CN102216762B - 纳米结构的微电极以及集成所述微电极的生物传感器件 - Google Patents

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Abstract

本文公开了纳米结构微电极以及集成所述微电极的生物传感器件。

Description

纳米结构的微电极以及集成所述微电极的生物传感器件
相关申请
本申请要求保护于2008年9月5日提交的美国临时申请号61/093,667(名称：纳米结构微电极以及集成所述微电极的生物传感器件(NanostructuredMicroelectrodesandBiosensingDevicesIncorporatingtheSame))的优先权，该申请通过引用以其整体结合到本文中。
发明背景
基因组分析彻底革新了早期疾病诊断并显著增强了对患者的护理(McGuire等.Science317：1687，Srinivas等，LancetOncol.2：698)。微阵列(Drmanac等，Science260：1649，Hacia等，Nat.Genet.14：441)和基于聚合酶链式反应(PCR)的技术(Saiki等，Science230：1350)作为工具，有助于引领这场革新，使得能够发现并初步开发用于患者测试的测定法(Morris等，Curr.Opin.Oncol.19：547)。然而，将基因组学革新的范围扩展到患者床边需要用于个体生物标志概况分析的成本有效的工具，所述个体生物标志概况分析相对于假定疾病状态进行评价。具体地讲，优选能够常规患者护理的工具会比基于PCR的方法更简单、更轻便和更便宜，但应保持高度的选择性和灵敏度。
基于电子读出(electronicreadout)的生物标志分析早已作为有希望的方法提及，该方法能使基于芯片的器件的新家族以合适成本和灵敏度用于医学测试(Drummond等，Nat.Biotechnol.21：1192，Katz等，Electroanalysis15：913)。电子读出的灵敏度在原则上足以允许用简单仪器装置就可直接检测少量分析物分子。然而，尽管在该领域和涉及新诊断学的相关领域都取得了巨大进展(Clack等，Nat.Biotechnol.26：825，Geiss等，Nat.Biotechnol.26：317，Hahm等，NanoLett.4：51，Munge等，Anal.Chem.77：4662，Nicewarner-Pena等，Science294：137，Park等，Science295：1503，Sinensky等，Nat.Nano.2：653，Steemers等，Nat.Biotechnol.18：91，Xiao等，J.Am.Chem.Soc.129：11896，Zhang等，Nat.Nano.1：214，Zhang等，Anal.Chem.76：4093，Yi等，Biosens.Bioelectron.20：1320，Ke等，Science319：180，Armani等，Science317：783)，但是目前多路复用芯片(multiplexedchip)仍然必须实现对细胞样品和临床样品的生物标志进行直接电子检测。限制这类器件实施的挑战主要来自在当测定复杂生物样品时存在的高背景噪声水平存在下获取非常低的检测限的困难，以及产生具有高度灵敏性和特异性的多路复用系统的挑战。
电化学系统的小型化一直是分析化学和生物分析化学中的主要焦点(Matysik，MiniaturizationofElectroanalyticalSystems(Springer-Verlag，2002))，因为用具有微米级至纳米级尺寸的系统可能能够达到提高灵敏度(Szamocki等，A.Anal.Chem.2007，79，533-539)。已用微米级或亚微米级尺寸的电极进行了大量工作。这些系统具有许多超出常规大电极的优势，例如双层充电更快、欧姆损耗降低、传质速率高和电流密度高(Bond等Anal.Chimi.Acta1989m216，177-230，Heinze，Angew.Chem.Iht.Ed.2003，32，1268-1288)。实际上，这样的电极已经成为各种分析应用中的充分确立工具(Bard，ElectrochemicalMethods：FundamentalsandApplications(Wiley，NewYork，2001)，Reimers，Chem.Rev.2007，107，590-600，Zosic，Handbookofelectrochemistry(Elsevier，2007))。然而，采用纳米级电极的工作明显更具挑战性，因为制作通常是劳动密集型的、重现性差，而且由这类结构产生的电流通常难以进行精确测量。
已经研究了纳米线电极(nanowireelectrode)在超灵敏的核酸和蛋白质检测中的应用(Gasparac等JAmChemSoc126：12270)。这种电极平台的应用使得能够电化学检测皮摩尔水平的分析物，而这种灵敏度水平用大尺度材料是无法达到的。尽管已经报道了纳米线能够检测渺摩尔(attomolar)水平的分析物，但是当处理通常用于分析的体积时，这实际上相当于皮摩尔水平。也已经证明了纳米粒改性的电极可以表现出超出常规大电极的若干优势，例如传质的增强、催化作用、高的有效表面积和对电极微环境的控制(Katz等Electroanalysis2004,16,19-44,Welch等Anal.Bioanal.Chem.2006,384,601-619)。然而，制备纳米线电极阵列非同小可。
通过铂纳米粒的电沉积改性的硼掺杂的金刚石微电极已经用于对低于1ppb水平的As(III)的氧化测定(Hrapovic等Anal.Chem.2007,79,500-507)。然而，这类电极不能集成到用于多元实验的基于阵列的格式中。
对核酸生物标志组或蛋白质生物标志组的分析为作出临床决策提供了有价值的诊断和预后信息。向对临床样品进行概况分析提供特异性和灵敏度的现有方法通常是昂贵、缓慢和连续的。因此需要超灵敏的器件，用于以多元方式检测生物标志。
发明概述
一方面，本发明的特征在于纳米结构微电极(NME)。NME是电极，它具有纳米质地，因此具有增加的表面积。优选的NME由以下构成：贵金属(例如金、铂、钯、银、锇、铟、铑、钌)；贵金属合金(例如金-钯、银-铂等)；导电聚合物(例如聚吡咯(PPY))；非贵金属(例如铜、镍、铝、锡、钛、铟、钨、铂)；金属氧化物(例如氧化锌、氧化锡、氧化镍、氧化锡铟、氧化钛、氮掺杂的氧化钛(TiOxNy)；金属硅化物(硅化镍、硅化铂)；金属氮化物(氮化钛(TiN)、氮化钨(WN)或氮化钽(TaN))；碳(纳米管、纤维、石墨烯和无定形物)或任何以上材料的组合。上述材料的NME是高度导电的并与探测物(例如核酸和肽)形成强的键。优选的NME具有约0.5-约100微米(μm)范围的高度，例如约5-约20微米(例如10微米)范围的高度；约1-约10微米范围的直径；并具有纳米级的形态(例如在约1-约300纳米和更优选范围为约10-约20纳米的长度尺度上为纳米结构的)。NME可以是任何不同形状，包括半球形、不规则形(例如钉状)、环形(线状)或分形(fractal)(例如树枝状)。NME的表面还可用材料包被，该材料维持电极的高电导率，但促进与探测物结合。例如，含氮NME(例如TiN、WN或TaN)可与探测物的胺官能团结合。同样，作为NME的部分的硅/二氧化硅化学(silicon/silicachemistry)可与探测物上的硅烷或硅氧烷基团结合。
另一方面，本发明的特征在于与探测物缔合的NME。在一个实施方案中，所述探测物是核酸(例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物，包括例如肽核酸(PNA)(其含有由通过肽而不是脱氧核糖或核糖连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的骨架)、肽核酸、锁定核酸或磷酰二胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholinooligomer)。在合适条件下，所述探测物可以与互补核酸杂交，以提供样品中核酸存在的指示。在另一个实施方案中，所述探测物是能够与生物标志靶标(例如受体或配体)结合或以其它方式与之相互作用的肽或蛋白质(例如抗体)，以提供样品中配体或受体存在的指示。所述探测物可包含促进与NME结合的官能团(例如硫醇、二硫酚、胺、羧酸)。探测物也可含有其它特征，例如纵向间隔物、双链区和/或单链区、聚T接头、作为刚性接头的双链双链体和PEG间隔物。
又一方面，本发明的特征在于在基材上阵列的多个NME。优选的基材由例如以下半导体材料构成：硅、二氧化硅、石英、锗、砷化镓、碳化硅和铟化合物(例如砷化铟、锑化铟和磷化铟)、硫化硒、陶瓷、玻璃、塑料、聚碳酸酯或其它聚合物或任何上述材料的组合。基材可任选包括钝化层，其由提供高阻抗并维持小的活性表面积的材料构成。合适材料的实例包括：二氧化硅、氮化硅、氮掺杂的氧化硅(SiOxNy)或聚对二甲苯(paralyene)。在某些实施方案中，在基材上阵列的多个NME包括与单层间隔物连接的探测物，所述间隔物使探测物密度最小化，从而使配位效率最大化。优选的单层间隔物具有对金属的亲和力并且可由例如以下组成：硫醇(例如巯基己醇、烷烃硫醇、半胱氨酸、胱胺、硫醇胺、芳族硫酚(例如苯硫酚、二硫酚))、膦酸或次膦酸。
