JPH11507222A - マルチプレックスプライマー結合による男性不妊ｙ染色体欠失検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書は、男性の正常生殖能力と関連したヒトＹ染色体の特定の領域を増幅するマルチプレックスＰＣＲ反応を利用してＹ染色体の完全性を証明する方法を開示する。本方法は、男性の不妊を予測するＹ染色体内の欠失突然変異を検出し得る方法である。また、上記方法を実施するため必要とされる試薬を含むキットが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 マルチプレックスプライマー結合による男性不妊Ｙ染色体欠失検出 本願は、１９９５年６月７日に出願されたシリアル番号08/472,416号の一部継 続出願である。 発明の分野 本発明はヒトの男性のＹ染色体の欠失突然変異の検出に係わる。特に、本発明 は雄の不妊を示すＹ染色体欠失突然変異用のマルチプレックスポリメラーゼ鎖反 応（ＰＣＲ）検定に関する。 引用文献 本明細書で参照する完全な引用文献は、配列一覧の直前にある引用文献セクシ ョンに含まれる。 従来技術の説明 Netti Stevens とEdmund Wilson が性別判定の染色体理論をサポートする最初 の直接的な証拠を別々に記載した１９０５年から、研究者は、Ｘ及びＹ染色体に コード化された生成物の発現により制御された他の形質を判定するため性染色体 を研究している。例えば、Stevens とWilsonの実験の直後に、Thomas Hunt Morg anは、ショウジョウバエの白い眼の突然変異は、Ｘ染色体に配置された伴性劣性 形質であることを示した。近年、非常に強力な遺伝子マッピングツールの出現に 伴って、多数の研究者は、新生児の男性性器発育と、成人男子の生殖能力を担う 上記遺伝子座を判定するためＹ染色体を研究している。 特に、明らかな病因が分からないカップルの不妊原因の判定に関心がある。一 般的に、世界全体で全カップルの中の２乃至８％が不 妊症であると考えられている。予想外ではないが、子供をもうけることに困難さ を感じているカップルの５０％の原因は明らかに男性の不妊に帰すことができる 。上記の不妊のケースの病因は、男性からの精液の顕微鏡検査により同定される 。このようにして、男性不妊の明らかな原因は、精液中の無精子(azoospermia) 、精子の数の過少(oligospermia)、若しくは、異常形態を有する精子（例えば、 asthenozoospermia 及び teratospermia）が同定される。しかし、男性不妊のケ ースの３０乃至５０％は特発性であると分類されている。即ち、原因不明であり 、顕微鏡的に明白な原因が無い。原因不明の多くの不妊、並びに、それが不妊の カップルに及ぼす悪影響は、種々の研究者側に一般的に不妊の原因と、特に男性 の不妊と関連した遺伝因子の同定とをより良く理解するための強い要求を生じさ せた。 そのため、従来、多数の研究者が無精子症及び精子過少症の男性のＹ染色体に 関する欠失突然変異を研究している。かかる研究が現在特発性であるとされてい る不妊の多くの場合に対する遺伝子的基礎を明らかにすることを期待されている 。以下の引用文献は、精子形成及び正常男性生殖能力のため必要とされる遺伝子 座を明確に説明するためＹ染色体の遺伝子研究を記載している。 Whitehead Institute for Biomedical Research に所属するページ(David C． Page)により出願された２件の特許協力条約出願は、正常Ｙ染色体の領域の有無 を明確に確定するためプローブとして使用され得るＹ特異ＤＮＡを記載する。（ 国際特許出願第WO 87/05027 号、１９８７年８月２７日公開及び国際特許出願第 WO 89/02440 号、１９８９年３月２３日公開）。上記両方の引用文献は、Ｙ染色 体を分析する際に一般的な問題を指摘する。Ｙ染色体は、通常半数染色体（ハプ ロイド）状態だけで出現するので、相同染色体と再結合する機会は非常に少ない 。これは、従来の連鎖技術を用いてＹ染色体の遺伝連鎖を研究することを不可能 ではないとしても非常に困 難にさせる。ページは、さらに、ある種の形質のＹ連鎖を確定しようとする試み は、Ｙ染色体上にコード化された蛋白質の限性発現から真性Ｙ連鎖遺伝を識別す ることが困難であるため、決定的ではない点を指摘する。 しかし、核型分析及び染色のような細胞遺伝学的技術を使用することにより、 性別判定に要求される遺伝子以外の多数の遺伝子がＹ染色体上に在ることが分か る。ページの特許出願は、正常な体からのＹ染色体の制限断片からなるプローブ を用いて検体の遺伝的性質を証明することにより遺伝子をＹ染色体にマップする 困難さを回避する方法を開示する。Ｙ−ＤＮＡプローブを用いることにより、ペ ージはヒトＹ染色体の欠失マップを作成し、異常な核型を有する個体、或いは、 構造的に異常のあるＹ染色体を有することが細胞遺伝子学的に判断されるような 個体で同じプローブを用いて作成された欠失マップとの比較のため使用する。 簡約すれば、ページは、検体のＤＮＡを探針してＹ染色体欠失を見つけるため ページの上記国際特許出願に記載されているようなＹ特異ＤＮＡ制限断面を選択 しクローニングする基本として、正常Ｙ染色体の欠失マップを使用することを開 示している。ページの先行する出願では、ＤＮＡ断片は分子量及び制限酵素開裂 部位についてのみ説明されている。塩基対配列については記載されていない。ペ ージの新しい方の出願には、Ｙ染色体の１３５ｋｂからの１．２ｋｂ領域Hind I II断片の単一のＤＮＡヌクレオチド配列が含まれる。ページの参考文献には、精 巣判定因子（ＴＤＦ）をＹ染色体の短いアーム（Ｙｐ）にマップするためプロー ブを使用することが記載されている。 ページによってハイブリダイゼーションプローブとして使用されるＹ−ＤＮＡ の大部分は、National Laboratory Gene Library Projectから入手したフローソ ートされたＹ染色体から作成されたライブラリから得られた。このライブラリは 、（ＤＮＡの完全な消化に より得られる）Ｙ染色体ＤＮＡの断面がクローン化されたλファージ(Charon 21 A)からなる。ランダムに選択されたＹ−ＤＮＡ含有クローンの分析により、Ｙ染 色体に沿った欠失インタバルが定義される。問題となるＤＮＡ配列はλファージ から削除され、核外遺伝子（例えば、pUC8又はpUC13）内に再クローン化される 。 Ma他（１９９２）は、ゲノミックブロットハイブリダイゼーションによりＹ染 色体の長いアーム（Ｙｑ）における構造上の異常を分析するため同様のアプロー チを使用した。従来の不妊男性の細胞遺伝子学的研究は、無精子症因子（ＡＺＦ ）と称される遺伝子制御精子形成の配置がＹ染色体のバンドq11.23であることを 示唆した。さらに、分子マッピングは、ＡＺＦをＹ染色体のインタバル６に配置 した。予めＹｑにマップされた３０個のＤＮＡプローブの系列を使用することに より、Ma他は、ある種の無精子症男性のインタバル６にマイクロ（微少）欠失を 見つけた。 ３０個のプローブを用いることにより、Ma他は、ヒトＹ染色体のインタバル６ の詳細な欠失マップを作成した。Ma他は、細胞遺伝子学的に定義されたＹ染色体 の長いアーム上に欠失又は再配置を含む２１の個体からゲノミックブロットを探 針することによりインタバル６を１４個のサブインタバルに分化した。２１個の ブロットの結果を使用することにより、Ma他は、ＤＮＡプローブをインタバル６ の１４個のサブインタバルにマップし、患者の変更されたＹ染色体明白性のブレ ークポイントを並べることができた。 Ma他による他の論文は、インタバル６、サブインタバルXII-XIVのＹ染色体欠 失内にある遺伝子ファミリーの単離及び特徴化を報告している。遠位インタバル 欠失にマップするＹ特異プローブから単離されたコスミッドクローンを用いるこ とにより、Ma他は潜在的なＣｐＧアイランド、すなわち、遺伝子の存在の指標を 識別した。コスミッドを使用して分離された精巣ｃＤＮＡライブラリからのＤＮ Ａ配列を用いることにより、Ma他は配列が長いアームの遠位真性染 色質にだけマップすることを発見した。 Ma他（１９９３）は、インタバル６、サブインタバルXII-XIVがＡＺＦ遺伝子 座の有力な候補を構成することを結論付けた。この結論の裏付けとして、引用文 献は、部分ｃＤＮＡクローンがＹｑインタバル６の遠位欠失インタバル、即ち、 無精子症に関係した領域にマップすることを指摘する。更に、遺伝子の発現は精 巣特異であることが分かった。Ma他は、他のいかなる組織の発現も検出できなか った。最後に、Ma他は、一つの遺伝子の少なくとも一部分が二人の精子過少症患 者のマイクロ欠失内に含まれることを指摘している。遺伝子は、更に、他の何種 類かの哺乳動物からのＤＮＡに雄特異保存性を示した。 ナガフチ他（１９９３）及びコバヤシ他（１９９４）による引用文献には、無 精子症の男性のＹ染色体の欠失分析が記載されている。最初の引用文献において 、ナガフチ他は、Ｙ染色体が細胞遺伝子学的に正常な特発性無精子症の５０人の 日本人男性からのＹ染色体ＤＮＡを分析した。ナガフチ他は、Ｙ染色体上の２３ の遺伝子座の検出を探針するため１７個のＹ特異ＤＮＡ断片を使用した。更に、 ナガフチ他は、ＳＲＹ遺伝子座を含む３個の付加的な遺伝子座を分析するためＰ ＣＲを使用した。５０人の被験者の中で、６人にＹｑ１１の遠位部内に配置され た小さい間質性欠失があった。上記６人の患者の中で、５人は同じ二つの遺伝子 座ＤＹＳ７Ｃ及びＤＹＳ１を欠いていた。残りの検体は、ＤＹＳ７Ｃを含むがＤ ＹＳ１遺伝子座を含まないより大きい欠失を示した。従って、上記引用文献の著 者は、Ｙ染色体のＹｑ１１インタバルの近位の部位が無精子症の原因となる遺伝 子欠失を含む可能性を推定している。 コバヤシ他（１９９４）によるＹ染色体の他のＰＣＲ分析は、２番目の遺伝子 座が必要であることを明らかにした。その中で、Ｙ染色体に明らかな欠失又は細 胞系モザイク現象が無い６３人の日本人の無精子症又は著しい精子過少症の男性 は、Ｙｑ上のＤＹＳ７Ｅと ＤＹＺ１との間の１５個の遺伝子座と、ＹＲＲＭ遺伝子座とを含む全部で１６個 の遺伝子座の有無が検査された。