ES2606154T3

ES2606154T3 - Biosensor versátil y sensible

Info

Publication number: ES2606154T3
Application number: ES12851735.6T
Authority: ES
Inventors: Shana O. Kelley; Alexandre ZARAGOZA; Edward Hartley Sargent; Jagotamoy Das; Kristin CEDERQUIST
Original assignee: University of Toronto
Current assignee: University of Toronto
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2017-03-23
Anticipated expiration: 2032-11-21
Also published as: JP2015501934A; WO2013078424A3; EP2783018B1; US20180217082A1; RU2014125242A; CN104271762A; JP6095681B2; HK1206067A1; CA2856881A1; US20140342359A1; CN104271762B; EP3147372A2; EP3147372A3; EP2783018A4; EP2783018A2; WO2013078424A2

Abstract

Un método para detectar un analito, que comprende: poner en contacto una muestra con un primer complejo reversible que comprenda una sonda, fijada en una superficie de sensor, y un pseudo-ligando que tenga una carga opuesta a la de la sonda; y detectar la presencia del analito mediante la detección de un segundo complejo, formado por el desplazamiento del pseudo-ligando de la sonda por parte del analito, si está presente en la muestra, en el que la detección comprende comparar un estado de carga de la sonda, previo al desplazamiento del pseudo-ligando, con un estado de carga de la sonda después del desplazamiento del pseudo-ligando.

Description

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DESCRIPCION

Biosensor versatil y sensible Campo de la invencion

El campo de la invencion es los dispositivos analiticos para caracterizar o detectar una amplia gama de analitos, incluyendo los acidos nucleicos, las proteinas y las moleculas pequenas.

Antecedentes

Resulta sumamente deseable desarrollar sensores universales que puedan detectar una amplia gama de diferentes dianas moleculares. Por ejemplo, tales plataformas versatiles pueden proporcionar potencialmente una unica solucion a pruebas que se ejecuten utilizando diferentes tipos de instrumentation. Sin embargo, hasta la fecha, se han desarrollado muy pocos sistemas de detection universales y ninguno tiene la suficiente sensibilidad para el analisis de muestras o el uso clinico directos. Adicionalmente, aquellos metodos de deteccion que sean rapidos y mas sensibles que los disponibles en la actualidad cubriran necesidades no satisfechas en la deteccion de drogas, el diagnostico medico, las pruebas en el punto de atencion y la monitorizacion del medio ambiente.

La deteccion electroquimica es una modalidad atractiva para tales sensores universales, ya que no se basa en sistemas opticos complejos y relativamente fragiles, y la superficie del sensor puede fabricarse como un microchip compacto y relativamente barato que contenga un conjunto de sensores, con diferentes especificaciones, que puedan leerse esencialmente de manera simultanea. En los documentos WO2008018833, WO200052456 y US2007099211 de Hiroshi Aoki y otros (the Analyst, 2003, 128:681-685) se dan a conocer ejemplos de metodos de deteccion electroquimica. Se han desarrollado propuestas de deteccion que informan sobre los cambios en el sistema electrostatico de una monocapa inmovilizada sobre un sensor, con diversas estrategias de lectura, incluyendo transistores de efecto de campo (Tian, B. y otros (2010), Science 13:830-834), micropalancas (Wu, G. y otros (2001) Nat. Biotechnol. 19:856-860), y sensores electroquimicos (Drummond, TG; Hill, MG, y Barton, JK (2008) Nat. Biotechnol. 21:1192-1199). Sin embargo, sigue siendo dificil obtener un metodo eficaz que pueda detectar con sensibilidad diversos analitos. Los metodos de serialization electroquimicos son especialmente llamativos de cara a una deteccion rapida, sensible, portatil y rentable. Un sistema electroquimico ha resultado prometedor de cara a una deteccion versatil, pero con una sensibilidad limitada a los analitos de acidos nucleicos que requieren una amplification enzimatica compleja y lenta de las secuencias diana antes de la deteccion (Lai, R.L. y otros (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. 103:4017-4021).

Sumario

La invencion se define en las reivindicaciones.

