WO2023241228A1 - 一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用，包括如下步骤：S1、根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；S2、分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列GC-add和AT-add，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3'末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配；S3、配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS-PCR扩增反应；S4、扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。本发明中通过调整GC-add或AT-add序列的长度和在引物中的嵌入位置来平衡ASP1和ASP2的扩增效率，从而成功消除杂合基因型样品检测中的不均一扩增现象。
Description
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用。
等位基因多态性(Allelic Polymorphism，AP)广泛存在于各物种基因组中并与各种性状相关联，因此AP分型检测被广泛用于遗传疾病诊断，药物开发，作物育种及纯度鉴定等领域。等位基因特异扩增PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)是用于AP分型的主要技术手段，通过设计三条引物，其中两条等基因特异引物(Allele Specific Primer，ASP)仅在3＇末端碱基存在差异(分别和对应的多态性位点互补)，共用一条等位基因通用反向引物(Locus Specific Primer，LSP)，在同一反应体系中进行PCR反应产生在AP位点存在差异的两种产物，通过鉴别这两种产物是否存在以完成样品的AP分型鉴定。使用基于荧光信号的AS-PCR进行AP分型检测具有准确，快速，高通量，低成本，无污染，设备要求低及易操作的优势。通常来说，荧光信号的产生主要有两种方式：
一种方式是荧光探针法，目前已有多种类型的荧光探针用于AS-PCR产物检测，大部分都是基于荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理，即在产物之前使探针的荧光基团和猝灭基团靠近而处于猝灭状态，产物出现之后通过探针和产物结合或者被水解的方式，导致荧光基团和猝灭基团分离，从而产生荧光信号。另一种方式是荧光染料法，荧光染料如SybrGreenI可以特异性的和双链DNA结合而产生荧光，将其添加在反应体系中，每次循环后检测荧光信号强度即可实时监控PCR反应的进程。
荧光染料法的成本虽然低于荧光探针法，但由于荧光染料和双链DNA是无
差别结合，当反应体系中存在不同的双链DNA的时候，因此仅通过实时荧光信号无法在反应中对产物进行区分。由于荧光染料具有和双链DNA特异结合并发光而未结合时不产生荧光信号这一特性，在PCR反应结束后对反应体系进行升温处理，在升温至接近变性温度的过程中，双链DNA产物会逐步变性解离为单链，该过程中荧光染料同时逐渐解离而出现荧光信号逐渐减弱的现象，以这一过程中的荧光强度为Y轴，温度为X轴作图，即可获得该双链DNA的熔解曲线(Melting Curve，MC)，以及将这一过程中荧光强度和温度的单阶导数的相反数为Y轴，温度为X轴作图获得该双链DNA的导数熔解曲线(Derivative Melting Curves，DMC)，从DMC中可以获得一半双链DNA解离时的温度即熔解温度Tm(melting temperature,Tm)、熔解峰数量、位置和峰高等信息。不同双链DNA的DMC形态，Tm及熔解峰数量位置等均有差异，因此通过熔解曲线分析即可区分不同的双链DNA。K.M.Ririe等(Product differentiation by analysis ofDNA melting curves during the polymerase chain reaction.Analytical Biochemistry.1997；245(2):154-60.)以SybrGreenI为荧光染料使用熔解曲线分析用于鉴别PCR产物，证实相同长度不同GC含量，相同GC含量不同长度，以及同长度同GC含量但不同GC分布的双链DNA均可以通过熔解曲线进行分辨。
熔解曲线分析可用于AP分型鉴定，但当等位基因之间差异极小时，例如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)或者数个碱基插入缺失多态性(Insertion-Deletion，InDel)，等位基因特异扩增产物间熔解温度差异(ΔTm)极小。由于SybrGreenI在高浓度下会抑制PCR反应，因此只能在低浓度下使用，导致该染料无法结合在双链DNA的所有位置，在熔链升温的过程中从低熔点区域脱离的染料会重新结合在高熔点区域中尚未结合荧光染料的部分，即发生染料重排导致微量的荧光信号强度变化无法被检测到，或者含有多态性位点的区
域未结合荧光染料导致该区域在解离前后荧光强度无变化。这可能会导致在纯合突变体分型鉴定中两种突变体的ΔTm过小而无法区分，或者在杂合突变体的分型鉴定中只产生一种熔解峰而导致被误判为纯合材料。虽然染料重排现象可以通过在PCR反应之后加入高浓度的SybrGreenI染料进行熔解曲线分析加以解决，但这会导致操作步骤增加且因为开盖而造成气溶胶污染。
高分辨率熔解曲线(High-resolutionMelting Curve，HRM)可以在单一封闭容器内通过熔解曲线分析完成微小差异等位基因分型，即双链DNA解离过程中温度增速低于0.1℃/秒，搜集数据点至少10个/℃。HRM测定可以使用荧光探针替代SybrGreenI，例如利用鸟嘌呤核苷酸能够猝灭荧光基团的特点，使用荧光基团标记的引物对目标DNA进行PCR扩增，获得带有荧光标记的DNA产物并进行HRM分析(C.N.Gundry et al.Amplicon melting analysis with labeled primers:a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes.Clinical Chemistry.2003；49(3):396-406.)；或者相对于需要特异设计且合成成本较高的荧光探针，使用其他荧光染料替代SybrGreenI进行HRM分析。
C.T.Wittwer等(High-Resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen.Clinical Chemistry.2003；49(6):853-60.)使用荧光染料LCGreen进行高分辨率熔解曲线分析，该染料在高浓度下不会抑制PCR反应，因此在熔解曲线测定过程中不会发生染料重排，从而实现在单一封闭容器中完成HRM测定。在基因分型工作中，同样的样品HRM获得的Tm值差异更大，并成功鉴定杂合样品。尽管HRM的分辨率较高，但不同基因型PCR产物GC含量差异极小时，如SNP样品中的G/C和A/T两种基因型，不一定能够取得较好的分型效果或者需要人工干预加以判断，如能在HRM基础上进一步增大多态性扩增产物之间的Tm值差异，则更有利于进行分型结果的准确判定，尤其是减少人为干预以实现
高通量自动化判定。
S.Germer等(Single-tube genotyping without oligonucleotide probes.Genome Research,1999,9(1):72-78.)建立的Tm-shift genotyping技术是通过在一条ASP的5＇末端添加一段富含GC的序列来增大两种扩增产物间的ΔTm以完成基因分型。J.Wang等(High-throughput SNP genotyping by single-tube PCR with Tm-shift primers.Biotechniques.2005；39(6):885-93.)建立的Tm-shift SNPAdvanced技术则是通过在两条ASP的5＇末端分别添加一段不同长度的富含GC的序列来增大两种扩增产物间的ΔTm以完成基因分型。这两种技术虽然可以使用熔解曲线完成SNP分型，但仍存在一些缺陷：(1)杂合基因型样品的两个熔解峰差异过大，即存在不均一扩增现象；(2)Tm-shift SNPAdvanced本意通过两条ASP均添加富含GC的序列以消除不均一扩增，但在部分靶标基因SNP位点分型检测中该现象依然存在，并且两条ASP均添加富含GC的序列造成ΔTm偏低，杂合基因型的两个熔解峰距离较近而形成连续熔解峰，不利于判读；(3)上述检测对象未涉及熔解曲线差异较小A/T和G/C多态性位点测试。