上記のMa他による引用文献からは僅かに変更さ れたＹＲＲＭ１のためのプライマー配列を除いて、コバヤシ他はMa他により記載 されたプライマーペアと同じプライマーペアを使用した。 Chandley及びCooke（１９９４）は、Ｙ配置ＲＮＡモティーフ遺伝子（ＹＲＲ Ｍ）の分離を説明している。このレビュー論文は、ＹＲＲＭドメインの特徴が非 常に高度に保存されたモティーフのペアであることを指摘している。上記引用文 献は、また、ＹＲＲＭ遺伝子ファミリーは、少なくとも１５のメンバーを有し、 ＹＲＲＭ遺伝子の転写は精巣の外側で検出されなかった点を指摘する。 Henegariu 他（１９９４）は、Ｙｑ１１内のヒトＹ染色体の長いアームにおい て欠失を検出するマルチプレックスＰＣＲプログラムを記載する。ＰＣＲプログ ラムは、Ｙ染色体の領域内で小さい間質性欠失を高速に検出するため設計されて いる。Henegariu 他は、（上記）Ma他により作成された“マーマップ(Ma map)” と称される遺伝地図が、Ｙｑ１１の近位部位及び遠位部位の二つの小さい間質性 欠失を用いて作成されたことを最初に指摘する。Henegariu 他は、上記マイクロ 欠失は重なり合わないので、一般的に定義されたＡＺＦが２個以上の精子形成遺 伝子或いは非常に大きい遺伝子構造により表わされるかどうかに関する問題が残 る。 Henegariu 他は、２８個のＹｑ１１特異プライマーペアを用いて５通りのマル チプレックスＰＣＲ実験を行った。５通りのマルチプレックスＰＣＲ実験に対す るプライマーペアの組合せは、混合物中の任意の２個の増幅生成物の間の長さの 差が少なくと１８乃至２０ｂｐであるように選択された。この長さのとき、増幅 生成物は正常アガロースゲルマトリックス上で明瞭に分離された。さらに、実験 上のアーティファクトに起因した欠失に対する誤った陽性を防止するため、１回 の混合中のプライマーはＹ染色体上に並置された２個 の遺伝子座を認識しない。最後に、各混合物はＹｑ１１インタバルの近位及び遠 位の両方の端部からのプライマーペアを含む。このようにして、各マルチプレッ クス混合物はより大きい欠失イベントが生じた場合に少なくとも一つの正の内的 統制を含む。 ５個のマルチプレックスＰＣＲ混合物は、“ＰＣＲ反応カクテル”を形成する ため必要な反応物と共に別々の管で合成される。従来の材料は、滅菌限外濾過水 、緩衝液、塩、ｄＮＴＰヌクレオチド、及び、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む 。この溶液は使用されるまで冷却又は冷凍される。 マルチプレックスＰＣＲ分析を実行するため、５本の管がプライマー混合物I- V で夫々充填される。検体からのゲノミックＤＮＡの一部分は５本の各管に導入 される。管は９４°Ｃまで余熱された熱循環器に直ぐに収容される。５０サイク ルに対する最適循環条件は９４°Ｃで３０秒間（溶融）、５４°Ｃで４５秒間（ アニーリング）、６５°Ｃで１２０秒間（エクステンション）である。次に、Ｐ ＣＲ反応生成物は従来公知の方法で分離される。 １個以上のＰＣＲ断片の欠失の場合に、欠失は、マルチプレックスＰＣＲ反応 物から削除されたプライマーペアを用いて単一のプライマーペアＰＣＲ実験に対 する検体のＤＮＡを分析することにより確認され得る。正のＰＣＲプライマーペ アが内的統制として添加される。一定のＰＣＲ生成物の欠失がマルチプレックス ＰＣＲ実験だけで観察され、単一ＰＣＲ実験で観察されないならば、その欠失の 発生は殆どの場合にＰＣＲマルチプレックスのアーティファクトである。更に、 マイクロ欠失が検体内で新たに生成されたか否かを判定するため、同一のマルチ プレックスＰＣＲ反応が被験者の父親又は生殖可能な兄弟からのＤＮＡを用いて 行われる。父親又は兄弟が同じＹ染色体欠失を示すならば、その欠失は殆どの場 合にＹ染色体内の多形性イベントに起因する。 Henegariu 他は、ｐＹ６Ｈ配列ファミリーのＹ特異部位からのオ リゴペアを用いてＰＣＲマルチプレックス実験用のオリゴプライマーペアを確定 した。また、Ｙ−ＤＮＡからのオリゴペアはｓＹＤＮＡ遺伝子座が調製されたこ とを示す。 マルチプレックスＰＣＲ実験で使用されるＹ−ＤＮＡ配列はｐＹ６Ｈ欠失シー ケンスの近傍の場所に基づいて選択された。正の統制として、Henegariu 他は、 ｓＹ１４ ＤＮＡ配列を各実験に導入した。その増幅はＹ染色体の短いアームの 遠位部位にＳＲＹ遺伝子が存在することを示す。このエリアはヒトＹ染色体の推 定される性別判定遺伝子座“ＴＤＦ”である。最後に、マルチプレックスＰＣＲ 実験で使用される全てのＹ−ＤＮＡの順序及び位置は、それらを上記のMa他のサ ブインタバルにマッピングすることにより確認された。 Henegariu 他は、ＰＣＲマルチプレックスプロトコル投与が多数の実験上のア ーティファクトを生成することを指摘している。例えば、上記の如く、幾つかの Ｙ染色体遺伝子座は多形性である。検体がＰＣＲプライミング部位の一つにかか る多形性点突然変異を有するならば、誤った欠失イベントが生じる可能性がある 。ＰＣＲ実験のエクステンションサイクルは、正しいプライマー部位の間でＤＮ Ａの増幅だけを生成するので、プライマー部位内の点突然変異は、ゲル内の欠失 イベントとして現れる。 検体のゲノム内に多数の遺伝子座の写しが在るならば、別のアーティファクト が発生する。この場合、反復ＤＮＡ遺伝子座の欠失が検出されるのは、この遺伝 子座の全ての配列の写しが削除された場合に限る。それ以外の場合、残りの写し が増幅される。しかし、この可能性は、適切なＤＮＡブロット実験を用いること により回避され得る。 ＰＣＲマルチプレックス実験は不妊男性のＹ染色体内の突然変異イベントを検 出し損なう場合があることが指摘されている。これは、点突然変異、又は、使用 されたプローブでは検出されないゲノム内の非常に小さい欠失に起因する可能性 がある。 Henegariu 他によって記載されたＰＣＲマルチプレックス結合は、本明細書に 記載されるＰＣＲマルチプレックス結合とは全く異なる点に注意する必要がある 。 １９９４年に、Cytogenetics and Cell Geneticsは、ヒトＹ染色体マッピング に関する第５回国際ワークショップ１９９４の報告書を発行した。このワークシ ョップは１９９４年４月２〜５日の期間、英国ケンブリッジで開催された。この ワークショップには、Ｙ染色体の物理的分析の討論、偽性常染色体領域にマップ された遺伝子、Ｙ染色体のＹ特異領域にマップされた遺伝子、並びに、Ｙ染色体 の比較マッピング及び進化を扱う討論が含まれた。上記の全ての著者の研究がワ ークショップ中に議論された。この報告書は、Ken McElreaveyが、Ｙ染色体特異 配列標識部位（ＳＴＳ）を使用して、Ｙｑ欠失を抱えた５人の患者の分析を発表 した点を指摘する。上記患者の中の二人がターナー症兆候を示した点に注意する 必要がある。 Agulnik 他は、ＳＭＣＹと称されるＹ染色体遺伝子の単離を説明する。ＳＭＣ Ｙは、ＳＭＣＸと称されるＸ染色体上の相同遺伝子を有する。ＳＭＣＹは、マウ ス、ヒト、及び有袋動物でもＹ染色体上に巧く維持されることが分かった。ＳＭ ＣＹ遺伝子の発現は、ＳＭＣＹ特異ＰＣＲプライマーペアＳＨ３４Ｙ／ＳＨ３５ Ｙを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により研究された 。この研究は、ＳＭＣＹ遺伝子がヒトの機能的な遺伝子であり、広く発現される ことを示している。 ＳＭＣＹをヒトＹ染色体上にマップするため、David Pageの酵母合成染色体（ ＹＡＣ）セットｙＯＸが使用される。ＳＭＣＹは精巣以外の細胞で発現されるこ とが分かった。性転換マウスの分析により、Ｓｍｃｙの欠失（マウス相同性）と 相関し得る唯一の突然変異表現型だけが精子形成の生後の欠陥であることが分か った。これは、Ｓｍｃｙが精子形成に何らかの役割を果たすことを示している。 上記引用文献から明らかになるように、Ｙ染色体の秘密の解明に 大きな進歩が得られたとしても、特に、不妊を説明し得る限定的な原因が判定で きない場合に、男性の不妊の原因となり得るＹ染色体上の欠失を検出し、定量す る高速かつ再現可能な方法が非常に要望されている。 上記の如く、全てのカップルの中の２乃至８パーセントが不妊であると推定さ れる。上記不妊カップルの中で、男性不妊の場合の３０乃至５０パーセントは突 発性であると分類されている。このように、原因不明の男性不妊の数が非常に大 きいため、男性不妊の原因をより良く理解したいという強い要望が研究者並びに 医師の側にある。 しかし、現在まで、男性不妊の原因を診断するため射精液の顕微鏡検査の他に 利用できる手段は殆ど無い。例えば、被験者のライフスタイル及び環境の巨視的 な検査は、男性不妊の外因を明らかにする。かかる原因には環境因子、放蕩及び 食餌不足が含まれる。 しかし、上記引用文献から明らかにされるように、男性生殖腺の正常な発育及 び正常な精子形成は、殆どの場合に、Ｙ染色体上にある遺伝子によって制御され る。また、上記引用文献は、精子形成がＹ染色体上とＹ染色体外の両方に在る多 数の遺伝子により制御される非常に複雑なプロセスであることを示している。重 要な点は、正常な精子形成がＹ染色体上のある種の突然変異によって損なわれる ことが知られていることである。 Ｙ染色体の構造は、偽性常染色体領域により終端された短いアーム（Ｙｐ）と 、異質染色体領域により終端された長いアーム（Ｙｑ）とを含む。動原体はＹｐ をＹｑから分割する。Ｙ染色体の真性染色体領域は、Ｙｐの偽性常染色体領域か ら、動原体を介して、Ｙｑの異質染色体領域まで拡がる。上記用語は引用文献の 技術において従来定義されたのと同じように本明細書で使用される。 Ｙ染色体の真性染色体領域は、更に、欠失マッピングによりインタバル及びサ ブインタバルに分割される。７個のインタバル及びそ れらのサブインタバルは、Ｙ染色体の領域を特定するためヌクレオチド配列をマ ッピングする際に補助となる基準点を与える。 