CN106591442B - 用于y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及染色体微缺失的引物组合和试剂盒，本发明利用多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳技术检测7个与Y染色体微缺失密切相关的STS位点来判断Y染色体的微缺失情况。本发明选取特异性及灵敏性高的7个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY160)作为检测位点，并同时利用ZFX/Y、SRY这2个位点作为质控位点，分别针对每个位点设计引物，9个位点经复合扩增后的产物直接置于琼脂糖凝胶上进行电泳检测。利用本发明的引物和检测体系，只需单管扩增反应就可对Y染色体微缺失进行检测。

Description

用于Y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及Y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒。
背景技术
据估计，大约15％的育龄夫妇丧失生育能力，而男性因素约占50％。男性不育的原因主要在于男方生精障碍，表现为严重少精(小于2×106/ml～5×106/ml)或无精子，而临床不育的男性中大约有20％是由遗传性、非梗阻性的无精症或少精症引起的，这些患者大多染色体核型检测正常。在已知的导致男性不育的遗传学因素中，Y染色体微缺失是继克氏综合症后的第二大遗传因素。
1976年，Tiepolo等人在对1千多例男性不育患者的染色体核型分析中，发现多个原发性无精子症患者的Y染色体长臂存在染色体断裂的现象，据此提出Y染色体长臂可能存在与精子发生相关的基因，于是将其命名为无精子因子(azoospermia factor，AZF)。1996年，Vogt将AZF基因定位于Y染色体长臂远端的第5、6区，并将AZF划分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区域，这3区染色体上的基因分别主导精子形成过程中的不同阶段，AZFa区主导精母细胞的增生；AZFb区缺失可导致生殖细胞成熟障碍；AZFc区缺失可造成无精子症，也可造成极度少精症。据研究统计，在所有的Y染色体微缺失中，AZFc缺失最常见(80％)，其后依次是AZFa(0.5-4％)和AZFb(1-5％)。
通过对无精子症或少精子症患者进行缺失筛查，可以指导临床诊断及治疗措施的选择，从而避免不必要的治疗。另外，单精子胞浆内注射技术(intracytoplasmic sperminjection,ICSI)使许多少精症甚至是无精症患者可以生育下一代，但这种技术也可能将生殖缺陷人为地传给后代，导致子代男性生殖力下降或不育，通过术前筛查可以避免这种传递并指导ICSI后代的生育。总之，Y染色体微缺失与男性不育关系密切，Y染色体微缺失的检测具有很重要的意义。
原则上，AZF各亚区内仅检测一个非多态性STS位点就足以说明该亚区是否存在位点缺失，但考虑到PCR扩增可能受多个因素的影响而导致假阴性的结果出现，而微缺失通常涵盖一个以上的STS位点，故每个亚区内选取2个STS位点进行检测更能提高诊断的准确性，所以普遍认为每个AZF亚区应至少检测2个STS位点。Simoni等人在3次大规模的室间质控实验基础上提出最小检测体系应包括sY84、sY86(AZFa)；sY127、sY134(AZFb)；sY254、sY255(AZFc)等6个STS位点(见图1)。经过多个实验室的研究证实，这6个STS位点被采用的频率最高，且检测结果重复性好，能检测出AZF3个亚区内超过90％的缺失。2013年，EAA和EMQN发表修订版的Y染色体微缺失分子诊断指导意见，指出利用以上6个STS位点来检测AZF区域缺失的方法(一般为2个多重PCR反应，每个反应分别检测不同区域的3个STS位点)能有效地对Y染色体微缺失进行准确诊断，而增加或包含更多STS位点的新检测方法并不能提高检测的灵敏度，甚至会增加对结果解释的复杂性，所以并不推荐增加更多的STS位点。另外，EAA/EQMN指南还建议若sY254和sY255位点发生缺失后则应继续检测sY160位点(异染色质Marker)，看是否为末端缺失(sY160缺失)，对于末端缺失的患者建议进一步做核型分析，因为末端缺失通常与嵌合体核型(46,XY/45,X)有关。
建立简便、快速、准确的Y染色体微缺失检测的方法和体系已成为近年来研究Y染色体微缺失领域的一大热点，但这一工作并不容易，主要原因可能有以下3点：1.由于目标STS位点区域散布多个SNP位点，导致设计扩增STS位点的引物非常困难，如有设计不当将可能出现等位基因丢失(Allele dropout)的现象；2.由于引物之间的相互干扰，要建立一个能同时检测多个STS位点的多重扩增体系也是非常困难；3.多个STS位点和2个质控位点的扩增产物要能在后续的琼脂糖凝胶电泳检测中能区分出来必须保证每个位点的扩增产物其片段大小要有一定的差距(20-50bp)，这种限制大大增加了引物设计的难度。
目前市面上此类产品主要分为2大类：