有鉴于此，有必要提供一种用于基因多态性分型的鉴定方法来解决上述技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用。通过调整GC-add或AT-add序列的长度和在引物中的嵌入位置来平衡ASP1和ASP2的扩增效率，从而成功消除杂合基因型样品检测中的不均一扩增现象。
本发明的一个目的在于提供一种用于基因多态性分型的鉴定方法。
一种用于基因多态性分型的鉴定方法，包括如下步骤：
S1、根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；
S2、分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3＇末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配；
S3、配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS-PCR扩增反应；
S4、扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。
进一步地，步骤S1中，所述特异性引物ASP1和ASP2位于所述多态性位点的上游或位于所述多态性位点的下游。
进一步地，步骤S2中，所述额外序列插入的位置距离所述特异性引物的3＇末端最短距离为10个碱基，最远可位于所述特异性引物的5＇末端。
进一步地，步骤S2中，所述额外序列选自GC-add或AT-add中的一种。
更进一步地，所述GC-add添加在所述特异性引物ASP1中，所述AT-add添加在所述特异性引物ASP2中。
更进一步地，所述GC-add和所述AT-add分别在所述特异性引物ASP1和ASP2上的插入位点和3＇末端碱基的距离相同或不同。
更进一步地，所述GC-add和所述AT-add的长度相同或不同。
更进一步地，所述GC-add和所述AT-add至少由如下物质中的一种组成：
1)核苷酸碱基；
2)核苷酸碱基类似物；
3)化学修饰的核苷酸碱基。
更进一步地，所述GC-add的长度为3～40bp，并且所述GC-add中的鸟嘌
呤碱基(G)和胞嘧啶碱基(C)所占比例不少于60％。
更进一步地，所述AT-add的长度为3～40bp，并且所述AT-add中的腺嘌呤碱基(A)和胸腺嘧啶碱基(T)所占比例不少于60％。
进一步地，步骤S3中，所述PCR反应体系包括两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2、一条通用反向引物LSP、缓冲体系、DNA聚合酶、dNTPs、待检测样品DNA以及荧光染料。
更进一步地，所述荧光染料包括可以和双链DNA特异结合或嵌入结合并产生荧光信号的荧光染料。
更进一步地，所述待检测样品DNA包括双链DNA、单链DNA、线性DNA、环状DNA以及由RNA转录获得的cDNA。
进一步地，步骤S4中，所述熔解曲线分析分析过程中，用于双链DNA解链的升温过程中升温速率不低于1.5℃/分钟。
进一步地，所述AS-PCR扩增反应可在单管中进行，并且所述单管中可以同时进行两个以上靶基因的分型检测。
进一步地，所述基因多态性分型的鉴定为复等位基因多态性分型的鉴定。
更进一步地，所述复等位基因多态性分型的鉴定过程中，AS-PCR扩增反应可在单管中进行，通过单管反应依次检测复等位基因中的单个多态性位点或通过单管反应同时检测复等位基因中的多个多态性位点，从而完成复等位基因多态性分型的鉴定。
本发明的另一个目的在于提供一种用于基因多态性分型的鉴定系统。
一种用于基因多态性分型的鉴定系统，包括如下模块：
信息获取模块：根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向
引物LSP；
引物设计模块：分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3＇末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配，即可得到用于基因多态性分型的引物；
PCR扩增反应模块：配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS-PCR扩增反应；
分析模块：扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。
更进一步地，所述引物设计模块还包括引物相关参数优化模块，所述引物相关参数优化模块用于对引物在模板上的位置、引物长度、退火温度、GC含量、GC-add和AT-add选择、GC-add和AT-add在引物上的插入位点进行优化。
本发明中的用于基因多态性分型的鉴定方法的原理如下：在ASP设计过程中，在一条ASP(ASP1)的内部或5＇末端嵌入GC-add，在另一条ASP(ASP2)的内部或5＇末端嵌入AT-add，即通过增加GC或者AT含量来分别提高和降低两种扩增子的Tm，增大二者的ΔTm，并通过调整GC-add或AT-add序列的长度和在引物中的嵌入位置来平衡两个ASP的扩增效率。GC-add和AT-add位于引物5＇末端时即作为引物的尾端序列参与PCR反应被引入对应的扩增子；GC-add和AT-add位于引物内部时，引物与模板退火形成DNA泡状结构(DNA-bubble)参与PCR反应，使GC-add和AT-add被引入对应的扩增子。GC-add和AT-add的引入导致对应的扩增子的整体GC含量分别增高和降低，二者的GC含量差异明显大于对应的靶序列。在熔解曲线测定过程中，当ASP未添加GC-add和AT-add时，ASP1和ASP2对应的扩增产物的解链方式和ΔTm几乎没有区别(图3a和图3d)。当GC-add或AT-add位于引物5＇末端时，GC-add产物的解链从对应的另
一端起始(图3b)，而AT-add产物的解链则从产物两端同时起始(图3e)，解链速度快于GC-add产物，相比未添加GC-add或AT-add的PCR产物(图3a和图3d)产生较大ΔTm。当GC-add(图3c)或AT-add(图3f)位于引物内部时，虽然GC-add产物和AT-add产物均是从两头开始解链，但GC-add区段的解链仍然晚于AT-add区，且GC-add产物的Tm值显著高于GC-add位于5＇末端时的Tm值(图3b)，AT-add产物的Tm值低于AT-add位于5＇末端时的Tm值(图3e)，因此两种PCR产物的ΔTm比GC-add或AT-add位于引物5＇末端时更大，更易区分，通过熔解曲线分析即可完成两种基因型的PCR产物的鉴定，达到高效实现基因多态性分型鉴定的目的。
本发明的还提供一种用于基因多态性分型的引物。
一种用于基因多态性分型的引物，由上述所述的引物设计模块设计得到。
本发明又提供了一种用于基因多态性分型的检测试剂盒。
一种用于基因多态性分型的检测试剂盒，包括上述所述的用于基因多态性分型的鉴定方法中的PCR反应体系。
本发明最后提供了一种用于基因多态性分型的鉴定方法在等位基因多态性分型检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明通过在两条ASP分别添加富含GC的序列(GC-add)以及富含AT碱基的序列(AT-add)，增大两种扩增产物的ΔTm，即使对于A/T多态性位点的杂合基因型样品也能形成分离较好的两个熔解峰；
2)本发明中富含GC碱基的序列(GC-add)以及富含AT碱基的序列(AT-add)的添加位置不局限于ASP的5＇末端，而是可以嵌入ASP内部，可以进一步加大ΔTm，提高检测的精度；
3)本发明通过调整GC-add或AT-add序列的长度和在引物中的嵌入位置来平衡两个ASP的扩增效率，成功消除杂合基因型样品检测中的不均一扩增现象。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明用于等位基因多态性分型检测原理流程图(GC-add和AT-add位于ASP 5＇末端)，以多态性位点为C/T，等位基因特异性引物ASP位于多态性位点上游，荧光染料为Super EvaGreen并在反应起始阶段加入为例进行说明；其中，图(A)为反应体系组成图，包括SNP Allele1和SNP Allele2的目标DNA(多态性位点以C/T为例)，两条同向引物ASP1，ASP2(5＇末端分别带有GC-add和AT-add)，一条通用反向引物LSP以及和双链DNA特异性结合的荧光染料Super EvaGreen(反应前未结合双链DNA而处于猝灭状态)；图(B)为初始几轮PCR反应示意图，其中，ASP1、ASP2分别和LSP配对扩增含有相应多态性位点的目标DNA(a，b，e)，若ASP和SNP位点不匹配，延伸反应无法进行(c，d)，ASP1和ASP25＇末端的GC-add和AT-add序列被引入对应的扩增子(f，g)；图(C)为多轮PCR反应示意图，其中，ASP1、ASP2分别和LSP配对，以图(B)f和g中的产物为模板，扩增产生大量含有GC-add和AT-add序列的PCR产物，荧光染料和PCR产物结合产生荧光信号；图(D)为PCR产物熔解曲线测定示意图，随着反应体系温度的逐渐升高，双链DNA解离，含有GC-add和AT-add序列的产物会产生不同的解离方式，GC-add产物的解链从对应的另一端起始，而AT-add产物的解链则从产物两端同时起始，随着双链DNA解离，荧