本発明において特に関心があるのは、インタバル５及びインタバル６にマップ された遺伝子である。これらの遺伝子は正常精子形成において重要な役割を果た すことが明らかである。これらの遺伝子の欠如、或いは、上記遺伝子内の突然変 異は、著しい精子過少症若しくは完全な無精子症に至ることが明らかである。本 発明のマルチプレックスＰＣＲ一式を使用することにより、Ｙ染色体上の欠失突 然変異の有無及び位置が高速かつ正確に判定できるようになる。しかし、精子形 成は非常に複雑なプロセスであることに注意することが重要である。上記引用文 献に記載されているように、無精子症の男性の分析は、無精子症の男性が、常染 色体欠失突然変異と同様に、屡々、Ｙｐ及びＹｑの両方に欠失を有することを明 らかにした。 男性不妊を生じさせる可能性のある多数の欠失突然変異のため、多数のタイプ の男性不妊の遺伝子的要因に帰すことは、不可能ではないとしても、従来困難で あった。しかし、機能的な精子形成に関連していることが分かった上記の遺伝子 座に焦点を絞ることにより、上記遺伝子座の中の一つにおける突然変異が観察さ れた不妊を生じさせる原因である蓋然性に関する情報が得られる。 発明の概要 本発明は、Ｙ染色体に沿って生じ、ヒト男性不妊症に関連するマイクロ欠失及 びマクロ欠失を検出する方法及びキットに関する。本発明の主目的は、ユーザが 迅速かつ高い再現性で、男性不妊症に関連するＹ染色体上の特定領域の完全性を 評価する方法及び対応するキットを提供することにある。本発明は、マルチプレ ックス・オリゴヌクレオチド器具を備え、従前のＰＣＲ試薬、酵素、対照アンプ リマー・ラダー、及び対照ＤＮＡを含む。 かかる突然変異を迅速に判定するため、本発明は、ヒトＹ染色体 の選択された領域に特有のオリゴヌクレオチド・プライマーペアを含む一連のマ ルチプレックスＰＣＲ器具を提供する。より具体的には、マルチプレックスＰＣ Ｒバッテリーは、ヒト男性不妊症の一因として知られ又は疑われているＹ染色体 上の遺伝子座にマップされた遺伝視座の増幅を起動するプライマーペアを含んで いる。 増幅されるべきＰＣＲプライマーペア及びＹ特異的遺伝子座は、配列標識部位 （sequence-tagged sites; ＳＴＳ）を用いた遺伝子解析に基づいて選択される 。ＳＴＳは、ＰＣＲにより明確に同定されるＤＮＡの短いストレッチである。簡 潔のため、本文においては、特に断らない限り、ＳＴＳはＹ染色体特異的ＳＴＳ を意味するものとする。ＳＴＳは、既にＰＣＲにより同定されているので、所望 の遺伝子座に対する適当なＰＣＲプライマーを得るのは遙かに容易である。更に 、ＰＣＲマルチプレックス・プロトコルは迅速かつ効果的なＰＣＲ増幅となるよ うに最適化されている。 本文に開示されるマルチプレックスを用いて１，０００以上の増幅が実行され た。これらの増幅により、マルチプレックスの欠陥率は２．５％未満であること がわかった。 マルチプレックスは種々の広い用途を有している。主には、マルチプレックス は無精子症又は乏精液症を示す男性のＹ染色体の完全性を評価するのに用いるこ とができる。マルチプレックスは生殖器形成不全の幼児の遺伝子型を評価する小 児科薬において用いることもできる。 マルチプレックスは、また、不妊症の分野においても有用である。この分野で は、マルチプレックスは、試験管受精（又は、他の関連する受精処置）を考慮す る夫婦のための診断薬として用いることもできる。この場合、父親がＹ染色体上 に１又は２以上の欠失を有することがわかれば、その結合から生まれる男性の子 孫もまた欠失を担うことになるため、夫婦は先に進むという決断を考え直したい と思うこともあろう。更に、マルチプレックスを埋込遺伝子診断に用 いて、受精卵が遺伝子変化を受けているか否かを判定することもできる。 マルチプレックスは、また、癌遺伝子及び催腫瘍を研究する診断ツールとして の用途も有している。開示されるマルチプレックスで増幅された遺伝子座の多く は、催腫瘍において未だ決定されていない役割を有することが示されている。そ の存否を対象の異常表現型に対応付けることにより、異常表現型を遺伝子型に帰 することができる。 マルチプレックスは、精子バンクに預けられた試験精子を試験する特性調節器 として用いることもできる。 従って、本発明は、Ｙ染色体上の欠失突然変異の存在を判定する一連のマルチ プレックスＰＣＲ器具に関する。 本発明は、上記ＰＣＲマルチプレックス混合試薬を含むキットにも関する。キ ットは、ＰＣＲマルチプレックス解析を実行するのに必要な全ての試薬を含む。 この場合、ユーザは、試験対象の血液又は精製ＤＮＡのサンプルを提供するだけ でよい。キットは、精製水、緩衝液、塩化マグネシウム、及びＤＮＡポリメラー ゼ酵素の供給を含んでもよい。キットは、また、分子量標識、及び、ＰＣＲプラ イマーにより起動された遺伝子座に対応するＤＮＡ配列を含むアンプリマー対照 ラダーと共に、男性対照ＤＮＡ及び女性対照ＤＮＡの供給を含んでもよい。 作動中、試験対象からのＤＮＡは、Ｘ染色体から得られた陽性対照プライマー ペアを含む１又は２以上の本文中に述べるＰＣＲ多重プライマーペア群に、別々 に結合される。次に、試験対象ＤＮＡは対応するマルチプレックス混合剤の夫々 において、対照正常男性ＤＮＡを含む対照ＰＣＲ試薬と共に直列的に増幅される 。試験対象の増幅生成物は、好ましくは３％アガロースゲル上で分離される。ア ンプリマー対照ラダー、及び、任意的には男性対照ＤＮＡ及び女性対照ＤＮＡも また、試験対象の増幅生成物に隣接するレーン上で分 離される。試験対象における欠失発生の存在は、試験対象レーンをアンプリマー 対照ラダーのレーンと比較することにより迅速に判定される。本発明は臨床的及 び研究的用途の双方を提供する。臨床用セッティングにおいて、マルチプレック スＰＣＲ器具は、男性の不妊症を予測するのに使用することができる。更に、本 発明は、欠失突然変異の位置を同定することにより、遺伝子治療による受精回復 の最初のステップを提供する。同じコインを裏返せば、本発明は、精子形成に必 要なこれらの遺伝子座を同定することにより、避妊という形で男性不妊をもたら すように設計された特定の突然変異を導くことができる。 研究的な観点からは、本発明をＹ遺伝子及びその上の遺伝子の役割についての より良い理解を得るのに利用することができる。更に、本発明は、所与のＹ染色 体欠失突然変異から生ずる表現型を予測するのに利用することもできる。 上記の観点から、本発明の主な目的は、Ｙ染色体の完全性を迅速かつ高い再現 性で判定するＹ染色体特異的マルチプレックスＰＣＲ解析法を提供することにあ る。 更に、本発明の目的は、上記方法を実行するのに必要な試薬を含むキットを提 供することになる。 本願において請求された発明の上記及び他の目的及び機能は、発明の詳細な説 明及び添付の請求の範囲を完全に読むことにより明らかとなろう。 図面の簡単な説明 図１は、親ＤＮＡ、正常対照男性ＤＮＡ、及び水が、男性不妊器具のマルチプ レックスＩ−Ｖを用いて増幅され、３％メタフォー（Metaphor）アガロースゲル 上で電気泳動された９つのアガロースゲルを示す（中央２列；マルチプレックス Ｉ、II、III、及びＶについでは繰り返し行われた）。最も左側の列の３つのゲ ル（ＹＱ６ −１、ＹＱ６−３、及びＹＱ５−１で示されている）は図示した５つのマルチプ レックスのうちの３つで検出された患者の欠失を示している。これらの欠失は、 無精子症又は乏精液症に関連することがわかっている。最も右側の列は、アンプ リマーのサンプルの強度及び増幅効率を図示するＡＭＢＩＳ画像解析システムか らの電荷結合表示器（ＣＣＤ）スキャンを示す。各マルチプレックスゲルは左か ら右へ以下のように添加されている：レーン１−分子量マーカー；レーン２−正 常男性調節ＤＮＡ；レーン３−正常男性調節ＤＮＡ；レーン４−患者１；レーン ５−患者２；レーン６−アンプリマー・ラダー；レーン７−正常男性１；レーン ８−正常男性２；レーン９−正常男性３；レーン１０−患者３；レーン１１−患 者４；レーン１２−患者５；レーン１３−アンプリマー・ラダー；レーン１４− 対照ナノピュア水。 図２Ａは、マルチプレックスVIからの増幅ラダーのゲル電気泳動を示す。 図２Ｂは、マルチプレックスVII からの増幅ラダーのゲル電気泳動を示す。 図２Ｃは、正のＸ結合対照ＳＭＣＸを示す。 図３は、選別された患者のサンプルからの欠失ブレークポイントを示す。Ｙ染 色体領域及びインターバルは左から右へ水平軸上に示されている。正常な男性及 び女性、及び、８名の患者が上から下へ鉛直軸上に示されている。 図４は、Ｙ染色体の末端部がＸ染色体へ転座し、マルチプレックスIII のＳＲ Ｙを除く全てのＹに対して陰性であるとわかった無精子症ＸＸ男性を示す。 図５は、作動中のマルチプレックスＩ〜Ｖの写真である。このゲルにおいて、 Ｔ−１及びＴ−２は、それぞれ、生まれていない「双子１及び２」を示し、Ｃは 対照女性染色体ＤＮＡを示す。ＤＮＡは、羊水（amniosytes）から抽出され、本 願で請求された男性不妊症／ Ｙ欠失検出システムにより分離された。結果：双子は二卵性である。双子１はイ ンターバル３からインターバル７まで、及びＢｋｍの全ての遺伝子座を欠いてい る。双子２は欠失のない正常な男性である。 図６は、作動中のマルチプレックスの写真例である。サンプルは左から右へ次 のように添加された：レーン１−分子量対照；レーン２−アンプリマー・ラダー １；レーン３−欠失Ｉを有する患者；レーン４−アンプリマー・ラダー２；レー ン５ 欠失IIを有する患者；レーン６−アンプリマー・ラダー３；レーン７ 欠 失III を有する患者；レーン８−アンプリマー・ラダー４；レーン９−欠失IVを 有する患者；レーン１０−アンプリマーラダー５；レーン１１−欠失Ｖを有する 患者。最も右側のレーンは無関係の実験である。 図７は、作動中のマルチプレックスＩ、VI、X-XIII、及びXVIIを示す。各マル チプレックスに対して、レーンＡは増幅された染色体ＤＮＡであり、レーンＢは 各遺伝子座に対するアンプリマー・ラダーであり（陽性の対照）、レーンは負の 対照である。「ｓｄ」と印されたレーンは分子量基準である。 