Los dispositivos y metodos descritos en el presente documento proporcionan un nuevo enfoque a la deteccion electroquimica que permite una excelente sensibilidad a una amplia gama de analitos, incluyendo los acidos nucleicos, las proteinas y las moleculas pequenas. En ciertas realizaciones, se inmoviliza una sonda de secuencia o sonda de aptamero sobre una superficie de sensor que detecta la carga local. Esta sonda de secuencia o sonda de aptamero se expone a un pseudo-ligando o neutralizador, que se acompleja con la sonda de secuencia o sonda de aptamero y tiene una carga opuesta a la misma, reduciendo de este modo la magnitud de la carga total o global que esta presente en el medio ambiente local de la sonda. En ciertas realizaciones, se pone en contacto con la sonda una muestra, que puede contener un analito. El analito de interes, si esta presente en la muestra, forma un complejo con la sonda de secuencia o sonda de aptamero. La formation del complejo desplaza el neutralizador, cambiando asi el estado de carga del ambiente local de la sonda, por ejemplo al generar una densidad de carga mas alta cerca de la superficie de ensayo, que se detecta posteriormente. El neutralizador puede contener uno o mas emparejamientos incorrectos de secuencia, con el fin de mejorar la eficiencia de desplazamiento de la sonda de secuencia o sonda de aptamero por parte del analito.

Puede utilizarse cualquier superficie de sensor adecuada. En ciertas realizaciones, la superficie del sensor proporciona una respuesta que es dependiente de la carga. En ciertas realizaciones, la superficie del sensor es un electrodo de deteccion electroquimica nanoestructurado. En ciertas realizaciones, la superficie del sensor es un transistor de efecto de campo, una micropalanca, o un sensor electroquimico. En ciertas realizaciones, se usan al menos dos superficies de sensor con diferentes sondas fijadas, que son capaces de formar complejos con diferentes analitos.

El analito puede ser cualquier sustancia o quimico de interes en un procedimiento analitico, incluyendo sin limitation acidos nucleicos, proteinas y moleculas pequenas. En una realization, el analito de interes puede ser una molecula pequena, incluyendo pero sin estar limitado a, un farmaco terapeutico, una droga, un contaminante del medio ambiente, y nucleotidos libres. En tal realizacion, la sonda puede ser un aptamero configurado para fijar la molecula pequena, y puede incluir un neutralizador que se acompleje con la sonda y se vea desplazada por la molecula pequena.

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En ciertas realizaciones, pueden modificarse las estabilidades relativas entre la sonda y el pseudo-ligando, la sonda y el analito, y el analito y el pseudo-ligando mediante la manipulacion de la temperatura. En ciertas realizaciones, pueden modificarse las estabilidades relativas entre la sonda y el pseudo-ligando, la sonda y el analito, y el analito y el pseudo-ligando mediante la composicion de una solucion tampon en la que se formen los complejos.

En ciertas realizaciones, el analito de interes puede ser un acido nucleico diana, incluyendo, pero sin estar limitado a, ADN, ARN y acido nucleico peptido (APN). En tales realizaciones, la sonda puede ser una secuencia de acido nucleico que sea al menos parcialmente complementaria al analito de acido nucleico, y puede incluir un neutralizador que se acompleje con la sonda de secuencia y se vea desplazado por el acido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la sonda puede comprender un acido nucleico, tal como ADN o APN. En ciertas realizaciones, el pseudo-ligando puede comprender un APN.

En ciertas realizaciones, el analito de interes puede ser una protelna o un fragmento de protelna. En tales realizaciones, la sonda puede ser un aptamero configurado para ligarse con la protelna o fragmento de protelna, y puede incluir un neutralizador que se acompleje con el aptamero de la sonda y se vea desplazado por la protelna o el fragmento de protelna. En ciertas realizaciones, el analito de interes puede ser una molecula no cargada. En ciertas realizaciones, el analito es una molecula pequena con un peso molecular inferior a 500 daltons aproximadamente.

En ciertas realizaciones, el analito de interes se liga al neutralizador con una afinidad elevada. En tales realizaciones, la formacion de un complejo entre el neutralizador y el analito libera el neutralizador de la sonda, lo que provoca un aumento de la magnitud de la carga cerca de la superficie del sensor. En tales realizaciones, el neutralizador puede incorporar uno o mas emparejamientos incorrectos de las bases con el fin de reducir su afinidad con la sonda.

