NO174825B - Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett - Google Patents

Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett Download PDF

Info

Publication number
NO174825B
NO174825B NO891012A NO891012A NO174825B NO 174825 B NO174825 B NO 174825B NO 891012 A NO891012 A NO 891012A NO 891012 A NO891012 A NO 891012A NO 174825 B NO174825 B NO 174825B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nucleotide
primer
diagnostic
sequence
complementary
Prior art date
Application number
NO891012A
Other languages
English (en)
Other versions
NO891012D0 (no
NO891012L (no
NO174825C (no
Inventor
Clive Robert Newton
Alexander Fred Markham
Original Assignee
Zeneca Ltd
Ici Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26293607&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO174825(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB888805692A external-priority patent/GB8805692D0/en
Priority claimed from GB888814170A external-priority patent/GB8814170D0/en
Application filed by Zeneca Ltd, Ici Plc filed Critical Zeneca Ltd
Publication of NO891012D0 publication Critical patent/NO891012D0/no
Publication of NO891012L publication Critical patent/NO891012L/no
Publication of NO174825B publication Critical patent/NO174825B/no
Publication of NO174825C publication Critical patent/NO174825C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for påvisning av et fravær eller en tilstedeværelse av én eller flere variante nukleotidsekvenser, som foreligger i en prove, en nukleotidsekvens med fra 5 til 50 bp for bruk i fremgangsmåten, og et diagnostisk sett for gjennomføring av fremgangsmåten .
Foreliggende oppfinnelse er av spesiell interesse ved diagnostiske undersøkelser av DNA-prøver for arvelige tilstander, predisponeringer eller somatiske muteringer, og tilveiebringer bl.a. en generell fremgangsmåte for lett påvisning av punktmutasjoner. Fremgangsmåten kan også brukes for påvisning og typifisering av infiserende patogener ved hjelp av en analyse av deres DNA eller RNA.
Det er kjent flere hundre genetiske sykdommer hos mennesker som er et resultat av spesielle mutasjoner på DNA-nivået. Den molekylære basis for visse av disse sykdommer er allerede kjent, og forskning vil raskt kunne avsløre den molekylære basis for de genetiske sykdommer hvis type mutasjon man ikke kjenner for tiden. I de tilfeller hvor man ikke kjenner den presise molekylære basis for den arvelige til-standen, så kan en diagnose av lidelsen eller en påvisning av bærere tilveiebringes i informative avstamningstavler eller stamtrær ved hjelp av RFLP-teknologi, idet man bruker DNA-prober i genetisk binding med sykdomslocus. Således kan man for tiden diagnostisere Duchennes muskulære dystrofi, cystisk fibrose og Huntingtons Chorea ved hjelp av RFLP-teknologi.
Det er imidlertid nødvendig å utføre en testing separat med hensyn til hver enkelt tilstand eller sykdom, og det er følgelig nødvendig med en betydelig mengde arbeid som bl.a. krever DNA-rensning, restriksjonsenzymnedbrytning, agarosegelelektroforese, Southern blotting, hybridisering, påvisning av hybridiserte geneprober og analyse av avstamningstrær eller stamtavler. Visse andre arvelige sykdommer er forbundet med enkeltpunktmutasjoner i gener, og hver av disse tilstandene eller lidelsene må analyseres separat og det er ytterligere vanskeligheter i de tilfeller hvor punktmutasjonene er heterogene. Således vet man at det er mer enn 40 forskjellige punktmutasjoner som kan forårsake /3-thalassemi, og minst 5, og sannsynligvis mer enn 12 punktmutasjoner som kan forårsake hemofili A. Med hensyn til disse heterogene tilstander så må hvert mulig mutasjonspunkt for tiden analyseres separat. Dette involverer ofte en kompleks RFLP-haplotypeanalyse med multiple restriksjonsenzymer.
Det har vist seg at en rekke punktmutasjoner i somatiske celler inngår i utviklingen av forskjellige typer kreft, f.eks. punktmutasjoner innenfor ras oncogenet (J.L. Boos et al, Nature 327, 293 (1987).
Europeisk patentsøknad nr. 87302196.8 (publikasjon nr. 237.362) fra Cetus Corporation, beskriver en fremgangsmåte for påvisning av et nærvær eller et fravær av minst én nukleotid variasjon i sekvensen av én eller flere nukleinsyrer som forefinnes i en prøve, og hvor nevnte fremgangsmåte innbefatter følgende trinn: (a) prøven behandles sammen med eller i rekkefølge med fire forskjellige nukleotidtrifosfater, et polymerisasjonsmiddel for nukleotidtrifosfåtene, og én oligonukleotidprimer for hver tråd av hver nukleinsyre som man mistenker inneholder nevnte variasjon under hybridiserende betingelser, slik at man kan påvise hver nukleinsyretråd som inneholder forskjellig variasjon, hvoretter man syntetiserer et forlengelsesprodukt av hver primer som er komplementært til hver enkelt nyklein-syretråd, og hvor nevnte primer eller primere velges slik at de i alt vesentlig er komplementære til hver enkelt nukleinsyretråd som inneholder en slik forskjellig variasjon, slik at forlengelsesproduktet syntetisert fra én primer, når det skilles fra sitt komplement, kan tjene som en template for syntese av forlengelsesproduktet av den andre primeren; (b) behandler prøven under denaturerende betingelser for å skille primerforlengelsesproduktene fra sine templater hvis de(n) variasjon(er) som skal påvises er tilstede; (c) behandler prøven sammen med eller i rekkefølge med nevnte fire nukleotidtrifosfater, et polymerisasjonsmiddel for nukleotidtrifosfåtene, og oligonukleotidprimere slik at primerforlengelsesproduktet syntetiseres når man bruker hver
av de enkle trådene fremstilt i trinn (b) som en template, hvoretter trinnene (b) og (c) gjentas tilstrekkelig antall ganger til at man får en påvisbar forsterkning av den nukleinsyre som forefinnes i sekvensvariasjonen(e), hvis den er tilstede; (d) fester produktet fra trinn (c) til en membran; (e) behandler membranen under hybridiseringsbetingelser med en merket sekvens-spesifikk oligonukleotidprobe som er i stand til å hybridisere seg med den forsterkede nukleinsyresekvensen bare hvis probens sekvens er komplementær til et område i den forsterkede sekvensen; og (f) påviser hvorvidt proben har hybridisert seg til en
forsterket sekvens i nukleinsyreprøven.
Påvisning av et fravær eller et nærvær av minst én nukleotidvariasjon kan i visse spesielle situasjoner oppnås ved hjelp av forskjellige teknikker. I det spesielle tilfellet f.eks. hvor punktmutasjonen skaper eller ødelegger en restriksjonsposisjon (f.eks. i sigdcelleanemi), kan restriksjonsenzymnedbrytning brukes enten før eller etter forsterkning [F.F. Chehab et al Nature 329. 293, (1987)]. Med hensyn til store utelatte nukleinsyresekvenser så kan videre primere for en forsterkning fremstilles for områder innenfor den mistenkte utelatelse f.eks. for 23 kb utelatelsen som forårsaker a-thalassemi; og i slike tilfeller vil en manglende forsterkning av den utelatte sekvensen bekrefte denne, og er således et eksempel på en diagnose for a-thalassemi [F.F. Chehab et al, Nature 329, 293 (1987)].
Den forsterkningsmetode som er beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 237.362 har visse fordeler fremfor RFLP (restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme) og en allele spesifikk oligonukleotidteknikk slik denne f.eks. er beskrevet av Kan og Dozy, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 75, 5631 (1978), Rubin og Kan, Lancet, 1985-1,75 (1985), Conner et al, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 80/ 78 (1983), Kidd et al, Nature, 304, 230 (1983) and Piratsu et al, New England Journal of Medicine, 309, 284
(1983).
Ikke desto mindre så beskriver europeisk patentpublikasjon nr. 237.362 en fremgangsmåte som innbefatter en indiskriminerende forsterkning av en spesiell sekvens av interesse, og dette fører uunngåelig til et behov for en rekke tidkrevende påvisningstrinn som enten innbefatter ytterligere bruk av en merket sekvens-spesifikk oligonukleotid probe. Denne må være i stand til å kunne skille mellom sekvenser som bare skiller seg ved en enkel nukleotid og/eller at man bruker en spesifikk restriksjonsendonuklease i de begrensede tilfeller hvor punktmutasjonen skaper eller ødelegger enzymgjen-kj ennelsessekvensen og/eller man må bruke en direkte sekvens-metode på det forsterkede DNA [se C. Wong et al Nature 330. 384 (1987)].
Det er følgelig behov for en enkel fremgangsmåte for direkte påvisning av minst én enkelt baseforskjell i nukleinsyrene såsom genomisk DNA, hvor påvisningstrinnene er nedsatt til et minimum, og dette resulterer i en fremgangsmåte som kan utføres raskt, nøyaktig og lett med minimal opplæring av det personale som skal utføre arbeidet.
Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse, at ved et passende valg av nukleotidsekvensen i en oligonukleotidprimer, er det mulig selektivt å oppnå en primerforlengelse av enten en sekvens som inneholder et mistenkelig variant nukleotid, eller den tilsvarende sekvensen som inneholder det normale nukleotid, eller å hindre en slik primerforlengelse, noe som i alt vesentlig vil forenkle den nødvendige påvisningsprosedyren.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for påvisning av et nærvær eller fravær av minst ett variant nukleotid i én eller flere nukleinsyrer som forefinnes i en prøve, hvilken fremgangsmåte er særpreget ved behandling av prøven samtidig eller i rekkefølge med;
(i) tilsvarende nukleosidtrifosfater,
(ii) et reagens for polymerisering av nukleosidtrifosfåtene og (iii) en diagnostisk primer for en diagnostisk del av en målbasesekvens under hybridiserende betingelser,
idet nukleosidsekvensen til den diagnostiske primer er slik at
den er hovedsaklig komplementær til den diagnostiske del, og 5' eller 3' sluttnukleotidet av den diagnostiske primer enten er komplementært med det forventede variant-nukleotid eller med det tilsvarende normale nukleotid, hvorved et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primer syntetiseres når sluttnukleotidet av den diagnostiske primer er komplementært med det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, idet ikke noe forlengelsesprodukt syntetiseres når sluttnukleotidet av den diagnostiske primer ikke er komplementært med det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen; og påvisning av nærvær eller fravær av den forventede variant-nukleotid ut fra nærvær eller fravær av et forlengelsesprodukt.
Det er underforstått at skjønt fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er av spesiell interesse for påvisning av et nærvær eller et fravær av punktmutasjoner, så kan den også anvendes for påvisning av om delesjoner foreligger eller ikke, og her inngår delesjoner eller fjerninger av mer enn ett nukleotid så vel som en påvisning av et nærvær eller fravær av substitusjoner av ett eller flere nukleotider. I så henseende er det nødvendig å kjenne det relevante nukleotidet, spesielt det relevante terminale nukleotid, slik at man kan utforme de(n) nødvendige diagnostiske primer(e).
Det er underforstått at et mulig forlengelsesprodukt som dannes kan så påvises i enhver hensiktsmessig form, f.eks. i en enkelt- eller dobbelt-trådet form.
Det er videre underforstått at et mulig forlengelsesprodukt som oppnås kan, hvis det er ønskelig, forsterkes ved den polymerasekjedereaksjonen (PCR), som er beskrevet i U.S. patent nr. 4683195 og 4683202 eller ved hjelp av Q-beta replikase slik det er beskrevet i PCT patentpublikasjon WO87/06270 og i Biotechnology Vol. 6 oktober 1988, ved å bruke den transkripsjonsbaserte nukleinsyreforsterkning som er beskrevet av Siska Corporation i PCT patentpublikasjon WO88/10315, eller ved å bruke lineær forsterkning. Med begrepet "lineær forsterkning" slik det brukes her, forstås en forsterkning hvor man bruker en enkelt primer for hver diagnostisk del i nærværet av et polymerisasjonsmiddel og passende nukleotidtrifosfater, hvorved forsterkningen utføres ved en primerforlengelse basert på bruken av en enkelt tråd av prøvenukleinsyren som en template.
En første og spesielt foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse innbefatter følgende trinn: (i) behandling av prøven under denaturerende betingelser for å skille primer-forlengelsesproduktet fra sin mal; (ii) kontakt av de enkle kjeder fremstilt i trinn (i), enten samtidig med eller i rekkefølge med tilsvarende nukleosid-trif osf ater, et reagens for polymerisering av nukleosidtrifosfåtene, en diagnostisk primer og en forøkelsesprimer, hvorved et hvert forlengelsesprodukt av den diagnostiske primer tjener som en mal for syntese av et forlengelsesprodukt av forøkelsesprimeren; slik at det om mulig syntetiseres ytterligere forlengelsesprodukter ved bruk av de enkle kjeder fremstilt i trinn (i) som maler, og hvori forøkelsesprimeren eventuelt også er en diagnostisk primer, slik at enten (a) en første diagnostisk primer har en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, idet den første diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det forventede variant-nukleotid, og en andre diagnostisk primer med en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en andre nukleinsyresekvens, idet den andre diagnostiske primer har et terminalt nukleotid komplementært med det komplementære forventede variantnukleotid; eller
(b) en første diagnostisk primer har en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, idet den første diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det normale nukleotid som svarer til det forventede variantnukleotid, og en andre diagnostisk primer med en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en andre nukleinsyresekvens, idet den andre diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det normale nukleotid som svarer til det forventede variant-nukleotid; idet sluttnukleotidet av den første diagnostiske primer og sluttnukleotidet til den andre diagnostiske primer
enten befinner seg begge ved 5' enden eller begge ved 3' enden av de respektive primere, og den første nukleinsyresekvens er i den motsatte retning til den andre nukleinsyresykvens; (iii) gjentagelse av trinnene (i) og (ii) et tilstrekkelig antall ganger til å føre til en påviselig forøkelse av en tilsvarende nukleotidsekvens; (iv) påvisning av nærvær eller fravær av det forventede variantnukleotid ut fra nærvær eller fravær av et forøkelses-produkt oppnådd i trinn (iii).
Den andre diagnostiske primeren vil derfor anses å være en forsterkningsprimer som referert ovenfor og i det etterfølgende.
Denne utførelsen gjør det mulig å diskriminere og øke spesifiteten ettersom eventuelle artefakt-produkter krever priming for å opptre i den relevante terminale ende (vanligvis 3 *-terminalenden) på to mistilpassede oligonukleotider snarere enn i en enkeltende, noe som er tilfelle bare når man bruker en enkel diagnostisk primer.
Påvisning av et nærvær eller fravær av et mistenkt variant nukleotid kan f.eks. utføres som beskrevet i det etterfølgende.
I en videre utførelse av foreliggende oppfinnelse blir en prøve som innbefatter DNA som inneholder et mistenkt variant nukleotid underkastet en forsterkning, f.eks. ved en lineær forsterkning som definert her, eller som f.eks. beskrevet i US patentene nr. 4.683.195 og 4.683.202, i PCT patentpublikasjon WO87/06270, i Bioteknologi vol. 6, oktober 1988 eller i PCT patentpublikasjon WO88/10315, hvoretter forsterkningsproduktet behandles med en diagnostisk primer for en diagnostisk del av en målbasesekvens under hybridiserende betingelser, og i nærværet av passende nukleosidtrifosfater, og et polymerisasjonsmiddel for nukleosidtrifosfåtene, og hvor nukleotidsekvensen i nevnte diagnostiske primer er slik, at den i alt vesentlig er komplementær til nevnte diagnostiske del, og hvor et terminalt nukleotid på nevnte diagnostiske primer enten er komplementær til det mistenkte variante nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid.
I denne utførelse av foreliggende oppfinnelse vil man således utføre en vanlig kjent forsterkning i det forønskede antall ganger, hvoretter man prøver hybridisering med den diagnostiske primeren som neste trinn før påvisningstrinnet. Man trenger ikke her å anvende noen forsterkningsprimer.
Denne utførelsen er av interesse ettersom mengden av polymerisasjonsreagens eller reagenser som er nødvendig kan i vesentlig grad reduseres (f.eks. minst halveres), og det samme gjelder mengden av nukleosidtrifosfater og det antall poly-merasekjedereaksjons- (PCR) varmemaskiner man anvender. Denne utførelsen gjør det således mulig å oppnå en betydelig reduk-sjon av omkostningene. Ettersom forsterkningstrinnet kan utføres ved en rekke forskjellige temperaturer uten ulemper, så krever denne tredje utførelsen bare at den mer temperatur-følsomme forsøkte hybridiseringen med den diagnostiske prøven trenger å utføres én gang, noe som ytterligere vil redusere risikoen for en falsk tilpasning av en terminalt mistilpasset (vanligvis 3'-mistilpasset) diagnostisk primer. Denne tredje utførelsen tilveiebringer således en mulig mer holdbar og robust fremgangsmåte som også ikke-eksperter kan anvende, og som ikke er så følsom overfor feil i selve utførelsen. Denne utførelsen unngår ytterligere behov for et ekstra polymerase-kjedereaksjons-kontrolltrinn, ettersom den første forsterkningen tilveiebringer sin egen interne kontroll.
Hvis det er ønskelig, kan den diagnostiske primeren ha et signal eller et merke som ikke så lett vil kunne destrueres, f.eks. ved en høytemperatursykliseringsteknikk som man anvender som PCR. Merkingen kan f.eks. utføres på passende måte eller ved hjelp av en signalgruppe, såsom en alkalisk fosfatase eller en pepperrotperoksydase slik det er beskrevet i litteraturen.
I så henseende kan det være av interesse å anvende et termostabilt enzym for merking, f.eks. en fosfatase fremstilt fra Thermus aquaticus.
En ytterligere og foretrukken utførelse av foreliggende fremgangsmåte modifiserer den foregående utførelsen ved at man bruker to diagnostiske primere slik det er beskrevet i den andre utførelsen av foreliggende fremgangsmåte, og hvor den andre diagnostiske primeren i alt vesentlig tjener som en forsterkende primer.