図８は、マルチプレックスＸを用いた反復解析写真である。レーンＡ〜Ｇは、 マルチプレックスＸで増幅されたＤＮＡを含んでおり、レーンＨは、ＤＮＡを含 まない陰性負の対照であり、レーンＩは分子量基準である。レーンＡ〜Ｇで増幅 された７つの遺伝子座は、上から下へＤＹＳ２１８、ＤＹＳ２１９、ＤＹＳ２１ ２、ＤＹＦ５３Ｓ１、ＤＹＳ２０５、ＤＹＳ２８１、及びＭＩＣ２である。 図９は、図５に示す双子をマルチプレックスIX〜XIIIを用いて解析した写真で ある。図９において、「双子Ａ及びＢ」は、それぞれ、図５の「双子１及び２」 に対応している。双子Ａは、開発されたマルチプレックスゲルにおいて多数の欠 失発生を有していることがわかった。 図１０は、Ｙ染色体上での欠失発生位置を示す双子ＡのＹ染色体欠失マップで ある。 定義 以下の定義は、用語の範囲及び詳細の明確かつ一貫した理解の助けとなること を意図したものである。 対立遺伝子ラダー：遺伝子座の増幅された対立遺伝子より構成された標準サイ ズ標識。 対立遺伝子：ＤＮＡセグメントに関連する遺伝子変化、すなわち、同一の遺伝 子座を占めるＤＮＡ配列の２以上の選択的な形態のうちの１つ。 生化学命名法：本文において、ヌクレオチド基がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ ）、グアニン（Ｇ）、及びシトシン（Ｃ）と称される標準生化学命名法を用いた 。対応するヌクレオチドは例えばデオキシグアノシン−５’−三リン酸（ｄＧＴ Ｐ）である。 ＤＮＡ多型現象：２以上の異なるヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の同一の交配 集団に共存する状態。 遺伝子座：染色体上の特定の位置。遺伝子座の対立遺伝子は相同染色体上の同 一座位に位置する。 遺伝子座特異的プライマー：上記した遺伝子座又はその相補的ストランドと少 なくとも遺伝子座の１つの対立遺伝子について雑種形成し、本増幅法で用いられ る状態の下で他のＤＮＡ配列とは十分に雑種形成しないプライマー。 重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）：変性のサイクル、プライマーによるアニーリン グ、及びＤＮＡ重合酵素によるエクステンションがターゲットＤＮＡ配列の複数 の複製を１０⁶倍より大きく増幅するのに用いられる技術。拡散を増幅する重合 酵素連鎖反応プロセスは米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２ ０２号において言及されている。マルチプレックス重合酵素連鎖反応は、２以上 の別個のターゲットＤＮＡ配列が同一サンプル内で同時に増幅される類似の技術 である。 初期反応：生成ヒト遺伝子ＤＮＡをＰＣＲに対する鋳型として用 いる最初の反応。 プライマー：その３’末端が互いに最も接近するように遺伝子座の対向ストラ ンドと雑種形成する２つの単一ストランド・オリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラ グメント。 プライマー対：ＤＮＡ配列の一端にて単一ストランドに雑種形成して増幅され るプライマー１と、増幅されるべきＤＮＡ配列の相補ストランドの他端と雑種形 成するプライマー２とを含む２つのプライマー。左右プライマーとも称する。 プライマー座：プライマーが雑種形成するターゲットＤＮＡの領域。 二次反応：初期反応の希釈物をＰＣＲに対する鋳型として用いた同一又は異な るプライマー対による再増幅。 発明の詳細な説明 本発明はＹ染色体の真性を評価する方法を含む。本発明の方法は、最初に、検 体の染色体ＤＮＡ（又は、精製ＤＮＡ又は血液等）を、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX; DYS218，DYS219，DYF53S1，DYS205，DYS212，DYS281，SMCX; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，SMCX; DYS240，DYS238，DYS271，DYS221，KAL182，SMCX; DYS221，DYS226，DYS222，DYS227，SMCX; DY848S1，DYZ1，DYS230，DYF49S1，DYF50S1，DYS228，SMCX; DYF65S1，SMCY，DYS217，DYS229，DYS199，DYS220，DYS235，DYS237，DYS215，S MCX; YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYF53S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYF53S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; 並びに、 DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; からなる遺伝子座の群から選択されたヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグ ループをプライミングし得る異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なく とも１個のグループと結合する段階を含む。 増幅された染色体ＤＮＡ断片を生成するため、異なるオリゴヌクレオチドプラ イマーペアの少なくとも１個のグループは、少なくとも一つの対応するマルチプ レックスポリメラーゼ鎖反応によって増幅される。増幅された染色体ＤＮＡ断片 は、次に分離され、検体のＹ染色体の真性を判定するため、正常男性からの対応 する増幅された染色体断片と比較される。 より詳しく言うと、本発明のＹ染色体の真性を評価する方法は、検体のＤＮＡ を、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYF53S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYF53S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; 並びに YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなるヒト染色体遺伝子座の１０個のグループをプライミングし得る異なるオ リゴヌクレオチドプライマーペアの１０個のグループと結合する段階からなる。 上記異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個の各グループは、夫々 の検体のゲノムＤＮＡが別々の容器内に配置されている。上記の如く、増幅され た染色体ＤＮＡ断片を生成するため、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペア の１０個のグループは１０個の対応するマルチプレックスポリメラーゼ鎖反応に よって増幅される。増幅生成物は、次に分離され、検体のＹ染色体の真性を判定 するため、正常者からの対応する増幅された染色体ＤＮＡ断片と比較される。 また、本発明はＹ染色体上の欠失突然変異を検出するキットである。上記キッ トは、オリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１個の対応したグループ を収容する少なくとも１個の第１の容器を含む。上記キットは、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYF53S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYF53S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; 並びに、 YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなる遺伝子座の群から選択されたヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグ ループをプライミングし得るオリゴヌクレオチドプラ イマーペアの少なくとも１個の対応したグループを収容する。 上記キットは、上記ヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグループに対応し た少なくとも一つの対照ＤＮＡアンプリマー・ラダーを収容する少なくとも１個 の第２の容器を更に有する。 上記キットはキットを使用するための命令を更に含む。 本発明は、上記キットと類似して、ヒトＹ染色体上の特異領域の真性を評価す るシステムを含む。上記領域は男性の不妊と関連づけられている。上記システム は、オリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１個の対応したグループを 収容する少なくとも１個の第１の容器を含む。上記システムは、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYF53S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYF53S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; 並びに、 YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなる遺伝子座の群から選択されたヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグ ループをプライミングし得るオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１ 個の対応したグループを収容する。 