Breve descripcion de los dibujos

Los objetos y ventajas anteriores, y otros, resultaran evidentes tras considerar la siguiente descripcion detallada, tomada en conjunto con los dibujos adjuntos, en los que los mismos caracteres de referencia se refieren a las mismas partes.

La FIG. 1A ilustra el metodo de deteccion electrostatica de la tecnica anterior, que utiliza una sonda electronegativa sobre una superficie de sensor.

La FIG. 1B ilustra una realizacion en la que se genera un gran cambio en la carga cerca de la superficie de deteccion cuando un analito desplaza un pseudo-ligando, de una sonda cargada inmovilizada sobre la superficie de deteccion.

La FIG. 2 muestra un proceso ilustrativo para detectar un analito de acuerdo con ciertas realizaciones.

La FIG. 3A ilustra una realizacion en la que iones indicadores cargados se ven atraldos hacia la sonda al liberar el neutralizador y fijar una diana.

La FIG. 3B muestra un chip sensor ejemplar que contiene multiples electrodos de deteccion nanoestructurados. La FIG. 3C muestra un electrodo de deteccion nanoestructurado ejemplar.

La FIG. 4 muestra un sistema ejemplar de deteccion de un analito, de acuerdo con ciertas realizaciones.

La FIG. 5 muestra una lista de secuencias ilustrativas de la sonda y del neutralizador.

La FIG. 6A muestra un biosensor de ATP ilustrativo, en el que se produce el desplazamiento de un neutralizador con respecto a una sonda de aptamero de ADN de un electrodo de deteccion, cuando el ATP se acompleja con una sonda de aptamero.

La FIG. 6B muestra voltamogramas diferenciales de impulsos ilustrativos para un biosensor de ATP, en ausencia de un neutralizador (solo aptamero), despues de que el neutralizador se haya acomplejado con la sonda de aptamero (+ neutralizador), y tras el desplazamiento del neutralizador con respecto a la sonda de aptamero por parte del ATP (+ ATP).

La FIG. 6C muestra la relacion entre la fuerza de la senal y la concentracion de ATP en un biosensor de ATP ilustrativo.

La FIG. 6D muestra la dependencia del tiempo para el cambio de la senal, observada a partir de un biosensor de ATP ilustrativo al anadir ATP.

La FIG. 7A muestra un biosensor de cocalna ilustrativo, en el que se produce el desplazamiento de un neutralizador con respecto a una sonda de aptamero de un electrodo de deteccion, cuando la cocalna se acompleja con la sonda de aptamero.

La FIG. 7B muestra voltamogramas diferenciales de impulsos ilustrativos para un biosensor de cocalna, ante la presencia de cocalna (+ cocalna) y la ausencia de cocalna (- cocalna).

La FIG. 7C muestra la relacion entre la intensidad de senal y la concentracion de cocalna en un biosensor de cocalna ilustrativo.

La FIG. 8A muestra un biosensor de acido nucleico ilustrativo, en el que se produce el desplazamiento de un neutralizador con respecto a una sonda de secuencia inmovilizada sobre un electrodo de deteccion, cuando un acido nucleico diana se acompleja con la sonda de secuencia.

La FIG. 8B muestra voltamogramas diferenciales de impulsos de un biosensor de ADN, ante la ausencia de un neutralizador (solamente sonda), una vez que el neutralizador se ha acomplejado con la sonda de secuencia

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(+ neutralizador), y tras desplazarse el neutralizador con respecto a la sonda de secuencia 1 pM de un ADN diana complementario (+ ADN diana) de 20 mer.

La FIG. 8C muestra la relacion entre la intensidad de senal y la concentracion del ADN diana complementario, de 20 mer, para un biosensor de ADN.

La FIG. 8D muestra la relacion entre la intensidad de senal y la concentracion total de ARN de E. coli, para un biosensor que utiliza una sonda complementaria al rpoB.