I denne utførelse av foreliggende oppfinnelse vil således en prøve som innbefatter DNA inneholdende et mistenkt variant nukleotid underkastes en forsterkning, hvoretter det forsterkede produktet behandles, enten sammen med eller i rekkefølge med enten: (a) en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt vesentlig er komplementær til en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, og hvor nevnte første diagnostiske primer har et terminalt nukleotid som er komplementært til nevnte mistenkte variante nukleotid, og en annen diagnostisk primer med en sekvens som i alt vesentlig er komplementær til en diagnostisk del av en annen nukleinsyresekvens, og hvor den andre diagnostiske primeren har et terminalt nukleotid som er komplementært til det nukleotid som er komplementært til nevnte, mistenkte variante nukleotid, eller (b) hvor en har en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt vesentlig er komplementær til en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, og hvor den første diagnostiske primeren har et terminalt nukleotid som er komplementært til det normale nukleotid, som tilsvarer nevnte mistenkte variante nukleotid, og en annen diagnostisk primer med en sekvens som i alt vesentlig er komplementær til en diagnostisk del av en annen nukleinsyresekvens, og hvor nevnte andre diagnostiske primer har et terminalt nukleotid som er komplementært til det nukleotid, som er komplementært til nevnte normale nukleotid som igjen tilsvarer det nevnte mistenkte variante nukleotid; og hvor nevnte terminale nukleotid på første diagnostiske primer og nevnte terminale nukleotid på andre diagnostiske primer, enten er begge i 5'-enden eller begge i 3'-enden av de respektive primere, og hvor første nukleinsyresekvens er komplementær til den andre nukleinsyresekvensen.
Generelt vil nevnte terminale nukleotid på første diagnostiske primer og nevnte terminale nukleotid på andre diagnostiske primer begge være i 3'-enden til sine respektive
primere.
Denne utførelsen av foreliggende oppfinnelse kombinerer således en mulig fordel ved de ovenfor angitte utførelser av oppfinnelsen, og bl.a. vil man kunne øke spesifiteten, redusere omkostningene og ha en mer pålitelig og brukervennlig teknikk.
Påvisning av et fravær eller en tilstedeværelse av et mistenkt variant-nukleotid kan utføres som beskrevet i det etterfølgende.
Det er underforstått at det forsterkede produkt, så snart det er behandlet med enten (a) eller (b) som definert ovenfor, kan underkastes én eller flere sluttsykluser etter behov. Når man utfører flere sykluser, kan man oppnå et ytterligere produkt, og dette er en hybrid av de forlengede produkter av de diagnostiske primere. Disse forskjellige produktene vil bli dannet i et forhold som er avhengig av det relative forhold mellom den opprinnelige PCR (polymerasekjedereaksjons-) primeroligonukleotidene og de tilsatte diagnostiske primeroligonukleotidene.
Når forsterkning utføres enten ved å bruke diagnostiske og forsterkende primere, eller ved å bruke to diagnostiske primere som f.eks. beskrevet i forbindelse med første og andre utførelse av foreliggende oppfinnelse, eller som en del av den forsterkningsmetode som er beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 237.362, så vil trinn (a) hvor man denaturerer for å skille primerforlengelsesproduktene fra sine templater og (b) kontakter de fremstilte enkle tråder, enten sammen eller i sekvens med passende nukleosidtrifosfater, et polymerisasjonsmiddel for nukleosidtrifosfåtene, og de relevante primere for å få en syntese av ytterligere forlengelsesprodukter, fortrinnsvis bli gjentatt minst fem ganger opp til et uendelig antall, spesielt i de tilfeller hvor primeren er sterkt motstandsdyktig mot forsterkning, uten at dette skader foreliggende fremgangsmåte. Man kan anvende fra 15-60, f.eks. fra 15-3 0 sykluser hvis prøven inneholder humant genomisk DNA. Hvis prøven består av celler, så bør disse fortrinnsvis oppvarmes før man i trinn (a) eksponerer nukleinsyrene overfor nevnte reagenser. Ved hjelp av dette trinn unngår man en rensing av nukleinsyrene før reagens-tilsetningen. Det er i så henseende underforstått at foreliggende oppfinnelse representerer en vesentlig forbedring fremfor tidligere kjente fremgangsmåter, selv om en DNA-rensing fra en prøve utføres før den forsøkte forsterkning.
Det er underforstått at i trinn (b) vil en kontakt mellom de enkle tråder fremstilt i trinn (a) og de passende nukleo-sidtrif osf åtene, et polymerisasjonsmiddel for nukleosidtrifosfåtene, primeren, f.eks. den diagnostiske primeren og/eller forsterkningsprimeren, utføres enten ved at disse reagensene tilsettes reaksjonsblandingen etter at man har utskilt primer-forlengelsesproduktet fra sin template (trinn a) eller man kan bruke de reagenser som allerede er tilstede i reaksjonsblandingen. I virkeligheten kan én eller flere forskjellige nukleosidtrifosfater og/eller polymerisasjonsmidlet og/eller primerene, f.eks. den diagnostiske primer og/eller forsterkningsprimeren, tilsettes på ethvert trinn av foreliggende fremgangsmåte.
Ifølge en siste og foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer man en fremgangsmåte som definert tidligere, men hvor forsterkninger utføres ved en primerforlengelse basert på bruken av en enkeltkjedet prøve-nukleinsyre som mal.
I denne utførelsen vil en primerforlengelse utføres ved å bruke den samme kjeden i en prøvenukleinsyre som mal, og man trenger ingen forsterkningsprimer. Denne forsterkningen er aritmetisk snarere enn eksponensiell, men man kan oppnå en eksponensiell forsterkning i det minste i teorien, med polymerasekjedereaksjoner (PCR). Fordelen ved denne femte ut-førelsen (også her betegnet som en lineær forsterkning), er at kunstige produkter, hvis de blir fremstilt, ikke i seg selv vil underkastes en eksponensiell forsterkning.
Lineær forsterkning kan utføres på enhver hensiktsmessig måte, og kan således utføres ved å bruke komplementære nukleo-sidtrif osfater i nærvær av et polymerisasjonsmiddel for disse trifosfåtene, hvorved man får fremstilt primerforlengelsesprodukter av ubestemt lengde når det er en tilstrekkelig grad av komplementaritet mellom den diagnostiske primer og prøve-nukleinsyren. Det er foretrukket, når alle de komplementære nukleosidtrifosfåtene er brukt, så kan prøvenukleinsyren underkastes en endonukleasenedbrytning, og hvor restriksjons-endonukleasen velges slik at den sikrer en spaltning av prøvenukleinsyren i en posisjon som er egnet til å gi dannelse av primerforlengelsesprodukter av fast lengde. Det er imidlertid fordelaktig hvis den lineære forsterkningen kan utføres i nærvær av bare én, fordelaktig bare to eller fortrinnsvis bare tre nukleosidtrifosfater, slik at den diagnostiske primeren i sin bundne tilstand (d.v.s. hybridisert til prøvenukleinsyren) bare kan forlenges så langt som et nærvær av bare én, to eller tre nukleosidtrifosfater vil tillate. Så snart et nukleosidtrifosfat er tilstede i prøvenukleinsyren for hvilken det ikke foreligger noen komplementær nukleosidtrifosfat, så vil primerforlengelsen stoppe opp.
Hvis det er ønskelig, kan den lineære forsterkningen utføres ved smeltetemperaturen (Tm) for sekvensen. Ved denne temperaturen vil den diagnostiske primeren bli hybridisert til den komlementære sekvensen i prøvenukleinsyren ved at den er i likevekt med fri diagnostisk primer i oppløsningen, slik at den diagnostiske primeren (eventuelt i forlenget form) raskt hybridiseres til å denatureres fra prøvenukleinsyren. Hvis det er ønskelig, kan den lineære forsterkningen også utføres ved varmeoscillering. En slik varmeoscillering vil vanligvis innbefatte raske temperatursvingninger omkring smeltetemperaturen for sekvensen.
Hvis bare én, to eller tre nukleosidtrifosfater er tilstede, så vil den diagnostiske primeren bare bli forlenget så langt som et nærvær av disse nukleosidtrifosfater vil tillate. Som indikert ovenfor, når det er mistilpasning mellom f.eks. 3'-terminalenden på den diagnostiske primeren og det tilsvarende nukleosidtrifosfat i prøvenukleinsyren, så vil man ikke få noen primerforlengelse. Hvis derimot 3'-terminal-nukleosidtrifosfatet er komplementært med det tilsvarende nukleosidtrifosfat i prøvenukleinsyren, så vil man få en primerforlengelse.
Når bare én, to eller tre nukleosidtrifosfater brukes, så vil det terminale nukleosidtrifosfat i den forlengede diagnostiske primeren bare brukes én gang, og det kan da være fordelaktig å bruke et dideoksynukleosidtrifosfat som nukleosidtrifosfatet, fordi dette i bruk vil utgjøre det terminale nukleosidtrifosfatet i det forlengede diagnostiske primerproduktet. Dette vil gjøre det lettere å fremstille en klart avsluttet forlengelse på den diagnostiske primeren.
Hvis det er ønskelig kan én eller flere av de nukleoside trifosfater som er tilstede i reaksjonsblandingen for å bli inkorporert i de forlengede primere, være merket på en eller annen hensiktsmessig måte. Således kan f.eks. én eller flere av nukleosidtrifosfåtene være merket fluorescerende. Denne merkingen av nukleosidtrifosfåtene er av spesiell interesse i forhold til den femte utførelsen av oppfinnelsen, hvor man kan påvise produksjonen av et forlenget produkt av den diagnostiske primeren ved å påvise det merkede nukleosidtrifosfatet som er inkorporerert i det forlengede produktet. Når det ikke er dannet noe forlengelsesprodukt så skjer det ingen inkorporering, og det merkede nukleoside trifosfatet kan da vaskes vekk. Mer spesielt unngår den femte utførelsen av foreliggende oppfinnelse problemet med en forsterkning av kunstige produkter og man får derved en meget god diskriminering i nærvær av merkede nukleosidtrifosfater. Når f.eks. forsterkningen utføres ved hjelp av PCR så vil en produksjon av et kunstig produkt kunne resultere i en forsterkning av dette produktet, hvorved man får inkorporert det merkede nukleosidtrifosfatet, og dette vil redusere diskrimineringen.
I tillegg til det som er nevnt ovenfor, så kan det være ønskelig at den diagnostiske primeren har ett ledd av et immunologisk bindende par, f.eks. et antigen eller et anti-stoff, eller et ledd eller en del av et kompleksdannende par, f.eks. biotin, for binding til andre deler av det nevnte bindende par eller at de kan danne par for det formål å kunne innfanges i en fast fase.
Ifølge et annet trekk ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det et sett for påvisning av et nærvær eller fravær av minst ett variant-nukleotid i én eller flere nukleinsyrer som forefinnes i en prøve, og hvor settet består av følgende: (1) en diagnostisk primer for hver diagnostisk del av en målbasesekvens, og hvor nukleotidsekvensen i hver diagnostisk primer er slik at den i alt vesentlig er komplementær til nevnte diagnostiske del, og hvor et terminalt nukleotid på den diagnostiske primeren enten er komplementært til det mistenkte variante nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid, slik at i bruk vil man få syntetisert et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primeren når nevnte terminale nukleotid på denne diagnostiske primeren er komplementært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, mens man ikke får produsert noe forlenget produkt når nevnte terminale nukleotid i den diagnostiske primeren ikke er komplementært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen;
(2) hver av fire forskjellige nukleosidtrifosfater; og
(3) et polymerisasjonsmiddel for nukleosidtrifosfåtene i del (2) .
Fordelaktig vil settet ifølge foreliggende oppfinnelse dessuten innbefatte en forsterkningsprimer som tilsvarer hver av de diagnostiske primere, og hvor nukleotidsekvensen i forsterkningsprimeren er slik, at et eventuelt forlengelsesprodukt av den tilsvarende diagnostiske primeren etter separasjon fra sitt komplement, kan tjene som en template for syntese av et forlengelsesprodukt av forsterkningsprimeren. F.eks. kan settet ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatte enten eller begge settene av diagnostiske primere som beskrevet ovenfor i forhold til annen utførelse av oppfinnelsen.
Settet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også, hvis det er ønskelig, innbefatte indre kontrollprimere når dette er passende.
Det er imidlertid spesielt foretrukket at settet ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter PCR- (polymerasekjedereaksjon) primere og en diagnostisk primer (som definert i det etterfølgende) med hensyn til hvert mistenkte variant-nukleotid. Hvis det er ønskelig kan settet dessuten inneholde én eller begge settene av diagnostiske primere som er beskrevet ovenfor i forhold til annen utførelse av oppfinnelsen.
Hver av reagensene som er angitt i (1), (2) og (3) ovenfor og/eller forsterkningsprimeren kan hensiktsmessig pakkes i en separat beholder, men det er foretrukket at de alle er kombinert i en enkelt beholder som man tilsetter det materialet som skal analyseres. Fordelaktig vil enkelt-beholderen dessuten inneholde buffer.
Det er underforstått at når settet ifølge forliggende oppfinnelse inneholder begge sett av diagnostiske primere (a) og (b) slik det er beskrevet ovenfor i forhold til annen utførelse av oppfinnelsen, så vil begge sett av diagnostiske primere ikke være tilstede i samme beholder, skjønt hvert sett av primere kan være tilstede sammen med hver av de reagenser som er beskrevet ovenfor i (2) og (3) og/eller forsterknings-primere i separate beholdere. Når den prøve som skal under-søkes først skal forsterkes ifølge europeisk patentpublikasjon nr. 237.362, så kan det være fordelaktig å innbefatte PCR-primerene så vel som den eller de diagnostiske primere i en enkel beholder sammen med reagensene som angitt under avsnitt (2) og (3) ovenfor. Hvis det er ønskelig, kan imidlertid den eller de diagnostiske primere være tilstede i en separat beholder for senere bruk etter at forsterkningen er utført.
Med begrepet "nukleosid trifosfat" forstås her de nukleosider som er tilstede enten i DNA eller RNA, og innbefatter nukleosider som inkorporerer adenin, cytosin, guanin, thymin og uracil som base, og hvor sukkerdelen kan være deoksyribose eller ribose. Vanligvis vil man anvende deoksyribonukleosid'r i kombinasjon med en DNA-polymerase. Det er imidlertid underforstått at man også kan bruke andre modifiserte baser som er i stand til å basepare seg med de vanlige kjente baser, dvs. adenin, cytosin, guanin, thymin og uracil. Slike modifiserte baser innbefatter f.eks. 8-azaguanin og hypoxantin.
Begrepet "nukleotid" refererer seg til de nukleotider som er tilstede i enten DNA eller RNA, og innbefatter således nukleotider som inkorporererer adenin, cytosin, guanin, thymin og uracil som base, og hvor sukkerdelen er deoksyribose eller ribose. Det er imidlertid underforstått at man også kan bruke andre modifiserte baser som er i stand til å basepare seg med én av de vanlige kjente baser, dvs. adenin, cytosin, guanin, thymin og uracil, i den diagnostiske primeren og den forsterkende primer som brukes i foreliggende oppfinnelse. Slike modifiserte baser innbefatter f.eks. 8-azaguanin og hypoxantin.
Det skal videre understrekes at når fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse skal brukes for å påvise et nærvær eller et fravær av et mistenkt variant nukleotid som ligger inntil en del av målbasesekvensen som ikke inneholder alle de fire forskjellige nukleotidene, så kan man få dannet et forlenget produkt av den diagnostiske primeren og, hvis det er ønskelig, et forlenget produkt av forsterkningsprimeren i nærvær av bare de passende tilsvarende nukleosidtrifosfåtene, og det er ikke nødvendig med alle fire forskjellige nukleosid-trif osf åtene .
Polymerisasjonsmidlet for nukleosidtrifosfåtene kan være enhver forbindelse eller system som vil funksjonere slik at man oppnår en syntese av primerforlengelsesproduktene, og heri inngår enzymer. Egnede enzymer for dette formål innbefatter, f.eks. E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragment av E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, andre tilgjengelige DNA-polymeraser, reversert transkriptase og andre enzymer og heri inngår termostabile enzymer. Med begrepet "termostabilt enzym" forstås her et enzym som er stabilt overfor varme og som er varmeresistent og som vil katalysere kombinasjonen av nukleotider2 på en passende måte slik at det dannes primerforlengelsesprodukter som er komplementære til hver enkelt nukleinsyretråd. Vanligvis vil syntesen starte i 3•-enden av hver primer og vil skje langs 5'-retningen langs templatetråden inntil syntesen slutter, idet man da får fremstilt molekyler av forskjellige lengder. Det kan f.eks. være enzymer, og her inngår også termostabile enzymer, som starter syntesen i 5'-enden og hvor den skjer i motsatt retning, idet man bruker samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Et foretrukket termostabilt enzym som kan brukes i foreliggende fremgangsmåte er det som kan ekstraheres og renses fra Thermus acruaticus. Dette enzymet har en molekylvekt på mellom 86.000 og 90.000 dalton som beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 237.362 (se også europeisk patentpublikasjon nr. 258.017). Thermus aquaticus-rase YT1 er tilgjengelig uten begrensning fra the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA som ATCC 25.104.
Med uttrykket "diagnostisk del" forstås her den del av målbasesekvensen (som definert i det etterfølgende) som inneholder som sitt terminale nukleotid det mulige variante nukleotid, og hvor man påviser et nærvær eller et fravær av dette. Vanligvis vil det mulige variante nukleotid være i den 5'-terminale enden av den diagnostiske delen, ettersom en vanlig syntese av primerforlengelsesprodukter vil starte i 3'-enden av hver primer som beskrevet ovenfor. Når imidlertid man bruker et polymerisasjonsmiddel hvor man starter syntesen i 5'-enden av den diagnostiske primer og denne skjer i 3'-retningen langs templatetråden inntil syntesen slutter, så vil den "diagnostiske delen" som inneholder det mulige variante nukleotid være i dens 3'-ende. De diagnostiske primere kan også utformes i så henseende som angitt i det etterfølgende.
