JP4947355B2 - 増加した感度を持つ核酸検出方法 - Google Patents
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Description
本願は、2003年11月10日に出願された「NUCLEIC ACID DETECTION METHOD HAVING INCREASED SENSITIVITY(増加した感度を持つ核酸検出方法)」と題する米国仮特許出願第60/518,816号に基づく優先権を主張し、前記仮特許出願の開示は全て参照により本明細書に組み入れられる。
場合によっては、検出すべき特異的配列に相補的になるように設計された一組の固定化プローブを使って、各チップを、検出すべき配列に対して専用に製造しなければならないことが、チップ技術の欠点になる。単一生物に特異的なチップは大きな製造投資を必要とし、そのチップは狭く限定された範囲の試料にしか使用することができない。対照的に、「汎用チップ」または「汎用アレイ」は、プローブが生物特異的な配列または産物を標的としていないので、生物非依存的である。遺伝子発現解析にしばしば用いられる特定の組織、生理状態、または発生段階に特異的なチップも同様に、限定された範囲の試料に使用するために、かなりの製造投資を必要とする。汎用チップは、関心対象の組織、生理状態、または発生段階を研究するための制約のないアプローチを提供する。ポリヌクレオチド検出に汎用チップを用いることにより、製造品質管理を改善することができる。
汎用チップを製造するためのもう一つのアプローチでは、標的ポリヌクレオチド中に自然には存在しない一組のタグ配列を使用し、これらのタグが汎用チップ上の相補的プローブに結合する。そのような用途を持つタグは、時には「アドレスタグ」または「ジップコード」と呼ばれたり、標的を同定するための「バーコード」に類似しているとみなされたりする。そして、検出、同定、追跡、選別、回収、その他の操作は、標的ポリヌクレオチドの配列ではなく、タグ配列に対して行われる。オリゴヌクレオチドタグは、ポリヌクレオチドに共有結合させるか、ポリヌクレオチド中に組み込むことができる。少なくとも二つのドメイン(プローブに相補的なタグ配列を持つドメインと、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を持つドメイン)を持つことでリンカーとして機能する別個のオリゴヌクレチドのハイブリダイゼーションにより、タグは、あるポリヌクレオチドと関係づけられた状態になりうる。オリゴヌクレオチドタグを使用するシステムは、複雑な混合物中の個々の分子を操作し同定するための手段として、例えば標的ヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを検出するための手段として、または薬物候補を求めてゲノムライブラリー、cDNAライブラリー、もしくはコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする際の補助手段などとして、提案されている。BrennerおよびLerner,1992,Proc Natl Acad Sci,89:5381−5383、Alper,1994,Science,264:1399−1401、Needelsら,1993,Proc Nat Acad Sci,90:10700−10704。
タグ付きポリヌクレオチドの有用性は、あるタグと、表面に固定化されたその相補的プローブとの間で達成される特異的ハイブリダイゼーションの成功に大きく依存する。オリゴヌクレオチドタグによるポリヌクレオチドの同定を成功させるには、偽陽性シグナルおよび偽陰性シグナルの数を最小限に抑えるべきである。残念なことに、偽シグナルは珍しくない。なぜなら、塩基対形成および塩基スタッキングの自由エネルギーは、二重鎖構造または三重鎖構造をとっているヌクレオチド配列の間で、大きなばらつきを持ちうるからである。例えば、グアノシン−シトシン(G−C)対の数がもう一つの二重鎖と比べて相違しているタグ−プローブ二重鎖は異なる融点を有するので、ハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー要件も相違しているだろう。また、スタッキングエネルギーが相違するので、アデノシン(A)とチミジン(T)の反復配列がその相補鎖に結合しているものからなるタグ−プローブ二重鎖は、GとCの反復配列がミスマッチを含有する部分的に相補的な標的に結合しているものからなる同じ長さの二重鎖より、安定性が低いということも起こりうる。このようなスタッキングエネルギーの相違を埋め合わせるには、特殊な試薬がしばしば必要になる。
いくつかの実施形態には、電極表面でそれ自体が電子移動を起こす対イオン(例えばルテニウム錯体)の代わりに触媒的検出部分を使用することが含まれる。触媒的検出スキームでは、通例、酸化/還元を起こすことができる2以上の部分が存在し、それらの少なくとも一つは1サイクルを超える酸化還元サイクルに参加することができる。これらの部分の一部はこのようにして「再利用」されるので、検出可能なシグナルは、それらの部分の全てが1回の酸化還元サイクルしか起こさない場合よりも、大きくなるだろう。いくつかの実施形態では、触媒的検出部分が、自らは消耗されることなく数多くの酸化/還元サイクルに参加することができる酵素である。
HRPR+H2O2+2H+→HRPO+2H2O
HRPO+MedR→HRPR+MedO
MedO+ne−→MedR
チップなどの基板上にある核酸二重鎖のシグナルを増強するためのもう一つの技術は、捕捉プローブへのハイブリダイゼーション後に標的核酸を増幅または伸長することである。次に、増幅または伸長された標的核酸を検出試薬に結合させることができる。好ましくは、ハイブリダイズしていない捕捉プローブでの電流と、プローブ/標的二重鎖での電流との差が、できる限り大きくなるように、標的鎖を伸長する。この技術は「オンチップ増幅」と呼ぶことができ、米国特許出願第10/429293号に開示されている(この出願は参照によりその全文が明示的に本明細書に組み入れられる)。
以下のプロセスを核酸検出アッセイに使用した。
電極表面上に固定化したアビジンによって固定化された捕捉プローブは、標的に相補的な配列を含有する。次に、試料核酸をプローブにハイブリダイズさせる。標的内の配列に相補的な配列を含有する環状プローブを加える。このサークルは、後続のステップで使用する検出子プローブに相補的な特異的配列も含有する。
パッドロックプローブサークル(PLPC)を以下の核酸検出アッセイで抗フルオレセイン−HRPコンジュゲートと共に使用した。
試料中の標的核酸を定量することができる本発明のさらなる応用例を図9に示す。図示するように、濃度が25pM、250pM、および2500pMの標的核酸を、触媒的プロセスを使って検出した。検出可能な電流は存在する標的核酸の濃度と共に変化した。これにより、実際の濃度がわからない場合に、試料中の標的核酸濃度を、検出された電流に基づいて予測することが可能になるだろう。この実施形態の実用的応用例には、例えば特定試料における病原体の蔓延を決定することが含まれる。より具体的には、この技術は、特定ウイルスによる感染を患っている患者におけるウイルス量を決定するために使用することができるだろう。
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて以下のプロセスを使用した。
以下の実施例では、電気化学的検出アッセイを行なう際に「2段階」RCA手続きを使用した。このプロセスを図12に図解する。図示するように、合成的に調製された第1サークル100が、捕捉プローブによって捕捉され、プライマー伸長が起こる。図12では、セグメント化されたサークルおよび線状核酸分子が描かれている。各セグメントはそれが含有するユニークな塩基配列によって定義される。RCAプロセスが起こると、サークルが回転を完了する度に、それらのセグメントが反復される。例えば、4つのセグメントを含有する第1サークル100を示し、そのうちの1つのセグメントを「Cx247」と呼ぶ。「Cx247」セグメントは、最初に固定化された鎖の第1アンプリコン102上の「Px247」と呼ばれるセグメントに相補的である。第1サークルのもう一つのセグメントを「Cn」と呼ぶ。「Cn」セグメントはアンプリコン102上の相補的「Pn」セグメントに相補的である。
Ru(NH3)6 3+を使った矩形波ボルタンメトリー(SWV)による検出を伴う2段階RCAを以下のように行なった。ライゲートされたPLPサークルに特異的な捕捉プローブを固定化したチップを、10mM Hepes、pH7.5/200mM NaClに37℃で20分間浸漬した。矩形波ボルタンメトリー(SWV)を10mM Tris/10mM NaCl緩衝液中の5μM Ru(NH3)6 3+内で行なった。12パッドチップ上に標的含有溶液20μlを加えることによって、標的ハイブリダイゼーションを行なった。チップを60℃で10分間および室温で30分間インキュベートした。チップを10mM Tris/200mM NaCl緩衝液ですすぎ洗いした。50mM Tris(pH7.5)を含有するRCA溶液を1チップに20μLずつ、150mM KCl、10mM Mg2Cl、4mM DTT、10mM硫酸アンモニウム、1.5mM dNTP、およびφ29 DNAポリメラーゼ20単位と共に加えた。次に、RCAを室温で5分間進行させた。10nM汎用PLPおよび15nM RCA開始複合体のライゲーションによって得た汎用サークル溶液2μlを各チップに加え、37℃で70分間インキュベートした。チップをPBS緩衝液ですすぎ洗いした。SWVを10mM Tris/10mM NaCl緩衝液中の5μM Ru(NH3)6 3+内で行なった。
Claims (38)
- 試料が標的ポリヌクレオチドを含有するかどうかを決定する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを伸長するステップ、および
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができ、ペルオキシダーゼを含む触媒的検出試薬によって生成されるシグナルが、生成しているかどうかを決定するステップを含み、
前記検出ゾーンは、前記捕捉プローブポリヌクレオチドを固定化している電極を含み、前記シグナルが生成しているかどうかを決定するステップが、前記電極から前記ペルオキシダーゼへの電子の移動によって電圧または電流が生成されているかどうかを決定することを含む、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項1の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項1の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを伸長するステップが、前記標的ポリヌクレオチドを第1環状分子にハイブリダイズさせ、前記標的ポリヌクレオチドを前記第1環状分子に沿って伸長することにより、第1ローリングサークル増幅産物を生じさせることを含む、請求項1の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを伸長するステップが、頭尾(head-to-tail)構造となるように増幅することを含む、請求項1の方法。
- 前記触媒的検出試薬を前記伸長された標的ポリヌクレオチドと会合させることをさらに含む、請求項1の方法。
- 電子移動媒介物質が前記電極から電子を受け取り、前記電子を前記ペルオキシダーゼに移動させる、請求項1の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが電子を過酸化水素に移動させる、請求項7の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが核酸プローブに結合される、請求項1の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが核酸と静電的に相互作用する分子に結合される、請求項1の方法。
- 核酸と静電的に相互作用する前記分子が、カチオン性ポリマー、カチオン性ペプチド、ポリアミン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群より選択される、請求項10の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項1の方法。
- 前記触媒的検出試薬を前記伸長された標的ポリヌクレオチドと会合させる、請求項1の方法。
- 前記第1ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第2環状分子中の配列に相補的な配列を含む第1ブリッジ核酸を、前記第1ローリングサークル増幅産物および前記第2環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第2環状分子に沿って伸長することにより、第2ローリングサークル増幅産物を生成させることをさらに含む、請求項4の方法。 - 前記決定ステップが、前記第1ローリングサークル増幅産物、前記第2ローリングサークル増幅産物、前記ブリッジ核酸、または先に挙げた核酸の任意の2以上に結合される触媒的検出試薬によって、シグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項14の方法。
- 前記触媒的検出試薬が前記第2ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項14の方法。
- 前記第2ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第3環状分子中の配列に相補的な配列を含む第2ブリッジ核酸を、前記第2ローリングサークル増幅産物および前記第3環状分子にハイブリダイズさせること、および前記ブリッジ核酸を前記第2環状分子に沿って伸長することにより、第2ローリングサークル増幅産物を生成させることをさらに含む、請求項14の方法。
- 前記決定ステップが、前記第1ローリングサークル増幅産物、前記第2ローリングサークル増幅産物、前記第3ローリングサークル増幅産物、前記第1ブリッジ核酸、前記第2ブリッジ核酸または先に挙げた核酸の任意の2以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項17の方法。
- 前記触媒的検出試薬が前記第3ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項18の方法。
- 試料中の標的ポリヌクレオチドの量を定量する方法であって、
前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド中の配列の少なくとも一部に相補的な捕捉プローブポリヌクレオチドを含有する検出ゾーンと、前記標的ポリヌクレオチドが前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを許す条件下で、接触させるステップ、
前記捕捉プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしている任意の標的ポリヌクレオチドを伸長するステップ、
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すシグナルであって、消耗されずに複数のシグナルを生じさせることができ、ペルオキシダーゼを含む触媒的検出試薬によって生成されるシグナルを、検出するステップ、および
シグナルのレベルに基づいて試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの量を定量するステップを含み、
前記検出ゾーンは、前記捕捉プローブポリヌクレオチドを固定化している電極を含み、前記シグナルを検出するステップが、前記電極から前記ペルオキシダーゼへの電子の移動によって電流が生成しているかどうかを決定することを含む、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドが生物学的試料に由来する核酸配列を含む、請求項20の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが核酸タグ配列を含む、請求項20の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを伸長するステップが、前記標的ポリヌクレオチドを第1環状分子にハイブリダイズさせること、および前記標的ポリヌクレオチドを前記第1環状分子に沿って伸長することにより、第1ローリングサークル増幅産物を生じさせることを含む、請求項20の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを伸長するステップが頭尾(head-to-tail)構造となるように増幅することを含む、請求項20の方法。
- 前記触媒的検出試薬を前記伸長された標的ポリヌクレオチドと会合させることをさらに含む、請求項20の方法。
- 電子移動媒介物質が前記電極から電子を受取り、前記電子を前記ペルオキシダーゼに移動させる、請求項20の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが電子を過酸化水素に移動させる、請求項26の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが核酸プローブに結合される、請求項26の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが核酸と静電的に相互作用する分子に結合される、請求項26の方法。
- 核酸と静電的に相互作用する前記分子が、カチオン性ポリマー、カチオン性ペプチド、ポリアミン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群より選択される、請求項29の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項26の方法。
- 前記触媒的検出試薬を前記伸長された標的ポリヌクレオチドと会合させる、請求項20の方法。
- 前記第1ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第2環状分子中の配列に相補的な配列を含む第1ブリッジ核酸を、前記第1ローリングサークル増幅産物および前記第2環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第2環状分子に沿って伸長することにより、第2ローリングサークル増幅産物を生成させることをさらに含む、請求項23の方法。 - 前記シグナルを検出するステップが、前記第1ローリングサークル増幅産物、前記第2ローリングサークル増幅産物、前記ブリッジ核酸、または先に挙げた核酸の任意の2以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項33の方法。
- 前記触媒的検出試薬が前記第2ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項33の方法。
- 前記第2ローリングサークル増幅産物中の配列に相補的な配列および第3環状分子中の配列に相補的な配列を含む第2ブリッジ核酸を、前記第2ローリングサークル増幅産物および前記第3環状分子にハイブリダイズさせること、および
前記ブリッジ核酸を前記第2環状分子に沿って伸長することにより、第2ローリングサークル増幅産物を生成させることをさらに含む、請求項33の方法。 - 前記シグナルを検出するステップが、前記第1ローリングサークル増幅産物、前記第2ローリングサークル増幅産物、前記第3ローリングサークル増幅産物、前記第1ブリッジ核酸、前記第2ブリッジ核酸または先に挙げた核酸の任意の2以上に結合される触媒的検出試薬によってシグナルが生じているかどうかを決定することを含む、請求項36の方法。
- 前記触媒的検出試薬が前記第3ローリングサークル増幅産物に結合される、請求項37の方法。
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