光染料被释放成为游离状态而导致荧光猝灭。
图2为本发明用于等位基因多态性分型检测原理流程图(GC-add和AT-add位于ASP内部)，以多态性位点为C/T，等位基因特异性引物ASP位于多态性位点上游，荧光染料为Super EvaGreen并在反应起始阶段加入为例进行说明；其中，图(A)为反应体系组成图，SNP Allele1和SNP Allele2的目标DNA(多态性位点以C/T为例)，两条同向引物ASP1，ASP2(内部分别嵌入GC-add和AT-add)，一条通用反向引物LSP以及和双链DNA特异性结合的荧光染料Super EvaGreen(反应前未结合双链DNA而处于猝灭状态)；图(B)为初始几轮PCR反应示意图，其中，ASP1、ASP2分别和LSP配对扩增含有相应多态性位点的目标DNA(a，b，e)，若引物和SNP位点不匹配，延伸反应无法进行(c，d)，ASP1和ASP2内的GC-add和AT-add序列被引入对应的扩增子(f，g)；图(C)为多轮PCR反应示意图，其中，ASP1、ASP2分别和LSP配对，以图2(B)f和g中的产物为模板，扩增产生大量含有GC-add和AT-add序列的PCR产物，荧光染料和PCR产物结合产生荧光信号；图(D)为PCR产物熔解曲线测定示意图，随着反应体系温度的逐渐升高，双链DNA解离，含有GC-add和AT-add序列的产物会的解链方式存在差异，二者均是从两头解链，但GC-add区段的解链仍然晚于AT-add区段，随着双链DNA解离，荧光染料被释放成为游离状态而导致荧光猝灭。
图3为本发明水稻靶基因1(OsTarget1)的单核苷酸多态性位点1(SNP Allele1)和单核苷酸多态性位点2(SNP Allele 2)的靶标序列和扩增序列熔解图；其中，图a为SNP Allele1的靶标序列(SEQ ID NO:66)熔解图；图b为GC-add1位于5＇末端的SNP Allele1的扩增产物(SEQ ID NO:82)熔解图；图c为GC-add1位于引物内部的SNP Allele1的扩增产物(SEQ ID NO:84)熔解图；图d为SNP Allele2的靶
标序列(SEQ ID NO:67)熔解图；图e为AT-add1位于5＇末端的SNP Allele2的扩增产物(SEQ ID NO:83)熔解图；图f为AT-add1位于引物内部的SNP Allele2的扩增产物(SEQ ID NO:85)熔解图；熔解图由uMelt Map软件分析绘制(https://www.dna-utah.org/umelt/quartz/map.php)。
图4为本发明实施例1中水稻靶基因(OsTarget1)AS-PCR产物熔解曲线图；图a中ASP未添加GC-add和AT-add；图b中GC-add和AT-add位于引物5＇末端；图c中GC-add和AT-add位于引物内部，均距离ASP 3＇末端9个碱基；图d中GC-add和AT-add位于引物内部，均距离ASP 3＇末端10个碱基；图e中GC-add和AT-add位于引物内部，均距离ASP 3＇末端14个碱基；图f中GC-add和AT-add位于引物内部，均距离ASP 3＇末端17个碱基；图g中GC-add和AT-add序列等长，位于引物内部，均距离ASP 3＇末端14个碱基。
图5为本发明实施例2中水稻靶基因(OsTarget2)AS-PCR产物熔解曲线图；图a中ASP未添加GC-add和AT-add；图b中GC-add和AT-add位于引物5＇末端；图c中GC-add距离ASP1 3＇末端17个碱基，AT-add距离ASP2 3＇末端19个碱基；图d中GC-add距离ASP1 3＇末端17个碱基，AT-add距离ASP2 3＇末端20个碱基；图e中GC-add和AT-add序列等长，分别距离ASP1 3＇末端17个碱基，ASP2 3＇末端19个碱基；图f中GC-add和AT-add序列等长，分别距离ASP1 3＇末端19个碱基，ASP2 3＇末端20个碱基。
图6为本发明实施例3中水稻靶基因(OsTarget1)AS-PCR大量群体样品熔解曲线分型检测结果，GC-add和AT-add均距离ASP 3＇末端17个碱基；图a为各基因型单个样品结果展示，图b为大量样品测试结果。
图7为本发明实施例4中水稻靶基因(OsTarget2)AS-PCR大量群体样品熔解曲线分型检测结果，GC-add距离ASP1 3＇末端19个碱基，AT-add距离ASP2
3＇末端20个碱基；图a为各基因型单个样品结果展示，图b为大量样品测试结果。
图8为本发明实施例5中单管反应同时对两个靶基因(水稻靶基因1(OsTarget1)、水稻靶基因2(OsTarget2))进行熔解曲线分型检测结果；图a为亲本1，图b亲本2，图c为杂交一代材料，图d为阴性对照(No-Template Control，NTC)。
图9为本发明实施例6中单管反应同时对三个靶基因(水稻靶基因1(OsTarget1)、水稻靶基因2(OsTarget2)和水稻靶基因3(OsTarget3))进行熔解曲线分型检测结果；图a为亲本1，图b为亲本2，图c为杂交一代材料，图d为NTC。
图10为本发明实施例7中“单重检测”对Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体进行分型鉴定结果；其中，图a:Wx-a纯合体各位点单重检测熔解曲线图，图b:Wx-in纯合体各位点单重检测熔解曲线图，图c:Wx-a/Wx-in杂合体各位点单重检测熔解曲线图，图d:NTC各位点单重检测熔解曲线图。
图11为本发明实施例7中“二重+二重+单重检测”对Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体进行分型鉴定结果；其中，第1行:Wx-a纯合体，第2行:Wx-in纯合体，第3行:Wx-a/Wx-in杂合体，第4行:NTC；第1列:Int1-1&Ex4-53位点双重检测，第2列:Ex6-62&Ex10-115位点双重检测，第3列:Ex4-77位点单重检测。
图12为本发明实施例7中“二重+三重检测”对Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体进行分型鉴定结果；其中，第1行:Wx-a纯合体，第2行:Wx-in纯合体，第3行:Wx-a/Wx-in杂合体，第4行:NTC；第1列:Ex4-53&Ex6-62位点双重检测，第2列:Int1-1&Ex4-77&Ex10-115位点三重检测。
图13为本发明实施例7中“单重检测”对Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体进行分型鉴定结果；其中，图a:Wx-op纯合体各位点单重检测熔解曲线图，图b:Wx-mq纯合体各位点单重检测熔解曲线图，图c:Wx-op/Wx-mq杂合体各位点单重检测熔解曲线图，图d:NTC各位点单重检测熔解曲线图。
图14为本发明实施例7中“二重+二重+单重检测”对Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体进行分型鉴定结果；其中，第1行:Wx-op纯合体，第2行:Wx-mq纯合体，第3行:Wx-op/Wx-mq杂合体，第4行:NTC；第1列:Int1-1&Ex4-77位点双重检测，第2列:Ex6-62&Ex10-115位点双重检测，第3列:Ex4-53位点单重检测。
图15为本发明实施例7中“二重+三重检测”对Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体进行分型鉴定结果；其中，第1行:Wx-op纯合体，第2行:Wx-mq纯合体，第3行:Wx-op/Wx-mq杂合体，第4行:NTC；第1列:Ex4-53&Ex6-62位点双重检测，第2列:Int1-1&Ex4-77&Ex10-115位点三重检测。
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中使用AS-PCR进行SNP分型检测(以SNP位点为C/T，ASP位于多态性位点上游，荧光染料为Super EvaGreen并在反应起始阶段加入为例进行说明)的原理如下：
如图1(GC-add和AT-add位于ASP 5＇末端)和图2(GC-add和AT-add
