同；所有媒介探针所包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所有媒介探针各自独立地标记有相同或不同的猝灭基团；所有信号探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。
优选地，还包含上游引物、下游引物、通用引物、核酸聚合酶、逆/反转录酶中的一项或几项的组合。
本发明提供了一种基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，采用上述探针组实现，具体包括以下步骤：针对待检测的每一种靶核酸序列，设计一种上游引物序列和一种媒介探针；将待测的n种靶核酸与上游引物和n种媒介探针进行核酸杂交，n为≥2的整数；核酸杂交完成后，上游引物延伸并对所述媒介探针进行切割，得到媒介子产物；将所述媒介子产物与m种信号探针接触并杂交后，进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中，m为≤n且＞0的整数。
进一步地，还包括将待测的n种靶核酸与上游引物、下游引物序列、通用引物和媒介探针进行核酸杂交；所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述下游引物序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述上游引物序列和下游引物序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列。
进一步地，每一种所述信号探针至少对应两种媒介探针。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)当靶标存在时，切割释放的媒介子片段可与信号探针杂交，并在熔解分析阶段产生向上的熔解峰；无检测靶标时，完整的媒介子探针与信号探针杂交，并产生向下的熔解峰。媒介探针中猝灭基团的修饰免去了媒介子以信号探针为模板的延伸步骤，从而显著缩短了检测的反应时间并降低了媒介探针及信号探针序列的设计难度。
(2)媒介子片段与信号探针杂交产物中碱基不同的错配类型、错配/缺失数量及错配/缺失位置均可导致双链体Tm值的差异，可使用一种通用的信号探针实现对多种媒介子片段的识别及Tm值的编码，因此可同时检测靶序列的最大数目远远超出了信号探针的数目。
(3)本发明的检测方法，其反应体系更为简单，具有更低的检测成本、更为快速地实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR。
附图说明
图1为本发明的原理示意图；
图2为本发明实施例1的流程示意图；
图3为本发明实施例2中分管体系下，不同荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线；其中，虚线为以TE(Tris-EDTA)缓冲液为靶标的阴性对照(NC)；图3A为FAM通道，图3B为HEX通道，图3C为ROX通道，图3D为Cy5通道；
图4为本发明实施例2中单管体系下，不同荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线；其中，虚线为以TE(Tris-EDTA)缓冲液为靶标的阴性对照(NC)；
图5为本发明实施例3中使用单管七重体系分别对单个靶核酸的检测可行性验证的熔解曲线；
图6为本发明实施例3中使用单管七重体系分别对单个靶核酸的检测灵敏度验证的熔解曲线；
图7本发明实施例3中使用单管七重检测体系对7种靶核酸同时验证的熔解曲线。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。
本发明提供了一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针；所述媒介探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列的前端区域碱基上；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。所述信号探针在与其完全互补或部分互补媒介子序列杂交的情况下发出的信号不同于信号探针与完整媒介探针杂交的情况下发出的信号。更为具体地，所述信号探针与媒介子序列杂交后发出信号；信号探针与完整媒介探针杂交后信号被媒介探针修饰的猝灭基团吸收。在本发明的部分实施例中，探针组中所有媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同。
具体地：
1、在本发明的部分实施例中，媒介探针的种类至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少12种、至少15种、至少16种、至少20种、至少25种、或至少30种；并且，各种类的媒介探针之间所修饰的猝灭基团可为相同或不同的猝灭剂。
所述媒介探针具有下列的一个或多个特征：
(1)所述媒介探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(2)所述媒介探针的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；(3)所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-140nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；
(4)所述媒介探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt；