La FIG. 8E muestra la relacion entre la intensidad de senal y los lisados obtenidos a partir de diferentes concentraciones de E. coli, para un biosensor ilustrativo que utiliza una sonda complementaria al rpoB.

La FIG. 9A muestra un biosensor de protelna ilustrativo, en el que se produce el desplazamiento de un neutralizador con respecto a una sonda de aptamero inmovilizada sobre un electrodo de deteccion, cuando una protelna (en este caso, trombina) se acompleja con la sonda de aptamero.

La FIG. 9B muestra voltamogramas diferenciales de impulsos para un biosensor de trombina ilustrativo, en ausencia de un neutralizador (aptamero solamente), despues de que el neutralizador se haya acomplejado con la sonda de aptamero (+ neutralizador), y tras verse desplazado el neutralizador con respecto a la sonda de aptamero por 100 pM de trombina (+ trombina).

La FIG. 9C muestra voltamogramas diferenciales de impulsos para un biosensor de trombina, ante la presencia de la protelna de bloqueo no especlfica albumina de suero bovino (+ BSA) y ante la ausencia de la albumina de suero bovino (- BSA).

La FIG. 9D muestra la relacion entre la fuerza de senal y la concentracion de trombina para un biosensor de trombina. La llnea discontinua horizontal muestra la senal generada por 100 nM de albumina de suero bovino, una protelna no especlfica.

La FIG. 10 muestra un biosensor de acido nucleico ilustrativo, en el que se produce el desplazamiento de un neutralizador con respecto a una sonda de secuencia inmovilizada sobre un electrodo de deteccion, cuando un acido nucleico diana se acompleja con el neutralizador.

Description detallada

En la FIG. 1A se ilustran los principios subyacentes de los ensayos de la tecnica anterior. En los ensayos de la tecnica anterior, como se ilustra en la FIG. 1A, se fija una sonda de molecula no acomplejada a la superficie de un electrodo de deteccion. Como resultado, la carga del sensor se determina unicamente mediante la sonda de molecula antes de introducir el analito, siendo el analito un ligando que se liga a la sonda de molecula y forma un complejo estable con la misma. Tras la fijacion por parte del analito, la carga del analito cambia el estado de carga en la superficie del electrodo. Este enfoque conlleva limitaciones significativas en los metodos de deteccion basados en la carga de la tecnica anterior. En primer lugar, la senal de fondo puede ser elevada debido a la carga inherente de la molecula de la sonda, que a menudo es un acido nucleico electronegativo. Como resultado, la relacion entre la senal, que resulta al acomplejarse el analito con la sonda, y la senal de fondo puede ser baja si la carga de la sonda es muy elevada en relacion con la carga del analito, lo que resulta en una sensibilidad limitada del ensayo. Como resultado, tales ensayos a menudo requieren una amplification (mediante metodos tales como PCR) del analito tediosa, costosa, y dada a errores, antes del analisis. Los analitos no cargados que no producen un cambio significativo en la carga en la superficie del electrodo cuando se acomplejan con la sonda, en particular los analitos de bajo peso molecular, pueden resultar indetectables. Por ultimo, la senal de deteccion a es menudo una reduction de la magnitud de carga en la superficie del electrodo, como resultado de la formation de complejos entre la sonda fijada y el analito. Esto conlleva una estructura de ensayo de tipo “sin senal” en la que la presencia del analito esta indicada por la ausencia de senal, una configuration que a menudo resulta en una alta tasa de determinaciones de falsos positivos. Los metodos de deteccion de la tecnica anterior dependen esencialmente de la naturaleza de la amplitud de senal, la relacion entre senal y fondo, y el signo de cambio de senal del analito. Desafortunadamente, la election del analito no es una variable que el disenador del ensayo pueda cambiar, sino que mas bien es un requisito de la prueba.

