KR101188433B1 - 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법 - Google Patents

과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 핵산효소의 과산화효소 활성에 의한 효소적 침전 반응을 이용하여 목적핵산을 전기화학적 임피던스 분광법으로 측정하는 핵산의 검출 방법 및 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 효소적 촉매 반응의 '진행'이 아니라 '생성된 결과물'을 측정함으로써, 효소적 촉매 반응이 진행 중이거나 종료된 후에도 목적핵산의 측정이 가능하며, 전기화학적 임피던스 분광법을 이용함으로써, 수치적 결과값을 확인할 수 있고, 장치의 소형화가 용이하며, 목적핵산의 유무를 별도의 세척과정 없이 단일 단계만으로 매우 간단하게 전기적인 방법으로 측정할 수 있다.

Description

과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법{Method for Detecting Nucleic Acid Using DNAzyme Having Peroxidase Activity}
본 발명은 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 핵산효소의 과산화효소 활성에 의한 효소적 침전 반응을 이용하여 목적핵산을 전기화학적 임피던스 분광법으로 측정하는 핵산의 검출 방법 및 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물에 관한 것이다.
사회가 고도화?현대화될수록 보다 오래, 건강하게 살고 싶은 인간의 욕구는 증가하고 있다. 특히 최근 의학기술의 비약적인 발전에 의해 치료가 극히 어려운 질병이라도 조기에 발견했을 경우에는 높은 완치율을 보이는 경우가 많아 질병 진단 기술 개발에 대한 요구가 증가하고 있다. 이에 따라 현재 각종 감염성 질병이나 유전성 질병 등을 검출 및 정량하는 기술은 경제적?기술적으로 매우 중요하며 산업적으로 큰 파급효과를 가지기 때문에 세계적으로 활발히 연구되어지고 있는 분야이다. 이와 같은 질병의 진단은 단백질을 비롯한 다양한 생체 물질의 검사를 통해 가능하지만 현재 가장 정확한 진단은 유전자 검사를 통하여 진단이 이루어진다. 특히, 최근 세계적으로 이슈가 되었던 신종플루 A(H1N1) 바이러스 감염도 유전자 검사를 통해 확진 진단이 이루어진 경우이다. 그러나 현재의 형광 기반의 유전자 검사는 주로 고가의 장비와 분석 시료, 그리고 숙련된 기술을 필요로 하기 때문에 반드시 전문 검사 기관에서만 가능하다. 따라서 검체의 수집부터 검사 결과 통보까지 시간과 비용이 소요되기 때문에 최근의 신종플루 바이러스가 유행했던 경우와 같은 상황에서 많은 사람들이 불편을 겪을 수밖에 없다. 이와 같은 한계를 극복하기 위해서 누구나 쉽고 간단하게 사용할 수 있는 유전자 진단 키트의 개발이 시급하다.
이런 관점에서 전기화학적인 분석 방법은 기존의 형광 기반의 방법에 비해 장치의 소형화가 용이하고, 조작이 비교적 간단하며, 수치적 결과값을 보여주기 때문에 간편한 유전자 진단 키트 개발에 가장 적합한 방법이다(Newman and tunner, Biosens. Bioelectron ., 20:2435, 2005; J. Wang, Biosens . Bioelectron ., 21: 1887, 2006). 현재까지 유전자 검출을 위한 전기화학적인 방법들이 많이 연구되어 왔으며, 산화/환원 효소를 이용한 신호 발생 방법이 많은 비중을 차지하고 있다(Bardrea et al., Chem. Commun. 21, 1999; Patolsky et al., Langmuir 15: 3703, 1999; Patolsky et al., Angew. Chem. Int. 41:3398, 2002). 상기 방법들은 효소 단백질을 다양한 방법으로 수식화하여 목적핵산과 특이적으로 결합시키는 방법이며, 목적핵산과 반응한 효소의 활성을 측정함으로써 목적핵산의 양을 간접적으로 정량할 수 있다. 이와 같은 효소 중에 대표적인 것이 과산화효소이다. 그러나 현재까지 보고된 방법들은, 효소 단백질과 목적핵산 간의 반응 단계가 필요하며, 목적핵산과 결합하지 못한 효소를 제거해야 하는 세척과정이 반드시 필요하다. 따라서 전체 검출 과정은 '시료주입 - 세척 - 효소 단백질 결합 - 세척 - 분석'의 단계가 기본적으로 반드시 필요하며, 경우에 따라 추가적인 단계가 더 필요한 경우도 있다. 이와 같은 많은 반응 단계로 인해 전체 분석 시간이 증가하고 진단 키트의 구성이 매우 복잡해져서 간편하게 다룰 수 있는 진단 키트의 구현이 매우 어려워지기 때문에, 반응 단계를 최소화한 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.