(5)所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的前端区域碱基上修饰有信号猝灭基团，猝灭基团可修饰于媒介探针第5-140位碱基上，例如5-10位，10-20位，20-30位，30-40位，40-50位，50-60位，60-70位，70-80位，80-90位，90-100位，100-110位，110-120位，120-130位，130-140位，猝灭基团为能够吸收/猝灭所述信号的分子或基团(例如DABCYL、BHQ、ECLIPSE、TAMRA和/或MGB)；
(6)所述媒介探针3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。在某些实施方案中，可通过对媒介探针的最后一个核苷酸进行修饰，以封闭媒介探针，例如3'-C6 Spacer、3'-C3Spacer、3'-OH、3'-NH2 C7、3'-P等，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭媒介探针的3'末端。
在某些优选的实施方案中，媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)，并且，媒介子序列的长度为5-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)。
2、在本发明中，信号探针与媒介探针的媒介子序列完全互补，或存在碱基错配/缺失/缺失；并且，每一种信号探针各自独立地标记有报告基团和猝灭基团；信号探针与媒介子序列杂交后发出信号；信号探针与完整媒介探针杂交后信号被媒介探针修饰的猝灭基团吸收。
在本发明中，信号探针可与多个媒介子序列完全互补或其部分互补，例如，第一媒介子序列可与信号探针完全互补；第二媒介子序列与信号探针形成双链体中碱基错配/缺失类型为除A-T、C-G组合以外，其他任一碱基的组合，如A-A，A-C，A-G、T-T、T-C、T-G、C-C、G-G或碱基缺失形成缺口；第三媒介子序列与信号探针形成双链体中碱基错配/缺失位置位于信号探针任一碱基位置，如第1-5位、第6-10位、第11-15位、第15-25等；第四媒介子序列与信号探针形成双链体中碱基错配/缺失数量至少2个(例如3、4、5、10、15、20或更多)；在某些优选的实施方案中，媒介子序列与信号探针形成双链体可以包含以上四种杂交方式任何一种或者多种的组合。
在本发明的部分实施例中，单个信号探针与至少2个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)媒介探针组合使用。因此，在某些优选的实施方案中，单个信号探针的用量相对于单个媒介探针是过量的(例如，过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍)。
所述信号探针具有选自下列的一个或多个特征：
(1)所述信号探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；在某些优选的实施方案中，信号探针包含或者由天然的核苷酸组成。在某些优选的实施方案中，信号探针包含经修饰的核苷酸，例如N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。在某些优选的实施方案中，信号探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)等。
(2)所述信号探针的长度为5-200nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-60nt，60-80nt，80-100nt，100-150nt，150-200nt；
(3)所述信号探针3'-末端是封闭的，如3'-C6 Spacer修饰；
(4)所述信号探针为自猝灭探针，其报告基团和猝灭基团并非必须标记在信号探针的末端。例如，所述信号探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有猝灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记猝灭基团。
在某些优选的实施方案中，报告基团和猝灭基团相距5-80nt或更长的距离，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。
(5)所述报告基团和猝灭基团可以是本领域已知的任何合适的基团或分子，在某些优选的实施方案中，所述报告基团包括但不限于例如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CALGold540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590，ROX，CAL FluorRed610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705等。在某些优选的实施方案中，所述猝灭基团包括但不限于各种猝灭剂，例如DABCYL、BHQ、ECLIPSE、TAMRA和/或MGB等。
(6)所述信号探针是线性的，或者具有发夹结构。发夹结构可以是天然的，也可以是人工引入的。例如，可通过在信号探针的5'端和3'端添加互补的2段核苷酸序列，使得信号探针可形成发夹结构。发夹结构的臂不受其长度的限制，例如臂的长度可以是2-15nt，例如3-7nt，4-9nt，5-10nt，6-12nt。
在本发明中，信号探针标记有报告基团和猝灭基团，当信号探针未与其他序列杂交时，由于信号探针分子的自由卷曲或者信号探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述猝灭基团彼此接近，使得报告基团发出的信号被所述猝灭基团吸收，从而使得信号探针不发出信号。
当信号探针与媒介子片段杂交时，所述信号探针上的报告基团和淬灭基团相互分离足够的距离，使得信号探针的报告基团发出的信号不能被其上的淬灭基团吸收，从而使信号探针发出信号。虽然未被切割的媒介探针也能够通过媒介子序列与信号探针杂交，但在媒介探针中靶核酸特异性结合序列的内部修饰有猝灭基团，因此信号探针所标记的报告基团发出的信号可被媒介探针所修饰的猝灭基团吸收，从而使信号探针不发出信号。
本发明中每种靶核酸对应的媒介探针在具有5'核酸酶活性聚合酶的作用下，释放出各自的媒介子片段，并与对应的信号探针杂交形成双链体；并且，每一种双链体具有彼此不同的碱基序列，由于碱基不同的错配类型、错配/缺失数量及错配/缺失位置均可导致Tm值的差异，因此，在熔解曲线分析中，每一种双链体显示出彼此不同的熔解峰。如图1所示，在熔解分析阶段，媒介子与信号探针形成的双链DNA逐渐解离，荧光强度降低，从而产生相应向上的熔解峰；若没有靶核酸存在时，完整的媒介探针与信号探针杂交，因媒介探针上修饰有荧光猝灭基团，故荧光强度上升，从而产生向下的熔解峰。
基于上述原理，本发明提供了一种基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，采用上述探针组，具体包括以下步骤：
步骤一，将n种待测的靶核酸与上游引物、下游引物序列和媒介探针接触进行核酸杂交。其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更大的整数)。
针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游引物序列、下游引物序列和一种具有上述特征的媒介探针，并且将待测的靶核酸与所提供的上游引物和媒介探针置于同一个反应体系。所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述下游引物序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述上游引物序列和下游引物序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列。当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游引物位于所述靶核酸特异性结合序列的上游，所述下游引物序列位于所述靶核酸特异性结合序列的下游。
1、在本发明的方法中，靶核酸不受限于其序列组成或长度。例如，所述靶核酸序列可以是DNA或RNA分子。此外，待检测的靶核酸序列可以是单链的或双链的。当靶核酸序列为RNA时，优选地，可在反应体系中添加逆/反转录酶，将RNA反转录成cDNA。
2、所述上游引物序列具有选自下列的一个或多个特征：
(1)所述上游引物序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合构成；
(2)所述上游引物序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(3)所述上游引物序列在与靶核酸序列杂交后，位于媒介探针的上游远端，或位于媒介探针的上游邻近，或与媒介探针的靶核酸特异性结合序列具有部分重叠的序列；
(4)所述上游引物序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。
3、所述下游引物序列具有选自下列的一个或多个特征：
(1)所述下游引物序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(2)所述下游引物序列的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
4、作为本发明的一种优选地，在步骤一中，除了所述上游引物序列、媒介探针和下游引物序列之外，还提供一种通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游引物序列、媒介探针、下游引物序列和通用引物接触。
所述通用引物具有选自下列的一个或多个特征：
(1)所述通用引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(2)所述通用引物的长度为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
(3)在某些优选的实施方案中，通用引物包含经修饰的核苷酸，例如N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。在某些优选的实施方案中，通用引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)等。
步骤二，将步骤一的产物与具有5'核酸酶活性的聚合酶接触，进行媒介探针的切割。所述具有5'核酸酶活性的聚合酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶)；具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，其可获自各种细菌物种，例如，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles，Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermotogamaritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermotogamaritima,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum和Aquifex aeolieus等。特别优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。
在将样品与各种上游引物序列和各种媒介探针接触后，需要诱导媒介探针的切割，以释放含有媒介子序列的片段。在步骤一中，当媒介探针与靶核酸序列接触时，其所包含的靶核酸特异性结合序列与靶核酸序列杂交并形成双链结构，而媒介子序列不与靶核酸序列杂交，保持单链结构。因此，可利用具有5'核酸酶活性的聚合酶来切割这种包含双链结构和单链结构的寡核苷酸，并释放具有单链结构的片段。
在该步骤中，使用核酸聚合酶以靶核酸序列为模板催化上游引物序列的延伸，并且随后，所述具有5'核酸酶活性的聚合酶结合至上游引物序列的延伸产物，并催化媒介探针的切割。
在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游引物序列位于媒介探针的上游邻近。在此类实施方案中，上游引物序列直接诱导具有5'核酸酶活性的聚合酶切割媒介探针，而无需进行延伸反应。邻近的两条核酸序列(例如，上游引物序列和媒介探针)相距不超过30nt，例如不超过20nt，例如不超过15nt，例如不超过10nt，例如不超过5nt，例如4nt，3nt，2nt，1nt。
在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游引物序列与媒介探针的靶核酸特异性结合序列具有部分重叠的序列。在此类实施方案中，上游引物序列直接诱导具有5'核酸酶活性的聚合酶切割媒介探针，而无需进行延伸反应。所述部分重叠的序列的长度为1-10nt，例如1-3nt或1-8nt。
在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游引物序列位于媒介探针的上游远端。在此类实施方案中，上游引物被核酸聚合酶延伸，随后所产生的延伸产物诱导具有5'核酸酶活性的聚合酶切割媒介探针。因此，在此类实施方案中，两条核酸序列彼此远离，例如相距至少30nt，至少50nt，至少80nt，至少100nt或更长。
在某些优选的实施方案中，以对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用等量的上游和下游引物序列进行扩增。
在某些优选的实施方案中，以不对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用不等量的上游和下游引物序列进行扩增。在某些实施方案中，上游引物序列相对于下游引物序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。在某些实施方案中，下游引物序列相对于上游引物序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。
在某些优选的实施方案中，可采用HANDS策略来提高核酸扩增的效率，在此类实施方案中，步骤一所提供的所有上游序列和下游引物在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列，并且，还提供一种通用引物(其用量通常远远大于上游和下游引物序列的用量)，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；将所述样品与所提供的上游引物序列、媒介探针、下游引物序列和通用引物接触；核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物，对靶核酸序列进行初步扩增，获得初步扩增的产物；随后，利用通用引物对初步扩增的产物进行再次扩增。在整个扩增过程中，核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性，切割杂交至靶核酸序列或扩增产物的媒介探针，从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。
步骤三，将步骤二的产物与所述m种信号探针接触并杂交后，进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。其中，m为≤n且＞0的整数，其分别与步骤一中提供的n种媒介探针的媒介子序列完全互补，或存在碱基错配/缺失/缺失；并且，每一种信号探针各自独立地标记有报告基团和猝灭基团；信号探针与媒介子序列杂交后发出信号；信号探针与完整媒介探针杂交后信号被媒介探针修饰的猝灭基团吸收。
在本发明的部分优选实施例中，当m≥2时，所述m种信号探针各自标记有不同的报告基团，所述m种信号探针可包含相同或不同的报告基团。在进行熔解曲线分析时，可通过双链体的熔点和/或信号探针中的报告基团来对双链体进行区分。因此在某些优选的实施方案中，所述m种信号探针包含相同的报告基团，在此情况下可根据熔解曲线中的熔解峰来确定某一双链体的存在；在某些优选的实施方案中，所述m种信号探针所包含的报告基团彼此不同，在此情况下可根据报告基团的信号类型以及熔解峰来确定某一双链体的存在。
在某些实施方案中，本发明提供了一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法(n为≥2的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，使用了m种信号探针(m为≤n且>0的整数，例如，至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，或更多)。针对每一种信号探针可设计至少两种或更多种(例如，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种，9种，10种，11种，12种，13种，14种，15种，16种，17种，18种，19种，20种，或更多种信号探针)的媒介探针。
在某些实施方案中，步骤三的产物从40℃或更低温度(例如，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至70℃或更高的温度(例如，至少70℃，至少80℃，至少90℃，至少95℃)，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃，并且每步骤维持0.5-15s，例如0.5-1s，1-5s，5-10s，5-15s；或者每秒升温0.01-1℃。
在上文描述的方法中，使用了一种信号探针即实现了对多种靶核酸序列的多重检测。然而，本发明的方法并不限于所使用的信号探针的数目。
在此类实施方案的步骤一和步骤二中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游引物序列以及媒介探针都与该靶核酸序列杂交，但是所述媒介探针中的媒介子序列处于游离状态，而不与靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的聚合酶的作用下，所述媒介探针中的媒介子序列从所述媒介探针上被切割下来。
当存在与某一种靶核酸序列对应的媒介子片段时，所述媒介子片段与所述信号探针杂交，形成与所述靶核酸序列对应的双链体。在进行熔解曲线分析时，当靶核酸存在时，媒介子与信号探针形成的杂交产物逐渐解离，荧光强度降低，从而产生对应向上的熔解峰；若没有靶核酸存在时，完整的媒介探针与信号探针杂交，因媒介探针上修饰有荧光猝灭基团，故荧光强度上升，从而产生向下的熔解峰。
在本发明的方法中，可根据需要，重复进行步骤一和步骤二一次或多次，以产生更多的媒介子片段用于步骤三。因此，在某些优选的实施方案中，步骤一至三可包含下述步骤(a)-(f)方案来进行：
(a)提供一种信号探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游引物序列、一种媒介探针和一种下游引物序列；并且，任选地，提供一种通用引物；
(b)将待检测的样品与所提供的信号探针，上游引物序列，媒介探针和下游引物序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；在某些实施方案中，当检测样本为RNA，可额外添加反/逆转录酶。
(c)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物(如检测RNA，逆转录后的cDNA)；
(d)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(e)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
(f)任选地，重复步骤(c)-(e)一次或多次。
在此类实施方案中，在步骤(c)中，样品中的所有核酸分子将解离为单链状态；随后，在步骤(d)中，互补的核酸分子将退火杂交；随后，在步骤(e)中，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶将对杂交至靶核酸的引物序列进行延伸，并切割释放出媒介探针5'端的媒介子片段。由此，通过步骤(c)-(e)的循环，可实现靶核酸序列的扩增，媒介探针的切割及媒介子片段的持续产生。
在某些优选的实施方案中，步骤(c)中温育温度在80-105℃范围(例如，80-90℃，90-100℃，100-105℃)，以使核酸变性，温育时间在10s-5min范围，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min。
在某些优选的实施方案中，步骤(d)中温育温度在35-75℃范围(例如，35-45℃，45-55℃，55-65℃，65-75℃)，以使核酸退火或杂交；温育时间在10s-5min范围，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min。
在某些优选的实施方案中，步骤(e)中温育温度在35-85℃范围(例如，35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃)，以使核酸延伸。在某些优选的实施方案中，在步骤(e)中，，步骤(e)中温育时间在10s-30min范围，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。
在某些实施方案中，可在不同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在不同的温度下进行核酸的退火和延伸。在某些实施方案中，可在相同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在相同的温度下进行核酸的退火和延伸。在此情况下，可将步骤(d)和(e)合并为一个步骤。
在本发明的方法中，可重复步骤(c)-(e)至少一次，例如至少5次，至少15次，至少25次，至少35次，至少45次，或至少55次。当重复步骤(c)-(e)时，每一个循环步骤所使用的条件不必相同。例如，可使用一种条件来进行前5-10个循环，随后使用另一条件进行剩余的循环。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含至少一种上述的探针组。
其中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；所述试剂盒中的所有媒介探针所包含的媒介子序列彼此不同；所述试剂盒中的所有媒介探针所包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有信号探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含1-6种探针组。优选地，所述试剂盒中的所有信号探针所包含的报告基团彼此不同。优选地，所述试剂盒中的所有媒介探针所包含的媒介子序列彼此不同，并且，所述试剂盒中的所有媒介探针所包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同。