1.单管扩增反应，采用毛细管电泳检测扩增产物。采用毛细管电泳技术进行检测，除了引物需要标记荧光外还需昂贵的设备(如测序仪)，故检测成本较高，检测过程复杂，检测时间也较长。由于需要昂贵的仪器，也不易于推广。
2.2个扩增反应，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。2个扩增反应不仅增加了工作量和分析难度，也增加了由于样本混淆或其它原因导致的交叉污染几率。
我们经过长时间的努力，在引物上巧妙设计，在扩增体系上精心优化，最终开发出一个不仅结果准确可靠，而且经济简便并易于普及的Y染色体微缺失检测体系。
发明内容
本发明提供了Y染色体微缺失的检测引物、检测体系和试剂盒。本发明利用用于扩增7个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY160)和2个质控位点(ZFX/Y、SRY)的引物，通过多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳技术，检测上述7个与Y染色体微缺失密切相关的STS位点，从而判断Y染色体的微缺失情况。利用本发明的引物和检测体系，只需单管扩增反应就可同时对7个STS位点进行检测。
根据本发明的一个方面，提供Y染色体微缺失检测的引物组合物，包括：
用于扩增Y染色体AZFa区sY84位点的引物对，其碱基序列为：
sY84-F：GCTGATAGTCCTGGTTTCCCTA
sY84-R：CGTGCAGATTAAGGGAATTTGC；
用于扩增Y染色体AZFa区sY86位点的引物对，其碱基序列为：
sY86-F：CAGAGACTTGGTAATGGCTTCC
sY86-R：GCATCTACAACCCAAGGAGA；
用于扩增Y染色体AZFb区sY127位点的引物对，其碱基序列为：
sY127-F：AAGATAGCACCCACTGGAATCT
sY127-R：TATGCTCATGGCTACACAGACA；
用于扩增Y染色体AZFb区sY134位点的引物对，其碱基序列为：
sY134-F：AGAGGAATAGTACAGGTCAAAGGA
sY134-R：TCATGAGTACCACCCAAGACA；
用于扩增Y染色体AZFc区sY254位点的引物对，其碱基序列为：
sY254-F：ATGTGGGCCCTGTTACAAAC
sY254-R：CACACCAGTTCGATTCGTGA；
用于扩增Y染色体AZFc区sY255位点的引物对，其碱基序列为：
sY255-F：TGGATTCCGCCAGACGTT
sY255-R：TAGTTGTCCCCGATCTTCTATGA；
用于扩增Y染色体异染色质区sY160位点的引物对，其碱基序列为：
sY160-F：GGAATGGAAGGGAATGTAGTGT
sY160-R：GAATCCATTCGAGTACATTCCA；
用于扩增Y染色体短臂SRY位点的引物对，其碱基序列为：
SRY-F：ACAGCGATGATTACAGTCCA
SRY-R：AACCTGTTGTCCAGTTGCA；
和用于扩增ZFX/Y位点的引物对，其碱基序列为：
ZFX/Y-F：AACCATCCYGAACACCTTGC
ZFX/Y-R：ATGTCACACTTGAATGGCATCT。
在一些实施方案中，引物中的兼并碱基Y是C或T。
在一些实施方案中，引物ZFX/Y-F中的简并碱基Y是C。
在一些实施方案中，引物ZFX/Y-F是简并碱基Y为C的序列和简并碱基Y为T的序列的混合物。在另一些实施方案中，引物ZFX/Y-F是简并碱基Y为C的序列和简并碱基Y为T的序列的混合物，且两种序列的质量比为1：1。
本发明的引物组合物中的各对引物的Tm值都在(60+3)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差20-50bp以上，不会相互作用产生非特异产物或二聚体，在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。
在优选的实施方案中，各引物对的质量比例为下表1所示：
表1：引物质量比例
引物对名称 比例
sY84 12
sY86 10
sY127 18
sY134 12
sY254 4
sY255 5
sY160 6
SRY 10
ZFX/Y 10
本发明的引物组合物中的各对引物以表1比例混合时，各引物对的扩增效率(电泳图中各位点条带亮度)基本一致。
根据本发明的另一个方面，提供用于Y染色体微缺失检测的扩增反应体系，所述反应体系包含上述任一种引物组合物、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
在优选的实施方案中，所述反应体系的体积为10μl-50μl。
根据本发明的另一个方面，提供Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包含上述任一种引物组合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明。
在优选的实施方案中，所述试剂盒中还进一步包含聚合酶、PCR反应缓冲液或其一种或多种组分、dNTP。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