位于ASP内部)所示，熔解曲线测定在ABI公司的7900HT实时荧光定量PCR仪上完成，熔解曲线分析由软件SDS2.4.1完成。PCR反应通过三条常规引物进行，两条同向引物ASP1，ASP2分别用于区分C和T多态性位点，ASP1和ASP2的5＇末端分别带有不同的和目标扩增区段不匹配的尾端序列GC-add和AT-add,3＇部分和目标扩增区段完全匹配，仅在末端碱基因存在不同，末端碱基只有在和SNP位点碱基完全匹配时才能起始延伸反应。ASP1和ASP2共用同一条反向引物LSP，分别完成对含有不同SNP位点的靶标序列的扩增，通过PCR扩增引物上的GC-add和AT-add分别被引入对应的PCR产物。反应体系中包含荧光染料Super EvaGreen，该染料特异性的和双链DNA结合，在未和双链DNA结合时处于猝灭状态。随着PCR反应的进行，大量分别带有GC-add和AT-add的扩增产物出现，Super EvaGreen结合至PCR产物上而产生荧光。PCR反应结束后，开始进行熔解曲线测定，首先对体系进行0.025℃/秒的升温处理直至PCR产物完全变性。此时DNA双链逐渐解离程单链形式，结合于PCR产物上的Super EvaGreen被释放成为游离状态而导致荧光猝灭，荧光信号逐渐变弱，记录PCR产物变性过程中的荧光强度。由于两种产物分别带有GC-add和AT-add，GC含量存在明显差异且解链方式存在不同，Tm存在明显差异。最后绘制导数熔解曲线图，两种PCR产物会在各自的Tm温度下形成熔解峰，根据熔解峰的存在情况即可判断检测样品是杂合体或何种纯合体。
本发明所使用的常规试剂和设备，如无特殊说明，均可市售获得。
下面的实施例中将分别以水稻基因SNP分型检测、水稻复等位基因分型检测为例进行说明，但本发明中的引物和检测体系不仅仅只是用于水稻基因SNP分型检测、水稻复等位基因分型检测，还可以用于其他物种等位基因多态性分型的鉴定以及复等位基因分型检测。
本发明引物ASP的命名规则如下：
无GC-add或AT-add的ASP的命名：靶基因名+ASP及序号；例如OsTarget1ASP1表示靶基因OsTarget1的等位基因特异引物1。
带有GC-add或AT-add的ASP的命名：靶基因名+ASP及序号+添加序列长度+插入序列类型+添加位置+和3＇末端的距离(若添加位点位于ASP内部)，例如OsTarget1ASP1-10GC5＇表示在靶基因OsTarget1的等位基因特异引物1的5’末端添加10碱基长度的GC-add；OsTarget1ASP2-14AT3＇{-17}表示在靶基因OsTarget1的等位基因特异引物2的距离3＇末端17个碱基处嵌入14个碱基长度的AT-add。
使用的荧光染料：Super EvaGreen，能特异结合双链DNA产生荧光信号的饱和荧光染料，可用于高分辨率溶解曲线分析，具体参数如下：激发波长(500nm，结合DNA；471nm，未结合DNA)，发射波长为530nm。
GC-add：富含GC的序列；
AT-add：富含AT的序列。
实施例1
以水稻靶基因1(OsTarget1)为模板，测试ASP1和ASP2的相同位置分别添加不同长度或相同长度GC-add和AT-add时的基因分型检测效果，等位基因多态性位点为T(Allele1)/A(Allele2)基因型，总共设计7个add序列和14条引物，如下表1所示：
表1引物和add序列序列表
按表2配制反应体系，ASP1和ASP2的组合分别为：SEQ ID NO:8&SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10&SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12&SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14&SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16&SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16&SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19&SEQ ID NO:20。
表2单重检测反应体系配制
取10-100ng水稻标准品材料亲本1，亲本2及杂交一代材料基因组DNA于96孔PCR反应板的反应孔中，标准品的SNP类型已经PARMS检测确认(武汉市景肽生物科技有限公司)，每引物组合每模板设两个重复及两个NTC。65℃处
理30分钟至模板DNA干燥，每孔加入10μl反应混合液，矿物油封孔后置于PCR仪上，按表3设置程序完成扩增反应。
表3 AS-PCR反应程序
扩增反应完成后反应板转至ABI 7900HT上，按照表4设置程序完成熔解曲线测定。
表4熔解曲线测定程序
软件SDS2.4.1分析熔解曲线数据，绘制导数熔解曲线图，结果如图4所示。
如图4a所示，当ASP1和ASP2不含有GC-add和AT-add(SEQ ID NO:8&SEQ ID NO:9)时，OsTarget1亲本1和亲本2的熔解峰位置差异极小，ΔTm为0.5℃，杂合基因型只有一个熔解峰形成，因此对于该SNP位点，常规ASP1和ASP2无法通过熔解曲线分析完成基因分型。
如图4b所示，当不同长度GC-add(10碱基)和AT-add(14碱基)分别位于ASP1和ASP2的5’端(SEQ ID NO:10&SEQ ID NO:11)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分
别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，两个熔解峰的峰高之间存在较大差异，表明存在一定程度的不均一扩增，杂合基因型两种产物的ΔTm为4.0℃。
如图4c所示，当不同长度GC-add(22碱基)和AT-add(26碱基)分别位于ASP1和ASP2的距3＇末端9碱基时(SEQ ID NO:12&SEQ ID NO:13)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，二者的ΔTm为6.4℃。杂交一代材料仅形成一个特异的熔解峰，位于亲本2熔解峰对应的Tm位点，因此该引物组和设计虽能显著增大两种扩增产物的ΔTm，但无法完成杂合基因型分型检测，这是由于ASP1和ASP2存在严重的不均一扩增造成。
如图4d所示，当不同长度GC-add(22碱基)和AT-add(26碱基)分别位于ASP1和ASP2的距3＇末端10碱基时(SEQ ID NO:14&SEQ ID NO:15)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，两个熔解峰的峰高之间存在较大差异，表明存在一定程度的不均一扩增，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.0℃。
如图4e所示，当不同长度GC-add(16碱基)和AT-add(20碱基)分别位于ASP1和ASP2的距3＇末端14碱基时(SEQ ID NO:16&SEQ ID NO:17)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，两个熔解峰的峰高差异较小，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.2℃。
如图4f所示，当不同长度GC-add(10碱基)和AT-add(14碱基)分别位于ASP1和ASP2的距3＇末端17碱基时(SEQ ID NO:19&SEQ ID NO:20)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，两个熔解峰的峰
高几乎无差异，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.0℃。
如图4g所示，当相同长度GC-add(16碱基)和AT-add(16碱基)分别位于ASP1和ASP2的距3＇末端14碱基时(SEQ ID NO:16&SEQ ID NO:18)时，OsTarget1亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，两个熔解峰的峰高几乎无差异，杂合基因型两种产物的ΔTm为5.6℃。
综上所述，在ASP1和ASP2引物5＇末端和内部相同位置分别添加相同长度或不同长度的GC-add和AT-add均能够显著增大两种扩增产物之间的ΔTm并通过熔解曲线完成基因分型测定，且GC-add和AT-add位于ASP内(ΔTm＝5.6℃-6.2℃)的效果好于位于ASP的5＇末端(ΔTm＝4.0℃)；通过调整GC-add和AT-add在ASP内的插入位点可以消除杂合基因型样品检测中的不均一扩增现象。