上記システムは、上記ヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグループに対応 した少なくとも一つの対照ＤＮＡアンプリマー・ラダーを収容する少なくとも１ 個の第２の容器を更に有する。 正常男性ＤＮＡを収容する第３の容器及び正常女性ＤＮＡを収容する第４の容 器が、システムを使用するための命令と共にシステム 内に設けられる。 マルチプレックスシステムの構成 マルチプレックスシステムを構成する前に、増幅によってサイズの重ならない 種々の増幅された遺伝子座の断片が生成されるように、若しくは、サイズの重な り合いが生じたときには、異なる遺伝子座を表わす断片が別個の手段により検出 され得るように、遺伝子座と、プライマーと、増幅プロトコルの適切なセットが 選択されなければならない。更に、選択された遺伝子座は、特異欠失イベントが 確認されるように、単一増幅プロトコルと共に使用するため互換性が必要である 。また、患者、正常男性及び正常女性のサンプルに正の増幅が得られるように正 の内的統制が個々のマルチプレックスに作成されるべきである。以下に説明する 遺伝子座の特定の組合せはこのアプリケーションに特有である。遺伝子座の組合 せは、上記の理由のため、又は、組合せ中に、一つ以上の遺伝子座は適当な生成 量を生産しないため、若しくは、真正の対立遺伝子を表わさない断片が反応中に 生成されるため却下される場合がある。 成功する組合せは、含有された全ての遺伝子座の増幅が成功する平衡状態を識 別するため、ＳＴＳ組合せの試行錯誤、及び、プライマー濃度の調節により発生 される。また、特有のＳＴＳプライマーは、アンプリマー(amplimer)の直接的な 配列決定、又は、不妊患者の欠失ブレークポイントの側面にある領域内の一方向 のエクステンションから発生される。上記のＳＴＳは特異遺伝子座にマップされ 、マルチプレックス器具に組み込まれる。 マルチプレックス系において特に重要な点は、全体として分析される個々の遺 伝子座から生成された増幅された遺伝子座のサイズ範囲である。現在の技術によ る分析を容易化するため、５００塩基よりも小さい断面の増幅により検出可能な 系が、好ましくは、発生させられた配列決定反応物から選択又は生成される。 その上、分析の容易化のため、ＳＴＳは、相互に十分に異なる分子量を有する その遺伝子座のプライム増幅がアガロースゲル上の電気泳動により明瞭かつ明確 に分離されるように選択される。これにより、欠失イベントの検出が簡単かつ明 白になる。従って、所定の分析の結果の説明は、分析の単純さに起因して信頼性 が得られる。 本発明において利用された特異ＳＴＳのＹ染色体遺伝子座及び増幅された生成 物のサイズが以下の表１に示されている。 分析を行う方法論 本発明の方法を実施するため、最初に、検査される個体から血液が取り出され る。これは、従来通りの方法で、通常ＥＤＴＡ又はクエン酸中で行われる。血液 は、含有されたＤＮＡを分離するため処理される。これは、Promega Corporatio n のWizard（登録商標）（ウィスコンシン州、マディソン）を用いて、或いは、 標準的なフェノールクロロホルム方を用いた摘出により、従来の方法を使用して 行われる。約１００ｎｇの最小量のＤＮＡが１検体につき必要とされる。残りの 血液又はＤＮＡは、欠失が検出された場合の将来の利用に備えて−２０°Ｃで保 存される。略１００ｎｇの検体及び対照ＤＮＡが各反応管毎に使用される。 各マルチプレックスＰＣＲ増幅のため、以下の好ましい処理が続けられる。 増幅コンテナピペットに、総テンプレート容積１０マイクロリットルのナノピ ュア水中の１００ｎｇの検体ＤＮＡが注入され、次いで、４０マイクロリットル の選択されたマルチプレックス混合物（表１に示される如くのＩ乃至ＸＶＩＩ） 。管は、好ましくは渦巻運動を用いて攪拌される。適当な量のＴａｑ ＤＮＡポ リメラーゼが管に添加され、管は渦巻運動させられ、次いでパルス遠心分離が続 けられる。 全く同じ処理が、１）増幅後に正常標準増幅及び欠失対照として 働く対照正常男性ＤＮＡと、２）対照正常女性ＤＮＡとに対し別個の管を使用し て並列的に繰り返される。 上記処理は、実行された各マルチプレックスに対し繰り返される。かくして、 最小限、表１に掲載されたような１７個のマルチプレックスの完全な器具は、各 マルチプレックス毎に検体のＤＮＡの単一の管と、対応した正常妊性男性ＤＮＡ を含む対照アンプリマー・ラダーＤＮＡの管とを含み、各管は最適増幅に必要と される全ての成分を含む。選択的に、所定の各マルチプレックスＩ乃至ＸＶＩＩ に対し、１００ｎｇの女性ＤＮＡと夫々のマルチプレックス混合物からなる陰性 の（男性混在）対照が検査される。異質混入に対し付加された予防措置として、 １０マイクロリットルのナノピュア水がテンプレート対照として使用される。全 ての成分は準備中は氷の状態に保たれるべきである。好ましくは、１０人の患者 の増幅のために充分な試薬と、その対照とが供給される。しかし、検査される患 者は、５乃至１０人ずつのグループにまとめる方がよい。そのようにされたなら ば、１所定の“一括された”ＰＣＲ増幅の際に最初の患者に対し、セットの対照 だけが必要である。血液は、４°Ｃで４週間まで保存され、ＤＮＡは−２０°Ｃ で無期限に保存され得る。 増幅するため、１滴の無菌鉱油が各管に添加される。次に、管は閉められ、許 可された熱循環器に設置され、初期変性：９５°Ｃで２．５分間、変性：９５° Ｃで１分間、アニーリング：６１°Ｃで１分間、エクステンション：７２°Ｃで １分間に従って増幅される。増幅のプロトコルは３５サイクル繰り返されるべき である。 増幅後、サンプルは４°Ｃに維持される。増幅生成物は、従来の周知の電気泳 動処理を使用して標準的な３％Metaphor又はNuSeiveアガロースゲル上で分離さ れる。電気泳動の終了後、ゲルは標準的なプロトコルに従って臭化エチジウムで 染色され、紫外線光ボックスで可視化され、写真撮影される。この写真は欠失イ ベントの有無が分析される。 本発明で使用するための好ましいオリゴヌクレオチド遺伝子座特異プライマー 配列、並びに、増幅反応中の好ましいプライマー濃度（プライマー当たりの濃度 ）が上記表２に掲載されている。表２は表１と対応する。例えば、表２の配列Ｉ Ｄ番号１及び２は、表１に示される如く、ＤＹＳ２０９遺伝子座の遺伝子座特異 プライマーペアである。上記プライマー濃度は好ましい濃度であることに注意す る必要がある。ＰＣＲを最適化するため種々のプライマー濃度の濃度を変化させ ても良い。 試験キット 本発明のキットは、ヒト男性不妊症の種々のタイプに関連する小さなＹ染色体 関連欠失を、組み込まれた内的統制を用いて高い信頼性及び再現性で検出するよ うに設計されている。本キットの好ましい実施例において、キットは本方法を適 切に実行するのに必要な全ての試薬及び容器を含み、同時に、人為的誤り及び実 験的誤りの双方の可能性を最小化する。最も好ましい実施例において、キットは 、すぐ使用できるように、以下の品目を含むユーザフレンドリーなフォーマット で、一式がパッケージ化された表２に掲げるＳＴＳオリゴヌクレオチド・プライ マーペアを含む。 （ａ）予め最適化されＰＣＲに適した濃度及び比率で互いに結合された、表１に 詳細を示す遺伝子座の増幅を起動することが可能なオリゴヌクレオチド・ペア、 試薬緩衝液、マグネシウム、ｄＮＴＰ、及び、滅菌水を含有する１０個のマルチ プレックス混合物。好ましくは、末端ユーザが１０名の患者及びその対照を検査 できるように十分なマルチプレックス混合物が提供される。この１０個のマルチ プレックス混合物は別々の容器に収容され、それに応じてラベルが付されている 。 （ｂ）ゲル電気泳動分子量対照標識として用いられる１０個の対照アンプリマー ・ラダー。この１０個の対照アンプリマーラダーは上 記（ａ）で述べた１０個のマルチプレックス混合物に対応している。１０の対照 アンプリマー・ラダーは別々の容器に収容され、それに応じてラベルが付されて いる。実際には、各マルチプレックスは、サイズ及び特性の比較が容易となるよ うに夫々の対照男性増幅及び対照アンプリマーラダーが電気泳動された状態で、 アガロースゲル上で分離され溶解される。 （ｃ）対照正常男性ＤＮＡ（プロメガ社＃Ｇ１４７、マジソン、ウイスコンシン ）。 （ｄ）対照正常女性ＤＮＡ（プロメガ社＃Ｇ１５２、マジソン、ウイスコンシン ）。 （ｅ）ナノピュア水 キットは、その簡便性を向上するため付随的な品目を含んでもよい。かかる付 加的な付随的品目には、ＴａｑＤＮＡ重合酵素、滅菌鉱物油、複数の滅菌済み０ ．５ｍｌマイクロフュージ管、分子量対照標識（例えば、ＰＧＥＭプロメガ社＃ ＤＧ１７Ａ）、及び、電気泳動ゲル添加色素（例えばプロメガ社＃ＤＶ４３３Ａ ）が含まれる。 キットの全ての要素は、キットの正しい使用法の説明書と共に単一のユーザフ レンドリーな容器にパッケージされる。 上述の如く、多重体Ｉ〜XVIIに対する好ましい各オリゴヌクレオチド遺伝子座 特異的プライマーペア、及びその好ましい濃度は表２に掲げられている。 キットの利点 キットは、異常精子形成に結びつけられてきたＹ染色体上の領域での欠失突然 変異を判定する容易で簡単な方法を提供する。各マルチプレックスで結合された 種々のＳＴＳは次の理由により選択された：１）汚染Ｘ染色体、又は、複製Ｙ関 連配列が存在しないこと、２）マルチプレックス試薬内で互いに互換性があるこ と、３）特定のアンプリマーに対応する欠失が、妊性男性の十分に有意なサンプ ルに対応することは示されていないこと、及び４）これらＳＴＳは、そのサイズ がマルチプレックス内で増幅される他の生産物とは十分に異なっているため、増 幅されたフラグメントが従来のアガロースゲル上で明瞭に分離すること。これに より、欠失突然変異のためのゲルの解析が迅速かつ簡易となり、偽陽性欠失発生 すなわち実験的人為現象が欠失発生の存在をマスクする危険性（すなわち、擬陰 性）が最小化される。不妊症（少なくとも、無精子症及び乏精液症）に関連する 欠失が高頻度で観察される領域から選択された独自のＳＴＳを提供するため特別 の努力が払われた。 最も重要なことは、キットが「ユーザフレンドリー」であり、使用が非常に簡 単な点である。これにより、人為的誤りが最小化され、同時に、検査の精度及び 再現性が向上される。