另一方面的特征在于生物传感器件，例如集成电路，其包括例如基材；在所述基材上的导电的导线；覆盖所述导线的绝缘层或钝化层，所述绝缘层具有暴露部分导线的孔隙；以及与导线的暴露部分电相通的纳米结构微电极，所述微电极适于响应生物分子刺激(例如核酸杂交或蛋白质与蛋白质的结合)而产生电荷。
再一方面，本发明的特征在于NME的制备方法。使用电沉积以从NME籽晶生长出纳米结构微电极，允许这些结构的大小和形态可以被精细控制，并允许由一种或多种物质构成的电极的通用制作。可在生物传感器件上例如以基于芯片的格式来制备NME，使得一系列NME都可制备在单个芯片上，从而能够进行多元实验。该NME系统可为特别有用和通用的，允许调节若干参数，包括：对NME大小和形状的微米级控制、对NME纳米质地的纳米级控制、以及对NME材料的选择。
还一方面的特征在于具有纳米结构微电极的生物传感器件的制备方法。例如，所述方法可包括以下步骤：提供基材和在所述基材上导电的导线，所述导线被绝缘层覆盖；在所述绝缘层中蚀刻孔隙以暴露部分导线；和将导电材料电沉积在所述导线的暴露部分上，形成如上所述的纳米结构微电极。
另一方面，提供生物传感盒(biosensingcartridge)，其包括：用于包含生物样品的样品室；用于包含如上所述的生物传感器件并进行生物传感过程的生物传感室。
还一方面，提供生物传感工作站，其包括：用于固定如上所述的生物传感盒的盒固定器；用于进入所述生物传感盒的仪器尖端(instrumenttip)；用于选择待进行的生物传感过程的选择机构；适于使用生物传感盒来进行生物传感过程并根据所述生物传感盒产生的电子信号来确定所述生物传感过程的结果的处理器；和用于显示所述生物传感过程的结果的显示器。
又一方面的特征在于使用集成在如上所述的器件中的含有探测物的纳米结构微电极来进行生物传感过程的方法；相对于参比电极为所述微电极提供偏置；测定所述微电极与所述参比电极之间的参比电荷或参比电流；将所述微电极暴露至生物分子刺激(例如核酸探测物与互补核酸之间的杂交或肽探测物与生物样品中存在的结合配偶体之间的结合)；测定响应于所述生物分子刺激在所述微电极中产生的电荷或电流；然后通过将所测电荷或所测电流针对所述参比电荷或参比电流进行比较，确定所存在的生物分子刺激的量。
NME是通用的、稳健的并且易于使用。另外，它们可用用于顶端金属(top-metal)制作的现有硅CMOS铸造厂制作工艺或其简单外延工艺来制备，例如经无电沉积或电沉积在来自CMOS铸造厂的顶端金属层上，允许制备容易整合到现有生产设备上的NME。另外，NME能够与探测分子稳定连接。此外，NME促进即时接近靶分子，使得当与连接NME的探测分子互补的靶分子进入所述探测物附近时，高概率地发生杂交或蛋白质与蛋白质的结合。NME还与在杂交事件读出中所用的电催化电化学的性能相容。
根据以下详述和权利要求书，本文所公开的本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
附图简述
图1(A)是NME生物传感器件的示意图；图1(B)是用于形成NME的孔隙的剖视示意图；图1(C)是孔隙中NME形成的示意图；
图2是NME生物传感器件的示意图；
图3是具有探测物的NME的示意图，还显示出在探测物单层中以及电极与探测物之间的间隔物的存在；
图4是纳米结构程度增加中的NME的SEM图像；
图5显示了使用NME，在特定序列传感中所包括的步骤；
图6是具有NME的集成电路的剖视图；
图7是可与NME一起使用的电路的电路图；
图8是具有NME阵列的生物传感器件的图解；
图9是具有不同NME的生物传感器件的图解；
图10是生物传感盒的示意图；和
图11是生物传感工作站的示意图。
发明详述
本公开内容描述了纳米结构微电极(NME)，其可用于生物传感器件，例如生物传感芯片。
NME
图1A显示集成NME的示例性器件的示意图。在所示实例中，所述器件是具有8根导线的阵列的芯片。在本实例中，NME在金导线上形成，该金导线逐渐变细到5微米的宽度。在Si和SiO2的基材上提供所述导线，但其它合适的基材材料也可使用。在导线顶端，将绝缘层例如SiO2沉积在电绝缘和钝化导线上。孔隙，在这种情况下为500nm的洞，在绝缘层中产生，以暴露部分导线。
图1B是孔隙位于的芯片部分的侧视图，其显示器件的各层。最公知的光刻技术可适用于产生孔隙，例如100nm至1μm直径的孔隙。这通常可以高的稳健性和重现性在现有的生产设备中实现。假定仅此暴露表面具有电化学活性，则电沉积(Menke等NatureMater.2006，5，914-919)可用于在这一空间内生长NME。
图1C是将Pd用于NME的NME沉积实例的剖视示意图。该过程在以下将有更详细描述。
现作出对图2的引用，它也显示了NME在芯片上的形成。如同图1A，在芯片上原位提供小电极，其中通过光刻法来限定NME的位置和电接触。如同图1，该芯片是8倍多路复用钝化芯片。在硅基材上，采用常规光刻技术图案化约350nm厚的金层，以将8根5-μm宽的Au导线与大金属垫连接，用于连接芯片外(off-chip)的仪器装置。沉积无针孔的绝缘SiO2层并使其图案化以在每根Au导线的端部产生约500nm的开口(例如通过蚀刻)，从而暴露导线的部分。然后用电沉积，将金属NME电镀到该开口处。
所述NME可包含不同导电材料。如下形成NME的一些实例，但可能有变动并且在以下将会有更详细描述：使用DC电位安培法(potentialamperametry)，在-250mV下进行15s，将枝状分形PdNME在含有5mMH2PdCl4和0.5MHClO4的水溶液中沉积。使用DC电位电流测定法，在-100mV下进行300s，将具有纳米级粗糙度的半球状PdNME在含有5mMH2PdCl4和0.5MHCl的水溶液中沉积。在0mV下进行300s，在相同溶液中制作光滑的半球状PdNME。在-100mV下进行40秒，在含有0.01MHAuCl4溶液和0.5MH2SO4的金浴中制作AuNME。在-100mV下进行500s，在含有5mMH2PtCl6溶液和0.5MH2SO4的铂浴中制作PtNME。NME的大小和形状可通过改变金属盐浓度、支持电解质的种类和浓度、以及电沉积电位和持续时间而得以控制。
图3是具有探测物的NME的示意图，其中在探测物单层中和在电极与探测物之间具有间隔物。可使含有金属阳离子的化学溶液与NME表面和参比电极相通。参比电极可以是在同一导线上的NME或常规电极。可在NME与参比电极之间提供电偏置。然后可除去化学溶液并洗涤电极。然后可使含有探测分子的溶液与NME表面相通。可修饰探测分子或使其官能化，从而使得其与NME表面结合。例如，可将探测分子用巯基、胺基或羧酸基团官能化。
纳米结构增加中的NME见图4。出乎意料的是，电沉积条件的改变允许生长出非常光滑的半球形微电极(左)；高度分枝的纳米级分形结构(右)；或具有纳米级粗糙度的半球(中)。左边的结构是用作为支持电解质的HCl和0mV的施加电位制备的。中间的结构也是用作为支持电解质的HCl，但用-100mV的施加电位制备的。右边的结构是用作为支持电解质的HClO4和-250mV的施加电位制备的。图中的刻度条相当于5μm，除非另有说明。
图5显示了在特定序列传感中所包括的步骤(Lapierre等，Anal.Chem.75：6327，Ratilainen等，Biochemistry39：7781，Tomlins等，Science310：644)。在本实例中，将PdNME先用巯基衍生的探测物序列修饰，然后再杂交靶序列。再用电催化报道系统来转换靶标的存在情况。电催化提供电子放大或增益，促进高灵敏度的读出：从每个生物分子配位事件可产生上百个电子。本文所用的方法有赖于原电子受体(primaryelectronacceptor)Ru(NH3)63+，其通过静电以以下水平吸引到电极表面，该水平与所结合的核酸量相关。在电化学读出期间Fe(CN)63-的包含物起到再生Ru(III)基材的作用，因为Fe(III)物质甚至更容易还原，但它被电极静电排斥，因此仅经历经由Ru(II)的化学还原。该方法也是无标记的，无需以任何方式处理样品。
可以芯片例如集成电路(IC)芯片的形式来提供生物传感器件。一般而言，集成NME的IC可具有基材，其具有被绝缘层覆盖的导电的导线。绝缘层具有暴露部分导线的孔隙，而且在导线的暴露部分上提供NME。NME响应生物分子刺激。具体地讲，NME可用探测分子官能化，所述探测分子经历与靶生物分子(例如核酸序列)的杂交反应，导致在NME上产生电荷。IC也具有与导线电相通的电荷存储器(例如电容器或电池)，以存储这类产生的电荷。在通常使用中，可将NME暴露给样品达已知的时间期间或积分期(integrationperiod)，那么在所述时间内存储的电荷会指示靶生物分子的存在情况和/或量。
存储的电荷可被传递给计算器件用于分析，或者可以显示(例如通过数字显示元件)，用于直接读出积分期之后存储的电荷。