Med uttrykket "målbasesekvens" forstås her en nukleotidsekvens som innbefatter minst én diagnostisk del (som definert ovenfor) . F.eks. i en enkelt prøve for /3-thalassemi vil en målsekvens kunne inneholde opp til 60, f.eks. 50 diagnostiske deler, og hvor hver diagnostiske del inneholder et enkelt mulig variant nukleotid.
Begrepet "oligonukleotid" slik det brukes her definerer et molekyl bestående av to eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinnsvis mer enn tre. Den nøyaktige størrelsen vil være avhengig av mange faktorer, såsom reaksjonstemperaturen, saltkonsentrasjonen, nærvær av formamid og nærvær av andre nære mutasjoner, såsom i sigdcelle Hb C sykdommen, som igjen er avhengig av den endelige funk-sjonen eller bruken av oligonukleotidet. Den nøyaktige sekvensen i oligonukleotidet vil i virkeligheten være avhengig av en rekke faktorer slik det er beskrevet i det etter-følgende. Oligonukleotidet kan fremstilles syntetisk eller ved kloning.
Med begrepet "primer" forstås et oligonukleotid enten det forekommer naturlig i et renset restriksjonsnedbrytnings-produkt eller produseres syntetisk, som er i stand til å virke som et startpunkt for en syntese når det plasseres under betingelser hvor man induserer en syntese av et primerforlengelsesprodukt som er komplementert til en nukleinsyretråd, dvs. i nærvær av passende nukleosidtrifosfater og et polymerisasjonsmiddel såsom DNA-polymerase i en passende buffer ("buffer" innbefatter pH, ionestyrke, kofaktor etc.) og ved en egnet temperatur.
Primeren er fortrinnsvis enkeltkjedet for å få en maksimal effekt under forsterkningen, men kan alternativt være dobbelttrådet. Hvis den er dobbelttrådet bør primeren først behandles for å skille trådene før de brukes for å fremstille forlengelsesprodukter. Det er foretrukket at primeren er et oligodeoksyribonukleotid. Primeren må være tilstrekkelig lang til at den kan prime syntesen av forlengelsesprodukter i nærvær av polymerisasjonsmidlet. Den nøyaktige lengden på primeren vil være avhengig av mange faktorer såsom temperatur og type av primer og bruk i fremgangsmåten. Avhengig av kompleksiteten på målsekvensen kan f.eks. diagnostiske og forsterkende primere typisk inneholde fra 12-35, f.eks. fra 15-35 nukleotider, skjønt de kan inneholde flere eller færre nukleotider. Kortere primermolekyler krever vanligvis lavere temperaturer til at man får danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templaten.
Med begrepet "komplementært til" slik det brukes her i forhold til nukleotider, innbefatter et nukleotid som vil basepare seg med et annet spesifikt nukleotid. Således vil adenosintrifosfat være komplementært til uridintrifosfat eller thymidintrifosfat og guanosintrifosfat er komplementært til cytidintrifosfat. Det er underforstått at skjønt thymidintrifosfat og guanosintrifosfat kan basepare seg under visse omstendigheter, så er de ikke ansett å være komplementære i foreliggende beskrivelse. Det er også underforstått at skjønt cytosintrifosfat og adenosintrifosfat kan basepare seg under visse omstendigheter, så er de her ikke betraktet å være komplementære i foreliggende beskrivelse. Det samme gjelder cytosintrifosfat og uraciltrifosfat.
Primerene her velges slik at de er "i alt vesentlig" komplementære til de forskjellige trådene for hver spesifikk sekvens som skal forsterkes. Dette betyr at primerene må være tilstrekkelig komplementære til at de hybridiserer seg med sine respektive tråder. Dette betyr at primersekvensen ikke nødvendigvis helt nøyaktig reflekterer templetten. F.eks. når < den diagnostiske primeren innbefatter en nukleotidsekvens, hvor det 3'-terminale nukleotidet er komplementært enten til det mistenkte variante nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid, så kan et ikke-komplementært nukleotid-fragment være knyttet til 5'-enden på primeren, men hvor resten av primersekvensen er komplementær til den diagnostiske del av målbasesekvensen. Meget vanlig er det imidlertid at primerene har nøyaktig komplementaritet bortsett fra når det gjelder ikke-komplementære nukleotider som kan være tilstede ved en forutbestemt primerterminus slik det er beskrevet tidligere.
Det er imidlertid underforstått at under visse omstendigheter kan syntesen av et diagnostisk primerforlengelsesprodukt kunne induseres selv i nærvær av et ikke-komplementært 3'-terminalt residuum. Dette kunstige produkt kan oppstå ved bruken av for lav temperatur, og i slike tilfeller må temperaturen økes. Man kan også ha brukt for lang inkuberings/herd-ningstid og i dette tilfellet må tiden reduseres, man kan anvende for høy saltkonsentrasjon og i slike tilfeller må saltkonsentrasjonen reduseres, for høy enzymkonsentrasjon, for høy nukleosidtrifosfatkonsentrasjon, en uriktig pH eller en uriktig lengde på oligonukleotidprimeren. Alle disse faktorene er beskrevet og diskutert i europeisk patentpublikasjon nr. 237.362. En hovedkilde for kunstige produkter skyldes antagelig at man lar reaksjonstemperaturen falle for langt ned, noe som gjør at man får for liten stringens, f.eks. ved at man fjerner reaksjonsblandingen fra oppvarmingscykli-seringsanordninger, selv i kort tid for å tilsette f.eks. polymerisasjonsmidlet (f.eks. Taq-polymerase) spesielt i den første reaksjonssyklusen. I tillegg til dette har man funnet at slike kunstige resultater kan også oppstå ved å bruke en diagnostisk primer som er spesielt rik på G (guanosin) og C (cytidin) rester. En diagnostisk primer kan også gi opphav til vanskeligheter i så henseende hvis den er rik på G/C som et hele eller spesielt, hvis den er G/C-rik i sin relevante, dvs. normale 3'-ende. Videre kan den type baseparing man har i området omkring 3'-enden i den diagnostiske primeren også gi opphav til et kunstig resultat. Således vil et nærvær av As (adenosin) under baseparingen i det relevante området, dvs. normalt 3'-enden og enden av den diagnostiske primeren, gi en forbedret spesifitet mens et nærvær av Gs (guanosin) ikke gjør det samme. Videre vil den nøyaktige type av mistilpasning i den relevante, dvs. normale 3'-enden av den diagnostiske primeren, være en viktig faktor som avgjør om man får et kunstig resultat eller ikke. Således vil f.eks. en AA- eller CT-mistilpasning normalt ikke resultere i hybridisering, men en GT- eller AC-mistilpasning kan resultere i en tilstrekkelig grad av hybridisering til at man får dannet kunstige produkter. Kunstige produkter kan unngås ved at man med hensikt innfører én eller flere ytterligere mistilpassede rester, eller hvis det er ønskelig, utelatelser eller innsetninger, i den diagnostiske primeren for derved å destabilisere den og redusere binding under hybridisering.
F.eks. kan én eller flere av de 10, f.eks. 6 nukleotider inntil den terminale mistilpasningen endres for å inntrodusere ytterligere mistilpasning. Vanligvis vil bare én mistilpasning i tillegg til den terminale mistilpasningen være tilstrekkelig, plassert f.eks. 1, 2, eller 3 baser fra den terminale mistilpasningen. I forhold til en bestemmelse av et nærvær av en normal homozygote, heterozygote eller påvirket homozygote med hensyn til Z-allelen i al-antitrypsingenet, så har man funnet at man kan oppnå gode resultater hvis det tredje nukleotidet fra 3'-terminal-nukleotidet er endret for å utvikle en mistilpasning. Man har f.eks. funnet at et nærvær av en C istedenfor en A som det tredje nukleotidet fra 3'-enden i den diagnostiske primeren, gjør det mulig å skille normale homozygoter, heterozygoter og påvirkede homozygoter med hensyn til Z-allelet. Den beste utformingen av en diagnostisk primer kan således bestemmes ved enkel eksperi-mentering basert på ovennevnte kriteria, og slik eksperi-mentering ligger godt innenfor den evne man har hos de fleste molekylære biologer.
Med begrepet "diagnostisk primer" forstås her en primer
< som har en nukleotidsekvens slik at et terminalt nukleotid velges slik at det enten er komplementært til det mistenkte variante nukleotid, eller til det tilsvarende normale nukleotid, slik at man får syntetisert et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primeren når det terminale nukleotid på denne er komplementært til det passende terminale nukleotid i den
tilsvarende diagnostiske delen av målbasesekvensen, mens man ikke får syntetisert noe slikt produkt når det terminale nukleotidet i den diagnostiske primeren ikke er homologt med det passende terminale nukleotidet i den tilsvarende diagnostiske delen av målbasesekvensen.
Med begrepet "forsterkende primer" forstås her en primer som er i stand til å hydridisere seg til nukleinsyretråden som er komplementær til den nukleinsyretråd til hvilke den diagnostiske primeren er i stand til å hydridisere seg, og hvor "forsterkningsprimeren" har en nukleotidsekvens som er slik, at den er i stand til å hybridisere seg til et diagnostisk primerforlengelsesprodukt, etter separasjon fra sitt komplement, hvorved det diagnostiske primerforlengelsesproduktet tjener som en template for syntese av et forlengelsesprodukt av forsterknignsprimeren, noe som letter forsterkningen.
Foreliggende oppfinnelse angår således i det minste delvis, en forbedring av forsterkningsprosesser, f.eks. av den type som er beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 237.362 hvor denne forbedringen gjør det mulig selektivt å forsterke enten en sekvens, som inneholder et mistenkt variant nukleotid hvis dette er tilstede, eller en sekvens som inneholder det tilsvarende normale nukleotid hvis dette er tilstede, hvorved man forenkler påvisningen samtidig som man unngår sekvensering, allelespesifikke oligonukleotider og restriksjonsnedbrytning. For en gitt nukleotidvariasjon, f.eks. ved en punktmutasjon, så vil dens nærvær eller fravær kunne påvises enten 1) ved å utforme den diagnostiske primeren med et passende terminalt nukleotid som er komplementært til den mistenkte nukleotidvariasjonen, slik at syntesen av et forsterket produkt vil indikere nærværet av en mistenkt nukleotidvariasjon, mens et fravær av et forsterket produkt vil være indikasjon på et fravær av den mistenkte nukleotid-variajsonen; eller 2) ved å utforme den diagnostiske primeren slik at den har et passende terminalt nukleotid som er komplementær til den tilsvarende normale nukleotid, slik at en syntese av et forsterket produkt vil indikere et fravær av den mistenkte nukleotidvariasjonen, mens et fravær av et forsterket produkt vil kunne indikere et nærvær av en slik mistenkt nukleotidvariasjon. Med hensyn til begrepet "passende terminalt nukleotid" forstås det terminale nukleotid i den primer fra hvilken syntesen eventuelt ville kunne starte. Vanligvis vil polymerisasjonsmidlet starte syntesen i 3'-enden av primeren, og derfor vil det passende terminale nukleotidet vanligvis være det 3'-terminale nukleotidet.
Bekreftelse på et nærvær eller fravær av f.eks. en gitt punktmutasjon kan oppnås ved å bruke både fremgangsmåte (1) og fremgangsmåte (2) som angitt ovenfor. En kombinasjon av de to metodene gir samlet en fremgangsmåte for påvisning av heterozygoter som er meget verdifull ved analyse av dominant ned-arvede tilstander eller lidelser, og ved påvisning av bærere av recessive arvede tilstander.
I en foretrukken utførelse vil foreliggende oppfinnelse angå en påvisning av et fravær eller en tilstedeværelse av mer enn én mistenkt variant nukleotid i samme prøve. Evnen til foreliggende fremgangsmåte til selektivt å forsterke sekvenser avhengig av de forutbestemte nukleotidsekvenser i de diagnostiske primere, gjør det mulig å skille multiple forsterkningsprodukter ganske enkelt og nøyaktig og med minimal utdannelse, noe som gjør det mulig å tilveiebringe en robust fremgangsmåte for undersøkelse av enkeltprøver for multiple nukleotid-variasjoner. Foreliggende oppfinnelse er således av spesiell interesse ved undersøkelse av enkeltprøver av DNA eller RNA for en lang rekke arvede tilstander, såsom genetiske sykdommer, predisponerte lidelser og somatiske mutasjoner som fører til forskjellige sykdommer. Slik DNA eller RNA kan f.eks. ekstraheres fra blod eller vev, f.eks. chorionisk villi eller amniotiske celler ved en rekke forskjellige teknikker av den type som er beskrevet av Maniatis et al, Molecular Cloning
(1982), 280-281. Etter hvert som den molekylære basis for
andre arvede tilstander blir kjent, så kan disse tilstandene inkluderes i den undersøkelsesteknikk som her presenteres.
Multiple forsterkningsprodukter kan skilles ved en rekke forskjellige teknikker. Således kan man f.eks. bruke prober for hvert mistenkt forsterket produkt, idet hver probe bærer et forskjellig og skillbart signal eller rest som er i stand til å gi et signal.
Slike signaler og rester som er i stand til å produsere signaler er detajert beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 246.864, men kan f.eks. innbefatte et fast faseforsterk-ningssystem av den type som er beskrevet av Wang C G i World Biotech Report 1986, vol. 2, del 2, p. 33-37, (Diagnostics Healthcare Proceedings fra konferansen som ble holdt i november 1986 i San Francisco), hvor mikroperler dannet med mange valgte sporelementer blir konjugert med proben. Nærværet av spesifikke prober kan påvises ved røntgen-fluorescensanalyse. En slik teknikk vil vanligvis være enkel og rett frem ettersom det bare er nødvendig å påvise eksistensen av et forsterkningsprodukt snarere enn å kunne skille mellom sekvenser som bare skiller seg fra hverandre ved hjelp av et enkelt nukleotid.
En langt enklere og foretrukken fremgangsmåte for å skille mellom forsterkningsprodukter innbefatter at man velger nukleotidsekvensene i forsterkningsprimerene slik at lengden på hvert forsterket produkt er forskjellig i foreliggende fremgangsmåte. I så henseende vil antall basepar som er tilstede i et forsterkningsprodukt være diktert av avstanden som skiller de diagnostiske og forsterkende primere. Således kan man utføre forsterkende primere slik at hver potensiell variant nukleotid er forbundet med et potensielt forsterkningsprodukt av forskjellig lengde.
Nærværet eller fraværet av et gitt mulig variant nukleotid kan således med fordel påvises ved hjelp av elektroforeseteknikk, hvor de forskjellige forsterkede produkter kan fordeles etter sin molekylvekt og så identifiseres, f.eks. ved hjelp av autoradiografi eller fluorescensteknikk. Lengdene på de forskjellige produktene kan bare skille seg ved et enkelt nukleotid, men vanligvis vil det være minst 3 nukleotider som skiller lengdene. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis gjennomført ved hjelp av et interkalerende fargestoff såsom etidiumbromid, som så kan visualiseres som en orange fluorescens ved ultrafiolett bestråling. Således vil et nærvær eller et fravær av en rekke av mulige variante nukleotider i en enkelt prøve raskt nøyaktig og lett kunne bestemmes. Hvis det er ønskelig, så kan den diagnostiske
primer eller primere og/eller forsterkningsprimeren(e) merkes, f.eks. ved hjelp av en fluorofor. Således kan f.eks. hver forskjellig diagnostisk primer eller forsterkningsprimer ha forskjellige fluorforer, slik at man får et batteri av prøver som kan avleses fra en elektroforesegel ved hjelp av en laserscanner, noe som gjør at man kan automatisere foreliggende fremgangsmåte. Alternativt kan nærvær eller fravær av et forsterket produkt bare bedømmes ved hjelp av et oppløsningsmiddel som selektivt kan oppløse nukleosidtri-f osf ater, men som ikke er i stand til å oppløse en nukleotid sekvens (f.eks. DNA). Trikloreddiksyre (TCA) er et eksempel på et slikt oppløsningsmiddel. Således kan f.eks. fravær eller nærvær av et forsterket produkt bestmmes ved en TCA-
utfelling fra en forsterket reaksjonsblanding. Hvis det er skjedd en inkorporering av de passende nukleosidtrifosfater i en eksponensiell reaksjonsserie, så vil vesentlig større mengder av TCA-uoppløselig materiale være tilstede enn når det ikke var skjedd en forlengelse av den diagnostiske primeren. Kvantifisering av uoppløselige forbindelser kan utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Således kan f.eks. nukleosid-trif osf åtene merkes (f.eks. ved hjelp av en radioaktiv markør eller en fluorescerende markør), hvoretter reaksjonsblandingen kan sentrifugeres, den tilstedeværende væsken kan helles av eller væsken eller de uoppløselige produkter kan underkastes vanlig kjent påvisningsteknikk, f.eks. radioaktiv telling eller fluorescensbestemmelse.
Et annet trekk ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en nukleotid sekvens med fra ca. 5 til ca. 50 bp for bruk i foreliggende fremgangsmåte, og hvor et terminalt nukleotid i nevnte sekvens er komplementært, enten til et mistenkt variant nukleotid som er forbudnet med en kjent genetisk sykdom, eller det tilsvarende normale nukleotid, og hvor resten av nevnte sekvens i alt vesentlig er komplementær til den tilsvarende målbasesekvensen som ligger inntil det mistenkte variante nukleotid eller det tilsvarende normale nuxleotid, og hvor nevnte nukleotidsekvens er slik at når man bruker en diagnostisk primer i foreliggende fremgangsmåte, så vil man få syntetisert et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primeren når nevnte terminale nukleotid i denne primeren er komplementær til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, og hvor man ikke får syntetisert noe produkt når nevnte terminale nukleotid i primeren ikke er komplementær til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen.