实施例2
以水稻靶基因2(OsTarget2)为模板，测试ASP1和ASP2不同位置分别添加GC-add和AT-add时的基因分型检测效果，等位基因多态性位点为G(Allele1)/T(Allele2)基因型，GC-add和AT-add分别使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，总共设计1条add序列和11条引物，如下表5所示：
表5引物和add序列序列表
ASP1和ASP2的组合分别为：SEQ ID NO:23&SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25&SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27&SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:27&SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30&SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:30&SEQ ID NO:32。
除引物及探针组合以外，具体实施方式、包括所用测试样品，试剂和实验流程均和实施例1相同，具体测试结果如图5所示。
如图5a所示，当ASP1和ASP2不含有GC-add和AT-add(SEQ ID NO:23&SEQ ID NO:24)时，OsTarget2亲本1和亲本2的熔解峰位置差异极小，ΔTm为0.3℃，杂合基因型只有一个熔解峰形成，因此对于该SNP位点，常规ASP1和ASP2无法通过熔解曲线分析完成基因分型。
如图5b所示，当GC-add和AT-add分别位于ASP1和ASP2的5＇端(SEQ ID NO:25&SEQ ID NO:26)时，OsTarget2亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2
熔解峰对应的Tm位点，杂合基因型两种产物的ΔTm为5.0℃。
如图5c所示，当GC-add和AT-add分别位于ASP1的距3＇末端17碱基处和ASP2的距3＇末端19碱基处时(SEQ ID NO:27&SEQ ID NO:28)时，OsTarget2亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2对应的Tm位点，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.5℃。
如图5d所示，当GC-add和AT-add分别位于ASP1的距3＇末端19碱基处和ASP2的距3＇末端20碱基处时(SEQ ID NO:30&SEQ ID NO:31)时，OsTarget2亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.5℃。
如图5e所示，当等长的GC-add和AT-add分别位于ASP1的距3＇末端17碱基处和ASP2的距3＇末端19碱基处时(SEQ ID NO:27&SEQ ID NO:29)时，OsTarget2亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2对应的Tm位点，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.5℃。
如图5f所示，当等长的GC-add和AT-add分别位于ASP1的距3＇末端19碱基处和ASP2的距3＇末端20碱基处时(SEQ ID NO:30&SEQ ID NO:32)时，OsTarget2亲本1和亲本2在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂交一代材料形成两个特异的熔解峰，分别位于亲本1和亲本2熔解峰对应的Tm位点，杂合基因型两种产物的ΔTm为6.5℃。
综上所述，在ASP1和ASP2的5＇末端和内部不同位置处分别添加不同或相同长度的GC-add和AT-add，均能够显著增大两种扩增产物之间的ΔTm通过
熔解曲线完成基因分型测定，并且位于ASP内部(ΔTm＝6.5℃)的效果好于位于ASP的5＇末端(ΔTm＝5.0℃)的效果。
实施例3
使用水稻靶基因1(OsTarget1)进行大量群体样品分型检测。
ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，共测试92份样品和4份NTC。
具体实施方式、包括所用测试样品，试剂和实验流程均和实施例1相同，具体测试结果如图6所示。
从图6中可以看出，两种基因型的纯合材料在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂合材料形成两个特异的熔解峰，分别位于两种基因型的纯合材料对应的Tm位点(图6a)，92份样品和4份NTC均检测分型成功(图6b)，检测结果和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
实施例4
使用水稻靶基因2(OsTarget2)进行大量群体样品分型检测。
ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33，共测试92份样品和4份NTC。
具体实施方式、包括所用测试样品，试剂和实验流程均和实施例1相同，具体测试结果如图7所示。
从图7中可以看出，两种基因型的纯合材料在不同的Tm位点形成特异的熔解峰，杂合材料形成两个特异的熔解峰，分别位于两种基因型的纯合材料对应的Tm位点(图7a)，92份样品和4份NTC均检测分型成功(图7b)，检测结果和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
实施例5
单管反应同时对两个靶基因(水稻靶基因1(OsTarget1)、水稻靶基因2(OsTarget2))进行熔解曲线分型检测。
水稻靶基因1(OsTarget1)的ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21；水稻靶基因2(OsTarget2)的ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33。
各靶基因的引物按照表6配制成混合液(primer mix)，按表7配制反应体系；具体如下所示：
表6靶基因分型引物混合液(primer mix)配制
表7双重检测反应体系配制
具体实施方式、包括所用测试样品，试剂和实验流程均和实施例1相同，具体测试结果如图8所示。
从图8中可以看出，在纯合材料检测中，每个靶基因在对应的单个Tm位点形成特异的熔解峰，1个纯合材料共形成2个熔解峰且熔解峰之间互不干扰(图8a和8b)；在杂合材料检测中，每个靶基因在对应的两个Tm位点形成特异的熔解峰，1个杂合材料共形成4个熔解峰且熔解峰之间互不干扰(图8c)，检测结果和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致，NTC无扩增(图8d)。
实施例6
单管反应同时对三个靶基因(水稻靶基因1(OsTarget1)、水稻靶基因2(OsTarget2)和水稻靶基因3(OsTarget3))进行熔解曲线分型检测。
水稻靶基因1(OsTarget1)的ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21；水稻靶基因2(OsTarget2)的ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33。
水稻靶基因3(OsTarget3)等位基因多态性位点为C(Allele1)/A(Allele2)基因型，GC-add和AT-add分别使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，总共设计5条引物，如下表8所示：
表8引物和add序列序列表
水稻靶基因3(OsTarget3)的ASP1、ASP2和LSP分别使用SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。
具体实施方式、包括所用测试样品，试剂和实验流程均和实施例1相同，具体测试结果如图9所示。
从图9中可以看出，在纯合材料检测中，每个靶基因在对应的单个Tm位点形成特异的熔解峰，1个纯合材料共形成3个熔解峰且熔解峰之间互不干扰(图9a和图9b)；在杂合材料检测中，每个靶基因在对应的两个Tm位点形成特异的熔解峰，1个杂合材料共形成6个熔解峰且熔解峰之间互不干扰(图9c)，检测结果和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致，NTC无扩增(图9d)。