这样的IC可用常用IC制备设备来制备，允许该器件容易制备并且比生物传感微电极的其它形式的成本更低。所用材料可以是IC制备中已经常用的那些。例如，基材可由硅、石英、玻璃、陶瓷、二氧化硅、蓝宝石、砷化镓或目前用于IC的其它材料制备。基材或支持体可整合导电材料，以充当电极。具有金表面的导电支持体也可使用。支持体通常包括平(平面)表面，或者至少是其中待探询的探测物或p大致在同一平面上的结构。支持体可以是电极，或者可以与电极连接。
导线可由Au、Al、W、TiN、多晶硅或其它常用导线材料制成。IC可包括例如以下晶体管：场效应晶体管(FET)，包括n-型硅沟道FET和p-型硅沟道FET；或双极晶体管，包括n-p-n双极结型晶体管和p-n-p双极结型晶体管。
可以浸入电催化溶液中或以其它方式暴露给电催化溶液的方式提供IC，所述溶液与NME具有化学和电相通。这可有助于在NME中产生电荷。
现作出对图6的引用。该图显示适于传感生物样品中生物分子的存在情况的集成电路的剖视图。基材(1)是常规半导体器件基材，例如硅。显示了晶体管(2)、栅氧化物(3)和多晶硅栅电极(4)的沟道，以说明将常规CMOS电子学用于形成集成电路的晶体管。将金属(5)用于接触栅电极。钝化氧化物(6)将下面的硅晶体管水平面与上面的芯片顶面分隔开。一系列金属管(7)和互连(interconnect)提供晶体管层与顶端电极之间电相通的选择性通道。基本平的顶面是顶端电极(9)和顶端绝缘材料(8)的异质组合。该图显示了例如使用如上所述的方法在电极上提供的NME(10)。该图显示了探测生物分子(11)例如链端为硫醇的核酸，其显示出与互补靶分子的有效杂交。电催化溶液(12)可用于提供与生物分子(11)杂交的催化读出。电位和电流以持续方式从NME(10)通过电接触点(9)(7)(5)(4)传到其下的电子电路。
现作出对图7的引用，该图显示了可与所公开的NME一起使用的实例电路的电路图。在本实例中，电路可提供以下功能：为探测物官能化的NME提供偏置；将流过NME的电流整合到具有已知电荷存储容量的电荷存储器中；在电荷存储器上读出电压；和当在高度多路复用阵列芯片的情况下提供存储器和电极的二维阵列时，选择目标电荷存储器或NME。
现在描述实例电路的元件。提供偏压Vbias；通常选择偏压的范围可为约0.1-2.8V。在源极-跟随器漏极(source-followerdrain)提供偏压VbiasD；通常的选择范围可为约0.1-2.8V。在复位节点(resetnode)提供偏压VbiasR；通常的选择可为介于约-2V至2.8V之间的可调节值。信号电压是Vsrc，其范围通常可为约1.5-2.5V。列电压(columnvoltage)Vcol的范围可为约1.5V-0.5V。定时控制信号包括用于行选择(rowselect)(例如范围可为约0-2.8V)和用于复位(例如范围可为约0-4V)的那些。晶体管可以是复位晶体管Tr(复位)、读出缓冲晶体管TR(源极-跟随器)和行选择晶体管TR(行选择)。
以上偏压、信号电压和定时控制信号仅仅是实例，可采用其它数值。如本领域公知的，可将这些偏压、电压和信号经选择或调节到适于某些应用或制备条件。在本实例中，探测物官能化的NME可包括使用硫醇化核酸探测物(例如如上所述的探测物)官能化的NME。将Vsrc施加于探测物官能化的电极并将VbiasR施加于第二电极，所述第二电极可以是NME或任何其它常用电极，其与电催化溶液电相通。这导致探测物官能化的电极与电催化溶液之间的电压差。因此因这种电压差所致可有电流流过。流过的电流量通常可取决于在探测物官能化的NME上杂交的量，也就是说电流可指示经由NME如此检测的靶标量。
现在描述实例电路的操作。为了捕获流动的电流Isense，通过如下开启复位晶体管：将节点“复位”设置到足够高(例如高达4V，其可通过本领域公知的芯片内的电荷泵或调节电路来进行)，使得节点11将充电到电压等于Vbias(节点6)，其通常可设置至电源导轨(supplyrail)：例如2.8V。这是复位相。一旦该“复位”操作结束，可将节点5设置至0V以关掉复位晶体管Tr(复位)(1)。在这种情况下，电荷注入和寄生电容馈通效应将导致节点11(现在变成浮动节点)下降约300mV。因此在“复位”操作之后，节点11的实际“复位”电压值为约2.5V。此时，流动的电流Isense取决于所施加的电压(即Vsrc-VbiasR)。因为能够将VbiasR任意设置到-2V至2.8V之间的任何电压水平，所以可以调节所施加的电位差。电流Isense使在Vsrc节点(11)的寄生电容放电，并且其电压水平以以下速率下降，该速率取决于在Vsrc(节点11)的寄生电容的值以及在积分时间期间流动的Isense。在特定的积分时间之后，在节点11的所得积分电压(integratedvoltage)通过晶体管TR(源极-跟随器)和TR(行选择)(即源极跟随器缓冲晶体管和行选择晶体管)经由将节点SEL(8)设置到高电平(2.8V)而读出。
在节点11上放电的电荷存储器可包括在Vsrc(节点11)处与像素区的电极电相通的一个或多个晶体管的寄生电容。可将Vsrc(节点11)的电极与晶体管栅极(gate)例如Tr(源极-跟随器)2电相通，这提供寄生电容。在一个实例性实施方案中，可至少部分地通过源极跟随器晶体管Tr(源极跟随器)2的栅极与漏极之间的寄生电容，以及复位晶体管Tr(复位)1的源极与基材之间的寄生电容，来提供电荷存储器。这些是半导体基材上的结构(例如poly、n-阱与基材)之间的寄生电容，在所述基材上或其中形成像素电路。在一个实施方案中，这些寄生电容的范围可以为约1-2飞法拉或更通常约0.5-3飞法拉或包含在其中的任何范围。与探测物官能化的NME的接触可在用于形成晶体管的半导体基材区域上的不同层中形成。在一个替代实施方案中，在积分期期间，偏压的极性可以被反转而且在Vsrc的寄生电容可被充电而非放电。
现作出对图8的引用，该图显示了实例IC的顶视图，该实例IC具有可单独寻址的探测物官能化NME的多路复用阵列。可单独寻址意指各个NME可单独电气访问，使得可以对各个NME所产生的电流或电荷进行单独测量。在本实例中，NME以行-列方式阵列。有n行和m列，总共mxn个独立NME。如果仅有1行或1列NME，那它可能就不必具有行/列地址电路。然而，当希望在单个器件上具有总数量大的NME时，将它们以二维网格或类似方式阵列可更有效，因此对每个NME的独立电气访问可为有用的。可采用图7所示电路有效达到这一目的。在该方法中，与流过各个NME的电流相关的电荷都累积到电荷存储器例如电容器中，并且可通过将节点SEL(8)设置到高水平并监测该列上的电压Vcol，来对在特定行的NME读出与存储电荷成比例的电压。
该图显示，对于各列，可存在着时间依赖性信号(其时间依赖性可通过同步(clocking)行-地址电路来确定)，在某些实施方案中，在借助于电子缓冲或放大的情况下，该信号可被反馈入模拟-数字转换器中。模拟-数字转换器可接受具有预定电压摆动(例如通常为0-1V)的信号，并且对于各输入通道，可进行量化操作，在其中评价该信号中模拟水平的数字表示。A/D转换器的输出是数字流，其结合了并行性(例如多个并行线，其各自对应于数值在二进制表示中的有效数字)和串行定时(serialtiming)(例如对应于例如不同探测物官能化NME的时序数据元的定时表示)。
现作出对图9的引用，该图显示沿着单行上的3个相邻NME，其呈可在如上所述的生物传感器件或IC上提供的构型。用3个不同的列j、j+1和j+2来读取这3个NME。该图显示相对于NME中的差异的多个特征。
NMEEi，j和Ei，j+1可同时用相同类别的探测物(例如硫醇官能化PNA)官能化，但序列可以不同。也就是说，各个NME可用具有不同靶生物分子的类似探测物官能化。在本实例中，电极Ei，j和Ei，j+1响应于研究中的样品中存在的不同序列。总之，使用不同的官能化物，能够对在单一类别中但具有不同序列、构象或官能度的生物分子传感。
显示NMEEi，j、Ei，j+1和Ei，j+2具有不同形态和/或大小以及不同程度的纳米结构。如上所述，不同形态和/或大小在靶分子的检测中可同时提供不同检测限和不同的动态范围。通过将具有不同形态和/或纳米结构程度的NME集成到一个器件上，就可以扩大可用单个器件传感的靶浓度的动态范围。总之，使用不同NME形态、大小和/或纳米结构，可能能够传感比如果在生物传感器件上仅提供一种形态/纳米结构的其它方法所能达到的更宽范围的既定靶物质浓度。
NMEEi，j+1和Ei，j+2也描述成用不同类别的探测分子官能化。例如，Ei，j+1可用核酸例如PNA官能化，而Ei，j+2可用与电极连接的抗体官能化。总之，使用单个生物传感器件，利用不同类别的探测分子可能能够传感不同类别的靶生物分子，例如范围从DNA到RNA到微小RNA到蛋白质。
生物传感盒和工作站
如上所述的生物传感器件可集成到生物传感盒中。这样的盒可具有样品处理(例如破碎和基于树脂或珠粒的核酸纯化)室，以及生物传感器件室。所述盒可以是装备齐全的，例如所有必要试剂都可包含在盒盖中。所述盒可以是可再次使用的，或者可以是一次性的。一次性盒可使样品间的交叉污染危险最小化。
所述盒可用于生物传感工作站，用于协调和进行生物传感过程。工作站的元件可包括样品架、仪器尖端例如用于样品操作的移液器、样品识别模块、选择待进行的试验的选择机构、显示生物传感试验结果的电子显示器、以及管理这些元件并进行所选试验的处理器。所述工作站可同时容纳多个不同盒(例如10个以上)。工作站可允许对这些盒的随机访问，也就是说，在任何时间、在工作站的任何盒中都可进行独立试验。工作站可具有一次性仪器尖端，其将是与样品和试剂直接接触的工作站的唯一部分。一次性的尖端以及一次性的盒，可使在工作站中测试的样品间的交叉污染危险最小化。
一般而言，生物传感盒可含有用于盛装待测样品的第一室和含有如上所述的生物传感器件的第二室。还可具有对样品进行其它操作的额外室，所述操作为例如纯化和/或细分(例如通过化学、机械或振动方式)。对样品的某些处理和破碎可在第一室本身中进行。可将样品从第一室引入第二室，用于通过第二室中的生物传感器件进行检测。从器件活化或试验开始到将样品引入第二室之间，可具有预先设置的时间间隔。该时间间隔可允许对生物传感器件适当加上偏置或以其它方式为测试做好准备。如上所述，在积分期之后，可测量生物传感器件中产生的电荷或电流。
现作出对图10的引用，该图显示生物传感盒的实例和使用所述盒的步骤。在本实例中，所述盒具有3个室：装有样品的样品室，用于纯化样品的纯化室和用于进行生物传感的生物传感室。如本实例所示，将含有用于各个室的试剂的胶囊提供给盒盖，仪器尖端可插入所述胶囊。这使所述盒装备齐全，已经含有以下试剂，其适于进行生物传感操作并针对正被使用的生物传感器件的特定探测物和/或靶标生物分子而定制。在本实例中，样品室具有用于接近样品的1个胶囊。纯化室具有3个胶囊——2个含有洗涤试剂，1个含有洗脱缓冲液。生物传感室具有3个胶囊——每个都含有用于生物传感器件的包含分析物的电化学混合物。仪器尖端可序贯插入每个胶囊，以进行生物传感操作。例如，在样品室上的胶囊可含有含化学变性剂(例如尿素或甲酰胺)的裂解缓冲液；在纯化室上的胶囊可具有含洗涤缓冲液的2个胶囊并且洗脱缓冲液可以是标准缓冲液，例如含有低水平钠、氯化物和tris盐的缓冲液；在生物传感室上的胶囊可含有氧化还原报道基团(例如六胺合钌(rutheniumhexamine)、铁氰化物)和含钠、磷酸盐、氯化物和镁的缓冲液。
在使用时，先通过其单个胶囊从样品室中将样品提取出来。再将样品引入纯化室，在此随着仪器尖端经由2个洗涤胶囊引入时将样品洗涤2次，然后引入洗脱缓冲液。通过这样的处理，可将样品准备好用于通过生物传感器件进行生物传感。例如，在核酸样品的情况下，在纯化室中的处理可分离样品中的RNA或DNA。然后经由各个电化学胶囊将纯化样品引入生物传感室。于是，生物传感室中的生物传感器件可检测样品中存在的任何靶生物分子，并可测量所产生的电流或电荷。当将所述盒用于工作站时，工作站中的处理器可读出所产生的电流或电荷并根据此读数确定靶生物分子的存在情况。
现作出对图11的引用，该图显示了生物传感工作站的实例。该工作站包括条码阅读器，允许用各个盒上提供的唯一条码来识别样品。工作站具有选择机构，在本实例中，是触摸屏，其允许选择待进行的特定试验。也有废物容器，用于处理生物传感过程所产生的任何废物。可将工作站的处理器与外部计算器件(例如另一工作站)相连，用于进一步分析。可通过无线网络进行这种连接。工作站可以相对小(例如1.5x1ft的台面面积)，使其方便并易于使用。
使用方法
现在来描述NME和包含所述NME的器件的使用方法。器件可与已被探测分子官能化的NME一起提供，或者在制备所用器件时，可将探测分子结合到NME上。然后给器件加偏置以使用，例如通过加入电催化报道物(reporter)并等待某时间间隔来进行。除了NME之外，还可以有参比电极，所述参比电极可以是或不是NME，其与电催化报道物接触，但不与样品接触。可对在此时间间隔内在NME与参比电极之间产生的偏流或偏压进行测量并记录为参考点。然后将NME暴露给目标样品，并对某时间间隔(也称为积分期)内产生的电流或电荷进行测量。通过比较暴露时间间隔与偏置时间间隔之间的电流或电荷差异，可确定样品中靶生物分子的浓度、结合和/或量。
如本文所述，包含NME的器件可与合适探测物一起用于检测样品中特定生物标志的存在与否。本文所用的“样品”或“生物样品”是指含有DNA、RNA和/或蛋白质的任何天然(例如植物、动物、藻类、细菌或病毒)或合成材料，包括例如：从个体中分离的临床样品，例如组织、细胞培养物或流体(包括但不限于血液、血浆、血清、脑脊液、淋巴、泪、尿、唾液、黏液、滑液、脑脊液和组织切片)，环境样品(例如水、食物或空气样品)。生物样品可通过各种方式进行进一步处理，所述方式包括裂解(通过电、机械和化学)、电泳、酶促消化。最通常，样品已从有机体中取出，但术语“生物样品”也可指在体内(即无需取出)分析的细胞或组织。通常，“生物样品”会含有细胞，但该术语也可指非细胞的生物材料，例如血液、唾液或尿的无细胞部分。“生物样品”还指培养基，例如其中已繁殖有有机体的营养肉汤或凝胶，其含有细胞组分，例如蛋白质或核酸分子。
用于与刚描述的NME一起使用的探测物可包括核酸。“核酸探测物”是指能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成，结合互补序列的靶核酸的核酸(例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物，包括例如肽核酸(PNA)，其含有由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的骨架，所述单元通过肽而不是由磷酸二酯键连接的脱氧核糖或核糖来连接)。本文所用的核酸探测物可包含天然的(即A、G、C或T)或在碱基上修饰的(7-脱氮鸟苷、肌苷等)或在糖部分上修饰的那些。另外，探测物中的碱基可通过并非磷酸二酯键的键连接，只要不影响杂交即可。本领域技术人员会理解，探测物可结合缺乏与探测物序列的完全互补性的靶序列，这取决于杂交条件的严格性。通过测定探测物的存在与否，就可检测所选序列或亚序列的存在与否。用核酸探测物来检测靶核酸的方法描述于例如美国专利号7,36l,470，名称“ElectrocatalyticNucleicAcidHybridizationDetection(电催化核酸杂交检测).”和同名的US2005/0084881。
“杂交”是指核酸链通过碱基配对而与互补链结合的任何过程。“杂交条件”是指将核酸分子用于鉴定类似核酸分子的标准条件。这样的标准条件公开于例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLabsPress，1989。将Sambrook等，出处同上，通过引用以其整体结合到本文中(具体参见第9.31-9.62页)。另外，计算合适的杂交条件和洗涤条件、以达到允许不同程度的核苷酸错配的杂交的公式公开于例如Meinkoth等，1984，Anal.Biochem.138，267-284；将Meinkoth等，出处同上，通过引用以其整体结合到本文中。杂交条件的非限制性实例包括低严格性杂交条件、中等严格性杂交条件和高严格性杂交条件。
在另一个实施方案中，探测物是肽(由例如4-40个氨基酸组成)或蛋白质(例如抗体)，其能够与生物标志靶标(例如受体或配体)结合或以其它方式与之相互作用，以提供对样品中配体或受体存在情况的指示。使用肽探测物或蛋白质探测物来检测分析物的方法描述于例如国际专利申请WO2007/094805(PCT/US2006/013771)，名称“MethodforElectrocatalyticProteinDetection(电催化蛋白质检测方法)”。
探测物可包含官能团(例如硫醇、二硫酚、胺、羧酸)，其促进与NME的结合。探测物也可具有其它特征，例如纵向间隔物、双链区和/或单链区、聚T接头、作为刚性接头的双链双链体和PEG间隔物。
如上所述，可控制NME的表面纳米结构，而且所述结构可影响具有NME的器件的灵敏度和/或效率。在实施例1中，研究了表面纳米结构对核酸检测效率的影响。比较了2类不同的NME：将用低沉积电位而得到的更精细的纳米结构NME与用较高沉积电位得到的更粗糙的纳米结构NME进行比较。
尽管用低沉积电位得到的更精细的纳米结构NME可以检测低至1pM的浓度，但用较高沉积电位得到的更粗糙的纳米结构NME的检测限增加到10pM。这些结果证明增加的纳米结构在电极平台中有助于更灵敏的生物传感能力。该分析揭示了更精细结构的NME对亚nM浓度的靶序列显示出更高的响应性。
在此，用所公开的NME和电催化报道系统观察到的10aM灵敏度，对无标记且无PCR传感器提供低检测限；该检测限相当于检测＜100拷贝的靶序列。尽管先前已经用采用多步骤的催化读出的电化学检测器达到对60-1000拷贝的靶序列的测定(Munge等，Anal.Chem.77：4662，Nicewarner-Pena等，Science294：137，Park等，Science295：1503，Sinensky等，Nat.Nano.2：653，Steemers等，Nat.Biotechnol.18：91，Xiao等，J.Am.Chem.Soc.129：11896，Zhang等，Nat.Nano.1：214，Zhang等，Anal.Chem.76：4093)，但是本公开的器件在基于芯片的平台上用单步骤读出提供这样的测定。
实施例2描述了应用如本文所述的多路复用电极平台，用电子信号直接读出临床相关样品中的一组癌症生物标志。该系统将纳米质地的电极与快速催化读出结合，以实现长期存在的目标：使用便宜且实用的平台对癌症生物标志进行多元分析。