Det er hensiktsmessig at det terminale nukleotid, som er komplementært til enten et mistenkt variant nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid, er i 3'-enden av nukleotidsekvensen. Det er foretrukket at det mistenkte variante nukleotid er et resultat av en punktmutasjon i den tilsvarende normale sekvens.
Den nevnte nukleotidsekvensen kan f.eks. være fra 10 til
50 bp, f.eks. fra 10 til 36 bp.
Ifølge fire andre trekk ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt nukleotidsekvenser definert som angitt ovenfor, og hvor et terminalt nukleotid i nukleotidsekvensen er komplementært til et variant nukleotid som oppstår ved en forandring av det tilsvarende normale nukleotid til (i) A, (ii) G, (iii) C, (iv) T eller U hhv..
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et sett av to nukleotidsekvenser som definert ovenfor, og hvor et terminalt nukleotid i den ene sekvensen er komplementært til et mistenkt variant nukleotid forbundet med en kjent genetisk sykdom, og hvor et terminalt nukleotid i den annen sekvens er komplementært til det tilsvarende normale nukleotid.
Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse prober som består av en nukleotidsekvens som definert ovenfor, og som bærer et merke eller en markørkomponent.
Som et eksempel er det i det etterfølgende opplistet kjente genetiske sykdommer som viser de mutasjoner som er ansvarlig for sykdommen, foruten relevant litteraturreferanse for hver mutasjon. De nukleotidsekvenser og prober som er definert tidligere, kan f.eks. være basert på de genetiske sykdommer som detaljert er beskrevet i det etterfølgende, og hvor rekkefølgen i den relevante nukleotidsekvens eller probe er avledet fra den relevante litteraturreferanse som er angitt i tabellen.
+ = /?-Thalassemi-mutant (/3_) som forårsaker redusert j3-globin-kjedeproduksjon: 0 = en mutant (B°) som forårsaker et fravær av P-globinkjedeproduksj on.
Eksempler på utelatelser kan finnes i:
Forrest S M, Cross G C, Speer A, Gardner-Medwin D, Bum J, and Davies K E (1987) Preferential deletion of exons in Duchenne and Becker muscular dystrophies. Nature 320, 638-640.
Koenig M, Hoffman E P, Bertselson C J, Monaco A P, Feener C and Kunkel L M (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organisation of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell 50, 509-517. Malhotra S B, Hart K A, Klamut H J, Thomas N S T, Bodrug S E, Burghes A H M, Bobrow M, Harper P S, Thompson M W, Ray P N and Worton R G (1988) Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy, Science 242, 755-759.
Read A P, Mountford R C, Forrest S M, Kenwrick S J, Davies K E and Harris R (1988) Patterns of exon deletins in Duchenne and Becker muscular dystrophy. Hum. Genet. 80, 152-156.
Chamberlain J S, Gibbs R A, Ranier J E, Nguyen P N and
Caskey C T (1988) Deletion screening of the DMD locus via multiplex DNA amplification. Nuc, Ac. Res. 16; 23, 11141-11156.
Roberts R G, Cole C G, Hart K A, Bobrow M and Bentley D R (1989) Rapid carrier and prenatal diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy, Nuc. Ac. Res. 17; 2,811.
Ofte er det bare små mengder av genomisk DNA som er tilgjengelig for analyse. Man har funnet at spesifiteten for en diagnostisk primer for relevante normale eller variante nukleotidsekvenser kan hensiktsmessig bedømmes ved å øke antall kopier av nukleotidsekvensen(e) i hybridiseringsprøven. Dette kan f.eks. oppnås ved å konstruere en dobbelttrådet "kassett" som består av en normal sekvens festet til en variant sekvens, og hvor det er en mistilpasning mellom to nukleotider i tilstøtende tråder fortrinnsvis nær midten av kassetten. Kopier av denne kassetten kan så fremstilles hensiktsmessig ved at den innsettes i en plasmidvert fulgt av en replikasjon av plasmidet og en isolasjon av de forønskede sekvenser, noe som kan skje ved hjelp av kjent bioteknologisk teknikk. Denne fremgangsmåten er hensiktsmessig illustrert på figur 10.
For at man skal få en bedre forståelse av foreliggende oppfinnelse, er den i det etterfølgende beskrevet ved hjelp av eksempler med henvisning til de vedlagte tegningene, hvor: Figurene l(a) og l(b) illustrerer den første utførelsen av oppfinnelsen, figur l(c) illustrerer et typisk resultat av en slik prøve slik den kan vises ved hjelp av elektroforese; figurene 2(a) og 2(b) illustrerer den andre utførelsen av oppfinnelsen; figur 3 illustrerer en foretrukken fremgangsmåte for å skille mellom multiple forsterkningsprodukter; figurene 4(a) og 4(b) illustrerer en tredje utførelse av foreliggende oppfinnelse; figurene 5(a), (b) og (c) illustrerer den fjerde utførelse av oppfinnelsen; figur 6 (ikke i skala) viser det humane al-antitrypsingen; og figur 7 viser resultatet av en visualisering av den gel, man fikk fremstilt i eksemplene 1 og 2. Figur 8 viser visualiseringsresultatet fra en gel hvor stripene 1-4 representerer resultatene fra eksempel 3, stripene 5-8 representerer en del av resultatene fra eksmepel 4 mens stripe 9 representerer en størrelsesmarkør. Figur 9 viser visualiseringsresultatene av den gel hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 4. Figur 10 illustrerer bruken av et kassettplasmidsystem for å forsterke en forønsket DNA-dupleks. Figur 11 viser den femte utførelsen (lineær forsterkning) av foreliggende oppfinnelse. Figur 12 viser resultatene av en visulalisering av den gel, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 5. Figur 13 viser visualiseringsresultatene fra den gel hvis
fremstilling er beskrevet i eksempel 6.
Figur 1 viser den første utførelse av den foreliggende fremgangsmåte. Figur l(a) viser denaturerte genomiske DNA-tråder inneholdende et normalt nukleotid (N) i en stilling, hvor man f.eks. som et resultat av en genetisk sykdom, kan vente å finne et mistenkt variant nukleotid. Hvis man kontakter nukleinsyretråden under hybridiserende betingelser med en diagnostisk probe med et 3'-terminalt nukleotid som er komplementært til det
normale nukleotidet (-N) i nærvær av passende nukleosid-trif osf ater og et polymerisasjonsmiddel for disse trifosfater, vil resultere i en kjedeforlengelse av den diagnostiske primeren i 3'-retningen som vist på figur l(b). Det vil ikke bli noen slik kjedeforlengelse når man bruker en diagnostisk primer hvor det 3'-terminale nukleotidet er komplementært til det mistenkte variante nukleotid (-M). Et eventuelt kjedeforlenget produkt av den diagnostiske primeren kan så denatureres og en forsterkende primer (A) kan hybridiseres til det denaturerte produkt, noe som gir et ytterligere kjedeforlenget produkt. Dette kan så
denatureres og fremgangsmåten gjentas for å oppnå en forsterk-ning. Det området av det genomiske DNA som underkastes en forsterkning ved hjelp av den diagnostiske primeren, er betegnet DG på figur l(b). De diagnostiske produkter fra dette området er ansvarlig for de bånd som er betegnet DG på figur l(c). Som
en kontroll kan man bruke PCR (polymerasekjedereaksjon) primere (P) betegnet P på figur l(a) i en separat posisjon på nukleinsyretråden eller en annen nukleinsyretråd, f.eks. et annet
kromosom, f.eks. fra humant DNA. Denne separate posisjonen er betegnet PCR på figur l(c), og PCR kontrollproduktene fra denne posisjon er ansvarlig for de bånd som er betegnet PCR på figur l(c). Det fremgår at de bånd som er betegnet PCR kan representere enten større eller mindre produkter av det produktet som er representert ved båndet DG.
Figur l(c) viser resultatet av den fremgangsmåte som er vist på figur l(a) og l(b), i form av bånd som er oppløst på en agarosegelelektroforese i forhold til f.eks. en genetisk lidelse forårsaket av en punktmutasjon, og som er analysert enten ved å bruke en -M eller -N diagnostisk primer etter behov. Hvis den pasient som prøves, er en bærer (C) av den genetiske sykdommen, så vil man se bånd både med hensyn til normale (N) nukleotidsekvenser og den variante nukleotidsekvens (M). Normale homozygoter (N) vil vise et bånd som er tilstede med hensyn til normale nukleotidsekvenser, men intet bånd [angitt som ( )] med hensyn til variantnukleotid, og homozygoter for sykdommen som gir mutasjon (pasienter med genetisk sykdom (D) vil ikke vise noe bånd [vist som ( )] med hensyn til den normale nukleotidsekvensen, og et bånd med hensyn til den variante nukleotidsekvensen . Figur 2 illustrerer den annen utførelse av foreliggende oppfinnelse. Man bruker en diagnostisk primer for hver tråd av en dobbelttrådet nukleinsyre. I (a) er de diagnostiske primere utformet slik at det 3'-terminale nukleotidet er komplementært til det normale nukleotidet. Denne fremgangsmåten skjer som beskrevet i forbindelse med figur 1, men med to forskjellige diagnostiske primere som starter forsterkningen hvis det relevante nukleotidet er tilstede. I denne fremgangsmåten er således den andre diagnostiske primeren ekvivalent til forsterkningsprimer (A) på figur 1. På figur 2(a) vil således forsterkningen bli startet ved hjelp av primerene (-N og N-), men ikke av diagnostiske primere med 3'-terminale nukleotider som er komplementære til den variante nukleotidsekvensen (-M og M-). Det motsatte er tilfelle på figur 2(b), ettersom den variante sekvensen er tilstede i nukleinsyrestrådene i prøven. Resultatene av den fremgangsmåte som er vist på figur 2 kan vises på samme måte som vist på figur l(c), men de der angitte referanser til normal og variant (N og M) vil tilsvare par i slike sekvenser. Bokstaven P på figur 2 refererer seg til de PCR-primere som ble brukt som en kontroll. Figur 3 viser en måte ved hjelp av hvilken multiple forsterkningsprodukter kan utskilles, og derved muliggjøre en prøving av en enkel prøve av RNA eller DNA for en rekke arvelige tilstander. To tråder (denatuerert) av DNA eller RNA fra en prøve er vist inneholdende tre separate loci angitt med tallene 1, 2 og 3. Et annet område i en viss avstand fra disse loci brukes for PCR-forsterkning og tjener som en kontroll. Med hensyn til locus (1) bruker man en 20-mer diagnostisk primer (5'-N 3') sammen med en annen 20 mer (3'N-5') diagnostisk primer. Hvis forsterkningen finner sted i locus (1) vil man oppnå et 39-mer forsterket produkt. Ettersom det 3'-terminale nukleotid på figuren er normalt noe som også er tilfelle med det relevante nukleotidet i selve prøven, så vil man få en forsterkning. På tilsvarende måte vil man få en forsterkning hvis det relevante nukleotidet i prøven er et variant nukleotid, og de brukte diagnositiske primere også bærer et 3'-terminalt variant nukleotid. Man vil imildertid ikke få noen slik forsterkning når det er en mistilpasning mellom det relevante nukleotidet i prøven og det 3'-terminale nukleoltidet i den diagnostiske primeren. I locus (2) er den diagnostiske primeren utformet slik at den gir et 49-mer forsterket produkt hvis det skjer en forsterkning, og i locus (3) er de diagnostiske primere utformet slik at de gir et 59-mer forsterket produkt hvis det skjer en forsterkning. Ettersom det fremgår av det ovenfor angitte at båndestørrelsen for det forsterkede produktet er summen av størrelsene på de to diagnostiske primere minus én, så er det mulig å utføre multiple tester på en enkelt prøve i et enkelt reaksjonskar ved å passende utforme individuelle diagnostiske primere som karakteriserer hvert locus av interesse. Etter hvert som størrelsen på summen av de diagnostiske primere øker, så kan forsterkningsproduktene også oppløses på en agarosegel. Man kan oppnå en forbedret oppløsning hvis de diagnostiske primere markeres på enhver hensiktsmessig måte, og deretter kan f.eks. oppløses på en akrylamidgel. På figur 3 vil bokstaven P referere seg til de PCR-primere som brukes som en kontroll.
Figur 4 viser den tredje utførelsen av foreliggende oppfinnelse hvor det utføres en vanlig forsterkning av en nukleinsyresekvens som inneholder et normalt nukleotid i den stilling hvor et mistenkt variant nukleotid kan være tilstede, og hvor man f.eks. bruker vanlige PCR-primere. På lignende måte vil man få en vanlig forsterkning hvis det mistenkte variante nukleotid var tilstede istedenfor et normalt nukleotid. Det forsterkede produktet kontaktes med en diagnostisk primer som beskrevet tidligere i forbindelse med den tredje utførelsen av oppfinnelsen. Når det forsterkede produktet innbefatter en nukleinsyresekvens som inneholder et normalt nukleotid som beskrevet ovenfor, og man bruker en diagnostisk primer med et 3•-terminalt normalt nukleotid, så vil man få dannet et forlenget produkt av den diagnostiske primeren [ved å bruke den nukleotidsekvens som fremstilles ved vanlig PCR-forsterkning, (her referert som PCR-kontrollproduktet) som en template], forutsatt at det er tilstede passende nukleosidtrifosfater og et polymerisasjonsmiddel for disse trifosfater. Det vil ikke være nødvendig med noen forsterkningsprimer ettersom templaten for produksjon av det forlengede diagnostiske primerproduktet allerede er blitt forsterket. Nærvær eller fravær av det diagnostiske primer-forlengelsesproduktet betegnet DG på figur 4(b)) så vel som nærvær av PCR-kontrollproduktet (betegnet PCR på figur 4(b) kan f.eks. påvises ved hjelp av elektroforeseteknikk.
Det er underforstått at et diagnostisk primerforlengelsesprodukt også vil bli dannet når PCR-kontrollproduktet inneholder et variantnukleotid og den anvendte diagnostiske primeren har et 3'-termianlt komplementært variantnukleotid.
De resulterende produktbånd kan visualiseres, f.eks. som vist på figur 4(b). Symbolene N- M-, C-, N, D, DG og PCR er som definert i forhold til figur l(c). Båndet fra det forlengede produkt av den diagnostiske primeren har en lavere molekylvekt enn PCR-kontrollbåndet (som vist på figur 4b). I dette tilfellet vil kontrollbåndet representere en virkelig indre kontroll, ettersom én av PCR-primerene tjener som forsterkningsprimer for forsterkningen av det forlengede produkt av den diagnostiske primeren. I de tilfeller hvor PCR-kontrollproduktet inneholder et variant nukleotid og den diagnostiske primeren har et 3'-terminalt normalt nukleotid og vice versa , så vil man ikke få dannet noe forlengelsesprodukt. Hvis det er ønskelig, kan den tredje utførelsen av oppfinnelsen gjennom-føres ved at man kontakter den prøve som skal undersøkes ved begynnelsen av prøven, ikke bare med PCR-primere, men også med den diagnostiske primeren. Det er således ikke nødvendig å forsinke bruken av den diagnostiske primeren inntil man har oppnådd den forønskede grad av forsterkning med hensyn til PCR-kontrollproduktet. Den diagnostiske primeren kan i virkeligheten brukes med eller på ethvert tidspunkt etter at man har brukt PCR-primerene. Prøven kan derfor gjennomføres, f.eks. ved at man ganske enkelt tilsetter den prøve som skal undersøkes til en enkelt beholder, og hvor denne inneholder PCR-primerene, den diagnostiske primer, passende nukleosidtrifosfater, samt et polymerisasjonsmiddel for sistnevnte. De produkter som oppnås og således de produktbånd som vil bli sett vil være de samme som beskrevet ovenfor og angitt på figur. 4.
Figur 5 viser en fjerde utførelse av foreliggende oppfinnelse, hvor det utføres en vanlig forsterkning som beskrevet i forhold til figur 4. Det oppnådde forsterkede produkt blir så under hybridiserende betingelser kontaktet enten med (a) to separate diagnostiske primere som definert tidligere og som hver har et 3'-terminalt normalt nukleotid, eller b) to diagnostiske primere som beskrevet tidligere, som hver har et 3'-terminalt variant nukleotid (se figur 5a). Dannelsen av forlengelsesprodukter etter en enkelt syklus vil vise hvorved prøvenukleinsyren inneholder det normale eller det mistenkte variante nukleotid, idet elektroforeseteknikk gir et båndmønster lik det som er vist på figur 5b. Det skal understrekes imidlertid at når man bruker to diagnostiske primere, så vil den ene tjene som en forsterkningsprimer for den andre. Hvis det er ønskelig, så kan et eventuelt forlengelsesprodukt i seg selv underkastes en forsterkning. Etter flere sykluser så vil de lavmolekylære produktene slik det er vist med de andre båndene på figur 5c, bli dannet i forhold som er avhengig av det relative forhold mellom de opprinnelige PCR-primereoligonukleotidene og den tilsatte diagnostiske primeren. PCR-forsterkningsproduktene kan lett skilles fra de forsterkede produkter fra den diagnostiske primerforlengelsen, f.eks. ved å øke eller å nedsette den avstand som skiller bindeposisjonene for PCR-primerene på genomet.
Hvis det er ønskelig, kan en fjerde utførelse av oppfinnelsen gjennomføres ved at den prøven som skal undersøkes ved begynnelsen av undersøkelsen, ikke bare kontaktes PCR-primerene, men også de diagnostiske primere. Det er således ikke nødvendig å forsinke bruken av den diagnostiske primer inntil man har oppnådd en forønsket grad av forsterkning med hensyn til PCR-kontrollproduktet. Den diagnostiske primeren kan i virkeligheten brukes sammen med eller på ethvert tidspunkt etter at man har brukt de angitte PCR-primere. Prøven kan derfor gjennom-føres f.eks. ved at man ganske enkelt tilsetter den prøve som skal undersøkes til en enkel beholder, som inneholder PCR-primerene, de diagnostiske primere, passende nukleosidtrifosfater og et polymerisasjonsmiddel for sistnevnte. Hvis prøven gjennomføres på denne måten, så vil de lavmolekylære diagnostiske produkter som er angitt ovenfor, bli dannet og gir så opphav til de ytterligere bånd som er vist på figur 5.