实施例7
使用熔解曲线进行复等位基因检测鉴定。
具体而言，使用水稻淀粉粒结合淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase I，GBSS I，waxy，wx)的四种复等位基因样本Wx-a,Wx-in,Wx-op和Wx-mq的纯合体以及Wx-a/Wx-in和Wx-op/Wx-mq杂合体为检测对象。这四种复等位基因分别在5个SNP位点存在差异：Int1-1位点为G(Allele1)/T(Allele2)基因型；Ex4-53位点为G(Allele1)/A(Allele2)基因型；Ex4-77位点为G(Allele1)/A(Allele2)基因型；Ex6-62位点为C(Allele1)/A(Allele2)基因型；Ex10-115位点为C(Allele1)/T(Allele2)基因型，具体信息如表9和表10所示：
表9水稻Wx各复等位基因型的SNP情况
表10本发明所涉及水稻Wx基因SNP情况
其中，SEQ ID NO:72序列(OsWx Int1-1 Allele1)如下：TCATCAGGAAGAACATCTGCAAGGTATACATATATGTTTATAATTCTTTGTTTCCCCTCTTATTCAGATCGA；
SEQ ID NO:73序列(OsWx Int1-1 Allele2)如下：TCATCAGGAAGAACATCTGCAAGTTATACATATATGTTTATAATTCTTTGTTTCCCCTCTTATTCAGATCGA；
SEQ ID NO:74序列(OsWx Ex4-53 Allele1)如下：AATTCATTGCAGATCAAGGTTGCAGACAGGTACGAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAAGCGTGGAGTCGACCGTGTGTTCAT；
SEQ ID NO:75序列(OsWx Ex4-53 Allele2)如下：AATTCATTGCAGATCAAGGTTGCAGACAGGTACGAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAAGCATGGAGTCGACCGTGTGTTCAT；
SEQ ID NO:76序列(OsWx Ex4-77 Allele1)如下：TCGACCGTGTGTTCATCGGCCATCCGTCATTCCTGGAGAAGGTGGAGTCATCATTA；
SEQ ID NO:77序列(OsWx Ex4-77 Allele2)如下：TCGACCGTGTGTTCATCGACCATCCGTCATTCCTGGAGAAGGTGGAGTCATCATTA；
SEQ ID NO:78序列(OsWx Ex6-62 Allele1)如下：GCTCCTAGGATCCTAAACCTCAACAACAACCCATACTTCAAAGGAACTTCTGGTGAGTTATAATTGATCTCAAGAT；
SEQ ID NO:79序列(OsWx Ex6-62 Allele2)如下：GCTCCTAGGATCCTAAACCTCAACAACAACCCATACTTCAAAGGAACTTATGGTGAGTTATAATTGATCTCAAGAT；
SEQ ID NO:80序列(OsWx Ex10-115 Allele1)如下：CTGGAGGAACAGAAGGGCCCTGACGTCATGGCCGCCGCCATCCCGGAGCTCATGCAGGAGGACGTCCAGATCGTTCTTCTGGTATAA；
SEQ ID NO:81序列(OsWx Ex10-115 Allele2)如下：CTGGAGGAACAGAAGGGCTCTGACGTCATGGCCGCCGCCATCCCGGAGCTCATGCAGGAGGACGTCCAGATCGTTCTTCTGGTATAA。
针对上述五个SNP位点，总共设计2条add序列和25条引物，如下表11所示：
表11引物和add序列序列表
上述6种基因型材料分两组试验进行检测：一组为Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体，另一组为Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体；每种基因型设计三种方式完成5个SNP位点的检测，具体如下：
第一种(单重检测)：每个基因型需要5个反应完成5个SNP位点的检测，每个反应检测1个位点；
第二种(二重+二重+单重检测)：每个基因型需要3个反应完成5个SNP位点检测，2个反应均检测2个SNP位点，另1个反应检测1个SNP位点；
第三种(二重+三重测试)：每个基因型需要2个反应完成5个SNP位点检测，1个反应均检测2个SNP位点，另1个反应检测3个SNP位点。
图10为Wx-a纯合体(图10a),Wx-in纯合体(图10b)和Wx-a/Wx-in杂合体(图10c)的“单重检测”结果图，从图中可以看出，在Int1-1，Ex4-53及Ex4-77单重反应中，纯合材料及杂合材料均产生单一熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1,Ex4-53 Allele1及Ex4-77 Allele2位点；在Ex6-62单重反应中，Wx-a纯合体和Wx-in纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele2和Ex6-62 Allele1位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele1和Ex6-62 Allele2位点；在Ex10-115单重反应中，Wx-a和Wx-in纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Ex10-115 Allele2和Ex10-115 Allele1位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Ex10-115 Allele1和Ex10-115 Allele2位点；NTC均无扩增(图10d)；所有检测
结果均正确并且和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
图11为Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体的“二重+二重+单重检测”结果图，从图中可以看出，在Int1-1&Ex4-53双重反应中，纯合及杂合材料均产生两个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1和Ex4-53 Allele1位点；在Ex6-62&Ex10-115双重反应中，Wx-a纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele2和Ex10-115 Allele2位点，Wx-in纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele1和Ex10-115 Allele1位点；杂合材料则产生四个熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele1，Ex6-62 Allele2，Ex10-115 Allele1和Ex10-115 Allele2位点；在Ex4-77单重反应中，纯合材料及杂合材料均产生单一熔解峰，均对应Ex4-77 Allele2位点；NTC均无扩增；所有检测结果均正确并且和“单重检测”结果及PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
图12为Wx-a纯合体,Wx-in纯合体和Wx-a/Wx-in杂合体的“二重+三重检测”结果图，从图中可以看出，在Ex4-53&Ex6-62双重反应中，Wx-a纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex6-62 Allele2位点，Wx-in纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex6-62 Allele1位点，杂合材料则产生三个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1，Ex6-62 Allele1和Ex6-62 Allele2位点；在Int1-1&Ex4-77&Ex10-115三重反应中，Wx-a纯合体产生三个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Ex4-77 Allele2和Ex10-115 Allele2位点，Wx-in纯合体产生三个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Ex4-77 Allele2和Ex10-115 Allele1位点，杂合材料则产生四个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Ex4-77 Allele2，Ex10-115 Allele1和Ex10-115 Allele2位点；NTC均无扩增；所有检测结果均正确并且和“单重检测”结果，“二重+二重+单重检测”结果及PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
图13为Wx-op纯合体(图13a),Wx-mq(图13b)纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体(图13c)的“单重检测”结果，从图中可以看出，在Ex6-62及Ex10-115单重反应中，纯合材料及杂合材料均产生单一熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele2及Ex10-115 Allele1位点；在Int1-1单重反应中，Wx-op纯合体和Wx-mq纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1和Int1-1 Allele2位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1和Int1-1 Allele2位点；在Ex4-53单重反应中，Wx-op纯合体和Wx-mq纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex4-53 Allele2位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex4-53 Allele2位点；在Ex4-77单重反应中，Wx-op纯合体和Wx-mq纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Ex4-77 Allele1和Ex4-77 Allele2位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Ex4-77 Allele1和Ex4-77 Allele2位点；NTC均无扩增(图13d)；所有检测结果均正确并且和PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
图14为Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体的“二重+二重+单重检测”结果，从图中可以看出，在Int1-1&Ex4-77双重反应中，Wx-op纯合体产生两个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1和Ex4-77 Allele1位点，Wx-mq纯合体产生两个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele2和Ex4-77 Allele2位点位点，杂合材料则产生四个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Int1-1 Allele2，Ex4-77 Allele1和Ex4-77 Allele2位点；在Ex6-62&Ex10-115双重反应中，纯合及杂合材料均产生两个熔解峰，分别对应Ex6-62 Allele2和Ex10-115 Allele1位点；在Ex4-53单重反应中，Wx-op纯合体和Wx-mq纯合体均产生单一熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex4-53 Allele2位点，杂合材料则产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex4-53 Allele2位点；NTC均无扩增；所有检测结果均正确并且和“单
重检测”结果及PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
图15为Wx-op纯合体,Wx-mq纯合体和Wx-op/Wx-mq杂合体的“二重+三重检测”结果，从图中可以看出，在Ex4-53&Ex6-62双重反应中，Wx-op纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1和Ex6-62 Allele2位点，Wx-mq纯合体产生两个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele2和Ex6-62 Allele2位点，杂合材料则产生三个熔解峰，分别对应Ex4-53 Allele1，Ex4-53 Allele2和Ex6-62 Allele2位点；在Int1-1&Ex4-77&Ex10-115三重反应中，Wx-op纯合体产生三个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Ex4-77 Allele1和Ex10-115 Allele1位点；Wx-mq纯合体产生三个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele2，Ex4-77 Allele2和Ex10-115 Allele1位点，杂合材料则产生五个熔解峰，分别对应Int1-1 Allele1，Int1-1 Allele2，Ex4-77 Allele1，Ex4-77 Allele2和Ex10-115 Allele1位点；NTC均无扩增。所有检测结果均正确并且和“单重检测”结果，“二重+二重+单重检测”结果及PARMS检测结果(武汉市景肽生物科技有限公司)一致。
综上所述，高分辨率熔解曲线能够完成复等位基因的分型鉴定，且采用多重扩增的方式能够在保证检测结果的前提下，极大的减少工作量。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
- 一种用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；S2、分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3＇末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配；S3、配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS-PCR扩增反应；S4、扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述特异性引物ASP1和ASP2位于所述多态性位点的上游或位于所述多态性位点的下游。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述额外序列插入的位置距离所述特异性引物的3＇末端最短距离为10个碱基，最远可位于所述特异性引物的5＇末端。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述额外序列选自GC-add或AT-add中的一种。
- 根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC-add添加在所述特异性引物ASP1中，所述AT-add添加在所述特异性引物ASP2中。
- 根据权利要求5所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC-add和所述AT-add分别在所述特异性引物ASP1和ASP2上的插入位点和3＇末端碱基的距离相同或不同。
- 根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC-add和所述AT-add的长度相同或不同。
- 根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC-add和所述AT-add至少由如下物质中的一种组成：1)核苷酸碱基；2)核苷酸碱基类似物；3)化学修饰的核苷酸碱基。
- 根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC-add的长度为3～40bp，并且所述GC-add中的鸟嘌呤碱基(G)和胞嘧啶碱基(C)所占比例不少于60％。