これは、必要な試薬及びその容器を、簡潔な使用説明書と 共に単一のキットに結合することにより実現されている。このようにして、本発 明によれば、男性試験対象のＹ染色体を欠失突然変異について数時間で検査する ことが可能となる。 更に、試験キットが、広く受け入れられ評価されている実験手法であるＰＣＲ 法を用いているので、信頼性が高く、かつ、当業者に受け入れられることが保証 される。 実験例 以下の例は、本願で請求された発明の完全な理解の助けとなることのみを目的 として例示したものである。以下の例は、如何なる意味においても、本願で請求 された発明を限定するものでないことが理解される。 集団サンプリング 表３は、２９１の個体（マルチプレックスＩ〜Ｖ）及び４５の個体（マルチプ レックスVI〜VII）のサンプル集団についての各マル チプレックスの成功率を示す。この表からわかるように、マルチプレックスＩ〜 VIに対する成功率は全て９５％より大きく、マルチプレックスＩに対する成功率 は１００％である。本実験では、マルチプレックスVII 及びVIIIに対する成功率 は９１％であった。 下に示す表４は、表現型が正常な５２０名の妊性男性（血液は赤十字から提供 された）、及び、不妊男性患者を扱う４つの医師診療グループの集団研究の結果 を示す。赤十字の４００人の妊性男性のサンプルは、本マルチプレックス器具に よる解析によっては欠失を示さなかった。医師の患者群のうち最大の群（患者数 １７５）は。本マルチプレックス解析を用いて６．６％のＹ染色体欠失を示した 。表４にまとめられた研究全体に対して、試験された集団の１１．５％はＹ染色 体欠失突然変異を示した。 下に示す表５は、上記の如く赤十字より入手された正常妊性男性からの５２０ の血液サンプルを解析するのに用いられた場合の、マルチプレックスVIII-VIII の成功率を示す。 次の例は、本願で請求された発明が如何に作用してＹ染色体欠失発生を検出す るかを示す。本例は、単に例示のためのものであり、如何なる意味においても本 文に記載され請求された発明の範囲を限 定するものではない。 例１−マルチプレックスＩ〜Ｖを用いた解析 本例では、患者１〜５で示される５人の患者、及び、３人の正常成人男性が図 １に示すマルチプレックスＩ〜Ｖを用いて解析された。図１に示す如く、増幅さ れたフラグメントのＳＴＳ、遺伝子座、及び塩基対サイズが夫々ページの上から 下へ示されている。図１の中央を示す９つのゲルは各解析に対する結果である。 マルチプレックスＩ〜Ｖは、夫々、図面の上から下へ示されている。マルチプレ ックスＩ、II、III、及びＶについては繰り返して行われた。ＤＮＡ調製及び増 幅は先に詳細に述べた手順を用いて実行された。図１の最も左側に示すゲルは、 それぞれ、マルチプレックスＩ、III、及びIVで生じた欠失発生を示す。図１の 最も右側の図は、各増幅バンドの強度を示すＡＭＢＩＳスキャンである。 例２−マルチプレックスVI及びVII を用いた遺伝子分析 例２は、マルチプレックスVI及びVII が使用された点を除き例１と同一の方法 で実行された。その結果が図２Ａ及び図２Ｂに夫々示されている。例１と同様に 、ＤＮＡを調製し、ゲルを電気泳動させて解析するのに標準プロトコルが使用さ れた。 例３−ＳＭＣＸを用いた陽性Ｘ関連コントロール 本例では、Ｘ関連遺伝子座ＳＭＣＸが陽性対照として使用された。ここで、Ｓ ＭＣＸプライマーペアのみが標準プロトコルに従って発生された。その結果のゲ ルを図２Ｃに示す。 例４−マルチプレックスIII を用いた無精子症ＸＸ男性の解析 本例では、無精子症ＸＸ男性がマルチプレックスIII を用いて解析された。こ の患者は、Ｙ染色体の末端部がＸ染色体に転座してい た。図４に示す如く、マルチプレックスIII による解析の結果、この患者は、Ｓ ＲＹを除き、マルチプレックスIII に含まれる全てのＹ染色体遺伝子座について 完全に陰性であることがわかった。 例５−マルチプレックスＩ〜Ｖを用いた胎児双子の解析 例５では、ＤＮＡが羊水から抽出され、マルチプレックスＩ〜Ｖにより上述の 方式を用いて解析された。その結果を図５に示す。 図５において、Ｔ−１は第１の双子を示し、Ｔ−２は第２の双子を示す。Ｃは 、対照男性遺伝子ＤＮＡを示す。ゲルの解析により、双子は二卵性であることが わかった。対照レーンをＴ−２のレーンと比較することにより、双子２は欠失の ない正常男性であることがわかった。これに対して、対照レーンをＴ−１レーン と比較することにより、双子１は、インターバル３からインターバル７まで、及 びＢＫＭの遺伝子座を全て失っていることがわかった。 例６−各マルチプレックスにおいて欠失発生を示すマルチプレックスＩ〜Ｖ 本例では、マルチプレックスＩ〜Ｖの夫々に対するアンプリマー・ラダーが、 それぞれ、各マルチプレックスにおいて、欠失発生を示す患者について縦一列に 発生された。その結果を図６に示す。左から右へ進むと、第１のレーンは分子量 対照であり、マルチプレックスＩ〜Ｖ及び患者ＤＮＡサンプルの夫々のアンプリ マー・レーンの対が続く。最も右側のレーンの対は無関係の実験である。例７−マルチプレックスＩ、VI、Ｘ〜XIII、XVIIを用いた正常男性ＤＮＡの解析 本例では、正常男性染色体ＤＮＡがマルチプレックスＩ、VI、Ｘ〜XIII、及び XVIIを用いて増幅された。その結果が図７に示されている。左から右へ進むと、 各マルチプレックスのレーンＡ、Ｂ、及 びＣは、夫々、増幅された染色体ＤＮＡ、アンプリマーラダーＤＮＡ、及び陰性 対照である。分子量標識は「ｓｄ」と印されたレーンに含まれている。ゲルに欠 失発生は示されていない。このゲルは、開示されたマルチプレックスにより実現 された、明瞭な遺伝子座の解像を示している。 例８−マルチプレックスＸを用いた反復解析 本例では、マルチプレックスの再現性を示すため、マルチプレックスＸを用い て繰り返し実行された。その結果を図８に示す。レーンＡ〜Ｇはマルチプレック スＸで増幅されたＤＮＡを含んでいる。レーンＨは陰性対照を含んでいる。レー ンＩは分子量基準を含んでいる。図８は、マルチプレックスＸ内に含まれる遺伝 子座の明瞭で再現性のある分離を示している。 例９−マルチプレックスIX〜XIII及びXVIIを用いた胎児双子の解析 例５で述べたのと同一の解析がマルチプレックスIX〜XIII及びXVIIを用いて行 われた。本例において、双子Ａ及びＢは例５の双子１及び２に対応している。双 子Ａは多数の欠失発生を示した。 例１０−患者群及び双子Ａ（双子１）におけるＹ欠失発生の概略表示 図３は、選抜された患者のサンプルの欠失ブレークポイントを示す。Ｙ染色体 領域及びインターバルは左から右へ水平軸上に示されている。正常な男性及び女 性、及び８人の患者が上から下へ鉛直軸上に示されている。プラス（＋）符号は 遺伝子座が存在することを示し、マイナス（−）符号は遺伝子座が存在しないこ とを示す。 図１０は、双子Ａに対する同一の図であり、多数のＹ染色体欠失発生を示して いる。 本発明は、以上に列挙された特定の実施例に限定されるものでは なく、請求の範囲で画定される如く、その変形の全ての形態を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年７月１日 【補正内容】 より得られる）Ｙ染色体ＤＮＡの断面がクローン化されたλファージ(Charon 21 A)からなる。ランダムに選択されたＹ−ＤＮＡ含有クローンの分析により、Ｙ染 色体に沿った欠失インタバルが定義される。問題となるＤＮＡ配列はλファージ から削除され、核外遺伝子（例えば、pUC8又はpUC13）内に再クローン化される 。 ページ等のグループによる非常に類似したＹ染色体欠失マップはThe Human Y Chromosome: A 43-Interval Map，Science，258:52-59(2 October 1992)に報告 されている。この場合、４３−インタバル欠失マップが配列標識部位を利用して 顕微鏡的に検出可能なＹ染色体欠失を表示する男性の集団のＰＣＲ分析により作 成された。 Ma他（１９９２）は、ゲノミックブロットハイブリダイゼーションによりＹ染 色体の長いアーム（Ｙｑ）における構造上の異常を分析するため同様のアプロー チを使用した。従来の不妊男性の細胞遺伝子学的研究は、無精子症因子（ＡＺＦ ）と称される遺伝子制御精子形成の配置がＹ染色体のバンドq11.23であることを 示唆した。さらに、分子マッピングは、ＡＺＦをＹ染色体のインタバル６に配置 した。予めＹｑにマップされた３０個のＤＮＡプローブの系列を使用することに より、Ma他は、ある種の無精子症男性のインタバル６にマイクロ（微少）欠失を 見つけた。 ３０個のプローブを用いることにより、Ma他は、ヒトＹ染色体のインタバル６ の詳細な欠失マップを作成した。Ma他は、細胞遺伝子学的に定義されたＹ染色体 の長いアーム上に欠失又は再配置を含む２１の個体からゲノミックブロットを探 針することによりインタバル６を１４個のサブインタバルに分化した。２１個の ブロットの結果を使用することにより、Ma他は、ＤＮＡプローブをインタバル６ の１４個のサブインタバルにマップし、患者の変更されたＹ染色体明白性のブレ ークポイントを並べることができた。 Ma他による他の論文は、インタバル６、サブインタバルXII-XIVのＹ染色体欠 失内にある遺伝子ファミリーの単離及び特徴化を報告 している。遠位インタバル欠失にマップするＹ特異プローブから単離されたコス ミッドクローンを用いることにより、Ma他は潜在的なＣｐＧアイランド、すなわ ち、遺伝子の存在の指標を識別した。コスミッドを使用して分離された精巣ｃＤ ＮＡライブラリからのＤＮＡ配列を用いることにより、Ma他は配列が長いアーム の遠位真性染 びＣは、夫々、増幅された染色体ＤＮＡ、アンプリマーラダーＤＮＡ、及び陰性 対照である。分子量標識は「ｓｄ」と印されたレーンに含まれている。ゲルに欠 失発生は示されていない。このゲルは、開示されたマルチプレックスにより実現 された、明瞭な遺伝子座の解像を示している。 例８−マルチプレックスＸを用いた反復解析 本例では、マルチプレックスの再現性を示すため、マルチプレックスＸを用い て繰り返し実行された。その結果を図８に示す。レーンＡ〜Ｇはマルチプレック スＸで増幅されたＤＮＡを含んでいる。レーンＨは陰性対照を含んでいる。レー ンＩは分子量基準を含んでいる。図８は、マルチプレックスＸ内に含まれる遺伝 子座の明瞭で再現性のある分離を示している。 例９−マルチプレックスIX〜XIII及びXVIIを用いた胎児双子の解析 例５で述べたのと同一の解析がマルチプレックスIX〜XIII及びXVIIを用いて行 われた。本例において、双子Ａ及びＢは例５の双子１及び２に対応している。双 子Ａは多数の欠失発生を示した。 例１０−患者群及び双子Ａ（双子１）におけるＹ欠失発生の概略表示 図３は、選抜された患者のサンプルの欠失ブレークポイントを示す。Ｙ染色体 領域及びインターバルは左から右へ水平軸上に示されている。正常な男性及び女 性、及び８人の患者が上から下へ鉛直軸上に示されている。プラス（＋）符号は 遺伝子座が存在することを示し、マイナス（−）符号は遺伝子座が存在しないこ とを示す。 図１０は、双子Ａに対する同一の図であり、多数のＹ染色体欠失発生を示して いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ミューレム，アリエージュ アメリカ合衆国，ウィスコンシン州 53705，マディソン，ユニヴァーシティ・ アヴェニュー 2110番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 雄の不妊を表わすＹ染色体の欠失を検査する方法において、 （ａ）DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYS51S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYS51S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; 並びに、 DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなる群から選択されたヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個の対応したグル ープをプライミングする異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも １個のグループを、検体のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合する段階と、 （ｂ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を生成するため、異なるオリゴヌクレオチ ドプライマーペアの少なくとも１個のグループを、少なくとも一つの対応するマ ルチプレックスポリメラーゼ鎖反応によって増幅する段階と、 （ｃ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を分離する段階と、 （ｄ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を、正常男性からの対応する増幅された染 色体断片と比較することにより、検体のＹ染色体の欠失が検出される段階とから なる方法。 ２． 段階（ａ）において、検体のゲノミックＤＮＡ又は血液は、 配列ＩＤ番号：１−１４，９５及び９６、 配列ＩＤ番号：１５−２６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：２７−３８，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：３９，４０，４３−４８，９７−１００、 配列ＩＤ番号：４９−５６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：５９−６２，７５，７６，９７，９８及び１１５−１２２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９−８６，９７，９８，１０１及び１０２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９，８０，８３−８６，９７，９８及び１０１ −１０４、 配列ＩＤ番号：９７，９８及び１０５−１１４、並びに、 配列ＩＤ番号：８７−９４，１３及び１４ からなる群から選択された異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくと も１個のグループと結合される請求項１記載の方法。 ３． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なく とも１個のグループは、被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合される請求項 ２記載の方法。 ４． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なく とも１個のグループは、表現的に男性被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合 される請求項３記載の方法。 ５． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なく とも１個のグループは、表現的に性別が曖昧な被験者のゲノミックＤＮＡ又は血 液と結合される請求項３記載の方法。 ６． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマー ペアの少なくとも１個のグループは、表現的に女性被験者のゲノミックＤＮＡ又 は血液と結合される請求項３記載の方法。 ７． 段階（ｃ）において、増幅された染色体ＤＮＡ断片は、アガロース又はア クリルアミドゲル電気泳動により分離される請求項１記載の方法。 ８． 段階（ｂ）において、少なくとも一つの対応するマルチプレックスポリメ ラーゼ鎖反応により増幅された異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの少な くとも１個のグループは、上記少なくとも一つの対応するマルチプレックスポリ メラーゼ鎖反応を、約９５°Ｃで約２．５分間の初期変性に晒し、次に、約９５ °Ｃで約１分間の変性の２５乃至３５回のサイクルを循環させ、約６１°Ｃで約 １分間のアニーリングを行い、約７２°Ｃで約１分間のエクステンションをする ことにより増幅される請求項１記載の方法。 ９． 雄の不妊を表わすＹ染色体の欠失を検査する方法において、 （ａ）DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYS51S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYS51S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; 並びに、 DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなる群から選択された対応したヒト染色体遺伝子座の１０個のグループをプ ライミングする異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個のグループを 、検体のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合し、 上記異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個の各グループは、夫々 の検体のゲノミックＤＮＡ又は血液が別々の容器内に配置されている段階と、 （ｂ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を生成するため、異なるオリゴヌクレオチ ドプライマーペアの１０個のグループを１０個の対応するマルチプレックスポリ メラーゼ鎖反応によって増幅する段階と、 （ｃ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を分離する段階と、 （ｄ）増幅された染色体ＤＮＡ断片を、正常者からの対応する増幅された染色 体断片と比較することにより、検体のＹ染色体の欠失が検出される段階とからな る方法。 １０． 検体のゲノミックＤＮＡ又は血液は、以下の異なるオリゴヌクレオチド プライマーペアの１０個のグループ、即ち、 配列ＩＤ番号：１−１４，９５及び９６、 配列ＩＤ番号：１５−２６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：２７−３８，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：３９，４０，４３−４８，９７−１００、 配列ＩＤ番号：４９−５６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：５９−６２，７５，７６，９７，９８及び１１５−１２２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９−８６，９７，９８，１０１及び１０２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９，８０，８３−８６，９７，９８及び１０１ −１０４、 配列ＩＤ番号：９７，９８及び１０５−１１４、並びに、 配列ＩＤ番号：８７−９４，１３及び１４ と結合される請求項９記載の方法。 １１． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０ 個のグループは、被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合される請求項１０記 載の方法。 １２． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０ 個のグループは、表現的に男性被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合される 請求項１１記載の方法。 １３． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０ 個のグループは、表現的に性別が曖昧な被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結 合される請求項１１記載の方法。 １４． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０ 個のグループは、無精子症又は精子過小症のため不妊症である男性被験者のゲノ ミックＤＮＡ又は血液と結合される請求項１１記載の方法。 １５． 段階（ａ）において、異なるオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０ 個のグループは、表現的に女性被験者のゲノミックＤＮＡ又は血液と結合される 請求項１１記載の方法。 １６． 段階（ｃ）において、増幅された染色体ＤＮＡ断片は、アガロースゲル 電気泳動により分離される請求項９記載の方法。 １７． 段階（ｂ）において、１０個の対応するマルチプレックスポリメラーゼ 鎖反応内の異なるオリゴヌクレオチドプライマーペア の１０個のグループは、上記少なくとも一つの対応するマルチプレックスポリメ ラーゼ鎖反応を、約９５°Ｃで約２．５分間の初期変性に晒し、次に、約９５° Ｃで約１分間の変性の２５乃至３５回のサイクルを循環させ、約６１°Ｃで約１ 分間のアニーリングを行い、約７２°Ｃで約１分のエクステンションをすること により増幅される請求項１０記載の方法。 １８． 雄の不妊を表わすＹ染色体の欠失を検査するキットにおいて、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYS51S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYS51S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; 並びに、 DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; からなる群から選択されたヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個の対応したグル ープをプライミングし得るオリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１個 の対応したグループを収容する少なくとも１個の第１の容器と、 上記ヒト染色体遺伝子座の少なくとも１個のグループに対応した少なくとも一 つの対照ＤＮＡアンプリマー・ラダーを収容する少なくとも１個の第２の容器と からなるキット。 １９． 上記オリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１個の対応したグ ループは、 配列ＩＤ番号：１−１４，９５及び９６、 配列ＩＤ番号：１５−２６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：２７−３８，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：３９，４０，４３−４８，９７−１００、 配列ＩＤ番号：４９−５６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：５９−６２，７５，７６，９７，９８及び１１５−１２２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９−８６，９７，９８，１０１及び１０２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９，８０，８３−８６，９７，９８及び１０１ −１０４、 配列ＩＤ番号：９７，９８及び１０５−１１４、並びに、 配列ＩＤ番号：８７−９４，１３及び１４ からなる群から選択される請求項１８記載のキット。 ２０． ナノピュア水の供給器と、ＰＣＲ適合緩衝液の供給器と、ＰＣＲ適合マ グネシウムの供給器と、ＰＣＲ適合ｄＮＴＰの供給器とを更に有する請求項１８ 記載のキット。 ２１． 少なくとも一つの第３の容器を更に有し、 上記ナノピュア水の供給器と、上記ＰＣＲ適合緩衝液の供給器と、上記ＰＣＲ 適合マグネシウムの供給器と、上記ＰＣＲ適合ｄＮＴＰの供給器はＰＣＲ適合濃 縮器で一つに結合され、その中に配置されている請求項２０記載のキット。 ２２． 上記オリゴヌクレオチドプライマーペアの少なくとも１個のグループ及 び上記少なくとも一つの対照ＤＮＡアンプリマー・ラ ダーは、ナノピュア水、ＰＣＲ適合緩衝液、ＰＣＲ適合マグネシウム、及び、Ｐ ＣＲ適合ｄＮＴＰのＰＣＲ適合濃縮器と組み合わされて、夫々、上記少なくとも 一つの第１の容器及び上記少なくとも一つの第２の容器に収容されている請求項 １８記載のキット。 ２３． 予め滅菌されたマイクロフュージ容器のグループを更に有する請求項１ ８記載のキット。 ２４． ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの供給器を更に有する請求項１８記載のキッ ト。 ２５． 滅菌鉱油の供給器を更に有する請求項１８記載のキット。 ２６． 分子量ＤＮＡ対照標識の供給器を更に有する請求項１８記載のキット。 ２７． ゲル電気泳動ローディング色素の供給器を更に有する請求項１８記載の キット。 ２８． 正常ヒト女性ＤＮＡの供給器と、正常ヒト男性ＤＮＡの供給器とを更に 有する請求項１８記載のキット。 ２９． ヒトＹ染色体遺伝子座及びＹ染色体と結合されていない対照遺伝子座の １０個のグループ、即ち、 DYS209，DYF43S1，DYS210，DYS211，DYS33，DYS1，SMCX，DAZ(1); DYS218，DYS219，DYS212，DYS51S1，DYS205，DYS281，MIC2; DYS201，DYS241，DYS198，SRY，DYS197，DYS196，MIC2; DYS240，DYS271，DYS221，KAL182，DAZ(2)，MIC2; DYS224，DYS226，DYS222，DYS227，MIC2; DYS51S1，DYS229，DYZ1，DYS230，DAZ(3)，DAZ(4)，DAZ(5)，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS223，DYS7，DYS237，DYS215，MIC2; SMCY，DYS217，DYS220，DYS7，DYS237，DYS215，DAZ(6)，MIC2; 並びに、 DAZ(7)，DAZ(8)，DAZ(9)，DAZ(10)，DAZ(11)，MIC2; YRRM1，SMCY，ZFY，BKM，SMCX; をプライミングし得るオリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個の対応したグ ループを収容する１０個の第１の容器と、 上記ヒトＹ染色体遺伝子座及びＹ染色体と結合されていない対照遺伝子座の１ ０個のグループに対応した１０個の対照ＤＮＡアンプリマー・ラダーを収容する １０個の第２の容器とを更に有する請求項１８記載のキット。 ３０． 上記オリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個の対応したグループは 、 配列ＩＤ番号：１−１４，９５及び９６、 配列ＩＤ番号：１５−２６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：２７−３８，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：３９，４０，４３−４８，９７−１００、 配列ＩＤ番号：４９−５６，９７及び９８、 配列ＩＤ番号：５９−６２，７５，７６，９７，９８及び１１５−１２２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９−８６，９７，９８，１０１及び１０２、 配列ＩＤ番号：７１−７４，７９，８０，８３−８６，９７，９８及び１０１ −１０４、 配列ＩＤ番号：９７，９８及び１０５−１１４、並びに、 配列ＩＤ番号：８７−９４，１３及び１４である請求項２９記載 のキット。 ３１． ナノピュア水の供給器と、ＰＣＲ適合緩衝液の供給器と、ＰＣＲ適合マ グネシウムの供給器と、ＰＣＲ適合ｄＮＴＰの供給器とを更に有する請求項２９ 記載のキット。 ３２． 少なくとも一つの第３の容器を更に有し、 上記ナノピュア水の供給器と、上記ＰＣＲ適合緩衝液の供給器と、上記ＰＣＲ 適合マグネシウムの供給器と、上記ＰＣＲ適合ｄＮＴＰの供給器はＰＣＲ適合濃 縮器で一つに結合され、その中に配置されている請求項３１記載のキット。 ３３． 上記オリゴヌクレオチドプライマーペアの１０個のグループ及び上記１ ０個の対照ＤＮＡアンプリマー・ラダーは、ナノピュア水、ＰＣＲ適合緩衝液、 ＰＣＲ適合マグネシウム、及び、ＰＣＲ適合ｄＮＴＰのＰＣＲ適合濃縮器と組み 合わされて、夫々、上記１０個の第１の容器及び上記１０個の第２の容器に収容 されている請求項２９記載のキット。 ３４． 予め滅菌されたマイクロフュージ容器のグループを更に有する請求項２ ９記載のキット。 ３５． ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの供給器を更に有する請求項２９記載のキッ ト。 ３６． 滅菌鉱油の供給器を更に有する請求項２９記載のキット。 ３７． 分子量ＤＮＡ対照標識の供給器を更に有する請求項２９記載のキット。 ３８． ゲル電気泳動ローディング色素の供給器を更に有する請求項２９記載の キット。 ３９． 正常ヒト女性ＤＮＡの供給器と、正常ヒト男性ＤＮＡの供給器とを更に 有する請求項２９記載のキット。