Figur 6 (ikke i skala) viser det humane al antitrypsingenet som er velkjent i bioteknologien [Long G.L., et al Biochemistry Vol 23 p. 4828-4837, (1984)], og viser bl.a. de relative posisjoner for exonene III og V som henholdsvis bærer de mulige S- og Z-mutasjoner av al-antitrypsinproteinet. Mer spesielt viser figuren exon III av al antitrypsingenet og viser stillingen på S-varianten, hvor kodonet GAA er mutert til GTA, noe som resulterer i produksjon av en valinrest i aminosyre 264 istedenfor en glutaminsyrerest. En primer I har følgende sekvens:
som hybridiserer seg til stillingene 7440-7469 i al-antitrypsingenet, og hvor man hensiktsmessig kan bruke enten en primer II med følgende sekvens: eller en primer Ila (en CT 3' mistilpasning basert på II) med følgende sekvens: som begge er utformet for posisjonene 7770-7799 i al-antitrypsingenet. Figuren viser ytterligere exon V i al-antitrypsingenet og viser stillingen på Z-varianten hvor codonet GAG er mutert til AAG, noe som resulterer i produksjonen av en lysinrest i aminosyre-stilling 342 istedenfor en glutaminsyrerest. Man kan hensiktsmessig bruke en primer III med følgende sekvens: som hybridiserer seg til posisjonene 9890-9919 i al- antitrypsingenet, og en primer IV med følgende sekvens:
som hybridiserer seg til posisjonene 10081-10109 i al-antitrypsingenet. Den basenummerering som er angitt ovenfor, er i overensstemmelse med det som er angitt, i Biochem, 23. 4828-4837, 1984.
Figur 7 viser visualiseringsresultatet av den gel, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1 og 2. Bånd 1 representerer et plasmid inneholdende Exon V og spaltet med Alu I;
Bånd 2 viser en størrelsesmarkør som er bakteriofag * X174 DNA spaltet med Hae III; Bånd 3 viser en forsterkning av Exon III med primere I og II som definert her, og en forsterkning av Exon V med primere III og IV som definert ovenfor i den samme reaksjonsblandingen som gir produktene av 360 bp og 220 bp hhv.. Bånd 4 viser at det ikke er skjedd noen forsterkning av Exon III ved å bruke primerene I og Ila som definert tidligere, men at det er blitt en forsterkning av Exon V med primerene III og IV. Bånd 5 viser en negativ kontroll hvor primerene I, II, III og IV var tilstede under betingelser som effektivt fremmer forsterkning, men hvor det ikke var tilstede noe genomisk DNA.
Figur 8 viser i båndene 1-3 resultatene fra eksempel 3, i båndene 5-8 resultatene av å bruke normale og mutante diagnostiske primere hvor det ikke var utført noen destabilisering som angitt i eksempel 4, mens bånd 9 viser størrelsesmarkøren bakteriofag * X174. Bånd 1 viser resultatet ved å bruke nukleotidsekvensen:
som den diagnostiske primeren, og det oligonukleotid som er betegnet I, som forsterkningsprimeren. Det humane genomiske DNA som ble brukt, var fra en normal homozygot med et normalt nukleotid (A) i det mulige S mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet. Det forventede 267 bp forsterkningsproduktet er klart synlig. Bånd 2 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen: som den diagnostiske primeren og oligonukleotidet I som forsterkningsprimeren. Det humane genomiske DNA som ble brukt var fra en normal homozygot med et normalt nukleotid (A) i det mulige S mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet. I et nærvær av en A-A mistilpasning vil det ikke bli dannet noe 267 bp forsterkningsprodukt. Bånd 3 viser et kontrollbånd basert på humant apolipoprotein B gen med følgende sekvens
Bånd 4 er ubrukt.
Bånd 5 viser resultatene av å bruke nukleotidsekvensen
som en diagnostisk primer i eksempel 4. Den diagnostiske primeren har et 3' terminalt nukleotid (G) som er i stand til å basepare seg med et normalt nukleotid (C) i det mulige Z-mutasjonspunktet og er ellers fullstendig komplementært til nevnte prøve DNA. Dette prøve DNA var fra en normal homozygot med et normalt nukleotid (C) i det mulige Z-mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet. Bånd 6 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen: som den diagnostiske primeren i eksempel 4. Denne primeren bærer det 3'terminale nukleotid (A) som er i stand til å basepare seg med et mutant nukleotid (T) i Z-mutasjonspunktet, men er ellers fullstendig komplementært til prøven DNA. Den anvendte prøven DNA var fra en normal homozygot med et normalt nukleotid (C) i det potensielle Z-mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet. Bånd 7 viser resultatene man oppnådde ved å bruke nukleotidsekvensen med formel VII som den diagnostiske primeren i eksempel 4. Prøven DNA var fra en homozygot som hadde en human al-antitrypsingenetisk sykdom og som hadde et mutant nukleotid (T) i Z-mutasjonspunktet. Bånd 8 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen med formel VIII som den diagnostiske primeren i eksempel 4. Prøven DNA var fra en homozygot som hadde en human al-antitrypsingenetisk sykdom som hadde et mutant nukleotid (T) i Z-mutasjonspunktet. Nukleotidsekvensen i den forsterkningsprimer som ble brukt i hver av disse prøvene som er vist i båndene 5-8, har formel IV som definert tidligere. Det fremgår at produksjonen av 150 bp forsterkningsprodukt ikke fullt er undertrykt ved nærværet av en A-C mistilpasning (bånd 6) og er enda mindre undertrykt av et nærvær av en GT mistilpasning (bånd 7). Figur 9 viser visualiseringsresultatene fra den gel som ble fremstilt i eksempel 4. Båndene 1 og 14 viser størrelses-markøren bakteriofag X174 DNA spaltet med Hae III; Bånd 2 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen: som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) tilstede i det mulige Z mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet (prøve DNA var fra en normal homozygot). Den diagnostiske primeren har en bevisst endring (understreket i sekvensen IX-A istedenfor i C) med hensyn til det femte nukleotidet fra 3'-enden, men et 3'terminalt nukleotid (G) som er i stand til å basebare seg med et mutant nukleotid (C) som er tilstede i det potensielle Z-mutasjonspunktet. Bånd 3 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen:
som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) tilstede i det mulige Z-mutasjonspunktet (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagnostiske primeren har en bevisst endring (understreket i sekvensen X-A istedenfor i C) med hensyn til det femte nukleotidet fra 3'enden, og et 3'terminalt nukleotid (A) som er i stand til å basepare seg med et mutant nukleotid (T) hvis dette er tilstede i det potensielle Z-mutasjonspunktet; bånd 4 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen IX (som definert tidligere) som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutasjonen, og således en bærer av den humane al-antitrypsin genetiske sykdommen; bånd 5 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen X (som definert her) som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutasjonen, og således en bærer av den genetiske underskudds-sykdommen med hensyn til al-antitrypsin. Bånd 6 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen IX (som definert
tidligere) som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en homozygot som har nevnte humane al-antitrypsingenetisk sykdom, bånd 7 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen X (som definert tidligere) som en diagnostisk primer i nærvær av en prøve-DNA fra en homozygot som også har samme sykdom.
Bånd 8 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen: som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) i det mulige Z mutasjonspunktet i det humane al-antitrypsingenet (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagnostiske primeren bærer en bevisst endring (understreket i sekvens XI-C istedenfor i A) med hensyn til det tredje nukleotidet fra 3'enden, men har et 3'terminalt nukleotid (G) som er i stand til å basepare seg med et normalt nukleotid (C) som er tilstede i det potensielle Z mutasjonspunktet; Bånd 9 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen: som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) i det potensielle Z mutasjonspunktet (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagnostiske primeren bærer en bevisst endring (understreket i sekvens XII - C istedenfor i A) med hensyn til det tredje nukleotid fra det 3' terminale nukleotid og et 3'terminalt nukleotid (A) som er i stand til å basepare seg med et mutant nukleotid (T) hvis dette er tilstede i det potensielle Z-mutasjonspunktet; bånd 10 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen XI (som definert tidligere), som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutasjonen, og således en bærer av den nevnte humane al-antitrypsingenetiske sykdommen; bånd 11 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen XII (som definert tidligere), som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutasjonen og således en bærer av den nevnte sykdommen. Bånd 12 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen XI (som definert tidligere) som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve-DNA fra en homozygot som har den nevnte antitrypsinunderskuddsgenetiske sykdommen. Bånd 13 viser resultatet av å bruke nukleotidsekvensen XII (som definert her) som en diagnostisk primer i nærvær av et prøve DNA fra en homozygot som har nevnte humane al-antitrypsingenetiske sykdom.
I hvert av båndene 2-13 ble nukleotidsekvensen med
formel IV brukt som forsterkningsprimeren, mens man brukte nukleotidsekvensene med formelen XIII:
og formel XIV:
som en kontroll. De bånd som tilsvarer kontrollen er merket (C) på figur 9 og tilsvarer et 510 bp forsterkningsprodukt fra exon 26 i det humane apolipoprotein B-genet.
Figur 10 viser bruken av et kassettplasmidsystem. Plasmid pAT 153 har områder som har antibiotisk motstand til Ampicillin (Ap<r>) og tetracyklin (Tc<r>) foruten restriksjonsposisjonene EcoRI, BamHI og Sali, og som er nedbrutt med EcoRI og BamHI. Den syntetiske kassetten som innbefatter en DNA dupleks med et mistilpasset nukleotid (i sentrum) p.g.a. et nærvær av både en normal og en variant sekvens, bli ført inn i plasmidverten som vist ved å bruke en T4 DNA-ligase. Man repliserer og selekerer deretter plasmidet som vist.
Systemet er illustrert mer detaljert på følgende måte: Man fremstilte syntetiske DNA-kassetter som hver bestod av to sammensmeltede 65merer med EcoRI- og BamHI-restriksjonstermini og et midlere basepar som var mistilpasset p.g.a. et variant nukleotid. Disse kassetter ble ført inn i pAT153 plasmidverter som beskrevet ovenfor, og etter transformasjon ble tetracyklin-følsomme kloner isolert og plasmid ekstrahert. Plasmid-ekstraktene ble så brukt i en sekundær transformasjon for å gi kloner som enten hadde normale eller variante innsatte nukleotider. For å verifisere at klonene inneholdt den komplette normale eller mutante sekvens undersøkte man med hensyn til sekvens ca. 2 fig av hver, noe som skjedde etter NaoH-denature-ring og ved å bruke T4 DNA-polymerase (Sequenase, US Biochemicals) og en <32>P ende-merket primer. Når man hadde funnet minst én normal og én variant av hver type, dyrket man en representativ klon av hver av disse i stort volum, hvoretter plasmidet ble ekstrahert og renset ved å bruke en CsCl-gradient. Kassettene ble så spaltet med Sali, ekstrahert med fenol/kloro-form, utfelt og vasket med 70% etanol. Kassettene var så ferdig til bruk, f.eks. i polymerasekjedereaksjoner for å bestmeme sensiviteten og spesifiteten på forskjellige oligonukleotider. Figur 11 illustrerer en femte utførelse (lineær forsterkning) ifølge foreliggende oppfinnelse. I a) er det vist en normal genomisk DNA-sekvens sammen med to diagnostiske primere, hvorav én er komplementær i sin 3'-terminale ende til den normale genomiske DNA-sekvensen, mens den andre primeren har et nukleotid som er komplementært til det mistenkte variante nukleotid i dennes 3' terminale ende. I b) er det vist en variant genomisk DNA-sekvens sammen med de samme to diagnostiske primere. Når den genomiske DNA-sekvensen kontaktes med primerene under betingelser som tillater en komplementær hybridisering, så vil man i begge tilfelle få en slik hybridisering. Tilsetning av alle fire nukleosidtrifosfåtene under nevnte betingelser som gir primerforlengelse, vil bare føre til et forlenget produkt i tilfellet a) med den normale sekvensprimeren, og i b) vil man med den variante sekvensprimeren få hindret en forlengelse av denne p.g.a. en mistilpasning. Som vist i c) hvor bare tre eller færre passende nukleosidtrifosfater er tilsatt istedenfor fire, så vil man få hindret en forlengelse av den passende primeren på et gitt punkt p.g.a. en mangel av det eller de passende nukleosidtrifosfåtene. Figur 12 viser visualiseringsresultatene i den gel som er fremstilt som beskrevet i eksempel 5.
Båndene 1 og 2 tilsvarer DNA for en normal homozygot (MM), båndene 3 og 4 til DNA for en heterozygot (MS) og båndene 5 og 6 til DNA for en variant homozygot (SS). Med hensyn til båndene 1, 3 og 5, brukte man et normalt oligonukleotid XXII og med hensyn til båndene 2, 4 og 6 brukte man et variant oligonukleotid XXI. Som forutsatt og ventet fikk man ingen oligonukleotidforlengelse med hensyn til båndene 2 eller 5. De påviste produktbåndene er indikert med pilodder.
Figur 13 viser resultatene av en visualisering av den gel hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 6.
Båndet på venstre side viser størrelsesmarkører som ble brukt for å bekrefte størrelsen på de oppnådde produkter. Båndene 1 og 2 tilsvarer DNA fra en normal homozygot (MM), båndene 3 og 4 til DNA fra en heterozygot (MZ) og båndene 5 og 6 til DNA fra en variant homozygot (ZZ). Med hensyn til båndene 1, 3 og 5 brukte man primerene XIX og XI, mens man for båndene 2, 4 og 6 brukte primerene XII og XX. Som ventet fikk man ingen primerforlengelse i båndene 2 eller 5. De påviste produktbåndene er indikert ved hjelp av pilodder.
Sekvens av a- l- antitrvpsin S- locuset ( exon III).
De baser som er vist i det nedre tilfellet angir den normale sekvens i hvert locus. Understrekede baser i primerene viser en bevisst mistilpasning som er innsatt for å destabilisere primerene. Koordinatene er som angitt av Long et al (1984) Biochemistry 23. : 4828-4837.
Sekven s i a- l- antitrypsin Z- locuset ( exon V ) .
De baser som er vist i det nedre tilfellet angir den normale sekvens for hvert locus. De baser som er understreket i primerene viser den bevisste mistilpasningen som er innsatt for å destabilisere primerene.
Oppfinnelsen er illustrert, men ikke begrenset av de følgende eksempler. I eksemplene er det hvis intet annet er angitt, brukt materialer og forbindelser i de følgende mengder eller konsentrasjoner:
Substrat DNA: 1 ug humant genomisk DNA
Oligonukleotider: 100 pmol av hvert passende oligonukleotid. Deoksynukleosidtrifosfater: Hver i en sluttkonsentrasjon på 1,5 mM buffer (endelig konsentrasjon i reaksjonsblanding):
67 mM tris (pH 8,8 med HC1)
16,6 mM ammoniumsulfat
6,7 mM magnesiumklorid
10 mM /3-merkaptoetanol
6,7 /iM EDTA
Ladningsbuffer: 35% Ficoll 70 - (Ficoll 70 er en syntetisk polymer som fremstilles ved en sampolymeri-
sering av sukrose og epiklorhydrin, og denne sampolymering har en omtrentlig midlere
molekylvekt på 70 000 - produkt fra Pharmacia)
200 mM tris-acetat
100 mM natriumacetat
5 mM EDTA
0,2% bromfenolblått
Størrelsesmarkører: Bakteriofag * X174 DNA spaltet med Hae III; Størrelse på bånd i baseparene er: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 og 72.
Eksempel 1
1 ug humant genomisk DNA, 100 pmol av hver av oligonukleotidene I, II, III og IV som definert tidligere, 1,5 mM (sluttkonsentrasjon) av hver av de fire deoksynukleosid-trifosfåtene og buffer i sluttkonsentrasjonene som angitt ovenfor, ble blandet i et 1,5 ml skruekorkmikrosentrifugerør og volumet ble justert til 100 jul med sterilt destillert vann. Røret ble lukket og plassert i kokende vann i 5 min.. Reaksjonen ble startet ved å tilsette 1 fil Taq-polymerase som inneholdt 1 enzymenhet (Anglian Biotech porsjon 3 fortynnet til 1 enhet//xl med ovennevnte buffer) . Røret ble inkubert ved 58°C i 4 min. og så ved 91°C i 2 min.. 58°C/91°C oppvarmings-/avkjøl-ningssyklusen ble utført 5 ganger, og etter dette tilsatte man 1 ytterligere enhet enzym (som nevnte ovenfor). Vekslingen mellom 58°C/91°C ble så forsatt ytterligere 6 ganger fulgt av en tilsetning av ytterligere 1 enhet av enzym som nevnt ovenfor. Samme variasjon ble fortsatt ytterligere 6 ganger hvoretter man igjen tilsatte 1 enzymenhet, hvoretter 5 sykluser ble fulgt av en tilsetning av 1 ytterligere enhet som angitt ovenfor, hvoretter man utførte 2 sykluser til fulgt av en tilsetning av 1 enzym-enhet som ovenfor. Reaksjonsblandingen ble så inkubert ved 58°C i 20 min..
Påvisning av forsterkningsproduktene ble utført ved å blande 15 /il av reaks jonsblandingen med en separat 5 fil porsjon av den gelladende bufferen fulgt av elektroforese på en agarosegel (3% "NuSieve") som inneholdt ethidiumbromid
(2 ug/ml). Elektroforesen ble utført i forhold til størrelses-markører for å få en bekreftelse på den korrekte størrelsen av forsterkningsproduktene. Gelen ble visualisert i et trans-illumineringsapparat (3 00 nm bølgelengde) og det ble tatt et polaroidbilde. Bånd 3 på figur 7 viser resultatet av denne visualiseringen. Dette båndet viser en forsterkning av Exon III med primer I og II som angitt ovenfor, hvorved man fikk
fremstilt et 360 bp produkt og en forsterkning av Exon V med primerene III og IV som definert ovenfor, ga et produkt bestående av 220 bp.