- 根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述AT-add的长度为3～40bp，并且所述AT-add中的腺嘌呤碱基(A)和胸腺嘧啶碱基(T)所占比例不少于60％。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR反应体系包括两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2、一条通用反向引物LSP、缓冲体系、DNA聚合酶、dNTPs、待检测样品DNA以及荧光染料。
- 根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述荧光染料包括可以和双链DNA特异结合或嵌入结合并产生荧光信号的荧光染料。
- 根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述待检测样品DNA包括双链DNA、单链DNA、线性DNA、环状DNA以及由RNA转录获得的cDNA。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述熔解曲线分析过程中，用于双链DNA解链的升温过程中升温速率不低于1.5℃/分钟。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述AS-PCR扩增反应可在单管中进行，并且所述单管中可以同时进行两个以上靶基因的分型检测。
- 根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述基因多态性分型的鉴定为复等位基因多态性分型的鉴定。
- 根据权利要求16所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述复等位基因多态性分型的鉴定过程中，AS-PCR扩增反应可在单管中进行，通过单管反应依次检测复等位基因中的单个多态性位点或通过单管反应同时检测复等位基因中的多个多态性位点，从而完成复等位基因多态性分型的鉴定。
- 一种用于基因多态性分型的鉴定系统，其特征在于，包括如下模块：信息获取模块：根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；引物设计模块：分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3＇末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配，即可得到用于基因多态性分型的引物；PCR扩增反应模块：配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS-PCR扩增反应；分析模块：扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。
- 根据权利要求18所述的用于基因多态性分型的鉴定系统，其特征在于， 所述引物设计模块还包括引物相关参数优化模块，所述引物相关参数优化模块用于对引物在模板上的位置、引物长度、退火温度、GC含量、GC-add和AT-add选择、GC-add和AT-add在引物上的插入位点进行优化。
- 一种用于基因多态性分型的引物，其特征在于，由权利要求18所述的引物设计模块设计得到。
- 一种用于基因多态性分型的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法中的PCR反应体系。
- 权利要求1～17任一项所述的用于基因多态性分型的鉴定方法在等位基因多态性分型检测中的应用。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165865A1 (en) * | 2001-01-29 | 2003-09-04 | Hinkel Christopher A. | Methods of analysis of nucleic acids |
| US20100112565A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-05-06 | Life Technologies Corporation | Methods, kits, and reaction mixtures for high resolution melt genotyping |
| CN102199668A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-09-28 | 上海交通大学 | 纳米颗粒分子单倍型分型方法 |
| CN105624296A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-06-01 | 屈强 | 基于arms荧光pcr法检测基因多态性的通用型荧光发夹引物 |
| CN108220399A (zh) * | 2016-12-14 | 2018-06-29 | 李保伟 | 一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法 |
| CN114958986A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-30 | 武汉市景肽生物科技有限公司 | 一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用 |
-
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-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165865A1 (en) * | 2001-01-29 | 2003-09-04 | Hinkel Christopher A. | Methods of analysis of nucleic acids |
| US20100112565A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-05-06 | Life Technologies Corporation | Methods, kits, and reaction mixtures for high resolution melt genotyping |
| CN102199668A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-09-28 | 上海交通大学 | 纳米颗粒分子单倍型分型方法 |
| CN105624296A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-06-01 | 屈强 | 基于arms荧光pcr法检测基因多态性的通用型荧光发夹引物 |
| CN108220399A (zh) * | 2016-12-14 | 2018-06-29 | 李保伟 | 一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法 |
| CN114958986A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-30 | 武汉市景肽生物科技有限公司 | 一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHARMA DIVYA; LATHER MANILA; DYKES CHERRY L.; DANG AMITA S.; ADAK TRIDIBES; SINGH OM P.: "Disagreement in genotyping results of drug resistance alleles of thePlasmodium falciparumdihydrofolate reductase (Pfdhfr) gene by allele-specific PCR (ASPCR) assays and Sanger sequencing", PARASITOLOGY RESEARCH, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 115, no. 1, 26 September 2015 (2015-09-26), Berlin/Heidelberg, pages 323 - 328, XP035881746, ISSN: 0932-0113, DOI: 10.1007/s00436-015-4750-2 * |
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