实施例3描述了应用基于NME的芯片，检测微小RNA(一种最具挑战性的检测靶标)。微小RNA概况的电子读出提供在无需靶标扩增的情况下针对特定序列直接测定RNA样品的快速而高准确性的方法。
尽管所提供的实施例涉及癌症生物标志的检测，但是对于NME器件而言，其它应用也是可能的，所述应用可涉及对DNA、RNA和/或蛋白质的检测。实例包括乳腺癌基因的概况分析(例如通过检测RNA标志)；白血病相关基因的概况分析(例如通过检测RNA标志)；影响药物代谢(例如华发林)的细胞色素P450突变的概况分析(例如通过检测DNA标志和RNA标志)；遗传性疾病(例如囊性纤维化病)相关突变的概况分析(例如通过检测DNA标志)；病毒(例如HPV和HIV)的检测和分型(例如通过检测DNA标志和RNA标志)；使用电化学免疫测定形式的癌症相关蛋白的检测(例如前列腺特异性抗原(PSA))(例如通过测定蛋白质标志)；和对微小RNA的检测以鉴定癌症。如本领域所公知，通过将合适探测物与NME结合和/或通过选择待传感的合适的电催化反应，集成这些NME的生物传感器件可适用于检测这些其它生物分子。
本领域技术人员会理解的是，在不背离本公开内容的前提下可以进行改动。所述的所有实例和实施方案仅以说明性目的而提供，而不是意在限制。本文所提及的所有参考文献都通过引用以其整体结合到本文中。
实施例1.制备NME的参数
在本实施例中，将Pd用作电极材料。为了研究电沉积的时间依赖性，监测进行电沉积的PdNME结构随时间的变化。在-100mV下，用0.5MHCl作为支持电解质进行时间依赖性电沉积实验。持续以下时间来形成Pd结构：(a)25、(b)50、(c)125、(d)250和(e)500s。50s之后，观察到平均直径为1.3μm和高度为0.5μm的结构，而在500s之后，Pd电极的直径和高度通常分别为8μm和5μm。用较短的沉积时间制备的较小结构通常表现出微电极中心凹陷，这可表示成核作用优先发生在孔隙边界。
可影响NME最终结构的另一可控参数是沉积电位。具体地讲，可按照此方式控制NME的大小和表面形态。树枝状分形是在非平衡生长例如雪花的生长、灰粒的聚集和金属的凝固中通常观察到的现象。这样的分形结构还通过金属的非平衡电沉积获得并用作研究分枝和分形生长过程的模型系统(Fleury,Nature1997,390,145-148)。通常认为晶体形态严重取决于它们的形成条件与热力学平衡之间的“距离”：接近平衡条件产生由热力学稳定晶面所环绕的多面体晶体，但是增加该“距离”使晶体生长前缘具有对形成树枝状晶体不稳定的平面(Fukami等J.Phys.Chem.C2007,111,1150-1160)。在金属的电沉积情况下，可通过仅仅改变沉积电位来持续可逆地调节这样的“距离”，而且更高的负电位可施加更大的驱动力，从而对电结晶增加离平衡的“距离”。因此，可在空间上和动力学方面控制电沉积，以产生具有不同的良好限定形态的阵列NME。
在以下电压下进行250s和使用0.5MHCl作为支持电解质，来形成Pd结构：(a)0mV、(b)-100mV、(c)-250mV和(d)-400mV。发现更高的负沉积电位通常导致更大但更松散的显微结构。在0mV沉积电位下，得到直径3.5μm和高度0.7μm的饼形结构。当所施加的电位变为-100mV时，得到更粗糙的显微结构，其大小也更大(平均直径=5μm，高度=2.5μm)。所得到的纳米质地是非常小的纳米粒的不规则聚集体。当施加更高的负电位-250mV时，得到树枝状分形的显微结构，发现其直径和高度进一步分别增加11μm和6μm。如果将电位进一步提高(例如到-400mV)，则微电极结构变得更开放而且结构不再是连续的。
通过循环伏安法(CV)研究了随电位变化而形成的PdNME的电化学性质。在含有3mMRu(NH3)63+和0.09M磷酸钠的溶液中监测NME的电化学反应，扫描速率100mV/s。正如所料，各个电极都观察到稳态的伏安图，与电极的微米级尺寸一致。对于用0mV、-100mV或-250mV的沉积电位制备的电极，所观察到的电流与电极大小密切相关。也就是说，NME直径越大(即在更大的施加电位下形成)，观察到越大的反应电流。然而，对于在-400mV下制备的结构，所观察到的电流比根据微电极大小所预期的要小，表明电极结构不连续性可导致差的电气连通性并损失工作面积。
因此，中等沉积电位看来提供最显著的纳米质地，同时维持所得NME的完整性，因为小纳米粒在微电极表面形成。这看来对沉积反应提供太高驱动电位加速动力学到达以下点：在该点下形成没有与NME核心的强连通性的金属纳米粒。
也可通过电解质效应控制NME形态。使用(a)0.5MH2SO4和(b)0.5MHClO4作为支持电解质，在-100mV下进行250s形成PdNME。在如上所述的相同条件下形成这些结构，其中将HCl用作支持电解质。在H2SO4和HClO4中形成的结构明显大于在HCl中形成的结构，而且引人关注的是，所有3种结构都表现纳米结构的不同类型。在HClO4中制备的NME表现出最精细的纳米结构，其特征小至10-20nm。在HCl中，电极更紧密，并且纳米结构呈大致100nm。最粗糙的纳米结构是在H2SO4中得到，其中构成电极的颗粒大小超过200nm。这些观察结果表明也可通过改变电沉积所用的支持电解质来控制NME形态。
通常，NME的树枝状结构取决于制备期间的条件，包括电沉积溶液的浓度、对待电沉积的金属的选择、以及在电沉积期间所施加的电位。这些参数是容易控制的。例如可为理想的是，将电沉积中所用试剂的浓度和纯度控制在5%之内。对金属的选择易于控制，只要试剂纯度高即可，即简单地通过获得正确材料来控制。电沉积期间的电位可容易控制在数mV之内，这足以控制所得NME的大小和形态。
实施例2.使用多路复用纳米结构微电极集成电路直接对肿瘤组织中的前列腺癌生物标志进行概况分析
材料与方法
芯片制作。在加拿大光子学制作中心(CanadianPhotonicsFabricationCenter)制备芯片。将3”硅片用热生长的二氧化硅厚层钝化。用电子束辅助金蒸发，将350nm金层沉积在芯片上。用标准光刻法和剥离法图案化金膜。利用化学蒸汽沉积将500nm二氧化硅绝缘层沉积。用标准光刻法在电极上印下500nm孔隙，并用标准光刻法暴露2mmx2mm的接合焊盘(bondpad)。
纳米结构微电极的制作。通过在丙酮、IPA和DI水中漂洗30s并用氮气流干燥而清洁芯片。所有电沉积都在室温下用带有3-电极系统(特征为Ag/AgCl参比电极和铂丝辅助电极)的BioanalyticalSystemsEpsilon恒电位仪进行。将在制作电极上的500nm孔隙用作工作电极并用暴露的接合焊盘接触。使用DC电位安培法，在-250mV下进行10s，在含有5mMH2PtCl6溶液和0.5MHClO4的铂浴中制作铂NME。
寡核苷酸的制备和纯化.将所有合成寡核苷酸都通过反相HPLC严格纯化。将以下探测物和靶序列用于实验。Seq.P1.III型融合探测物(PNA)：NH2-Cys-Gly-ATAAGGCTTCCTGCCGCGCT-CONH2(SEQIDNO.1)，Seq.P2.I型融合探测物(PNA)：NH2-Cys-Gly-CTGGAATAACCTGCCGCGCT-CONH2(SEQIDNO.2)，Seq.P3.VI型融合探测物(PNA)：NH2-Cys-Gly-ATAAGGCTTCTGAGTTCAAA-CONH2(SEQIDNO.3)，Seq.T1(III型TMPRSS2：ERG融合DNA靶)：5’AGCGCGGCAGGAAGCCTTAT3’(SEQIDNO.4)，Seq.T2(WTTMPRSS2DNA靶)：5’AGCGCGGCAGGTCAT10ATTGA3’(SEQIDNO.5)，Seq.T3(WTERGDNA靶)：5’TCATATCAAGGAAGCCTTAT3’(SEQIDNO.6)，Seq.T4(非互补DNA靶)：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’(SEQIDNO.7)。通过在260nm处测定吸光度和用以下程序计算出的ext.系数来定量寡核苷酸：http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/。
用PNA探测物对NME的修饰.将含有500nM硫醇化单链PNA、25mM磷酸钠(pH7)和25mM氯化钠的溶液在50℃加热10分钟。再加入合适量的10mMMCH，使终MCH浓度为100nM。在4℃的黑暗湿度箱中过夜，将0.5-10μL(取决于多路复用程度)的该混合物沉积在NME上。将NME在25mM磷酸钠(pH7)和25mMNaCl缓冲液中漂洗，然后进行测定。
电化学测量.在含有10μMRu(NH3)63+、25mM磷酸钠(pH7)、25mM氯化钠和4mMFe(CN)63-的溶液中测量电化学信号。在杂交前后测定差示脉冲伏安法(DPV)信号，该测定使用5mV的电位阶跃、50mV的脉冲幅度、50ms的脉冲宽度和100ms的脉冲周期。采集杂交前后的循环伏安法信号，扫描速率100mV/s。通过在循环伏安法信号中从-300mV下的阴极电流中减去0mV下的的背景，来定量测定极限还原电流(Limitingreductivecurrent)(I)。对应于杂交的信号改变如下计算：ΔI＝(Ids-Iss)/Issx100％(ss＝杂交前，ds＝杂交后)。