Eksempel 2
Eksempel 1 ble gjentatt, men primeren II ble erstattet med primer Ila som definert tidligere. Bånd 4 på figur 7 viser visualiseringsresultatet av den gel man fikk i dette eksemplet. Det fremgår at det ikke skjedde noen forsterk-ning av Exon III når man brukte primerene I og Ila som definert tidligere, men at man fikk en forsterkning av Exon V med primerene III og IV, som ga det samme 220 bp produktet som i eksempel 1.
Eksempel 2 viser således at en mistilpasning i 3'-enden av oligonukleotidprimeren hindrer i det minste i alt vesentlig en start av polymeraseaktiviteten.
Eksempel 3
S- allel av humant g- l- antitrypsin
1 /xg humant genomisk DNA, 100 pmol av hvert av de oligonukleotider som er angitt nedenfor, 1,5 mM (sluttkon-sentrasjon) av hver av de fire deoksynukleosidtrifosfatene og buffer i den angitte sluttkonsentrasjon, ble blandet i et 1,5 ml skruekork-mikrosentrifugerør, og volumet ble justert til 100 /il med sterilt destillert vann. Røret ble lukket og plassert i et kokende vannbad i 5 min.. Reaksjonen ble startet ved å tilsette 1 /il Taq-polymerase som inneholdt 1 enzymenhet (Anglian Biotech porsjon 3 fortynnet til 1 enhet//il med ovennevnte buffer) . Røret ble inkubert ved 58°C i 4 min. og så ved 91°C i 2 min.. Denne variasjon mellom avkjøling til 58°C og oppvarming til 91°C ble gjentatt 5 ganger, hvoretter man tilsatte ytterligere 1
enzymenhet. Den angitte oppvarming og avkjøling ble så gjentatt ytterligere 6 ganger, hvoretter man igjen tilsatte 1 enzymenhet. Samme oppvarming og avkjøling ble gjentatt ytterligere 6 ganger igjen fulgt av en tilsetning av 1 enzymenhet, hvoretter oppvarming/avkjøling ble gjentatt 5 ganger og igjen avsluttet ved tilsetning av 1 enzymenhet, så ble det gjentatt 2 ganger hvoretter man igjen tilsatte 1 enzymenhet. Deretter ble røret
inkubert ved 58°C i 20 min..
De følgende prøver ble utført på basis av ovennevnte forsøk:
a) de brukte oligonukleotider var følgende
og det oligonukleotid som er betegnet med I som definert
tidligere. Det humane genomiske DNA var fra en normal homozygot som ikke led av den angitte humane al-antitrypsingenetiske sykdommen; og
b) de brukte oligonukleotider var følgende
og det oligonukleotid som tidligere er betegnet med I. Det
humane genomiske DNA var fra en normal homozygot som ikke led av den humane al-antitrypsingenetiske sykdommen.
Påvisning av forsterkningsproduktene ble utført ved å blande 15 pl av reaksj onsblandingen med 5 jul av gelladende buffer fulgt av en elektroforese på en agarosegel (3% "NuSieve") som inneholdt ethidiumbromid (2 /xg/ml). Elektroforesen ble utført i forhold til størrelsesmarkører (bånd 9 på figur 8), for å få en bekreftelse på den korrekte størrelsen av forsterkningsproduktene. Gelen ble visualisert ved hjelp av en transilluminator (bølgelengde 300 nm) og det ble tatt et polaroidbilde. Båndene 1 og 2 på figur 8 viser resultatene av denne visualiseringen. Bånd 1 viser således at man fikk en forsterkning når man brukte nukleotidsekvensen med formel V som har et 3'-terminalt nukleotid som er komplementert til det tilsvarende nukleotid i det mulige S-mutasjonspunktet i det DNA som ble brukt i prøven, og det dannet seg et forsterkningsprodukt med en lengde på 267 bp. Bånd 2 viser imidlertid at det ikke ble noen forsterkning når det var en mistilpasning ved den 3' terminale gruppen i den diagnostiske primeren, idet denne hadde et nukleotid (A) ved sin 3' terminale ende som er mistilpasset med nukleotid (A) i det mulige S-mutasjonspunktet i
en DNA-prøve fra en normal homozygot.
Eksempel 4
Z- allel
1 ug humant genomisk DNA, 100 pmol av hver av de oligonukleotider som er angitt nedenfor, 1,5 mM (sluttkonsentrasjon) av hver av de fire deoksynukleosidtrifosfatene og buffer i den ovenfor angitte sluttkonsentrasjon, ble blandet i et 1,5 ml skruekorkmikrosentrifugerør, og volumet justert til 100 /il med sterilt destillert vann. Røret ble lukket og plassert i et kokende vannbad i 5 min.. Reaksjonen ble så startet ved å tilsette 1 /il Taq-polymerase som inneholdt 0,5 enzymenheter (Anglian Biotech porsjon 9 fortynnet til 0,5 enheter//il med ovennenvte buffer) . Røret ble inkubert ved 60°C i 4 min. og så ved 91°C i 2 min.. Denne avkjøling til 60°C og oppvarming til 91°C ble gjentatt 5 ganger, hvoretter ytterligere 0,5 enheter enzym ble tilsatt. Oppvarming/avkjøling ble så gjentatt 6 ganger fulgt av en ny tilsetning av 0,5 enzymenheter. Igjen ble oppvarming/avkjøling gjentatt 6 ganger hvoretter man igjen tilsatte 0,5 enheter enzym, hvoretter oppvarming og avkjøling ble gjentatt ytterligere 5 ganger og igjen avsluttet med tilsetning av 0,5 enheter enzym, hvoretter syklus ble gjentatt 3 ganger og igjen avsluttet ved å tilsette 0,5 enheter enzym (som ovenfor). Forsøket ble så avsluttet ved at røret ble inkubert i 20 min. ved 60°C.
De følgende prøver ble utført på basis av ovennevnte forsøk: a) de oligonukleotider som ble brukt, var som angitt med formel IX og IV og det humane genomiske DNA som ble brukt, var fra en normal homozygot som ikke led av noen genetisk lidelse; b) de brukte oligonukleotider hadde formel X og IV som definert tidligere, og det humane genomiske DNA var fra en normal homozygot som ikke hadde noen genetisk sykdom; c) de brukte oligonukleotider hadde formlene IX og IV og det humane genomiske DNA var fra en heterozygot for det humane al-antitrypsin Z-allelet; d) de brukte oligonukleotidene hadde formel X og IV mens det humane genomiske DNA var tatt fra en heterozygot for humant al-antitrypsin Z-allel; e) de brukte oligonukleotider hadde formlene IX og IV som definert tidligere, mens det humane genomiske DNA var fra en
homozygot (ZZ) som hadde den tidligere angitte al-antitrypsin-sykdommen;
f) de brukte oligonukleotider hadde formlene X og IV mens det humane genomiske DNA var fra en homozygot (ZZ) som led av den
angitte al-antitrypsin-sykdommen;
g) de brukte oligonukleotider hadde formel XI og IV mens det humane genomiske DNA var fra en normal homozygot som ikke led av
noen genetisk sykdom;
h) de brukte oligonukleotider hadde formel XII og IV mens det humane genomiske DNA var fra en normal homozygot som ikke var
påvirket av noen genetisk sykdom;
i) de brukte oligonukleotidene hadde formel XI og IV mens det humane genomiske DNA var fra en heterozygot for humant al-antitrypsin Z-allel;
j) de brukte oligonukleotidene hadde formel XII og IV som definert tidligere, mens det humane genomiske DNA var fra en heterozygot for humant al-antitrypsin Z allel;
k) de brukte pligonukleotidene hadde formlene XI og IV som definert tidligere, mens det humane genomiske DNA var fra en homozygot (ZZ) som led av den angitte al-antitrypsinsykdommen;
1) de brukte oligonukleotider hadde formel XII og IV som definert tidligere, mens det humane genomiske DNA var fra en homozygot (ZZ) som led av den tidligere angitte al-antitrypsin-sykdommen.
I hver prøve brukte man nukleotidsekvensene med formlene
XIII og XIV som en forsterkningskontroll.
Påvisning av forsterkningsprodukter ble utført ved å blande 15 /il av reaks jonsblandingen med 5 /il gelladende buffer fulgt av
en elektroforese på en 1,4% agarosegel inneholdende ethidiumbromid (0,5 /ig/ml) . Elektroforese ble utført mot størrelses-markører som definert tidligere for å få en bekreftelse på en korrekt størrelse av forsterkningsproduktene. Gelen ble visualisert på en transilluminator (bølgelengde 300 nm) og det ble tatt et polaroidbilde. Båndene 2-13 på figur 9 viser resultatet av denne visualiseringen, idet båndene 1 og 14 representerer båndene for størrelsesmarkørene. Båndene 2-7 viser således at destabiliseringen av den diagnostiske primeren ved å endre det femte nukleotid fra 3'-enden, ikke er fullstendig effektivt til å gjøre primeren i stand til å skille mellom en normal og en mutant DNA-prøve under disse reaksjons-betingelsene. Båndene 8-13 viser imidlertid at en endring av det tredje nukleotidet fra den 3'enden av den diagnostiske primeren effektivt gjør primeren i stand til å diskriminere mellom en normal og en mutant DNA-prøve, og kan således være
diagnostisk for normale homozygoter, heterozygoter (bærere) eller ZZ homozygoter som er utsatt for den humane al-antitrypsinsykdommen.
De ovennevnte eksperimenter fra dette eksempel ble også utført ved å bruke en diagnostisk primer hvor det ikke var utført noen ytterligere destabiliserende nukleotidendringer, og hvor det syvende nukleotidet fra den 3'enden var endret (A til C) for å frembringe en destabilisering. I hvert enkelt tilfelle var den diagnostiske primeren ikke fullt ut effektiv med hensyn til diskriminering mellom en normal og en mutant DNA-prøve, og dette er vist på figur 8, båndene 5-8 som viser resultatene av å bruke den diagnostiske primeren hvor det ikke var utført noen ytterligere destabiliserende nukleotidendringer.
Eksempel 5
Man brukte oligonukleotidene XXII (normal) og XXI (variant) som primere. I dette eksempel vil dNTP-blandingen av A, G og T gi en syvbaset forlenget primer på templaten før man krever et C-nukleotidtrifosfat. Tm for disse oligonukleotidene var beregnet til å være 94°C ved å bruke formelen Tm = 4 (G+C) og 2(A+T), men man antar at dette bare er relevant for oligonukleotider med opptil 23 mer, slik at man fortrinnsvis brukte 75°C.
Oligonukleotidene (8 pmol av hvert) ble merket ved den 5' terminale hydroksylgruppen, idet man brukte d<32>P ATP (Amersham 2/xCi) og T4 polynukleotidkinase (4 enheter) i et reaksjonsvolum på 80 /il som inneholdt 5-mM tris.Cl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 100 /xM spermidin og 100 /xM EDTA. Kinasereaksjonen ble utført ved 37°C i 20 min., hvoretter de merkede oligonukleotider ble undersøkt ved hjelp av elektroforese på en 15% polyakryl-amiddenaturert gel/8M urea (innkjøring 1 time 500 V, hovedforsøk 4 timer 800 V).
Det ble brukt to plasmider, én som inneholdt den normale sekvensen (MM) med hensyn til S-locuset på exon III i det humane al-antitrypsingenet, og et annet som inneholdt den variante sekvensen som tilsvarer den variante homozygoten (SS). Det ble satt opp seks rør, 2 for hver mulig type DNA. 1 fmol av det passende plasmidet ble brukt for homozygotene, men for hetero-zygotene ble det simulert ved å bruke 0,5 fmol av begge av plasmidene. Et 200 gangers overskudd av merket oligonukleotid ble produsert i hvert rør ved å tilsette 200 fmol (2 /xl av den merkede oppløsningen) av enten det normale (XXII) eller variante (XXI) oligonukleotid for hver DNA-type. Hvert rør inneholdt 3dNTP A, G og T (Pharmacia) til en sluttkonsentrasjon på 5 mM hver i et reaks jonsvolum på 20 /xl som inneholdt 6,7 mM EDTA, 6,7 mM MgCl2, 67 mM Tris HC1 pH 8,8, 10 mm merkaptoetanol og 16,6 mM ammoniumsulfat. Reaksjonsvolumene ble tredoblet, dvs. man brukte 60 /xl i hvert tilfelle for å nedsette effekten av fordampning. Rørene ble kokt i 5 min. og så holdt på is før man tilsatte hvert rør 3 enheter Taq-polymerase (Cetus 1 i en 5 gangers fortynning med 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 10. mM Tris pH 8,3 og 0,01% gelatin til at man fikk 1 enhet//tl) . Rørene ble sentrifugert ved 13000 omdr. pr. min. i 2 min . og man tilsatte en 2 fil porsjon til 5 jul formamid/bromfenol-blått fargestoff. Rørene ble så hensatt ved 75°C i et vannbad. Etter 4 timer ble rørene tatt ut, sentrifugert i l min. ved 13000 omdr. pr. min. hvoretter man tok ut ytterligere 2 /il porsjon og tilsatte 5 /il fargestoff. Rørene ble så satt tilbake til vannbadet ved 75°C. Etter 6 timer ble rørene igjen tatt ut og tilsatt ytterligere 3 enheter Taq-polymerase, igjen sentrifugert i 1 min. ved 13000 omdr. pr. min. og tilsatt en dråpe lett mineralolje (Sigma) for å minske fordampningen, men ikke porsjoner ble tatt ut. Rørene ble så hensatt ved 75°C over natten. 24 timer etter beregnet fra slutten av den første sentrifugering, ble rørene tatt ut av vannbadet, sentrifugert i l min. og de siste 2 fil porsjonene ble tilsatt 5 ul fargestoff. Alle porsjonene ble underkastet elektroforese i et innledende forsøk (1 time 500 V) 15% denaturert polyakrylamidgel/8M urea i 1 x TBE buffer (0,089 M Tris borat, 0,089 borsyre, 0,002 M EDTA) i 5 1/2 time ved 880 V. Gelene ble så autoradiografert over natten ved romtemperatur uten skjerm på en langsom fotografisk film. Resultatene er vist på figur 12.
Båndene 1 og 2 tilsvarer DNA for en normal homozygot (MM), båndene 3 og 4 til DNA for en heterozygot (MS) mens båndet 5 og 6 tilsvarer en DNÅ for en variant homozygot (SS). For båndene 1, 3 og 5 brukte man oligonukleotidet med formel XXII (det normale) mens man for båndene 2, 4 og 6 brukte det variante oligonukleotidet med formel XXI. Som forutsatt fikk man ingen oligonukleotidforlengelse i båndene 2 eller 5. De påviste produktbåndene er indikert med pilodder.
Eksempel 6
1 ng av kassettplasmid DNA, 100 pmol av hver av oligo-nukleotidprimerene
1,5 mM (sluttkonsentrasjon) av hver av de fire deoksynukleosid-trifosfåtene og buffer i de sluttkonsentrasjonene som er angitt tidligere, ble blandet i et 1,5 ml skruekorkmikrosentrifugerør, og volumet ble justert til 100 /ul med sterilisert deionisert vann (Milli-Q). Røret ble lukket og plassert i et kokende vannbad i 5 min.. Reaksjonen ble startet ved å tilsette 2 enheter Taq-polymerase (Cetus) og blandingen ble lukket med lett mineralolje (Sigma) for å hindre fordampning. Røret ble inkubert ved 60°C i 4 min. fulgt av 90°C i 2 min.. Denne fremgangsmåten ble gjentatt totalt 30 ganger. 60 /xl av reaks jonsblandingen ble så fjernet, og man tilsatte 60 pmol av enten primerene XIX og XI (normalt) eller primerene XII og XX (variant). 1 enhet Taq-polymerase (Cetus) ble så tilsatt for å starte ytterligere reaksjon. Blandingen ble inkubert ved 92°C i 2 min. fulgt av 60°C i 4 min.. Denne fremgangsmåten ble gjentatt totalt fire ganger. Påvisning av forsterkningsproduktene ble utført ved å blande 10 fj. 1 porsjoner av reaksjonsblandingen med en gelladende "buffer" fulgt av en elektroforese på en 3% agarosegel ("NuSieve", FMC Bioproducts) som inneholdt 0,5 ixgl/ml av ethidiumbromid. Gelen ble visualisert på en transilluminator (bølgelengde 300 nm) og det ble tatt et polaroidbilde. Resultatene er vist på figur 13. Båndet på venstre side viser størrelsesmarkører som ble brukt for å bekrefte størrelsen på de fremstilte produktene. Båndene 1 og 2 tilsvarer DNA fra en normal homozygot (MM), båndene 3 og 4 DNA fra en heterozygot (MZ) mens båndene 5 og 6 tilsvarer DNA fra en variant homozygot (ZZ). Med hensyn til båndene 1, 3 og 5 brukte man primerene XIX og XI, mens man for båndene 2, 4 og 6 brukte primerene XII og XX. Som forventet fikk man ingen forlengelse av primeren i bånd 2 eller 5. De påviste produktbåndene er angitt med pilodder.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær eller fravær av minst et variant-nukleotid i en eller flere nukleinsyrer som foreligger i en prøve, karakterisert ved behandling av prøven samtidig eller i rekkefølge med; (i) tilsvarende nukleosidtrifosfater, (ii) et reagens for polymerisering av nukleosidtrifosfåtene og (iii) en diagnostisk primer for en diagnostisk del av en målbasesekvens under hybridiserende betingelser, idet nukleosidsekvensen til den diagnostiske primer er slik at den er hovedsaklig komplementær til den diagnostiske del, og 5' eller 3' sluttnukleotidet av den diagnostiske primer enten er komplementært med det forventede variant-nukleotid eller med det tilsvarende normale nukleotid, hvorved et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primer syntetiseres når sluttnukleotidet av den diagnostiske primer er komplementært med det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, idet ikke noe forlengelsesprodukt syntetiseres når sluttnukleotidet av den diagnostiske primer ikke er komplementært med det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen; og påvisning av nærvær eller fravær av den forventede variant-nukleotid ut fra nærvær eller fravær av et forlengelsesprodukt.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter; (i) behandling av prøven under denaturerende betingelser for å skille primer-forlengelsesproduktet fra sin mal; (ii) kontakt av de enkle kjeder fremstilt i trinn (i), enten samtidig med eller i rekkefølge med tilsvarende nukleosidtrifosfater, et reagens for polymerisering av nukleosidtri-fosfatene, en diagnostisk primer og en forøkelsesprimer, hvorved et hvert forlengelsesprodukt av den diagnostiske primer tjener som en mal for syntese av et forlengelsesprodukt av forøkel-sesprimeren; slik at det om mulig syntetiseres ytterligere forlengelsesprodukter ved bruk av de enkle kjeder fremstilt i trinn (i) som maler, og hvori forøkelsesprimeren eventuelt også er en diagnostisk primer, slik at enten (a) en første diagnostisk primer har en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, idet den første diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det forventede variant-nukleotid, og en andre diagnostisk primer med en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en andre nukleinsyresekvens, idet den andre diagnostiske primer har et terminalt nukleotid komplementært med det komplementære forventede variantnukleotid; eller (b) en første diagnostisk primer har en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en første nukleinsyresekvens, idet den første diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det normale nukleotid som svarer til det forventede variantnukleotid, og en andre diagnostisk primer med en sekvens hovedsaklig komplementær med en diagnostisk del av en andre nukleinsyresekvens, idet den andre diagnostiske primer har et sluttnukleotid komplementært med det normale nukleotid som svarer til det forventede variantnukleotid; idet sluttnukleotidet av den første diagnostiske primer og sluttnukleotidet til den andre diagnostiske primer enten befinner seg begge ved 5' enden eller begge ved 3' enden av de respektive primere, og den første nukleinsyresekvens er i den motsatte retning til den andre nukleinsyresykvens; (iii) gjentagelse av trinnene (i) og (ii) et tilstrekkelig antall ganger til å føre til en påviselig forøkelse av en tilsvarende nukleotidsekvens; (iv) påvisning av nærvær eller fravær av det forventede variantnukleotid ut fra nærvær eller fravær av et forøkel-sesprodukt oppnådd i trinn (iii).