根据本发明的另一个方面，提供Y染色体扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备扩增反应液，其中包含上述任一种引物组合物、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA；
(2)进行PCR扩增，扩增程序是：在95℃变性5-15分钟；然后进行30-35个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后57-61℃退火30-60秒，然后70-72℃延伸30-60秒；最后在60-72℃延伸10-30分钟。
其中模板DNA为样品的基因组DNA。
在优选的实施方案中，所述扩增反应液的体积为10μl-50μl。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
在优选的实施方案中，步骤(2)的扩增程序是：95℃变性15分钟；然后进行35个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后60℃退火30秒，然后72℃延伸30秒；最后℃72延伸10分钟。
根据本发明的另一个方面，提供Y染色体微缺失检测方法，包括以下步骤：
(1)制备扩增反应液，其中包含上述任一种引物组合物、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA；
(2)进行PCR扩增，扩增程序是：在95℃变性5-15分钟；然后进行30-35个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后57-61℃退火30-60秒，然后70-72℃延伸30-60秒；最后在60-72℃延伸10-30分钟。
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
其中模板DNA为样品的基因组DNA。
如果位点对应的位置无单一条带(琼脂糖凝胶电泳)出现，则说明模板DNA在该位点缺失。
在优选的实施方案中，所述扩增反应液的体积为10μl-50μl。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
在优选的实施方案中，步骤(2)的扩增程序是：95℃变性15分钟；然后进行34个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后57℃退火90秒，然后72℃延伸1分钟；最后℃72延伸10分钟。
根据本发明的另一个方面，提供上述任一种引物组合物或扩增反应体系在制备用于检测Y染色体微缺失的试剂中的应用。
本发明所述的热启动Taq酶是指通过对Taq酶进行修饰，使Taq酶的活性在低温下被抑制并在高温下被激活，使用热启动Taq酶可以提高PCR扩增特异性。
本发明的优势在于：
1.经济简便，检测时间短，易于普及。由于采用的是单管扩增反应和琼脂糖凝胶电泳技术，操作起来非常简便，4-5小时就可以完成整个检测。另外，由于引物无需标记荧光，大大节约了检测成本，加上无需昂贵、复杂的设备，无论大医院还是小医院或是其它检测机构均可开展。
2.结果判读直观而准确。由于选用EAA和EMQN推荐且大家公认的STS位点和质控位点(ZFX/Y、SRY)，同时经巧妙设计将各位点的扩增产物大小按区域和名称依次有序分布，不仅确保了结果的准确性而且非常容易判读。
3.增加了异染色质区域的sY160位点，可直接用于末端缺失判断，有助于预后评估和进一步的遗传咨询。
附图说明
图1是7个STS位点和SRY、ZFX/ZFY位点在Y染色体上的分布示意图。
图2是2例Y染色体微缺失阳性样本和1例正常男性样本的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
本文使用的术语“Y染色体微缺失”是指Y染色体上基因的小片段缺失。在本发明中，Y染色体微缺失主要是无精子因子(azoospermia factor，AZF)区的缺失，AZF区的不同程度的缺失可导致无精子或少精子症。
本文使用的术语“无精子因子(azoospermia factor，AZF)”是指引起无精症的基因，位于Y染色体长臂上。通常，AZF被划分为AZFa、AZFb和AZFc三个区域，其中AZFa位于Y染色体长臂远端第5区内，AZFb位于Y染色体长臂远端第5-6区，AZFc邻近异染色质区，如图1所示。AZF基因的缺失会导致少精或无精。
本发明使用的术语“STS”是指序列标签位点(sequence-tagged site)，是指染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一份拷贝的DNA段片段，一般长200-500bp，可以用PCR方法加以验证。本发明中，通过对STS的PCR扩增可以检测Y染色体上AZF区的缺失。本发明中使用的STS位点sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255和sY160以及质控位点ZFX/Y和SRY均是本领域已知的STS位点，但本发明通过对引物的选择，使得可以在一次扩增反应中同时扩增这些STS位点，快速实现Y染色体微缺失的检测。
本文使用的术语“引物”是能够指与靶核酸序列(例如本文中所述的STS位点)杂交以在合适的条件下引发引物延伸产物合成的短的线性寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以是一条或多条。本文使用的术语“引物对”表示一组或一对引物，包括与靶核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(也可被称为“正向引物”或“上游引物”，可以用简写“F”表示)，以及与靶序列的3'末端杂交的3'反义引物(也可被称为“反向”或“下游”，可以用简写“R”表示)。本文使用的术语“引物组合物”是指多个不同引物或多个不同引物对的混合物，用于在一个扩增反应中同时扩增靶序列上的不同位点。
本文使用的术语“扩增”是指增加样品中靶核酸序列拷贝数的体外方法，扩增反应通常由允许连续变性、退火和引物延伸循环的多轮重复温度循环组成。典型的扩增反应是PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。通常，PCR反应涉及一系列重复20-35次的热循环，所述循环包括变性步骤、引物退火步骤和延伸/延长步骤。PCR反应常常以5-100μ1的反应体积在小反应管中于热循环仪中进行。变性步骤在大约94℃-95℃的温度使核酸能够完全变性，这一步骤产生单链DNA。引物退火步骤通常在比引物-靶序列DNA双链体的解链温度低大约5℃的温度下进行，在这一步骤中，寡核苷酸引物特异性结合于单链靶序列。延伸步骤在约72℃进行，但这依赖于所用的DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶的最佳条件为72℃，在这一步中，DNA聚合酶通过从5'到3'方向上添加dNTP的引物延伸来合成与靶链互补的新DNA链。
聚合酶是扩增体系的重要组分，本文使用的术语“聚合酶”是指能从核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸合成核酸链(例如RNA或DNA)的酶。本发明的“聚合酶”优选地是DNA聚合酶，包括但不限于Taq酶。多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara的LA Taq和HS Taq、KAPA的HiFi Taq、Life的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性。本发明所使用的聚合酶优选为热启动聚合酶，更优选为热启动Taq酶。本文使用的术语“热启动聚合酶”是指这样的聚合酶，它的酶活性在非许可温度(例如大约25℃至大约45℃)下受到抑制而在与PCR反应相匹配的温度(例如，大约55℃至大约95℃)下被激活或“热诱导”。例如，Relia热启动酶是通过化学修饰的方法封闭酶的活性中心，低温下化学小分子和酶活性中心结合，酶无活性，当温度升高至大约95℃，两者脱离，酶活性中心暴露，开始指导体系扩增。热启动聚合酶(例如热启动Taq酶)可以极大地提高扩增的特异性和灵敏度。热启动聚合酶是本领域众所周知的，可以从市场上购买获得。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
1、引物组合的设计
根据7个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY160)和2个质控位点(ZFX/Y、SRY)设计引物，引物序列如表2所示。
表2：引物序列
Figure BDA0001168946070000081
Figure BDA0001168946070000091
其中引物ZFX/Y-F中的简并碱基Y是C或T。
2、PCR扩增体系及条件的建立
2.1样本和Taq酶
使用一正常男性基因组DNA作为模板，使用热启动Taq酶作为DNA聚合酶。
2.2反应体积的选择
分别采用10μl、25μl和50μl体系进行了复合扩增和电泳，3个不同体系的扩增产物其9个位点在电泳图中的条带无明显差别，结果(未显示)表明这3种不同的体系效果相当。
2.3反应程序的优化
退火及延伸温度：考察了退火温度从55℃到63℃之间各温度下扩增产物其9个位点在电泳图中的条带分布情况，结果显示在57-61℃范围内扩增产物其9个位点在电泳结果中均有明亮的目的条带出现且无非特异性条带出现。在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表3)的扩增均可以得到较好的结果(即扩增产物其9个位点在电泳结果中均有明亮的目的条带出现且无非特异性条带出现)：
表3：温度与时间
温度 时间
95℃(变性) 5-15min
57-61℃(退火) 30-60s
70-72℃(延伸) 30-60s
60-72℃(最后延伸) 10-30min
扩增循环数：考察而来循环数在30至35之间各循环数下的扩增产物其9个位点在电泳图中的条带分布情况，结果显示在30-35范围内扩增产物其9个位点在电泳结果中均有明亮的目的条带出现且无非特异性条带出现。
3、实验验证
在以下实施例中，采用本发明的9重复合扩增体系(序列见表2)分别对2例Y染色体微缺失阳性样本(编号分别为A和B)和1例正常男性样本进行检测。
3.1DNA提取
采用QIAGEN公司的FlexiGene DNA Kit对上述3例样本进行DNA提取，作为模板DNA，具体操作按说明书进行。
3.2PCR反应
将9对普通引物(引物序列见表2)分别溶解并配成浓度为10μM的工作液，然后后按表4体积比配成引物混合液(Primer mix)：
表4：各引物体积比
Figure BDA0001168946070000101
Figure BDA0001168946070000111
其中使用的引物ZFX/Y-F中简并碱基Y是C。
将各反应试剂(ddH2O、2×GoldStar Taq Master Mix、Primer Mix)振荡混合后按表5体积比(模板除外)配成PCR反应混合液，分装23μl于PCR反应管中，最后往各反应管分别加入每种模板DNA各2μl(另外准备对照管，其中加入超纯水作为空白对照)，离心后进入下一步。
表5 PCR体系
Figure BDA0001168946070000112
备注：2×GoldStar Taq Master Mix购于北京康为世纪生物科技有限公司，由GoldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成。
3.3 PCR反应程序
将PCR反应管置于扩增仪(ABI 2720循环扩增仪)上，运行如下程序：
第1步：95℃变性15分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火30秒，第4步：72℃延伸30秒，重复2至4步34次，最后72℃延伸10分钟。运行结束置于冰箱4℃保存。
3.4琼脂糖凝胶电泳检测(仪器：六一牌DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪)
预先配制2.5％的琼脂糖凝胶，取上一步得到的PCR扩增产物10μl点样于凝胶上，电压100v条件下进行电泳，180min后置于凝胶成像仪上观察结果并拍照保存。
3.5结果判读
空白对照无任何条带出现(如图2)。
正常男性样本出现9个单一明亮的条带(1个位点对应一个条带，如图2)。
Y染色体微缺失阳性样本除ZFX/Y和SRY位点外，其它7个STS位点均有可能存在缺失(即位点对应的位置无目的条带，一般是同属于一个AZF亚区的2个位点同时存在缺失)。
阳性样本A的sY127、sY134、sY254、sY255位点存在缺失，缺失类型为AZFbc，同时该样本的sY160位点缺失，说明末端也存在缺失(如图2)。阳性样本B的sY254、sY255位点存在缺失，缺失类型为AZFc，而末端未见缺失(sY160位点未缺失，如图2)。
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Figure BDA0001168946070000131
Figure BDA0001168946070000141
Figure BDA0001168946070000151
Figure BDA0001168946070000161
Figure BDA0001168946070000171
Figure BDA0001168946070000181
Figure BDA0001168946070000191
SEQUENCE LISTING
<110> 北京圣谷智汇医学检验所有限公司
<120> 用于Y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒
<130> 2016
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgatagtc ctggtttccc ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtgcagatt aagggaattt gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagagacttg gtaatggctt cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcatctacaa cccaaggaga 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagatagcac ccactggaat ct 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tatgctcatg gctacacaga ca 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agaggaatag tacaggtcaa agga 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcatgagtac cacccaagac a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgtgggccc tgttacaaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cacaccagtt cgattcgtga 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tggattccgc cagacgtt 18
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tagttgtccc cgatcttcta tga 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaatggaag ggaatgtagt gt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaatccattc gagtacattc ca 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acagcgatga ttacagtcca 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacctgttgt ccagttgca 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> Y是C或T
<400> 17
aaccatccyg aacaccttgc 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atgtcacact tgaatggcat ct 22

Claims (9)

1.Y染色体微缺失检测的引物组合物，包括：
用于扩增Y染色体AZFa区sY84位点的引物对，其碱基序列为：
sY84-F：GCTGATAGTCCTGGTTTCCCTA
sY84-R：CGTGCAGATTAAGGGAATTTGC；
用于扩增Y染色体AZFa区sY86位点的引物对，其碱基序列为：
sY86-F：CAGAGACTTGGTAATGGCTTCC
sY86-R：GCATCTACAACCCAAGGAGA；
用于扩增Y染色体AZFb区sY127位点的引物对，其碱基序列为：
sY127-F：AAGATAGCACCCACTGGAATCT
sY127-R：TATGCTCATGGCTACACAGACA；
用于扩增Y染色体AZFb区sY134位点的引物对，其碱基序列为：
sY134-F：AGAGGAATAGTACAGGTCAAAGGA
sY134-R：TCATGAGTACCACCCAAGACA；
用于扩增Y染色体AZFc区sY254位点的引物对，其碱基序列为：
sY254-F：ATGTGGGCCCTGTTACAAAC
sY254-R：CACACCAGTTCGATTCGTGA；
用于扩增Y染色体AZFc区sY255位点的引物对，其碱基序列为：
sY255-F：TGGATTCCGCCAGACGTT
sY255-R：TAGTTGTCCCCGATCTTCTATGA；
用于扩增Y染色体异染色质区sY160位点的引物对，其碱基序列为：
sY160-F：GGAATGGAAGGGAATGTAGTGT
sY160-R：GAATCCATTCGAGTACATTCCA；
用于扩增Y染色体短臂SRY位点的引物对，其碱基序列为：
SRY-F：ACAGCGATGATTACAGTCCA
SRY-R：AACCTGTTGTCCAGTTGCA；
和用于扩增ZFX/Y位点的引物对，其碱基序列为：
ZFX/Y-F：AACCATCCYGAACACCTTGC
ZFX/Y-R：ATGTCACACTTGAATGGCATCT；
其中引物ZFX/Y-F中的简并碱基Y是C和/或T。
2.根据权利要求1的引物组合物，其中各引物对的质量比例为
sY84:sY86:sY127:sY134:sY254:sY255:sY166:SRY:ZFX/Y＝12:10:18:12:4:5:6:10:10。
3.根据权利要求1或2的引物组合物，其中引物ZFX/Y-F中的简并碱基Y是C。
4.根据权利要求1或2的引物组合物，其中引物ZFX/Y-F是简并碱基Y为C的序列和简并碱基Y为T的序列的混合物。
5.用于Y染色体微缺失检测的扩增反应体系，所述反应体系包含权利要求1-4任一项的引物组合物、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。
6.根据权利要求5的扩增反应体系，其中所述聚合酶是热启动Taq酶。
7.根据权利要求5的扩增反应体系，其中所述反应体系的体积为10μl-50μl。
8.Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项的引物组合物或权利要求5-7任一项的扩增反应体系。
9.权利要求1-4任一项的引物组合物或权利要求5-7任一项的扩增反应体系在制备用于检测Y染色体微缺失的试剂中的应用。
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