杂交方案.杂交溶液通常在25mM磷酸钠(pH7)和25mMNaCl中含有靶序列。将电极在37℃的黑暗湿度箱中保温60分钟，然后用缓冲液彻底洗涤，再进行电化学分析。
mRNA的分离.使用DynabeadsmRNADirect试剂盒(Invitrogen)，从细胞系和患者组织样品中提取mRNA。两个典型的前列腺癌组织样品由合作人体组织网络(CooperativeHumanTissueNetwork)采集、获得自根治性前列腺切除术。将所述组织贮存在-85℃，直到选取富含肿瘤的组织用于mRNA提取。通过NanoDropND-1000(ThermoFisherScientific，USA)测定mRNA靶的浓度。所有融合序列都经RT-PCR和直接测序而得以证实。
DNA杂交在NME上的动力学测定.如上所述地制备PNA(seq.2)修饰的NME。将漂洗过的NME浸入含有10μMRu(NH3)63+、4mMFe(CN)63-、100fMDNA靶(seq.4-7)、25mM磷酸钠(pH7)和25mMNaCl的溶液中。如上所述地获取电催化CV信号。所有测定都在37℃下进行。
结果和讨论
我们试图产生基于纳米材料的平台用于超灵敏的生物分析，也就是说i)高度稳健的和直接制作的；ii)多路复用的和可升级的；和iii)当与异质生物样品一起存在时的灵敏的和特异性的。为了满足需要i)和ii)，我们需要使用可升级方案获得每个传感元件的可重现布局的方法。为了满足需要iii)，我们试图将纳米级特征整合到我们的传感阵列中。然而，阵列的纳米结构传感元件的产生是劳动密集型的并且倾向于低重现性。电子束光刻法提供了对纳米级特征及其布局的所需控制；然而，这是一系列技术，目前并不适合低成本、批量芯片生产。我们的方法改为使用成本有效的常规光刻术以定位和寻址我们的电极；然后寻找以高度重现性产生这些微电极的纳米结构的方法。
我们构建了8倍多路复用芯片，即通过将350nm厚的金层图案化在硅芯片上，产生8根5-μm宽的Au导线，其与用作外部联系的大金属垫连接。然后将SiO2沉积为钝化层并使其图案化，以在每根Au导线的端部产生直径500nm的孔隙。产生这些开口以用作纳米结构的受控局部生长的各个模板。然后我们使用钯电沉积，以将金属沉积在图案化的孔隙中。我们发现我们能够通过改变沉积时间来调节纳米结构的大小。我们能够容易地将结构直径限制至超微电极领域(＜10u)。在能够快速进行金属沉积的条件下，微电极表面显示高水平的纳米结构，特征大小为约20nm。这些结构显示出理想的微电极性质，表现出低电容电流和高稳态的坪电流(plateaucurrent)。
为了使这些纳米结构微电极(NME)起到核酸生物传感器的作用，我们用硫醇化肽核酸(PNA)探测物来修饰它们。先前已经表明将PNA用作探测分子，增加生物传感测定的灵敏度并且在电化学测定中特别具有优势，因为它产生较低的背景电流。为了将核酸杂交转换成电信号，我们使用了先前由我们实验室开发的电催化报道系统(Lapierre，M.A.等，Anal.Chem.2003，75.6327-6333)。该报道系统依赖于Ru(NH3)63+在电极表面的积累(当聚阴离子物质如核酸结合时)和对Ru(III)还原的催化，该催化通过Fe(CN)63-的包含物来进行，该包含物使Ru(III)再生并允许每个金属中心的多次还原。当用互补序列刺激PNA-修饰的NME时，可检测的信号变化可在飞摩尔浓度范围内清楚地检出。用完全非互补序列观察到可忽略不计的信号变化。
选择用于在该平台上分析的癌症生物标志是对前列腺癌具有特异性的一组基因融合物。这些融合物(由结合ERG基因和TMPRSS2基因的染色体易位产生)是最近发现的并且在至少50％的前列腺肿瘤中存在。此外，有约20种序列类型(其特征在于不同融合位点)，而在肿瘤中存在的融合物的准确类型看来与其侵袭性和转移潜力相关。因此，这些序列不仅是有希望的诊断标志，而且也是具有预后价值的因子。
为了确定NME传感器是否能将基因融合序列与半互补的野生型序列区分开来，用以下序列对用与III型融合物剪接位点互补的探测物修饰的传感器进行刺激：(1)融合靶(seq.T1)、(2)对应于野生型TMPRSS2基因的序列(seq.T2)、和(3)对应于野生型ERG基因的序列(seq.T3)。也测定了完全不互补的对照(seq.T4)。杂交时间为60分钟，用完全互补的靶标观察到大的信号增加，而用TMPRSS2靶则观察到小得多的信号变化。ERG靶产生甚至更小的信号变化，而用非互补序列观察到的则可忽略不计。TMPRSS2靶与位于并非连接电极的序列末端的探测物部分结合，而ERG靶与位于连接电极表面的末端的探测物部分结合。所观察到的不同信号水平表示探测物的最可接近一侧能更好地结合引入的靶分子，而与序列隐藏更深的部分的杂交是效率低的。
为了确定不同靶的杂交是否需要原先针对精确读出而测试的全部60分钟的时期，以在原先测试的窗口之内的不同间隔来监测电催化信号。引人关注的是，信号产生非常快，在2分钟内观察到明显的电流变化。然而，经过总共60分钟的时期，半互补序列和非互补序列的信号显著下降；60分钟内消减了2分钟信号的20-50％。看来对于并非完全互补的序列而言，在NME传感器暴露给靶溶液的最初几分钟内发生了某些非特异性结合，但这些复合体不会保持维持，也不会持续固定在电极上。因此，尽管可用短杂交时间将非互补序列与互补序列区分开来，但更长的时间增加差示信号变化，从而增加特异性程度。
这些纳米结构微电极作为核酸检测器的性能表明：当在合适杂交条件下使用时，图案化的结构确实是灵敏的和特异性的。因此我们试图证明基于多路复用芯片的NME可用于测定异质生物样品中存在的癌症生物标志。为了研究该能力，对来自前列腺癌患者的细胞提取物和肿瘤样品进行评价，以确定系统的灵敏度和特异性对用于临床测试而言是否足够稳健。
为了确定我们是否可使用NME芯片来检测前列腺癌相关基因融合物，我们首先分析从2种前列腺癌细胞系VCaP和DU145中分离的mRNA。前一细胞系是III型融合阳性，后者是融合阴性。当将来自缺乏该序列的细胞系的10ngmRNA与具有与III型融合物(seq.P1)互补的探测物的NME一起保温时，没有发生明显的信号改变，而在来自含有III型融合物的细胞系的10ngmRNA的存在下，观察到大的信号增加。另外，用与不同融合物(seq.P2)互补的探测物对NME的修饰并不与阳性mRNA样品产生显著的信号。因此，融合基因的检测是高特异性的。这些结果是显著的，因为样品(10ng)的使用效率和分析所需总时间(小于1.5小时)比其它检测方法(如荧光原位杂交(FISH)和测序)有显著的改善。
NME芯片的最终应用是对相关患者样品中的一组癌症生物标志进行直接多元分析。为了测试我们的器件在这类应用中的性能，我们针对一系列基因融合物分析了从细胞系和临床肿瘤样品中采集的一组mRNA样品。我们获取了一组样品，其可允许检测3类最常见前列腺癌基因融合物类型：I型、III型和VI型。不同的临床结果与这些序列相关，其中III型融合物是最常见的，但与低癌症复发率相关，而I型和VI型融合物则与具有高复发水平的侵袭性癌症相关。因此有很大兴趣来区分肿瘤中的这些融合物，而且允许快速且直接评价其存在与否的方法在其进一步研究和对其作为诊断生物标志的确证会有价值。
将与这3种融合物各自互补的各种探测物沉积在NME芯片上的其各自电极上，然后以多元形式针对不同基因融合物的存在情况对5个不同mRNA样品进行概况分析。测试了3种细胞系：VCap(III型阳性)、28NCI-H660(III型和VI型阳性)30和DU145(融合阴性)。另外，测试了2个肿瘤样品(通过根治性前列腺切除术采集到的组织)，通过常规测序证实，一个是I型融合阳性，一个是III型融合阳性。在各种情况下，所有实验都花费小于2小时并且只需要10ngmRNA。通过分析在具有不同探测物的NME上采集的电化学信号，我们确定了各个样品中存在的融合基因的身份(identity)。例如，在含有I型融合物(经测序证实)的患者样品中，在各种探测物修饰的NME上观察到的电流值按照下列顺序下降：I＞＞＞＞III＞VI。在含有III型融合的患者样品中，电子信号再次指向融合物的正确身份，其中探测物III＞＞＞＞I＞VI。这些结果以及用DU145、VCaP和H660细胞RNA所得到的结果(其中电子概况分析(electronicprofiling)正确地指出基因融合物的存在与否)，表明NME芯片能够对复杂样品中的这些重要的生物标志进行概况分析，并能够区分与不同临床结果相关的生物标志概况。
本文所述的检测平台不仅是特异的、灵敏的和稳健的，而且它还是实用和可升级的。我们选择的可再现的制作方法可用于产生探测物修饰的芯片，这使用与在消费电子学微芯片制作中广泛使用的相同的光刻技术；并且对于读出仅需要简单而便宜的仪器装置。对于自动化分析无需微流体，因为可以在单个反应容器中进行杂交并读出。该系统代表了对基于PCR方法(该方法灵敏但在临床情况下难以自动化)的具有吸引力的替代方法。