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man først forsterker i det minste en del av prøvenukleinsyren som inneholder det mistenkte variant-nukleotid og bruker det forsterkede produktet som den prøve, som skal behandles.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man først forsterker i det minste en del av prøvenukleinsyren som inneholder det mistenkte variant-nukleotid, og deretter bruker det forsterkede produkt som den prøve, som skal behandles.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man gjentar prøve-nukleinsyrebehandlingen i det minste én gang, hvorved man oppnår en lineær forsterkning av et forlengelsesprodukt, idet man bruker samme målbasesekvens som mal.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det terminale nukleotid i den diagnostiske primeren enten er komplementært til det mistenkte variante nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid og sitter i 3'-enden av den diagnostiske primeren.
7. Nukleotidsekvens med fra 5 til 50 bp for bruk i fremgangsmåten ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at et terminalt nukleotid i nevnte sekvens er komplementært enten til et mistenkt variant nukleotid som er forbundet med en kjent genetisk sykdom eller lidelse, eller til det tilsvarende normale nukleotid, og hvor resten av nevnte sekvens i alt vesentlig er komplementær til den tilsvarende målbasesekvensen inntil det mistenkte variant-nukleotid eller det tilsvarende normale nukleotid, og hvor nevnte nukleotidsekvens er slik at når den brukes som en diagnostisk primer i foreliggende fremgangsmåte så får man syntetisert et forlengelsesprodukt av denne primeren når nevnte terminale nukleotid i primeren er komplementært til det tilsvarende nukleotidet i målbasesekvensen, mens man ikke får syntetisert noe forlengelsesprodukt når nevnte terminale nukleotid i primeren ikke er komplementært til det tilsvarende nukleotidet i målbasesekvensen.
8. Nukleotidsekvens ifølge krav 7, karakterisert ved at det terminale nukleotid sitter i 3'-enden av nukleotidsekvensen.
9. Diagnostisk sett for påvisning ifølge krav 1 - 6 av nærvær eller fravær av minst ett variant nukleotid i én eller flere nukleinsyrer som forefinnes i en prøve, karakterisert ved at settet innbefatter:
(1) en diagnostisk primer for hver diagnostisk del av en målbasesekvens, og hvor nukleotidsekvensen i hver diagnostisk primer er slik at den i alt vesentlig er komplementær til nevnte diagnostiske del, et terminalt nukleotid i den diagnostiske primeren som enten er komplementært til det mistenkte variant-nukleotid eller til den tilsvarende normale nukleotid, slik at man får syntetisert under bruk et forlengelsesprodukt av den diagnostiske primeren når nevnte terminale nukleotid i primeren er komplementært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, mens man ikke får syntetisert noe slikt produkt når nevnte terminale nukleotid i primeren ikke er komplementært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen;
(2) hver av fire forskjellige nukleosidtrifosfater; og
(3) et polymerisasjonsmiddel for de nukleosidtrifosfater som er nevnt under (2).
NO891012A 1988-03-10 1989-03-09 Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett NO174825B (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB888805692A GB8805692D0 (en) 1988-03-10 1988-03-10 Method of detecting nucleotide sequences
GB888814170A GB8814170D0 (en) 1988-06-15 1988-06-15 Method of detecting nucleotide sequences

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO891012D0 NO891012D0 (no) 1989-03-09
NO891012L NO891012L (no) 1989-09-11
NO174825B true NO174825B (no) 1994-04-05
NO174825C NO174825C (no) 1994-07-13

Family

ID=26293607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO891012A NO174825B (no) 1988-03-10 1989-03-09 Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5595890A (no)
EP (1) EP0332435B2 (no)
JP (1) JP2853864B2 (no)
KR (1) KR970003151B1 (no)
CN (1) CN1034673C (no)
AT (1) ATE75262T1 (no)
AU (1) AU614584B2 (no)
BR (1) BR8901136A (no)
CA (1) CA1323592C (no)
DE (1) DE68901285D1 (no)
DK (1) DK175527B1 (no)
ES (1) ES2039294T5 (no)
FI (1) FI891126A (no)
GR (2) GR3004442T3 (no)
HU (1) HUT52565A (no)
IE (1) IE61148B1 (no)
IL (1) IL89545A (no)
MY (1) MY104957A (no)
NO (1) NO174825B (no)
NZ (1) NZ228266A (no)
PL (1) PL162338B1 (no)
PT (1) PT89980B (no)
TN (1) TNSN89026A1 (no)
YU (1) YU49789A (no)
ZW (1) ZW3388A1 (no)

Families Citing this family (252)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4038804A1 (de) 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
ATE108491T1 (de) * 1988-03-18 1994-07-15 Baylor College Medicine Mutationsnachweis durch kompetitiven oligonukleotid-priming.
FR2650840B1 (fr) * 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
JPH03123500A (ja) * 1989-10-06 1991-05-27 Canon Inc 核酸の分別方法
GB9001181D0 (en) * 1990-01-18 1990-03-21 Imp Cancer Res Tech Genetic assay
US6013431A (en) * 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
GB9006924D0 (en) * 1990-03-28 1990-05-23 Imperial College Prognosis of hepatitis infection
EP0463395B1 (en) * 1990-06-22 1997-05-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of poor metabolizers of drugs
US5844108A (en) * 1990-06-22 1998-12-01 Roche Molecular Systems, Inc. Primers targeted to NAT2 gene for detection of poor metabolizers of drugs
GB9019512D0 (en) * 1990-09-06 1990-10-24 Ici Plc Assay method
FR2668162B1 (fr) * 1990-10-17 1993-01-22 Eurobio Lab Fragments d'adn, procede et coffret de diagnostic pour la detection des porteurs de la mutation delta-f-508 responsable de la mucoviscidose.
IE66125B1 (en) * 1991-01-31 1995-12-13 Zeneca Ltd Detection method for variant nucleotides
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
DE69230736T2 (de) * 1991-08-27 2000-06-21 Zeneca Ltd Verfahren zur Charakterisierung genomischer DNA
US5853989A (en) * 1991-08-27 1998-12-29 Zeneca Limited Method of characterisation of genomic DNA
DE4129653A1 (de) * 1991-09-06 1993-03-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren
IL103935A0 (en) * 1991-12-04 1993-05-13 Du Pont Method for the identification of microorganisms by the utilization of directed and arbitrary dna amplification
US5541060A (en) * 1992-04-22 1996-07-30 Arch Development Corporation Detection of glucokinase-linked early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus
US6207368B1 (en) 1992-08-04 2001-03-27 Beckman Coulter, Inc. Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions
US6180338B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Beckman Coulter, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
WO1994008047A1 (en) * 1992-09-25 1994-04-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction method for detecting small mutations
US6335184B1 (en) 1993-07-23 2002-01-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Linked linear amplification of nucleic acids
EP0710296A4 (en) * 1993-07-23 1999-05-26 Bio Rad Laboratories LINEAR AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
AU1911395A (en) * 1994-02-04 1995-08-21 Beckman Instruments, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
PT705903E (pt) 1994-08-12 2001-11-30 Myriad Genetics Inc Mutacoes no gene de susceptibilidade para o cancro da mama e do ovario ligado a 17q
ATE209660T1 (de) 1994-08-12 2001-12-15 Myriad Genetics Inc 17q-verbundenes ovarial- und brustkrebs empfindlichkeitsgen
FR2737732B1 (fr) * 1995-08-07 1997-10-10 Ass Francaise Contre La Myopat Test co-dominant de diagnostic genetique
US5837492A (en) 1995-12-18 1998-11-17 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene
WO1997022689A1 (en) 1995-12-18 1997-06-26 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene
ES2325820T3 (es) 1995-12-22 2009-09-18 University Of Utah Research Foundation Gen del sindrome qt largo que codifica kvlqt1 y su asociacion con mink.
NO960163D0 (no) * 1996-01-15 1996-01-15 Thomas Berg Mutasjonsdeteksjon av bovin
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
AU2320597A (en) 1996-03-19 1997-10-10 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
GB9609441D0 (en) * 1996-05-04 1996-07-10 Zeneca Ltd Process
US6361940B1 (en) 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
IL119342A0 (en) * 1996-10-02 1997-01-10 Yeda Research And Development C Methods for priming and DNA sequencing
US5888778A (en) * 1997-06-16 1999-03-30 Exact Laboratories, Inc. High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
US6566101B1 (en) 1997-06-16 2003-05-20 Anthony P. Shuber Primer extension methods for detecting nucleic acids
GB9721240D0 (en) * 1997-10-08 1997-12-03 Zeneca Ltd Assay
US6794133B1 (en) 1997-12-11 2004-09-21 The General Hospital Corporation Broad range PCR amplification techniques
WO1999044045A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Single molecule detection with surface-enhanced raman scattering and applications in dna or rna sequencing
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6207379B1 (en) 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
EP1147196A4 (en) 1998-12-08 2002-10-16 Childrens Hosp Medical Center POLYMORPHE LOCI THE ESCHERICHIA COLI 0157: H7 DIFFERENT FROM OTHER TRIBES
US6503718B2 (en) 1999-01-10 2003-01-07 Exact Sciences Corporation Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease
US6280947B1 (en) 1999-08-11 2001-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension
CN1361829A (zh) 1999-03-18 2002-07-31 埃克西库恩公司 利用特异性lna引物检测基因突变
US20030215821A1 (en) * 1999-04-20 2003-11-20 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20020025519A1 (en) * 1999-06-17 2002-02-28 David J. Wright Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations
EP1061134A3 (en) * 1999-06-17 2003-01-08 Becton Dickinson and Company Oligonucleotides for amplification and detection of hemochromatosis genes
US20030165913A1 (en) * 1999-06-17 2003-09-04 Sha-Sha Wang Methods for detecting nucleic acid sequence variations
AU5882000A (en) 1999-06-22 2001-01-09 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
EP1072679A3 (en) * 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
DE10038229B4 (de) 1999-08-24 2011-06-09 LG Electronics Inc., Kangnam-gu Verfahren und Vorrichtung zur Ratenanpassung in einem Mobilkommunikationssystem
US6528066B1 (en) * 1999-09-14 2003-03-04 University Of Iowa Research Foundation Variant varicella-zoster viruses and methods of use
AU2000278349A1 (en) * 1999-09-28 2001-04-30 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin 13 gene
US20030148301A1 (en) * 1999-12-10 2003-08-07 Toshiya Aono Method of detecting nucleotide polymorphism
AU2001236491A1 (en) * 2000-01-18 2003-09-16 Quantom Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7955794B2 (en) * 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7435541B2 (en) * 2000-05-23 2008-10-14 Sequenom, Inc. Restriction enzyme genotyping
US7659054B1 (en) * 2000-05-23 2010-02-09 Nuvelo, Inc. Methods for genetic analysis of DNA to detect sequence variances
AU2000257122A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-21 Bionex, Inc. Method for detecting sequence variation of nucleic acid
JP3638516B2 (ja) * 2000-09-28 2005-04-13 株式会社日立製作所 核酸検出方法および核酸検出キット
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
WO2002083839A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-24 Amersham Biosciences Ab P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis
CN1186456C (zh) * 2001-04-30 2005-01-26 曹卫 通用模板核酸检测方法和试剂盒
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7888324B2 (en) 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
EP1430150B1 (en) 2001-09-24 2015-08-19 One Lambda, Inc. Diagnostic probe detection system
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
WO2003066897A2 (en) * 2002-02-08 2003-08-14 Evotec Technologies Gmbh Specific multiplex analysis of nucleic acids
AU2003213107A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Exact Sciences Corporation Methods for analysis of molecular events
JP3752466B2 (ja) * 2002-04-24 2006-03-08 株式会社日立製作所 遺伝子検査方法
EP1576174A4 (en) 2002-08-02 2007-07-25 Orchid Cellmark Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR GENOTYPING
US7192700B2 (en) 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
AU2003236461B2 (en) * 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
US20040121374A1 (en) * 2002-10-02 2004-06-24 Yoshihide Iwaki Method for detecting single nucleotide polymorphisms
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
WO2004042057A1 (ja) * 2002-11-07 2004-05-21 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 遺伝子変異検出法
US7511131B2 (en) 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
CA2507189C (en) 2002-11-27 2018-06-12 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
ATE373673T1 (de) * 2003-01-29 2007-10-15 Hoffmann La Roche Verbessertes verfahren zur behandlung durch bisulfit
CA2518452A1 (en) * 2003-03-11 2004-09-23 Gene Check, Inc. Reca-assisted allele specific oligonucleotide extension method for detecting mutations, snps and specific sequences
BRPI0408967B8 (pt) 2003-03-31 2021-07-27 Hoffmann La Roche kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas
US20040219532A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-04 Sampson Jeffrey R. Internal references measurements
US20040259100A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20050181394A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US7670810B2 (en) 2003-06-20 2010-03-02 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
GB0317592D0 (en) 2003-07-26 2003-08-27 Astrazeneca Ab Method
EP2982240B1 (en) * 2003-08-29 2019-07-31 Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
WO2005054502A1 (en) 2003-12-02 2005-06-16 Roche Diagnostics Gmbh Improved method for bisulfite treatment
US7129049B2 (en) 2003-12-22 2006-10-31 Regents Of The University Of Minnesota Method of detecting equine glycogen storage disease IV
US7432082B2 (en) * 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
WO2005098050A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US20050287558A1 (en) 2004-05-05 2005-12-29 Crooke Rosanne M SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP2592155B2 (en) 2004-06-04 2019-09-11 Genentech, Inc. EGFR mutations
US20060029954A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-09 Applera Corporation Compositions and methods for identifying nucleotides in polynucleotide sequences
CA2576813A1 (en) * 2004-07-30 2006-03-09 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxy acid synthase large subunit proteins comprising a p182l and uses thereof
WO2006026654A2 (en) 2004-08-27 2006-03-09 Exact Sciences Corporation Method for detecting a recombinant event
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
WO2006047787A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Exact Sciences Corporation Method for monitoring disease progression or recurrence
JP2006129811A (ja) * 2004-11-08 2006-05-25 Hitachi Ltd 試料核酸の分析方法、分析装置および分析キット
US20060275792A1 (en) * 2004-11-15 2006-12-07 Lee Jun E Enhancement of nucleic acid amplification using double-stranded DNA binding proteins
US20060105348A1 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Lee Jun E Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
GB0428255D0 (en) 2004-12-23 2005-01-26 Health Prot Agency Detection of nucleic acid mutations
MX2007010552A (es) * 2005-03-02 2009-02-19 Inst Nac De Tecnologia Agropec Plantas de arroz resistentes a herbicidas, polinucleotidos que codifican proteinas de subunidad grande de acido acetohidroxi sintasa resistentes a herbicidas, y sus metodos de uso.