한편, 특정 조건에서 고유의 3차원 구조를 자가 형성하여 다양한 효소적 활성을 보여주는 핵산효소 염기서열에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Juewen Liu et al., J. Am. Chem. Soc., 129:9839, 2007). 이와 같은 핵산효소 염기서열을 이용할 경우, 효소 결합 반응과 같은 추가적인 반응 없이 목적핵산을 핵산효소 염기서열로 수식화하거나, 여러 가지 형태로 수식된 핵산효소 염기서열을 이용하여 목적핵산의 존재 여부에 따라 3차원 구조 형성을 조절하는 방법 등을 통해 핵산 검출 단계를 간소화할 수 있다. 현재까지 보고된 많은 핵산효소 염기서열 가운데, 전기화학적 신호 측정이 용이한 것으로는 헤민이라는 철 함유 분자와 결합하여 과산화효소 활성을 나타내는 핵산효소 염기서열이다(Travascio et al., Chemstry & Biology, 5:505, 1998; Li et al., Chem. Commun. 4209, 2007).
과산화효소 활성의 전기화학적인 측정은 전압법(voltammetry) 및 전류법(amperometry)을 통해 주로 수행되는데, 이 방법들은 과산화효소가 기질의 산화를 촉매하는 반응의 ‘진행’을 특정 조건에서 측정하는 것이다. 따라서, 효소적 촉매 반응이 진행되는 동안에만 신호 측정이 가능하고, 효소적 촉매 반응이 종료된 시점 이후에는 신호 측정이 불가능하다는 단점이 있다
이에, 본 발명자들은 효소적 촉매 반응이 진행 중이거나 종료된 후에도 목적핵산의 측정이 가능한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 전극 위에서 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소(DNAzyme)에 의한 효소적 침전반응을 이용할 경우, 전극 표면에 형성된 침전층이 전극표면의 저항을 증가시켜, 침전층에 의한 저항 변화를 전기화학적 임피던스 분광법으로 간단히 측정함으로써, 기존 방법의 세척과정이나 2차 반응 과정과 같은 추가과정 없이 단 한번의 조작만으로 시료 내의 목적핵산을 용이하게 측정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소 염기서열을 이용하여 별도의 세척과정 없이 단일 단계만으로 목적핵산의 검출이 가능한 전기화학적 핵산 검출방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 목적핵산을 검출하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 핵산효소에 대하여 상보적인 염기서열과 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 목적핵산의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 상기 핵산효소가 연결된 목적핵산을 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭 산물과 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (c) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 양 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 한쪽 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 5' 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 3' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산효소의 염기서열를 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 효소적 촉매 반응의 '진행'이 아니라 '생성된 결과물'을 측정함으로써, 효소적 촉매 반응이 진행 중이거나 종료된 후에도 목적핵산의 측정이 가능하며, 전기화학적 임피던스 분광법을 이용함으로써, 수치적 결과값을 확인할 수 있고, 장치의 소형화가 용이하며, 목적핵산의 유무를 별도의 세척과정 없이 단일 단계만으로 매우 간단하게 전기적인 방법으로 측정할 수 있다.
도 1은 핵산 진단 키트의 구성 및 신호 발생의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 핵산효소 염기서열의 유무에 따른 임피던스의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 핵산효소에 대하여 상보적인 염기서열과 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 목적핵산의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응에 의해 생성된 핵산효소 염기서열을 이용하여 목적핵산의 유무를 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실시예 1의 방법을 이용한 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 양 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하는 프로브를 이용하여 목적핵산의 유무를 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 실시예 2의 방법을 이용한 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 한쪽 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 이용하여 목적핵산의 유무를 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8은 실시예 3의 방법을 이용한 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 5' 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 3' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브를 이용하여 목적핵산의 유무를 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 10은 실시예 4의 방법을 이용한 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 핵산효소의 과산화효소 활성에 의한 효소적 침전 반응을 이용하여 목적핵산을 전기화학적 임피던스 분광법으로 측정하는 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 핵산 검출용 조성물은 핵산효소 또는 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브를 함유하고, 4-클로로나프톨(4-chloronaphthol, 4-CN), 과산화수소, 헤민(hemin) 및 전자전달물질이 혼합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산효소는 목적핵산이 존재 또는 존재하지 않는 경우에만 헤민과 반응하여 고유의 3차원 구조를 형성하게 되고, 상기 3차원 구조는 과산화효소 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 과산화효소 활성에 의해 기질인 과산화수소와 4-CN이 불용성 침전층을 전극 표면에 형성시키고(도 1), 상기 침전층은 전자전달 물질로부터 전극으로의 전자전달을 저해하여 전극표면의 임피던스를 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다(도 2).
본 발명은 일 관점에서, (a) 핵산효소에 대하여 상보적인 염기서열과 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 목적핵산의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 상기 핵산효소가 연결된 목적핵산을 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭 산물과 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (c) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 하기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다(Li et al ., Chem . Asian J., 4:918, 2009).
서열번호 1 (핵산효소 염기서열)
5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGGG
서열번호 2 (핵산효소 염기서열)
5'-GGGTGGGTGGGTGGGT
서열번호 3 (핵산효소 염기서열)
5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG
서열번호 4 (핵산효소 염기서열)
5'-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG
서열번호 5 (핵산효소 염기서열)
5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG
본 발명에 있어서, 증폭은 PCR에 의하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소는 5' 람다절단효소(5' λ-exonuclase)인 것을 특징으로 할 수 있고, 전자전달물질은 페로센메탄올 (ferrocenemethanol)을 비롯한 페로센 유도체 (ferrocene derivatives), 페리시아나이드 (ferricyanide), 메틸렌블루 (methylene blue), 오스뮴 유도체 (osmium derivatives) 및 루테늄 유도체 (ruthenium derivatives)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 진단전극은 금(gold), 유리탄소(glassy carbon), 흑연(graphite), 백금(platinum) 및 인듐틴옥사이드(indium tin oxide, ITO)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 양 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하지 않는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 한쪽 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 5' 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 3' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및 (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소는 5' 람다절단효소(5' λ-exonuclase)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 핵산효소의 염기서열를 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브는 양 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하는 프로브, 한쪽 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브 또는 5' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브 및 3' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는, 핵산효소에 상보적인 염기서열이 수식된 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 수행함으로써, Chlamydia trachomatis의 유전자 증폭 결과물에 핵산효소 염기서열이 포함되도록 고, 이러한 중합효소연쇄반응의 결과물을 5'-람다 절단효소가 첨가된 진단 시약 혼합물과 반응시킴으로써, 핵산효소 염기서열을 단일 가닥으로 분리시켰다. 상기 단일 가닥은 진단 시약 혼합물의 헤민과 반응하여 고유의 3차원 구조를 형성함으로써, 과산화효소 활성을 나타냈고, 효소적 침전반응을 진행시켜 임피던스를 증가시켰다. 그 결과, 효소적 침전반응에 의한 임피던스 변화를 측정함으로써, 검사시료 내의 목적핵산 Chlamydia trachomatis 유전자를 검출하였다.
본 발명의 다른 양태에서는, 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하고, 양쪽으로 Chlamydia trachomatis의 유전자 서열과 혼성화가 가능한 상보적인 염기서열을 포함하고 있는 프로브와 Chlamydia trachomatis의 유전자와 진단 시약 혼합물을 반응시켜 상기 프로브 분자의 양 말단을 Chlamydia trachomatis의 유전자와 혼성화시켰다. 그 결과, 프로브의 가운데 핵산효소 염기서열을 제외한 나머지는 Chlamydia trachomatis의 유전자와 단단한 이중 가닥을 형성시켰고, 혼성화된 이중 가닥 중간에 위치한 핵산효소 염기서열은 진단 시약 혼합물의 헤민과 고유의 3차원 구조를 형성하지 못하여 과산화효소 활성을 나타내지 않는 것을 확인하였고, 검사시료 내의 목적핵산 Chlamydia trachomatis 유전자를 검출하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, Chlamydia trachomatis의 유전자와 상보적인 염기서열을 중간에 포함하고, 양쪽으로 핵산효소 염기서열 및 핵산효소와 상보적인 염기서열을 포함하여 분자 내에서 자가 혼성화되어 분자 비콘 구조를 형성하는 프로브와 Chlamydia trachomatis의 유전자를 비콘 구조 중간의 상보적인 염기서열과 결합시켜, 비콘 형태에서 자가 혼성화되어 있던 핵산효소 염기서열을 단일 가닥으로 분리시켰다. 상기 핵산효소 염기서열은 진단 시약 혼합물의 헤민과 결합하여 고유의 3차원 구조를 형성시켰고, 이에 따른 과산화효소 활성에 의한 침전층을 전극 표면에 형성시켜 임피던스를 증가시키는 것을 확인하였고, 검사시료 내의 목적핵산 Chlamydia trachomatis 유전자를 검출하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 핵산효소 염기서열을 포함하고, Chlamydia trachomatis의 유전자와 연속적으로 혼성화가 가능한 두 가닥의 프로브를 Chlamydia trachomatis의 유전자와 연속적으로 혼성화시켜, 분리된 두 가닥의 핵산효소 염기서열을 근접시키고, 동시에 헤민과 결합시켜 고유의 3차원 구조를 형성시켰다. 그 결과, 과산화효소 활성을 나타내어 침전반응에 의해 전극 표면의 임피던스를 상승시키는 것을 확인하였고, 검사시료 내의 목적핵산 Chlamydia trachomatis 유전자를 검출하였다.
따라서, 본 발명에 따른 목적핵산의 전기화학적 검출방법 및 조성물은 핵산 진단 키트에 적용할 수 있으며, 상기 목적핵산의 전기화학적 검출방법 및 조성물을 핵산 진단 키트에 적용하여 사용할 경우, 기존 방법의 세척과정이나 2차 반응 과정과 같은 추가과정 없이 단 한번의 조작만으로 시료 내의 목적핵산을 용이하게 측정할 수 있는 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
중합효소연쇄반응에 의해 생성된 핵산효소 염기서열을 이용한 목적핵산의 검출방법
본 실시예에서는 목적핵산으로 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하였다. Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하기 위해, 도 3에 나타난 바와 같이, Chlamydia trachomatis의 유전자에 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 핵산효소 염기서열까지 증폭시키기 위해 포워드(forward) 프라이머(primer)의 5'-말단을 핵산효소 염기서열에 상보적인 염기서열로 수식화하였고, 외부절단효소를 이용하여 이중나선구조를 단일 가닥으로 만들기 위해 최종 5'-말단을 phosphate 작용기로 수식화하여 제작하였다. PCR을 위한 포워드 프라이머 및 리버스(reverse) 프라이머의 서열은 다음과 같다.
서열번호 6 (포워드 프라이머)
5'-phosphate-CCCAACCCGCCCTACCCAC-CCATCTTCTTTGAAGCGTTGT
서열번호 7 (리버스 프라이머)
5'-ACAGGATGACTCAAGGAATAG
상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 상기 수행된 PCR의 결과물을 0.28cm2의 금 전극 위에서 핵산효소 염기서열의 효소적 활성 반응이 일어나는 진단 시약 혼합물과 반응시켰다.
진단 시약 혼합물은 과산화효소의 기질인 1mM 4-CN, 100mM 과산화수소, 전자전달물질인 1μM 페로센메탄올 및 핵산효소 염기서열의 3차원 구조를 형성하기 위한 1μM 헤민 분자가 혼합된 인산염 완충용액(50mM phosphate buffer, pH 7.2) 및 1U 람다-외부절단효소를 첨가하여 제조하였다. 상기 람다-외부절단효소는 PCR 결과물의 5'-phosphate를 인식하며, 이중나선구조의 DNA의 한가닥을 절단시킴으로써, 핵산효소 염기서열까지 증폭된 Chlamydia trachomatis의 유전자를 단일 가닥으로 분리시켰다. 분리된 단일 가닥은 헤민 분자와 결합하여 고유의 3차원 구조를 형성함으로써, 과산화효소 활성을 가지고, 과산화효소의 기질인 과산화수소와 4-CN이 불용성 침전층을 전극 표면에 형성시켰다. 이 침전층은 전자전달물질인 페로센메탄올로부터 전극으로의 전자 전달을 저해하여 전극표면의 임피던스를 증가시켰다.
따라서, 검사시료에 목적핵산이 존재할 경우, PCR의 결과물로 핵산효소 염기서열을 포함하는 목적핵산 서열가닥과 그에 상보적인 가닥(5'-phosphate)이 혼성화된 이중나선 구조의 결과물을 얻을 수 있는 반면, 검사시료에 목적핵산이 존재하지 않을 경우, 핵산효소 염기서열에 상보적인 염기서열로 수식된 포워드 프라이머가 증폭되지 않아 증폭 결과물에 핵산효소 염기서열이 존재하지 않기 때문에 목적핵산의 유무에 따른 임피던스의 변화를 측정함으로써, 목적핵산을 검출할 수 있다.
이와 같은 방법으로 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis 유전자의 존재 유무에 따른 임피던스를 측정하였다(임피던스 측정 조건 : DC 0.2V vs Ag/AgCl; 10mV AC pluse; 10000~0.05Hz frequency).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 침전층에 의한 임피던스 변화를 측정함으로써, 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis 유전자의 존재 유무를 확인할 수 있었다.
핵산효소 염기서열을 중간에 포함하고, 양쪽으로 목적핵산 서열과 혼성화가 가능한 상보적인 염기서열을 포함하고 있는 프로브를 이용한 목적핵산의 검출방법
본 실시예에서는 목적핵산으로 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하였다. Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하기 위해, 도 5에 나타난 바와 같이, 핵산효소 염기서열(18 base)을 중간에 포함하고, 양쪽으로 Chlamydia trachomatis의 유전자 서열과 혼성화가 가능한 상보적인 염기서열을 포함하고 있는 프로브 1(57 base)을 첨가한 진단 시약 혼합물[1mM 4-CN, 100mM 과산화수소, 1μM 페로센메탄올, 1μM 헤민 분자가 혼합된 인산염 완충용액(50mM phosphate buffer, pH 7.2)]을 제조하였다. 상기 프로브 1의 서열은 다음과 같다.
서열번호 8 (프로브 1)
5'-ATGCACTTTCTACAAGAGTAC-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-TTTGTCTTCGTAACTCGC
전극 위에서 Chlamydia trachomatis의 유전자와 진단 시약 혼합물을 반응시켜 상기 프로브 분자의 양 말단을 Chlamydia trachomatis의 유전자와 혼성화시켰다. 그 결과, 프로브의 가운데 핵산효소 염기서열인 18base를 제외한 나머지는 Chlamydia trachomatis의 유전자와 단단한 이중 가닥을 형성시켰고, 혼성화된 이중 가닥 중간에 위치한 핵산효소 염기서열은 진단 시약 혼합물의 헤민과 고유의 3차원 구조를 형성하지 못하고, 과산화효소 활성을 나타내지 않았다.
따라서, 검사시료에 목적핵산이 존재하지 않을 경우, 프로브는 단일 가닥으로 존재하게 되므로 프로브의 중간에 위치한 핵산효소 염기서열이 진단 시약 혼합물의 헤민과 고유의 3차원 구조를 형성할 수 있고, 과산화효소 활성으로 인해 전극 표면에 침전층을 형성시켜 임피던스를 증가시킨다.
이와 같은 방법으로 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis 유전자의 존재 유무에 따른 임피던스를 측정하였다(임피던스 측정 조건 : DC 0.2V vs Ag/AgCl; 10mV AC pluse; 10000~0.05Hz frequency).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 목적핵산인 Chlamydia trachomatis 유전자가 없을 경우, 임피던스의 변화가 큰 것을 확인하였다.
목적핵산과 상보적인 염기서열을 중간에 포함하고, 양쪽으로 핵산효소 염기서열 및 핵산효소와 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 이용한 목적핵산의 검출방법
본 실시예에서는 목적핵산으로 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하였다. Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하기 위해, 도 7에 나타난 바와 같이, Chlamydia trachomatis의 유전자와 상보적인 염기서열(40 base)을 중간에 포함하고, 양쪽으로 핵산효소 염기서열(18 base) 및 핵산효소와 상보적인 염기서열(9 base)을 포함하는 프로브 2를 첨가한 진단 시약 혼합물[1mM 4-CN, 100mM 과산화수소, 1μM 페로센메탄올, 1μM 헤민 분자가 혼합된 인산염 완충용액(50mM phosphate buffer, pH 7.2)]을 제조하였다. 상기 프로브 2는 양 말단의 서로 상보적인 염기서열에 의해 분자 내에서 자가 혼성화되어 분자 비콘 구조를 형성하도록 합성된 프로브로써, 프로브 2의 서열은 다음과 같다.
서열번호 9 (프로브 2)
5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG - ATGCACTTTCTACAAGAGTACATCGGTCAACGAAGAGGTT - CCAACCCGC
전극 위에서 Chlamydia trachomatis의 유전자와 진단 시약 혼합물을 반응시키고, 상기 프로브 2의 분자 내에서 자가 혼성화된 염기의 길이(9 base pairs)보다 Chlamydia trachomatis의 유전자와 상보적인 염기서열의 길이가 훨씬 길기 때문에 Chlamydia trachomatis의 유전자를 비콘 구조 중간의 상보적인 염기서열과 결합시켜, 비콘 형태에서 자가 혼성화되어 있던 핵산효소 염기서열을 단일 가닥으로 분리시켰다.
상기 핵산효소 염기서열은 진단 시약 혼합물의 헤민과 결합시켜 고유의 3차원 구조를 형성시켜, 과산화효소 활성을 나타내고, 전극 표면에 침전층을 형성시켜 임피던스를 증가시켰다.
따라서, 검사시료에 목적핵산이 존재하지 않을 경우, 프로브는 비콘 형태를 유지하고, 핵산효소 염기서열은 분자 내 자가 혼성화로 이중 가닥 형태를 유지하기 때문에 과산화효소 활성을 나타내는 3차원 구조를 형성하지 못해 임피던스의 변화는 발생하지 않는다.
이와 같은 방법으로 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis 유전자의 유무에 따른 임피던스를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Chlamydia trachomatis 유전자가 존재할 경우 임피던스의 변화가 큰 것을 확인하였다.
핵산효소 염기서열을 포함하고, 목적핵산과 연속적으로 혼성화가 가능한 두 가닥의 프로브를 이용한 목적핵산의 검출방법
본 실시예에서는 목적핵산으로 Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하였다. Chlamydia trachomatis의 유전자를 검출하기 위해, 도 9에 나타난 바와 같이, 핵산효소 염기서열을 포함하고, Chlamydia trachomatis의 유전자와 연속적으로 혼성화가 가능한 두 가닥의 프로브를 첨가한 진단 시약 혼합물[1mM 4-CN, 100mM 과산화수소, 1μM 페로센메탄올, 1μM 헤민 분자가 혼합된 인산염 완충용액(50mM phosphate buffer, pH 7.2)]을 제조하였다. 상기 두 가닥의 프로브는 두 가닥이 만나는 지점에 분리된 두 가닥의 핵산효소 염기서열을 각각 포함하며, 두 가닥의 프로브의 서열은 다음과 같다.
서열번호 10 ( 프로브 4)
5'-ATGCACTTTCTACAAGAG-AAATGTGGAGGGT
서열번호 11 ( 프로브 5)
5'-AGGGACGGGAAGAAA-TACATCGGTCAACGAAGA
전극 위에서 Chlamydia trachomatis의 유전자와 진단 시약 혼합물을 반응시켜 Chlamydia trachomatis의 유전자와 연속적으로 혼성화시킴으로써, 분리된 두 가닥의 핵산효소 염기서열이 근접해지고, 동시에 헤민과 결합하여 고유의 3차원 구조를 형성하고, 과산화효소 활성에 의한 침전반응으로 전극 표면의 임피던스를 증가시켰다.
따라서, 검사시료에 목적 핵산이 존재하지 않을 경우, 두 가닥의 프로브가 분리된 상태로 진단 시약 혼합액에 존재하게 되므로, 고유의 3차원 구조를 형성하지 못해 임피던스의 변화는 발생하지 않는다.
이와 같은 방법으로 성병 유발 인자인 Chlamydia trachomatis 유전자의 유무에 따른 임피던스를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, Chlamydia trachomatis 유전자가 존재할 경우 임피던스의 변화가 큰 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
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Claims (33)

  1. 다음 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법:
    (a) 헤민과 3차구조를 형성하여 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소의 염기서열에 상보적인 염기서열과 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 목적핵산의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 상기 핵산효소가 연결된 목적핵산을 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 증폭 산물과 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및
    (c) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 증폭은 PCR에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소는 5' 람다절단효소(5' λ-exonuclase)인 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  8. 다음 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법:
    (a) 양 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 헤민과 3차구조를 형성하여 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소의 염기서열을 중간에 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및
    (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  10. 제8항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  11. 제8항에 있어서, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하지 않는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  12. 제8항에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  13. 다음 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법:
    (a) 한쪽 말단에 헤민과 3차구조를 형성하여 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소의 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및
    (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  15. 제13항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  16. 제13항에 있어서, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  17. 제13항에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  18. 다음 단계를 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출방법:
    (a) 5' 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 헤민과 3차구조를 형성하여 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브, 3' 말단에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 목적핵산 검출용 시료와 혼합하여 진단전극에 적용하는 단계; 및
    (b) 전극 위에 형성된 4-CN의 불용성 침전물에 의한 임피던스의 변화를 측정하여, 목적핵산을 검출하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  20. 제18항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  21. 제18항에 있어서, 4-CN 불용성 침전물에 의하여 임피던스가 증가하는 경우, 목적핵산이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  22. 제18항에 있어서, 진단전극은 금, 유리탄소, 흑연, 백금 및 인듐틴옥사이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 전기화학적 검출방법.
  23. 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 5' 엑소뉴클레이즈 활성을 갖는 효소는 5' 람다절단효소(5' λ-exonuclase)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올, 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 헤민과 3차구조를 형성하여 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브, 4-클로로나프톨, 과산화수소, 헤민 및 전자전달물질을 포함하는 핵산효소를 이용한 목적핵산의 전기화학적 검출용 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 전자전달물질은 페로센메탄올을 비롯한 페로센 유도체, 페리시아나이드, 메틸렌블루, 오스뮴 유도체 및 루테늄 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브는 양 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 핵산효소 염기서열을 중간에 포함하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제26항 또는 제28항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브는 한쪽 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하고 다른 말단에 상기 핵산효소 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하며 중간에 목적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제26항 또는 제30항에 있어서, 상기 핵산효소의 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제26항에 있어서, 핵산효소의 염기서열을 포함하는 프로브는 5' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 3' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브 및 3' 말단에 목적핵산에 상보적인 염기서열을 포함하고 5' 말단에 핵산효소 염기서열을 포함하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제26항 또는 제32항에 있어서, 상기 핵산효소 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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