总之，我们在本文描述的新的多路复用电极平台是第一个用电子信号直接读出在临床相关样品中的一组癌症生物标志。能够进行这些测定的阵列的特征在于微电极，其具有对灵敏度所需的可控和通用的纳米质地。该系统将这些纳米质地电极与快速催化读出结合，以实现长期存在的目标：使用便宜且实用的平台对癌症生物标志进行多元分析。
实施例3.微小RNA的直接电子检测在30分钟内揭示差异表达概况。材料与方法
材料.6-巯基-1-己醇(97%MCH)、氯化六氨合钌(hexaaminerutheniumchloride)(99.9+%)、铁氰化钾(99%)和氯化钯(II)(99.9+%)购自Sigma-AldrichCanadaLtd(Oakville,ON)。高氯酸(70%)、丙酮(ACS级)和异丙醇(IPA,ACS级)得自EMD(Gibbstown,NJ)。硫醇化PNA寡聚物得自BiosynthesisInc(Lewisville,TX)，HPLC纯化级。PNA探测物在其N端具有Cys-Gly二肽。Gly作为间隔物，而Cys提供游离巯基，用于固定在电极表面。合成的微小RNA(5’端磷酸化和HPLC纯化的)得自EurofinsMWGOperon(Huntsville,AL)。所有PNA和RNA序列见在支持性信息中提供的表S1。
芯片制作.在加拿大光子学制作中心制备芯片。将3”硅片用热生长的二氧化硅厚层钝化。用电子束辅助金蒸发，将350nm金层沉积在芯片上。用标准光刻法和剥离法图案化金膜。用化学蒸汽沉积将500nm二氧化硅绝缘层沉积。用标准光刻法在电极上印下500nm孔隙，并用标准光刻法暴露2mmx2mm的接合焊盘。
纳米结构微电极的制作.通过在丙酮、IPA和DI水中漂洗30s并用氮气流干燥而清洁芯片。所有电沉积都在室温下用带有3电极系统(特征为Ag/AgCl参比电极和铂丝辅助电极)的BioanalyticalSystemsEpsilon恒电位仪进行。将在制作电极上的500nm孔隙用作工作电极并用暴露的接合焊盘接触。将芯片的2mm部分浸入含有5mM氯化钯(II)和0.5M高氯酸的电镀浴中，并保温约5min，然后进行电镀。让接合焊盘远离溶液。使用DC电位安培法，在施加电位为-100mV下进行6s，制作PdNME达。
用PNA探测物对NME的修饰.将单链硫醇化PNA探测物溶于含有25mM磷酸钠和25mM氯化钠的缓冲液(pH7)中，浓度为500nM。再将该溶液在50℃下加热10分钟，完全溶解PNA分子。再加入合适量的10mMMCH，使终MCH浓度为100nM。用手动微量移液器将10μL该混合物快速沉积在具有PdNME的芯片上。再将该PNA探测物溶液覆盖的芯片在4℃的黑暗湿度箱中保温过夜。将探测物修饰的PdNME用以上缓冲液充分漂洗，然后测定。对于多元实验，使用具有8根可单独寻址导线的芯片。
靶杂交.杂交溶液在25mM磷酸钠(pH7.0)和25mMNaCl中含有不同浓度的靶。将PdNME与10μL靶溶液在37℃下于湿度箱中保温30min，以使固定化的探测分子与靶分子杂交。再然后将芯片冷却并用缓冲液充分洗涤，然后进行电化学分析。
电化学测量.在含有10mMRu(NH3)63+、4mMFe(CN)63-、25mM磷酸钠(pH7.0)和25mMNaCl的溶液中，用电化学分析仪(BASi，WestLafayette，USA)进行电化学测量。在加入靶溶液前后进行循环伏安法(CV)，扫描速率为100mV/s。在5mV电位阶跃、50mV脉冲幅度、50ms脉冲宽度和100ms脉冲周期下，进行差示脉冲伏安法(DPV)。采集杂交前后的循环伏安法信号，扫描速率100mV/s。通过在循环伏安法信号中从-300mV下的阴极电流中减去0mV下的背景，来定量极限还原电流(I)。对应于杂交的信号改变如下计算：ΔI＝(Ids-Iss)/Issx100(ss＝杂交前，ds＝杂交后)。将检测限确定为第一浓度，其中减去背景(非互补ΔI)的信号为10fM非互补对照样品的标准差的2倍。
SEM成像.采用HITACHIS-3400SEM(HitachiHighTechnologiesAmerica，Inc.，Pleasanton，CA)研究电镀NME的形态和尺寸。用双面粘合的碳黑胶带将芯片固定在不锈钢SEM支柱(stub)上。用次级电子模式在20kV下获取SEM图像。
用于PCR分析和扩增方案的RNA提取.用mirVana试剂盒(Ambion)从细胞系中提取总RNA。通过内源对照RNU44的RT-PCR分析，使用AppliedBiosystemsTaqMan微小RNA测定法评价样品质量。该测定法包括利用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems，CA，USA)的逆转录(RT)步骤，其中茎环RT引物与mir分子特异性杂交，随后用MultiScribe逆转录酶进行逆转录。简而言之，逆转录混合物包括50nM茎-环RT引物、1xRT缓冲液、0.25mM各种dNTP、3.33U/μLMultiScribe逆转录酶和0.25U/μlRnase抑制剂。然后将7.5μL反应物在AppliedBiosystems7900Thermocycler中在16℃保温30分钟，在42℃保温30分钟，在85℃保温5分钟，然后保持在4℃。随后使用AppliedBiosystems7900HT实时PCR系统，将RT产物用序列特异性引物(hsa-mir-21引物4373090和hsa-mir-205引物4373093，来自AppliedBiosystems)扩增。10μLPCR混合物含有0.67μLRT产物、1x4TaqManUniversalPCRMasterMix、0.2μMTaqMan探测物、1.5μM正向引物和0.7μM反向引物。将反应物在384孔板中在95℃下保温10分钟，然后进行以下循环40次：在95℃下15秒种和在60℃下1分钟。
前miRNA-21的克隆和表达.按照制造商使用说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)，通过逆转录来自FaDu细胞的500ng总RNA产生cDNA。将50ngcDNA用作模板，用于进行前miRNA-21茎环的PCR扩增，其使用1μM引物MIR-F(CCTACCATCGTGACATCTCCATGG)和MIR-R(ATGAGAACATTGGATATGGATGGT)。PCR的条件为：95℃2min，然后40次循环，在95℃1min，55℃1min和72℃1min，最终延伸步骤在72℃10min。PCR产物经凝胶纯化(凝胶提取试剂盒，Qiagen)并克隆到pCR4-TOPO载体(invitrogen)中。挑取菌落并在LB培养基中培养。用质粒小型试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA，并用测序(ACGTcorporation)来检查正确产物、方向和不存在不需要的突变。将质粒DNA用NotI消化，NotI不产生3’突出末端(其在体外转录期间产生高背景的载体RNA)。将1μg线性化的质粒DNA用作体外转录模板，所述转录使用AmpliScribeTMT3高产量转录试剂盒(EpicentreBiotechnologies)。完成逆转录之后，加入DNA酶I，以消化模板DNA，然后用PureLinkMicrotoMidi总RNA纯化试剂盒(Invitrogen)纯化RNA。通过在260nm处读出吸光度测定RNA浓度。
结果与讨论
我们试图开发用于微小RNA概况分析的新方法，其特征在于基于阵列分析的便利，但会用测定小生物样品的低丰度微小RNA所需的卓越灵敏度来增加这种多元分析的能力。鉴于常规的基于荧光的方法对用简单仪器设备监测少量分子与表面结合的探测物序列的杂交而言灵敏度不够，我们改为寻求采用电子读出的方法。
为了提供用于微小RNA电子检测的平台，制备了多路复用芯片，其特征在于通过光刻法产生电极图案。该芯片用硅片作为基础来制备，并将金图案沉积在其表面，以提供多路复用导线组和外部接触。将SiO层沉积在金的顶部以钝化该金属，然后在最终制作步骤中，在各导线的末端开500纳米的孔隙，以暴露金。为了产生突出的微电极，将钯电沉积在孔隙中。将电沉积步骤经改造以产生高度纳米结构的微电极(NME)。先前的研究已经表明纳米结构传感元件可存在比体材料(bulkmaterial)更有效的生物分子探测物并促进表面的配位反应，但是该优势从未用于直接生物概况分析。
为了测试电子芯片在微小RNA检测中的灵敏度和特异性，将PdNME用PNA探测物修饰并暴露给RNA进行杂交。用氧化还原报道系统测定配位，先前已表明该系统当与纳米结构电极和PNA探测物一起使用时显示出飞摩尔灵敏度(R.Gasparac等，J.Am.Chem.Soc.2004，126，12270；Z.Fang，S.O.Kelley，Anal.Chem.2009，81，612；M.A.Lapierre，等，Anal.Chem.2003，75，6327；M.A.Lapierre-Devlin等，NanoLett.2005，5，1051)。该报道系统依赖于当核酸在电极表面时杂交Ru(III)的积累，并且得自该报道物的信号通过铁氰化物包含物而放大，该包含物可在其电化学还原之后化学再生Ru(III)。当将含有少至10aM靶的溶液暴露给基于芯片的NME时，miR-21序列的滴定显示出相对于非互补对照序列而言的可检测信号变化。这相当于10个分子/微升样品。非常高的灵敏度水平伴随着仅102的有限动态范围，但对于微小RNA的检测而言，考虑到这些序列丰度低，这种权衡是应该的。
两个关键性的额外传感标准是在微小RNA检测中的特定需求。第一，密切相关序列(只差一个碱基)必须被准确区分。第二，必须区分序列附加物(sequenceappendage)，例如在成熟微小RNA相对于前体微小RNA中发现的那些。我们试图用这些需求中的每一项来挑战我们的系统。我们首先研究了对成熟微小RNA序列测定的特异性。这可通过分析当将芯片暴露至以下溶液时所观察到的信号改变来进行，所述溶液含有miR-21的全长形式、双链形式、前体形式或明显更短的单链、成熟miR-21序列。对于发夹前体结构的所得信号接近背景水平，而对于成熟miR-21观察到强的信号改变。
我们评价了检测方法对点突变的灵敏度，即通过监测探测物修饰的传感元件对两个密切相关序列miR-26a和miR-26b的响应。将与每个序列互补的探测物阵列在芯片上，并监测这些元件对互补序列的响应。完全匹配miR-26a探测物在引入miR-26a时的所得信号为错配miR-26b探测物的约4倍，并且同样地，完全匹配miR-26b探测物在引入miR-26b时所得信号为其错配相应探测物的约4.5倍。这些结果表明，该多路复用芯片可成功区分密切相关的微小RNA序列。
相对于正常细胞，代表特定肿瘤类型的细胞系的微小RNA表达“指纹”，先前已经证明是鉴定微小RNA的有力方法，所述微小RNA可作为患者的生物标志。已经证实芯片对微小RNA靶的特异性和灵敏度，于是我们使用RNA样品对其进行测试，所述RNA样品提取自人的正常细胞和得自培养基中生长的人头颈部鳞癌细胞系。例如，将从人的下咽鳞癌FaDu细胞系和正常口腔上皮细胞系中提取的总RNA滴定到具有与miR-205互补的探测物的纳米结构微电极上。仅5ng来自FaDu细胞的RNA就得到阳性信号，而正常上皮细胞用高达20ngRNA都不产生任何信号变化。这表明信号响应对应于在癌细胞系中以显著较高水平存在的独特标志。
我们对2种不同的微小RNA：miR-21和miR-205进行了概况分析，并且在一组总RNA样品中还包括对照RNARNU-44。我们使用3种不同的头颈部鳞癌细胞系，并相对于分离自正常口腔上皮细胞的RNA，比较了微电极芯片对这些总RNA样品的响应。正如所料，如通过对暴露至用互补探测物修饰的传感元件的每种总RNA样品测定的电化学响应所判断的，RNU-44水平在所有4种细胞系中保持恒定。然而，miR-21信号和miR-205信号在癌细胞系中都显著升高。的确，判断这些微小RNA水平在癌细胞系中为正常上皮细胞的＞100倍。用常规定量PCR证实这些靶的过表达(参见支持性信息)。先前已观察到miR-21和miR-205两者都在原发性人头颈部鳞状癌中升高，表明这些微小RNA作为该恶性肿瘤的诊断用生物标志的巨大潜力。
总之，本文所述的微小RNA检测芯片提供了用于分析新的一类核酸生物标志的灵敏度和特异性，所述标志代表了一类最具有挑战性的检测靶标。微小RNA概况的电子读出提供快速但高准确的方法，用于直接针对特定序列测定RNA样品，并且无需标记或扩增使该方法特别直接和有效，该特征用其它基于PCR或杂交的方法都无法达到。

Claims (42)

1.一种适于响应于生物分子刺激而产生电荷的纳米结构微电极，其中所述微电极包含多个分枝的分形纳米结构，并且其中所述纳米结构微电极能够在所述纳米结构的表面呈现生物分子探测物。
2.权利要求1的微电极，所述微电极由选自以下的材料构成：贵金属、贵金属合金、导电聚合物、金属氧化物、金属硅化物、金属氮化物、碳或其任意组合。
3.权利要求1的微电极，所述电极的高度范围为约0.5-约100微米。
4.权利要求1的微电极，其中所述分枝的分形纳米结构的长度范围为约1至-约300纳米。
5.权利要求1的微电极，其中所述分枝的分形纳米结构的长度范围为约10-约20纳米。
6.权利要求1的微电极，其中所述微电极的近似直径范围为约1-约10微米。
7.权利要求1的微电极，所述微电极还包括选自以下的探测物：硫醇化探测分子；末端为硫醇的核酸、肽核酸、锁定核酸或磷酰二胺吗啉代寡聚物；末端为胺的核酸、肽核酸、锁定核酸或磷酰二胺吗啉代寡聚物；末端为羧酸的核酸、肽核酸、锁定核酸或磷酰二胺吗啉代寡聚物；用合适连接分子官能化的蛋白质或肽以及用合适的连接分子官能化的抗体。
8.一种生物传感器件，所述器件包括基材；在所述基材上的导电的导线；覆盖所述导线的绝缘层，所述绝缘层具有限定其中暴露部分导线的空间的孔隙；和沉积在所述孔隙内的权利要求1的纳米结构微电极，所述微电极与导线的暴露部分处于电相通，所述微电极适于通过电催化报道系统响应于生物分子刺激而产生电荷，其中所述微电极与导线的暴露部分处于电接触。
9.权利要求8的生物传感器件，其中所述导线包括选自以下的材料：Au、Al、W、TiN和多晶硅。
10.权利要求8的生物传感器件，其中所述基材包含选自以下的材料：硅、二氧化硅、石英、玻璃、蓝宝石、砷化镓、锗、碳化硅、铟化合物、硫化硒、陶瓷、塑料、聚碳酸酯和其它聚合物或任何上述材料的组合。
11.权利要求8的生物传感器件，其中所述绝缘层由选自以下的材料组成：二氧化硅、氮化硅、氮掺杂的氧化硅和聚对二甲苯或任何上述材料的组合。
12.权利要求8的生物传感器件，其中所述孔隙的近似直径范围为约100nm至约10μm。
13.权利要求8的生物传感器件，所述器件还包括与导线电相通的电荷存储器，用于存储来自所述微电极的电荷，其中在积分期末在所述电荷存储器中的电荷指示所述生物分子刺激。
14.权利要求8的生物传感器件，所述器件还包括用于显示所述电荷存储器中存储的电荷的显示元件。
15.权利要求8的生物传感器件，所述器件还包括晶体管。
16.权利要求15的生物传感器件，其中所述晶体管是场效应晶体管(FET)。
17.权利要求16的生物传感器件，其中所述FET选自：n-型硅沟道和p-型硅沟道。
18.权利要求15的生物传感器件，其中所述晶体管是双极晶体管。
19.权利要求18的生物传感器件，其中所述双极晶体管选自：n-p-n双极结型晶体管和p-n-p双极结型晶体管。
20.权利要求8的生物传感器件，所述器件包括多根导线，其各自具有各自的微电极。
21.权利要求20的生物传感器件，所述器件包括在所述微电极上提供的至少2种不同探测分子。
22.权利要求8的生物传感器件，其中在阵列中提供所述微电极，并且各个微电极分别可电子访问。
23.一种生物传感器件的制备方法，所述方法包括：提供基材和所述基材上导电的导线，所述导线被绝缘层覆盖；在所述绝缘层中蚀刻孔隙以暴露部分导线；和将导电材料电沉积在所述导线的暴露部分上，形成权利要求1的纳米结构微电极。
24.权利要求23的方法，其中所述电沉积包括控制所施加的电位，以得到所述分枝的分形纳米结构。
25.权利要求24的方法，其中所述施加的电位范围为约0mV至约-250mV。
26.权利要求23的方法，其中进行所述电沉积达以下时间：其范围为约25s至约500s。
27.权利要求23的方法，其中用选自以下的电解质来进行所述电沉积：H2SO4、HCl和HClO4。
28.权利要求23的方法，其中所述蚀刻区通过光刻法限定。
29.权利要求23的方法，所述方法还包括通过将靶生物分子的探测分子与所述多个分枝的分形纳米结构中的至少一个的表面结合，来官能化所述微电极。
30.权利要求29的方法，其中将所述探测分子用巯基、胺基或羧酸基团官能化。
31.一种使用纳米结构微电极进行生物传感过程的方法，所述方法包括：
提供权利要求8的器件；
相对于参比电极为所述微电极提供偏置；
测定所述微电极与所述参比电极之间的参比电荷或参比电流；
将所述微电极暴露至生物分子刺激；
测定响应于所述生物分子刺激而在所述微电极产生的电荷或电流；和
通过将所测电荷或所测电流针对所述参比电荷或参比电流进行比较，确定所存在的生物分子刺激的量。
32.一种生物传感盒，所述传感盒包括：用于包含生物样品的样品室；用于包含权利要求8的生物传感器件的生物传感室。
33.权利要求32的盒，其中所述生物传感室适于通过化学、机械或振动方式细分所述生物样品。
34.权利要求32的盒，所述盒还包括用于纯化或分离样品的纯化室。
35.权利要求32的盒，所述盒还包括具有胶囊的盖，所述胶囊含有用于进行所述生物传感过程的试剂。
36.权利要求32的盒，所述盒是一次性的。
37.一种生物传感工作站，其包括：用于固定权利要求32的生物传感盒的盒固定器；用于进入所述生物传感盒的仪器尖端；用于选择待进行的生物传感过程的选择机构；适于使用所述生物传感盒来进行生物传感过程并根据所述生物传感盒产生的电子信号来确定所述生物传感过程的结果的处理器；和用于显示所述生物传感过程的结果的显示器。
38.权利要求37的工作站，其中存在多个盒固定器，用于固定多个生物传感盒。
39.权利要求37的工作站，其中所述仪器尖端是一次性的。
40.权利要求37的工作站，所述工作站还包括条码阅读器，用于唯一识别所述生物传感盒。
41.权利要求37的工作站，所述工作站还包括废物室，用于包含来自所述生物传感过程的废物。
42.权利要求37的工作站，其中所述工作站能够通过无线网络进行无线通信。
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