GB2424886A (en) 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
US20090054320A1 (en) 2005-04-20 2009-02-26 Protemix Discovery Limited Vesiculins
WO2007044071A2 (en) 2005-04-21 2007-04-19 Exact Sciences Corporation Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
SI1902136T1 (sl) * 2005-07-01 2012-05-31 Basf Se Na herbicid odporne rastline sončnice polinukleotidi ki kodirajo na herbicid odporne acetohidroksikislina sintaza velika podenota proteine in postopki uporabe
GB0514913D0 (en) * 2005-07-20 2005-08-24 Univ Birmingham Polymorphism
US20090326042A1 (en) 2006-05-05 2009-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc Compounds and methods for modulating expression of crp
US7759062B2 (en) 2006-06-09 2010-07-20 Third Wave Technologies, Inc. T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection
KR100812259B1 (ko) * 2006-06-12 2008-03-10 주식회사 씨젠 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법
US20100159450A1 (en) 2006-06-23 2010-06-24 Susanne Wagner Dpyd gene variants and use thereof
CA2662591A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Astrazenca Ab Method for evaluating patients for treatment with drugs targeting ret receptor tyrosine kinase
CN102016035A (zh) * 2006-11-02 2011-04-13 犹他大学研究基金会 可用于等位基因特异pcr的寡聚核苷酸
UA108733C2 (uk) 2006-12-12 2015-06-10 Толерантна до гербіциду рослина соняшника
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP2097448A4 (en) 2006-12-22 2010-07-21 Univ Utah Res Found METHOD FOR DETECTING DISEASES AND OCULAR DISEASE CONDITIONS AND TREATMENT THEREOF
US8314220B2 (en) * 2007-01-26 2012-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods compositions, and kits for detection of microRNA
RU2015127794A (ru) 2007-03-24 2018-12-21 Касл Терапьютикс, ЭлЭлСи Введение антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных человеческому аполипопротеину в
US10017827B2 (en) 2007-04-04 2018-07-10 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use
JP5926487B2 (ja) 2007-04-13 2016-05-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法
AU2008247686B2 (en) 2007-05-03 2012-08-30 One Lambda, Inc. Methods of screening for binding interaction using sets of microparticles and unique probes
MX353428B (es) 2007-05-21 2018-01-12 Genentech Inc Métodos y composiciones para identificar y tratar lupus.
WO2008153804A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-18 Monsanto Technology Llc Soybean polymorphisms and methods of genotyping
US20100203051A1 (en) 2007-05-31 2010-08-12 The University Of Queensland Diagnostic markers for ankylosing spondylitis and uses thereof
ES2453108T3 (es) 2007-08-06 2014-04-04 Orion Genomics, Llc Nuevos polimorfismos de un único nucleótido y combinaciones de polimorfismos nuevos y conocidos para determinar la expresión específica de alelo del gen IGF2
CA2697860C (en) 2007-08-29 2019-01-15 Monsanto Technology Llc Method and compositions for breeding for preferred traits associated with goss` wilt resistance in plants
JP2009077712A (ja) 2007-09-11 2009-04-16 F Hoffmann La Roche Ag Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤に対する感受性についての診断試験
GB2453173A (en) 2007-09-28 2009-04-01 Dxs Ltd Polynucleotide primers
EP2851432B1 (en) 2007-11-01 2019-01-09 University of Iowa Research Foundation RCA locus analysis to assess susceptibility to AMD
EP2218019A4 (en) * 2007-11-02 2012-04-18 Hunch Inc INTERACTIVE AUTOMATIC LEARNING ADVICE INSTALLATION
WO2009074882A2 (en) * 2007-11-02 2009-06-18 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. One-step target detection assay
JP5188789B2 (ja) * 2007-11-29 2013-04-24 株式会社日立製作所 核酸の定量方法
US8530165B2 (en) 2008-02-05 2013-09-10 Olympus Corporation Nucleic acid detection method for determining if one or more analyte nucleotides are present in a nucleic acid
CN102098909B (zh) 2008-04-24 2014-12-31 孟山都技术有限公司 鉴定大豆中亚洲大豆锈病抗性数量性状基因座的方法和其组合物
EP2113574A1 (en) 2008-04-28 2009-11-04 Biotype AG Substances and methods for a DNA based profiling assay
EP2644709B1 (en) 2008-04-30 2014-12-17 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers
US9434988B2 (en) 2008-04-30 2016-09-06 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US8911948B2 (en) * 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
CN102076850B (zh) 2008-07-02 2014-05-07 爱科来株式会社 靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂
JP5590781B2 (ja) 2008-07-10 2014-09-17 オリンパス株式会社 標的核酸比率推定方法
CN102186996A (zh) * 2008-10-20 2011-09-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 改进的等位基因特异性扩增
EP2186907A1 (en) 2008-11-11 2010-05-19 Deutsches Primatenzentrum GmbH X-chromosomal variation as a diagnostic and therapeutic marker for the progression to AIDS
EP3722810A3 (en) 2009-02-11 2021-01-13 Caris MPI, Inc. Molecular profiling of tumors
AU2010213727A1 (en) 2009-02-11 2011-09-29 Orion Genomics Llc Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of IGF2
JP5457222B2 (ja) * 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
EP2408796B1 (en) 2009-03-16 2020-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Targeting Apolipoprotein B for the reduction of Apolipoprotein C-III
CA2754163C (en) 2009-03-25 2019-04-09 Genentech, Inc. Anti-fgfr3 antibodies and methods using same
WO2010112033A2 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Østjysk Innovation A/S Method for estimating the risk of having or developing multiple sclerosis using sequence polymorphisms in a specific region of chromosome x
US20100299773A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selecting an improved plant
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
RU2016131167A (ru) 2009-10-07 2018-12-07 Дженентек, Инк. Способы лечения, диагностики и мониторинга волчанки
JP6147502B2 (ja) 2009-10-27 2017-06-14 スウィフト バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドプライマー及びプローブ
WO2011056688A2 (en) 2009-10-27 2011-05-12 Caris Life Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
US8614071B2 (en) 2009-12-11 2013-12-24 Roche Molecular Systems, Inc. Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
CN102471771B (zh) 2010-01-21 2016-01-20 爱科来株式会社 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
US9340833B2 (en) 2010-04-30 2016-05-17 Arkray, Inc. Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide
JP5830268B2 (ja) * 2010-04-30 2015-12-09 アークレイ株式会社 標的ポリヌクレオチドの増幅効率の調節方法
GB201008125D0 (en) 2010-05-14 2010-06-30 Biofortuna Ltd Tissue typing assays and kits
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
WO2012071096A2 (en) 2010-09-03 2012-05-31 The Johns Hopkins University Arid1a and ppp2r1a mutations in cancer
WO2012052758A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Astrazeneca Ab Response biomarkers for iap antagonists in human cancers
WO2012095639A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Genefirst Limited Methods, compositions, and kits for determing the presence/absence of a varian nucleic acid sequence
GB201101200D0 (en) 2011-01-24 2011-03-09 King S College Method
CA2850175C (en) 2011-04-01 2021-04-13 Genentech, Inc. Biomarkers for predicting sensitivity to cancer treatments
US10172305B2 (en) 2011-04-29 2019-01-08 Monsanto Technology Llc Diagnostic molecular markers for seed lot purity traits in soybeans
AU2012250879B2 (en) 2011-05-02 2017-06-08 Nutech Ventures Plants with useful traits and related methods
AU2012300985A1 (en) 2011-08-31 2014-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
JP2014526901A (ja) 2011-08-31 2014-10-09 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗血管新生療法に伴う高血圧のリスクを予測する方法
WO2013033611A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for watermelon firmness
MX2014002990A (es) 2011-09-19 2014-05-21 Genentech Inc Tratamientos combinados que comprenden antagonistas de c-met y antagonistas de b-raf.
KR102102862B1 (ko) 2011-10-14 2020-04-22 제넨테크, 인크. 항-HtrA1 항체 및 사용 방법
CN105063186A (zh) 2011-11-10 2015-11-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
AU2012342682A1 (en) 2011-11-23 2014-05-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
CA2857114A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Genentech, Inc. Erbb3 mutations in cancer
EP2791352A1 (en) 2011-12-14 2014-10-22 Astrazeneca AB Gabr-a2 diagnostic
EP2607495A1 (en) 2011-12-23 2013-06-26 Genomica S.A.U. Method for detection of KRAS mutations
US10633707B2 (en) 2012-04-10 2020-04-28 Vib Vzw Markers for detecting microsatellite instability in cancer and determining synthetic lethality with inhibition of the DNA base excision repair pathway
US10294529B2 (en) 2012-04-10 2019-05-21 Life Sciences Research Partners Vzw Microsatellite instability markers in detection of cancer
WO2013159035A2 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Medical College Of Wisconsin, Inc. Highly sensitive surveillance using detection of cell free dna
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
EP2711432A1 (en) 2012-09-21 2014-03-26 Genomica S.A.U. Method for detection of BRAF and PI3K mutations
US10314253B2 (en) 2012-12-04 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for watermelon sex expression
JP6669500B2 (ja) 2013-02-25 2020-03-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 薬物耐性ａｋｔ変異体を検出し治療するための方法及び組成物
CA2901293A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Detection of bisulfite converted nucleotide sequences
EP2971104A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Abbott Molecular Inc. Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits
US10294489B2 (en) 2013-03-15 2019-05-21 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Soybean resistant to cyst nematodes
SG11201507739TA (en) 2013-03-19 2015-10-29 Toppan Printing Co Ltd Method for predicting sensitivity to egfr inhibitor
US10059999B2 (en) 2013-06-10 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Molecular markers associated with soybean tolerance to low iron growth conditions
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
JP2015096049A (ja) 2013-11-15 2015-05-21 凸版印刷株式会社 Ｖｅｇｆ阻害剤長期奏功性予測方法
NZ728726A (en) 2013-11-27 2018-09-28 Seminis Vegetable Seeds Inc Disease resistance loci in onion
CN106231893B (zh) 2014-02-21 2019-10-18 先正达参股股份有限公司 与玉米增加的能育性相关的遗传基因座
NZ630710A (en) 2014-02-27 2016-03-31 Seminis Vegetable Seeds Inc Compositions and methods for peronospora resistance in spinach
KR20160138494A (ko) 2014-03-31 2016-12-05 데비오팜 인터네셔날 에스 에이 Fgfr 융합물
TW201620526A (zh) * 2014-06-17 2016-06-16 愛羅海德研究公司 用於抑制α－１抗胰蛋白酶基因表現之組合物及方法
US10316369B2 (en) 2014-06-27 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and assays for male sterile watermelon
US10370673B2 (en) 2014-09-26 2019-08-06 Purecircle Sdn Bhd Single nucleotide polymorphism (SNP) markers for stevia
EP3005862A1 (en) 2014-10-10 2016-04-13 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Melon plants with improved disease tolerance
CA2961439A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-fgfr2/3 antibodies and methods using same
JP7231326B2 (ja) 2014-11-10 2023-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｉｌ－３３媒介性障害のための治療及び診断方法
US9909169B2 (en) 2014-12-17 2018-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression
BR112017023275B1 (pt) 2015-04-28 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Métodos para selecionar uma planta ou semente de milho braquítica
UA126326C2 (uk) 2015-04-30 2022-09-21 Монсанто Текнолоджі Елелсі Спосіб відбору рослини каноли, стійкої до кили капустяних
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
WO2017031059A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 Monsanto Technology Llc Methods for producing cotton plants with enhanced drought tolerance and compositions thereof
US10448595B2 (en) 2015-09-03 2019-10-22 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Downy mildew resistant lettuce plants
US10858709B2 (en) 2015-09-10 2020-12-08 Monsanto Technology Llc Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof
HUE054093T2 (hu) 2015-10-30 2021-08-30 Hoffmann La Roche Anti-HtrA1 antitestek és azok alkalmazási eljárásai
US10694693B2 (en) 2015-12-18 2020-06-30 Monsanto Technology Llc Methods for producing corn plants with northern leaf blight resistance and compositions thereof
WO2018031874A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for producing corn plants with resistance to late wilt
WO2018035377A1 (en) * 2016-08-17 2018-02-22 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
AU2017232187B2 (en) 2016-09-30 2023-11-09 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Xanthomonas resistant brassica oleracea plants
AU2017355458A1 (en) * 2016-11-02 2019-06-13 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for assessing risk using mismatch amplification and statistical methods
US11031099B2 (en) 2016-11-09 2021-06-08 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of sequence variants
WO2018118808A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 The Broad Institute, Inc. Methods of treating autism spectrum disorders
US20180265887A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Jacobs Farm Del Cabo Basil Plants With High Tolerance to Downy Mildew
CN110536969A (zh) 2017-04-24 2019-12-03 豪夫迈·罗氏有限公司 跨膜或近膜域中的erbb2/her2突变
JP7377544B2 (ja) 2017-05-17 2023-11-10 マイクロバイオ・プロプライエタリー・リミテッド バイオマーカーおよびその使用
CA3067637A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Assessing transplant complication risk with total cell-free dna
US11891632B2 (en) 2017-07-12 2024-02-06 Genecast Co., Ltd DNA polymerase with increased gene mutation specificity
WO2019118652A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Essenlix Corporation Sample manipulation and assay with rapid temperature change
SG11202007564VA (en) 2018-02-09 2020-09-29 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
US11268102B2 (en) 2018-05-16 2022-03-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae
KR20210111254A (ko) 2018-11-30 2021-09-10 캐리스 엠피아이, 아이엔씨. 차세대 분자 프로파일링
CA3126761C (en) 2019-01-15 2023-01-10 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
US11931674B2 (en) 2019-04-04 2024-03-19 Natera, Inc. Materials and methods for processing blood samples
JPWO2021010326A1 (no) 2019-07-12 2021-01-21
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
WO2021112918A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
US20230136203A1 (en) 2020-03-11 2023-05-04 Seagen Inc. Methods of treating her2 mutant cancers with tucatinib
JP2023516497A (ja) 2020-03-13 2023-04-19 メドイミューン・リミテッド Ｉｌ３３にリスクアレルを有する対象を治療するための治療方法
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
KR20230078705A (ko) 2020-09-28 2023-06-02 씨젠 인크. 항-her2 항체와 병용된 투카티닙으로 her2 변형에 의해 유도된 고형 종양을 치료하는 방법
CA3200671A1 (en) 2020-11-17 2022-05-27 Seagen Inc. Methods of treating cancer with a combination of tucatinib and an anti-pd-1/anti-pd-l1 antibody
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
WO2023250288A2 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311018D0 (en) * 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
GB8612087D0 (en) * 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
GB8709652D0 (en) * 1987-04-23 1987-05-28 Williamson R Diagnosis of cystic fibrosis
US4994368A (en) * 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
EP0317239A3 (en) * 1987-11-13 1990-01-17 Native Plants Incorporated Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis
AU613989B2 (en) * 1987-11-24 1991-08-15 Gen-Probe Incorporated Means and method for enhancing nucleic acid hybridization
AU2735988A (en) * 1987-12-21 1989-07-13 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
US4999290A (en) * 1988-03-31 1991-03-12 The Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of genomic abnormalities with unique aberrant gene transcripts
AU3694689A (en) * 1988-04-28 1989-11-24 Mark H. Skolnick Amplified sequence polymorphisms (asps)
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
CA1339731C (en) * 1988-10-12 1998-03-17 Charles T. Caskey Multiplex genomic dna amplification for deletion detection
CA2011818A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-17 Fred T. Oakes Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid
WO1990011372A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-04 Collaborative Research, Inc. Multiplex dna diagnostic test
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
US5137806A (en) * 1989-12-11 1992-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules
US6004744A (en) * 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer

Also Published As

Publication number Publication date
FI891126A (fi) 1989-09-11
KR970003151B1 (ko) 1997-03-14
AU3124689A (en) 1989-09-14
DK175527B1 (da) 2004-11-22
EP0332435A3 (en) 1990-06-27
DK118089A (da) 1989-09-11
JP2853864B2 (ja) 1999-02-03
PL278176A1 (en) 1990-02-05
CN1039618A (zh) 1990-02-14
ATE75262T1 (de) 1992-05-15
FI891126A0 (fi) 1989-03-09
DK118089D0 (da) 1989-03-10
EP0332435B1 (en) 1992-04-22
CA1323592C (en) 1993-10-26
IL89545A (en) 1994-11-11
EP0332435A2 (en) 1989-09-13
ES2039294T5 (es) 2000-01-16
PT89980A (pt) 1989-11-10
PL162338B1 (pl) 1993-10-30
NZ228266A (en) 1991-05-28
TNSN89026A1 (fr) 1991-02-04
EP0332435B2 (en) 1999-10-13
PT89980B (pt) 1999-12-31
YU49789A (sh) 1992-09-07
DE68901285D1 (de) 1992-05-27
KR890014750A (ko) 1989-10-25
NO891012D0 (no) 1989-03-09
US5595890A (en) 1997-01-21
GR3031532T3 (en) 2000-01-31
ZW3388A1 (en) 1989-11-22
ES2039294T3 (es) 1993-09-16
MY104957A (en) 1994-07-30
IE890739L (en) 1989-09-10
GR3004442T3 (no) 1993-03-31
IL89545A0 (en) 1989-09-10
JPH0242999A (ja) 1990-02-13
NO891012L (no) 1989-09-11
CN1034673C (zh) 1997-04-23
AU614584B2 (en) 1991-09-05
NO174825C (no) 1994-07-13
BR8901136A (pt) 1989-10-31
IE61148B1 (en) 1994-10-05
HUT52565A (en) 1990-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO174825B (no) Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett
DK175469B1 (da) Fremgangsmåde til multiplikation og påvisning af nukleinsyresekvenser
JP2726659B2 (ja) 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法及びそのためのキット
US6696277B1 (en) Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
JP5386357B2 (ja) 核酸サイズ検出法
US5496699A (en) Detection of allele - specific mutagens
US6200747B1 (en) Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences
JP5637850B2 (ja) 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬
US20040166506A1 (en) Methods and compositions for genotyping
JP5917144B2 (ja) 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
CN106591442B (zh) 用于y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒
JP2002510962A (ja) 男性不妊ｙ欠失検出器具
US9284603B2 (en) Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods
JPH11507222A (ja) マルチプレックスプライマー結合による男性不妊ｙ染色体欠失検出
JPWO2011077990A1 (ja) ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
RU2099426C1 (ru) Способ определения последовательности нуклеотидов
JP5635496B2 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
JP5568935B2 (ja) 標的塩基配列の識別方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired