KR100464084B1 - 다기능성 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응의 산물을확인하는 방법 - Google Patents

다기능성 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응의 산물을확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1개 내지 20개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(solid support)에서 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 염기를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 전기 PCR 수행에 의하여 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 방법, 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상지지체와 PCR 혼합물을 포함하는 PCR 산물 확인용 키트 및 남성불임 관련 유전자에 대한 다기능성 프라이머를 포함하는 남성불임 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 다기능성 프라이머가 프라이머 뿐만 아니라 탐침으로도 작용할 수 있기 때문에, 증폭과 교잡이 한 번에 수행되어 보다 간편하고 신속하며 정확하게 PCR 결과를 확인할 수 있다.

Description

다기능성 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응의 산물을 확인하는 방법{A Method for Identifying PCR Product Employing Multifunctional Primer}
본 발명은 다기능성 프라이머(multifunctional primer)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)의 산물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1개 내지 20개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(solid support)에서 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 염기를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 전기 PCR 수행에 의하여 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 방법, 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상지지체와 PCR 혼합물을 포함하는 PCR 산물 확인용 키트 및 남성불임 관련 유전자에 대한 다기능성 프라이머를 포함하는 남성불임 진단키트에 관한 것이다.
최근들어 활발한 유전자 연구로 인해 다수의 질병관련 유전자가 밝혀짐에 따라, 질병의 진단 및 연구에 있어 유전자를 증폭하는 PCR 기술이 매우 중요한 역할을 차지하고 있으며, 이에 따라, 한 번에 다수의 유전자를 증폭할 수 있는 PCR 방법과 증폭된 산물을 확인하는 방법이 개발되고 있다. 현재, 한 번에 다수의 시료 유전자를 증폭할 수 있는 마이크로플레이트를 이용하는 PCR 방법과 증폭된 산물을 확인하는 전기영동법이 주로 이용되고 있으며, 최근에는 PCR의 진행과정을 컴퓨터로 확인할 수 있는 실시간 PCR(real time PCR) 방법이 개발되었다(참조: Phillip B., Clinical Chemistry, 44:2191-2194(1988)). 그러나, 전기영동법은 아가로스 겔을 사용하므로, 겔 제작에 많은 불편함이 있고, 실시간 PCR 방법은 빠르게 확인할 수는 있으나, 분석에 많은 비용이 소비되는 문제점이 있다. 또한, 전기영동법과 실시간 PCR에 의한 결과로는 단순히 유전자의 증폭 여부만을 확인할 수 있을 뿐, 원하는 부분이 정확하게 증폭되었는지는 확인할 수가 없기 때문에, 정확한 PCR 산물의 확인을 위해서는, 탐침(probe)을 이용한 교잡(hybridization) 또는 서열분석(sequencing)이 다시 한 번 수행되어야만 한다. 따라서, 마이크로플레이트에서 PCR을 행한 후, 전기 마이크로플레이트에 탐침을 첨가하여 교잡을 형성함으로써, PCR 산물을 확인하는 방법이 주로 이용되고 있다(참조: Journal of MedicalVirology, 61:251-258(2000)). 그러나, 이 방법은 다수의 시료 유전자를 한 번에 증폭할 수 있고, 마이크로플레이트에서 교잡을 행하므로 간편하게 PCR 산물을 확인할 수는 있지만, 교잡 과정에 의해 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
따라서, 종래의 PCR 산물 확인방법이 가지고 있는 문제점을 해결할 수 있는 간편하고 신속하며 정확한 PCR 산물 확인방법을 개발해야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 종래의 PCR 산물 확인방법이 가지고 있는 문제점을 해결할 수 있는 새로운 PCR 산물 확인방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1개 내지 20개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 고상 지지체에 부착시키고, dNTP와 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 dNTP를 사용하여 PCR을 수행하고 세척한 다음, 전기 PCR에 의해 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출함으로써, 간편하고 신속하며 정확하게 PCR 산물을 확인할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상지지체, PCR혼합물 및 세척용 완충용액을 포함하는 PCR 산물 확인용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 남성불임 관련 유전자에 대한 다기능성 프라이머를 포함하는 남성불임 진단키트를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 다기능성 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)의 산물을 확인하는 방법을 종래의 방법과 비교하여 나타낸 그림이다.
도 2는 남성불임 유전자인 SY158, SY269 및 SPGY1을 주형으로 한 PCR 결과를 종래의 방법과 본 발명의 방법으로 확인한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
본 발명의 다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법은 (i) PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체를 제조하는 단계(이때, 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기는 A, T, G, C, AA, AT, AG, AC, TT, TA, TG, TC, GG, GA, GT, GC, CC, CA, CT 또는 CG이다); (ii) 전기 지지체에 목적하는 주형, 프라이머, dNTP, 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액을 첨가하여 PCR을 수행하고, 세척하는 단계; 및, (iii) 전기 PCR 수행에 의하여 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함한다: 이때, 형광물질이 결합된 염기로는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxigenie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP (coumarin-5-dUPT), 시아닌-3-dNTP(cyanine-3-dNTP), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP), DNP-dNTP, 플루오레신 클로로트리아지닐-4-dUTP(fluorescein chlorotri azinyl-4-dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민-dUTP(lissamine-dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein-dUTP), 피렌-dUTP(pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP(tetramethylrhodamine-6-dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP (texas red-dUTP)를 사용할 수 있으며, 전기 형광물질이 결합된 염기를 사용한 경우, PCR 산물을 확인하는 단계는 단순히 생성된 PCR 산물에 결합되어 있는 형광물질의 형광을 측정하여 수행되므로, 보다 간편하고 신속하게 PCR 산물을 확인할 수 있다. 바이오틴이 결합된 염기를 사용한 경우, PCR 산물을 확인하는 단계는 세척한 지지체에 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 첨가하여 염기에 결합된 바이오틴과 결합시키고, 세척한 다음, 전기 표지효소의 기질을 첨가하여 반응시키고, 전기 표지효소의 활성을 측정하여 수행되며, 이때, 표지효소로는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 기질로는 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate, pNPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosph ate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate)를 사용하거나, 또는 표지효소로는 페록시다아제(peroxidase), 기질로는 페닐렌다이아민(phenylene diamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산(aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarba zole) 또는 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)을 사용할 수 있으며, 표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정할 수 있다.
PCR 산물 확인방법에 있어서, 종래의 방법에 사용되는 프라이머는 단지 프라이머로만 작용하는 반면, 본 발명의 다기능성 프라이머는 프라이머 및 탐침으로 작용할 수 있다. 종래의 방법에서는 프라이머를 고상 지지체인 마이크로플레이트에 부착시키고, 전기 프라이머와 동일한 서열의 프라이머를 사용하여 전기 마이크로플레이트에서 PCR을 행한 후, 탐침을 첨가하여, 교잡에 의해 PCR 산물을 확인하므로,증폭과 교잡이 다른 단계에서 수행되지만, 본 발명에서는 마이크로플레이트에 부착시킨 다기능성 프라이머가 프라이머 뿐만 아니라 탐침으로도 작용할 수 있기 때문에, 증폭과 교잡이 한 번에 수행되어 보다 간편하고 신속하며 정확하게 PCR 산물을 확인할 수 있다(참조: 도 1).
본 발명자들은 현재 남성불임의 진단에 이용되고 있는 유전자를 이용하여 본 발명의 효과를 확인하고, (i) PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(이때, 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기는 A, T, G, C, AA, AT, AG, AC, TT, TA, TG, TC, GG, GA, GT, GC, CC, CA, CT 또는 CG이다); (ii) 프라이머, dNTP, 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; 및, (iii) 세척용 완충용액을 포함하는 키트를 구상하였으며, 구체적으로, (i) 스페이서인 폴리-d(T)를 포함하는 다기능성 프라이머(서열번호 10, 11 및 12)를 각각 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 프라이머(서열번호 1과 2, 3과 4 및 5와 6), dNTP, 바이오틴-11-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 효소의 기질인 pNPP; 및, (iv) PCR 후의 세척용 완충용액 0.4N NaOH/0.1% Tween 20 및 효소반응 후의 세척용 완충용액 PBS/0.1% Tween 20을 포함하는 남성불임 진단키트와 (i) 스페이서인 폴리-d(T)를 포함하는 다기능성 프라이머(서열번호 13, 14, 15, 16, 17 및 18)를 각각 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 프라이머(서열번호 19와 20, 21과 22, 23과 24, 25와 26, 27과 28, 29와 30), dNTP, 바이오틴-11-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 효소의 기질인 pNPP; 및, (iv) PCR 후의 세척용 완충용액 0.4N NaOH/0.1% Tween 20 및 효소반응 후의 세척용 완충용액 PBS/0.1% Tween 20을 포함하는 남성불임 진단키트를 완성하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법
실시예 1-1: 다기능성 프라이머의 제작 및 부착
프라이머 및 탐침으로 작용할 수 있는 다기능성 프라이머를 제작하고, 고상 지지체에 부착시켰다: PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1개 내지 20개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제작하고, '다기능성 프라이머'로 명명하였다. 전기 다기능성 프라이머는 PCR 효율을 높이기 위하여, 포스페이트가 결합된 5' 말단을 갖는 스페이서(spacer, 예를 들면, 폴리-d(T))를 추가로 포함할 수 있다. 전기 제작한 다기능성 프라이머를 94℃에서 10분간 가열하고, 곧바로 얼음에서 10분간 냉각시켰다. 냉각 후, 짧게 원심분리하여 다기능성 프라이머를 응집시키고, 냉각된 1-메틸이미다졸(1-methylimidazole, pH 7.0)과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC))를 최종농도 10mM이 되도록 첨가하여 혼합하였다. 전기 혼합액을 고상 지지체로 선택된 PCR용 뉴클레오링크(NucleoLink) 96웰 마이크로플레이트(Nunc, 덴마크)에 웰당 100㎕씩 주입하고, 증발되지 않도록 처리한 다음, 50℃에서 5시간 이상 배양하여, 다기능성 프라이머를 마이크로플레이트에 부착시켰다.
배양 후, 마이크로플레이트에 부착되지 않은 다기능성 프라이머를 제거하기 위하여, 마이크로플레이트의 각 웰을 세척하였다: 마이크로플레이트의 웰로부터 전기 혼합액을 제거하고, 각 웰을 200㎕의 0.4N NaOH/0.25% Tween 20 용액으로 상온에서 3번 세척한 다음, 동일 부피의 동일 용액에서 10분간 상온배양하고, 각 웰을 200㎕의 동일 용액과 증류수로 상온에서 각각 3번씩 세척하였다. 이어, 200㎕의 증류수를 가하여 5분간 상온배양하고 3번씩 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
실시예 1-2: PCR 및 다기능성 프라이머와 교잡되지 않은 PCR 산물의 제거
하기의 PCR 조건으로 시료 유전자를 증폭하였다: 시료 유전자(100ng/㎕) 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 0.1㎕, 프라이머 b(100pmol/㎕) 0.6㎕, dATP(100mM) 0.1㎕, dGTP(100mM) 0.1㎕, dTTP(100mM) 0.1㎕, dCTP(100mM) 0.05㎕, 바이오틴-11-dCTP(25nM) 0.2㎕, 10 ×Taq 완충용액 5㎕, Taq 중합효소(5unit/㎕, Promega, USA) 0.2㎕, 증류수 42.55㎕의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. 전기 PCR 혼합액을 온도순환기(thermocycler)에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 60℃에서30초, 72℃에서 30초의 순환을 30번 반복하였다.
PCR이 완료되면, 세척을 통해 마이크로플레이트에 부착된 다기능성 프라이머와 교잡되지 않은 PCR 산물을 제거하였다: 각 웰을 200㎕의 0.4N NaOH/0.1% Tween 20 용액으로 3번 세척하고, 200㎕의 동일 용액을 가하여 10분간 상온배양한 후, 200㎕의 동일 용액과 증류수로 각각 3번씩 세척하였다. 그런 다음, 200㎕의 증류수를 가하여 5분간 상온배양하고 3번씩 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
실시예 1-3: PCR 산물 확인
표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질을 첨가하여 효소 활성에 의한 발색으로써, PCR 산물을 확인하였다: PBS로 1:1000으로 희석한 스트랩트아비딘-알칼라인 포스파타아제 용액을 각 웰에 100㎕씩 가하여 40℃에서 1시간 배양하고, 200㎕의 PBS/0.1% Tween 20 용액으로 3번 세척한 후, 200㎕의 동일 용액을 가하여 5분간 배양하고 3번씩 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 세척한 각 웰에 알칼라인 포스파타아제의 기질인 pNPP 용액(Sigma, USA)을 100㎕씩 첨가하여 30분간 상온배양하고, 1N NaOH를 첨가하여 효소-기질 반응을 중지시킨 다음, 효소 활성에 의한 발색을 ELISA 리더(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서의 흡광도로 측정하였다.
실시예 2: 남성불임 유전자를 주형으로 한 PCR 산물 확인
현재 남성불임의 진단에 이용되고 있는 SY158, SY269 및 SPGY1 유전자를 이용하여, 종래의 방법과 본 발명의 방법으로 PCR을 수행하여 산물을 확인하고, 그 결과를 비교하였다: 전기 유전자를 증폭하기 위하여, 하기의 프라이머를 제작하였다.
① SY158 증폭을 위한 프라이머
5'-AGTTCCATGTGTGATGAAAG-3': S1a(서열번호 1); 및,
5'-TTTACAGTGGTTTGTAGCGG-3': S1b(서열번호 2)
② SY269 증폭을 위한 프라이머
5'-GACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': S2a(서열번호 3); 및,
5'-TGCATTGGCATGAATGTGTA-3': S2b(서열번호 4)
③ SPGY1 증폭을 위한 프라이머
5'-TACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': S3a(서열번호 5); 및,
5'-TGATAGTCTGAACACAAGCA-3': S3b(서열번호 6)
종래의 방법에서 고정 지지체에 부착되는 프라이머로서, S1, S2 및 S3를 제작하였다. S1, S2 및 S3는 각각 전기 S1a, S2a 및 S3a의 염기서열 및 15개의 dTTP로 구성된 스페이서(폴리-d(T))를 포함한다.
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGTTCCATGTGTGATGAAAGA-3': S1(서열번호 7);
5'-TTTTTTTTTTTTTTTGACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': S2(서열번호 8); 및,
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': S3(서열버호 9)
전기 남성불임 유전자의 증폭을 위한 프라이머의 염기서열 및 프라이머로부터 합성되는 염기서열(밑줄로 표시)을 포함하는 다기능성 프라이머로서, SN1, SN2 및 SN3를 제작하였다. SN1, SN2 및 SN3 역시 폴리-d(T)의 스페이서를 포함한다.
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGTTCCATGTGTGATGAAAGAAG-3': SN1(서열번호 10);
5'-TTTTTTTTTTTTTTTGACAAGTGTTCCTTGGAGATTCT-3': SN2(서열번호 11); 및,
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTACAGCCATTAAGTTTAGCATTTCAAGG-3': SN3(서열번호 12)
전기 S1, S2, S3, SN1, SN2 및 SN3를 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 마이크로플레이트에 각각 부착시키고, 각각에 해당하는 한 쌍의 전기 프라이머(S1a와 S1b, S2a와 S2b 및 S3a와 S3b)를 이용하여 전기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 시료 유전자를 PCR을 통해 증폭한 다음, 전기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 PCR 결과를 확인하였다. 도 2는 남성불임 유전자인 SY158, SY269 및 SPGY1을 주형으로 한 PCR 결과를 종래의 방법과 본 발명의 방법으로 확인한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 2에서 S1(+), S2(+) 및 S3(+)는 각각 SY158, SY269 또는 SPGY1을 주형으로 한 PCR 결과를 종래의 방법으로 확인한 결과, SN1(+), SN2(+) 및 SN3(+)는 각각 SY158, SY269 또는 SPGY1을 주형으로 한 PCR 결과를 본 발명의 방법으로 확인한 결과, S1(-), S2(-) 및 S3(-)는 각각 주형을 포함하지 않고 반응시킨 PCR 결과를 종래의 방법으로 확인한 결과, SN1(-), SN2(-) 및 SN3(-)는 각각 주형을 포함하지 않고 반응시킨 PCR 결과를 본 발명의 방법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 종래의 방법으로 확인한 결과에서는 주형을 포함하는 경우와 주형을 포함하지 않은 경우의 흡광도 차이가 크지 않은 반면, 본 발명의 방법으로 확인한 결과에서는 두 경우의 차이가 확연한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비해 정확성이 높다고 할 수 있다. 또한, SN1(+), SN2(+) 및 SN3(+)의 흡광도가 거의 비슷한 것으로 볼 때, 다기능성 프라이머가 포함하는 프라이머로부터 합성되는 염기의 개수는 2개만으로도 충분하다는 것을 알 수 있다.
남성불임의 진단에 이용되고 있는 다른 유전자인 SY147, SY158, SY254, SY269, SPGY 및 SRY를 주형으로 하고, 전기 남성불임 관련 유전자에 대한 다기능성 프라이머로서 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 및 18과 전기 남성불임 관련 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30을 사용하여 전기와 동일한 방법으로 실험을 수행한 결과도 전기와 유사하게 나타났다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1개 내지 20개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(solid support)에서 바이오틴 또는 형광물질이 결합된 염기를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 전기 PCR 수행에 의하여 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 방법, 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상지지체와 PCR 혼합물을 포함하는 PCR 산물 확인용 키트 및 남성불임 관련 유전자에 대한 다기능성 프라이머를 포함하는 남성불임 진단키트를 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 다기능성 프라이머가 프라이머 뿐만 아니라 탐침으로도 작용할 수 있기 때문에, 증폭과 교잡이 한 번에 수행되어 보다 간편하고 신속하며 정확하게 PCR 결과를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명은 유전자를 이용한 질병진단 및 연구의 자동화를 위해 이용될 수 있다.
<110> GenoCheck Co. Ltd. <120> A Method for Identifying PCR Product Employing Multifunctional Pr imer <160> 30 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S1a <400> 1 agttccatgt gtgatgaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S1b <400> 2 tttacagtgg tttgtagcgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S2a <400> 3 gacaagtgtt ccttggagat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S2b <400> 4 tgcattggca tgaatgtgta 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S3a <400> 5 tacagccatt aagtttagca t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S3b <400> 6 tgatagtctg aacacaagca 20 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S1 <400> 7 tttttttttt tttttagttc catgtgtgat gaaaga 36 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S2 <400> 8 tttttttttt tttttgacaa gtgttccttg gagat 35 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S3 <400> 9 tttttttttt ttttttacag ccattaagtt tagcat 36 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer SN1 <400> 10 tttttttttt tttttagttc catgtgtgat gaaagaag 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer SN2 <400> 11 tttttttttt tttttgacaa gtgttccttg gagattct 38 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer SN3 <400> 12 tttttttttt ttttttacag ccattaagtt tagcatttca agg 43 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer 147AE <400> 13 tttttttttt ttttagcttc tctttctcgt ttgatgatcc 40 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer 158AE <400> 14 tttttttttt tttttagttc catgtgtgat gaaagaag 38 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer 254AE <400> 15 tttttttttt tttttaccag aaggcaaaat cgtgcca 37 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer 269AE <400> 16 tttttttttt tttttgacaa gtgttccttg gagattct 38 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer SPGYAE <400> 17 tttttttttt ttttacagcc attaagttta gcatttcaag g 41 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multifunctional primer SRYAE <400> 18 tttttttttt tttttcatga acgcattcat cgtgtgg 37 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 147A <400> 19 agcttctctt tctcgtttga t 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 147B <400> 20 cagatgtaat tccaatgtgc ag 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 158A <400> 21 agttccatgt gtgatgaaag a 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 158B <400> 22 tttacagtgg tttgtagcgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 254A <400> 23 ttaccagaag gcaaaatcgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 254B <400> 24 aaccgtatct accaaagcag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 269A <400> 25 gacaagtgtt ccttggagat 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 269B <400> 26 tgcattggca tgaatgtgta 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1A <400> 27 tacagccatt aagtttagca t 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1B <400> 28 tgatagtctg aacacaagca 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYA <400> 29 catgaacgca ttcatcgtgt g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYB <400> 30 ggtcgatact tataattcgg g 21

Claims (11)

  1. 다음의 각 단계를 포함하는 다기능성 프라이머(multifunctional primer)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)의 산물을 확인하는 방법:
    (i) PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로 부터 합성되는 1 내지 2개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다 기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(solid support)를 제조하는 단계(이때, 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기는 A, T, G, C, AA, AT, AG, AC, TT, TA, TG, TC, GG, GA, GT, GC, CC, CA, CT 또 는 CG이다);
    (ii) 전기 지지체에 목적하는 주형, 프라이머, dNTP, 바이오틴 또는 형광 물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액을 첨가하여 PCR을 수 행하고, 세척하는 단계; 및,
    (iii) 전기 PCR 수행에 의하여 생성된 산물에 결합되어 있는 바이오틴 또는 형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    형광물질이 결합된 dNTP는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxi genie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP(coumarin-5-dUPT), 시아닌-3- dNTP (cyanine-3-dNTP ), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP), DNP-dNTP, 플루 오레신 클로로트리아지닐-4- dUTP(fluorescein chlorotriazinyl-4-dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민-dUTP(lissamine- dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein-dUTP), 피렌 -dUTP (pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP(tetramethylrhodamine-6- dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP(texas red-dUTP)인 것을 특징으로 하는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    바이오틴을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 단계는 세척한 지지체에 표 지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 첨가하여 염기에 결합된 바이오틴 과 결합시키고, 세척한 다음, 전기 표지효소의 기질을 첨가하여 반응 시키고, 전기 표지효소의 활성을 측정하여 수행되는 것을 특징으로하 는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    형광물질을 검출하여 PCR 산물을 확인하는 단계는 생성된 PCR 산물에 결합되어 있는 형광물질의 형광을 측정하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    표지효소는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)이고, 기질 은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenylphosphate, pNPP), 5-브로 모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphos phate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate) 인 것을 특징으로 하는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서,
    표지효소는 페록시다아제(peroxidase)이고, 기질은 페닐렌다이아민 (phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetra methylbenzidine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzi dine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole) 또는 4-클 로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)인 것을 특징으로 하는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정하는 것을 특징으로 하는
    다기능성 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 확인하는 방법.
  8. (i) PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(이때, 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기는 A, T, G, C, AA, AT, AG, AC, TT, TA, TG, TC, GG, GA, GT, GC, CC, CA, CT 또는 CG이다); (ii) 프라이머, dNTP, 바이오틴이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질; 및, (iv) PCR 후의 세척용 완충용액 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는, PCR 산물 확인용 키트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. (i) PCR에 사용되는 프라이머의 염기서열을 포함하는 5' 말단 및 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기를 포함하는 3' 말단을 포함하는 다기능성 프라이머를 부착시킨 고상 지지체(이때, 프라이머로부터 합성되는 1 내지 2개의 염기는 A, T, G, C, AA, AT, AG, AC, TT, TA, TG, TC, GG, GA, GT, GC, CC, CA, CT 또는 CG이다); (ii) 프라이머, dNTP, 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; 및, (iii) PCR 후의 세척용 완충용액을 포함하는, PCR 산물 확인용 키트.
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