此类试剂盒可用于上文中本发明方法的实施。因此，上文对媒介探针和信号探针所述的各种技术特征同样可应用于所述试剂盒中。并且，此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。
例如，在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含如上文所定义的上游引物、下游引物、通用引物、核酸聚合酶、逆/反转录酶或其任何组合。此外还可包含以上试剂的工作及储存试剂，如用于进行核酸杂交及延伸的试剂等，包括但不限于，酶的工作缓冲液、dNTPs、水、离子溶液(例如Mg2+)、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。
实施例1
使用1种信号探针和5种媒介探针来检测5种靶核酸。在该实施方案中，提供一种信号探针，并且针对每一种靶核酸(T1-T5)，分别设计并提供一条上游引物(上游引物1-5)，一条下游引物(下游引物1-5)，以及一条媒介探针(媒介探针1-5)；其中，每一条媒介探针各自包含一个独特的媒介子序列(媒介子序列1-5)。媒介子1与信号探针完全互补，媒介子2、媒介子3、媒介子4，则针对信号探针在不同碱基位点引入1个突变位点，媒介子5则引入2个突变位点。切割释放的媒介子片段1-5分别与信号探针杂交，如图2所示，形成了5种具有不同Tm值的双链DNA。通过熔解曲线分析，可确定具有特定Tm值双链DNA的存在，进而可确定与其对应靶核酸的存在。
实施例2
针对FAM、HEX、ROX、Cy5修饰的信号探针，通过引入不同类型、位置及数目的碱基突变，分别设计了3种不同熔解峰的媒介子序列。
在分管体系下，记录每种荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线，其结果如图3所示，每种荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线均呈现3种特异的熔解峰。
在单管体系下，记录每种荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线，其结果如图4所示，每种荧光通道下媒介子与信号探针形成双链体的熔解曲线均呈现3种特异的熔解峰。也就是说可在单管对12种媒介子进行高效识别，虚线为以TE缓冲液为靶标的阴性对照。
实施例3
在本实施例中，利用7条媒介探针和4条荧光探针，在单管/单次测定中实现了对七种靶核酸的同时检测。在本实验中，以上呼吸道感染常见的七种病原体为示例性的待检靶序列，以构建的假病毒核酸提取产物(甲流病毒、腺病毒、乙流病毒、新型冠状病毒、合胞病毒及鼻病毒)或质粒(肺炎支原体)为待检样品。
简言之，使用25μL的PCR反应体系来进行实时PCR，所述PCR反应体系包括1×One-Step RT-PCR buffer(50mM Tris-HCl,16mM(NH4)2SO4，7μM EDTA和0.08mg/mL BSA)，5.0mMMgCl2，0.7mM dNTPs，5.0U的聚合酶Taq HS及逆/反转录酶(TaKaRa，大连)，如表1所示的引物(7条引物和1条通用扩增引物)和探针(7条媒介探针和4条荧光探针)，以及5μL的待测核酸RNA/DNA。
表1实施例1中引物及探针的序列及用量
注：带有下划线碱基为引入的突变位点
在所述的4条信号探针中，FAM-HP标记有FAM和BHQ1，HEX-HP标记有HEX和BHQ1，ROX-HP标记有ROX和BHQ2，Cy5-HP标记有Cy5和BHQ2。媒介探针IAV-MP、AdV-MP中的媒介子序列能够与信号探针FAM-HP结合，分别用于靶核酸中甲流病毒及腺病毒的检测；媒介探针IBV-MP、Covid-19-MP中的媒介子序列能够与信号探针HEX-HP结合，分别用于靶核酸中乙流病毒及新型冠状病毒的检测；媒介探针RSV-MP、RhV-MP中的媒介子序列能够与信号探针ROX-HP结合，分别用于靶核酸中合胞病毒及鼻病毒的检测；媒介探针Mp-MP能够与信号探针Cy5-HP结合，用于靶核酸中肺炎支原体的检测。上述信号探针长度均为20bp左右，无需考虑探针过长形成二级结构或非特异结合对熔解峰的影响，且切割后的媒介子无需进一步延伸，在媒介探针及信号探针设计时不用考虑碱基序列对延伸效率的影响，因此，本发明中媒介探针及信号探针序列的设计难度显著降低。
在本实验所使用的PCR反应条件如下：95℃，5min；4个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；46个循环的(95℃，20s和62℃，1min)；以及35℃，30min。在PCR完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：以0.1℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从45℃升温至98℃；随后在45℃维持2min；随后，以0.04℃/step的升温速率，将反应体系的温度从40℃升温至90℃。在MCA测定的整个过程中，采集4个检测通道(FAM、HEX、ROX、和Cy5)的荧光信号。所使用的实验仪器为Quant StudioTM5实时PCR仪(Applied Biosystems，美国)。结果如图5至图7所示。
图5显示了使用了单管七重体系分别对单个靶核酸的检测可行性验证的熔解曲线；其中，所述实时PCR反应体系包含表1所描述的1条通用引物，7对靶核酸特异引物、7条媒介探针、4条信号探针。图5A表示FAM检测通道，甲流病毒对应的熔解曲线；图5B表示FAM检测通道，腺病毒对应的熔解曲线；图5C表示HEX检测通道，乙流病毒对应的熔解曲线；图5D表示HEX检测通道，新型冠状病毒对应的熔解曲线；图5E表示ROX检测通道，合胞病毒对应的熔解曲线；图5F表示ROX检测通道，鼻病毒对应的熔解曲线；图5G表示Cy5检测通道，肺炎支原体对应的熔解曲线；图5H为以TE缓冲液为模板的实验结果。结果显示，七种靶核酸对应的熔解曲线均有特异的熔解峰出现，表明该体系可实现分别对单个靶核酸进行检测。
图6显示了使用单管七重体系分别对单个靶核酸的检测灵敏度验证的熔解曲线；图6A表示FAM检测通道，不同梯度浓度下甲流病毒对应的熔解曲线；图6B表示FAM检测通道，不同梯度浓度下腺病毒对应的熔解曲线；图6C表示HEX检测通道，不同梯度浓度下乙流病毒对应的熔解曲线；图6D表示HEX检测通道，不同梯度浓度下新型冠状病毒对应的熔解曲线；图6E表示ROX检测通道，不同梯度浓度下合胞病毒对应的熔解曲线；图6F表示ROX检测通道，不同梯度浓度下鼻病毒对应的熔解曲线；图6G表示Cy6检测通道，不同梯度浓度下肺炎支原体对应的熔解曲线。图中实线分别表示以靶核酸浓度104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应、10拷贝/反应、1拷贝/反应为模板的实验结果；虚线表示以TE缓冲液为模板的实验结果。
图6结果表明，该检测体系对甲流病毒的检测下限为50拷贝/反应，对腺病毒的检测下限为50拷贝/反应，对乙流病毒的检测下限为5拷贝/反应，对新型冠状病毒的检测下限为50拷贝/反应，对合胞病毒的检测下限为50拷贝/反应，对鼻病毒的检测下限为50拷贝/反应，对肺炎支原体的检测下限为5拷贝/反应。
图7显示了使用单管七重检测体系对7种靶核酸同时验证的熔解曲线；图7A表示FAM检测通道，甲流病毒及腺病毒的熔解曲线，其中甲流病毒特征峰位于60.0℃，腺病毒特征峰位于66.7℃；图7B表示HEX检测通道，乙流病毒及新型冠状病毒的熔解曲线，其中乙流病毒特征峰位于67.6℃，新型冠状病毒特征峰位于52.5℃；图7C表示ROX检测通道，合胞病毒及鼻病毒的熔解曲线，其中合胞病毒特征峰位于61.6℃，鼻病毒特征峰位于68.2℃；图7D表示Cy5检测通道，肺炎支原体的熔解曲线，其特征峰位于61.8℃。图中实线表示以靶核酸浓度103拷贝/反应为模板的实验结果；虚线表示以TE缓冲液为模板的实验结果。
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在申请待批的本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，其特征在于：所述媒介探针从5 '至3 '方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列区域；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。
2.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述猝灭基团修饰于媒介探针第5-140位碱基上。
3.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：探针组内所有所述媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt；所述媒介子序列的长度为5-100nt。
4.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述信号探针为自猝灭探针，所述报告基团和猝灭基团相距大于或等于5-80nt。
5.一种试剂盒，其特征在于：包含至少一种权利要求1-4任意一项所述的探针组。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；所有媒介探针所包含的媒介子序列彼此不同；所有媒介探针所包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所有媒介探针各自独立地标记有相同或不同的猝灭基团；所有信号探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：还包含上游引物、下游引物、通用引物、核酸聚合酶、逆/反转录酶中的一项或几项的组合。
8.一种基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于，采用权利要求1至4任意一项所述探针组实现，具体包括以下步骤：
针对待检测的每一种靶核酸序列，设计一种上游引物序列和一种媒介探针；
将待测的n种靶核酸与上游引物和n种媒介探针进行核酸杂交，n为≥2的整数；
核酸杂交完成后，上游引物延伸并对所述媒介探针进行切割，得到媒介子产物；
将所述媒介子产物与m种信号探针接触并杂交后，进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中，m为≤n且＞0的整数。
9.根据权利要求8所述基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于：还包括将待测的n种靶核酸与上游引物、下游引物序列、通用引物和媒介探针进行核酸杂交；所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述下游引物序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述上游引物序列和下游引物序列在5 '端具有一段相同的寡核苷酸序列。
10.根据权利要求8所述基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于：每一种所述信号探针至少对应两种媒介探针。
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