Las realizaciones ilustradas en la FIG. 1B introducen una nueva libertad en el diseno del caracter electrostatico de la superficie del sensor. Se fija una molecula de sonda a la superficie de un electrodo y se forma un complejo con un neutralizador, siendo el neutralizador un pseudo-ligando que tenga afinidad por la sonda y neutralice la carga de la sonda durante la formacion del complejo. En ciertas realizaciones, puede suministrarse al usuario un dispositivo con el neutralizador ya acomplejado con la sonda. En ciertas realizaciones, el usuario puede aplicar el neutralizador a un elemento que contenga la sonda, tal como un electrodo de deteccion, antes de anadir el analito. En otra realization mas, el usuario puede aplicar el neutralizador a un elemento que contenga una sonda de forma esencialmente simultanea a la adicion del analito. El neutralizador actua como un pseudo-ligando que forma un complejo reversible con la sonda, y que puede desplazarse mediante un ligando o analito que forme un complejo con la sonda. Con este fin el neutralizador puede incorporar emparejamientos incorrectos de pares de base con la sonda, de manera que el analito de interes fije la sonda con mas fuerza, mas rapidamente y/o con mayor firmeza, lo que lleva al desplazamiento del neutralizador. Tambien puede modificarse la afinidad del neutralizador a la sonda utilizando cambios de temperatura o cambios en la composition del tampon. Tales cambios en la composition del tampon incluyen, pero no se limitan a, cambios en la resistencia ionica, la presencia o ausencia de cationes multivalentes, la presencia o ausencia de disolventes organicos, la presencia o ausencia de agentes caotropicos, y la presencia o ausencia de pollmeros hidrofilos.

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El neutralizador puede ser cualquier molecula que forme un complejo con la sonda de molecula. En ciertas realizaciones, dicho complejo tiene una magnitud de carga reducida en comparacion con la sonda fijada, de tal manera que el neutralizador se desplace con respecto a tal complejo al anadir el analito diana. El neutralizador puede ser un analogo de acido nucleico que incorpore una estructura cargada positiva o neutralmente. El neutralizador tambien puede ser un analogo de acido nucleico que incorpore una estructura cargada negativamente, pero que tenga una carga neta positiva. En ciertas realizaciones, el neutralizador es un conjugado de acido nucleico peptido y aminoacidos cationicos que se liguen especlficamente con una sonda electronegativa, de modo que la carga del complejo neutralizador-sonda sea menos electronegativa que la de la sonda sola. En otras realizaciones, el neutralizador puede incorporar analogos de acido nucleico morfolino o analogos de acido nucleico de metilfosfonato.

El uso de un pseudo-ligando desplazable permite que diversas realizaciones superen las limitaciones de los ensayos de carga de deteccion tradicionales. En ciertas realizaciones, se suprime la senal de fondo en el ensayo mediante una compensacion de carga disenada por el disenador del ensayo, mejorando de este modo la deteccion de la senal. En tales realizaciones, los cambios de senal que corresponden a la presencia de un analito no solo se determinan por la carga molecular del ligando del analito, sino tambien por la carga inherente de la sonda de molecula, que se descubre tras liberar el neutralizador. Esto permite detectar analitos que no produzcan cambios significativos en la carga de la sonda durante la formacion de complejos, lo que permite utilizar ensayos con una gama de analitos de bajo peso molecular que la deteccion electroqulmica no permitla anteriormente. Tales moleculas de bajo peso molecular habitualmente tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons, y pueden incluir, pero no se limitan a, nucleotidos y analogos de nucleotidos, drogas ilegales, drogas terapeuticas, y contaminantes del medio ambiente.

En ciertas realizaciones, la supresion de la senal de fondo tambien mejora en gran medida la relacion entre la senal especlfica del analito y la senal de fondo. Sorprendentemente, esta reduccion en la relacion entre la senal especlfica del analito y la senal de fondo permite la deteccion directa de analitos de acido nucleico, eliminando la necesidad de una amplificacion por PCR de las muestras, costosa y lenta antes, de la caracterizacion o la deteccion.

En ciertas realizaciones, el signo y la amplitud de la senal no solo estan determinados por la carga del analito, sino tambien por la de la sonda. Esto permite disenar un ensayo “con senal” en el que la presencia del analito esta indicada por un aumento de magnitud de la senal medida. Dichos ensayos de tipo con senal en general muestran una baja tasa de resultados con falsos positivos en relacion con los ensayos con una estructura de tipo sin senal.

La FIG. 2 muestra un proceso ilustrativo 200 para detectar un analito de acuerdo con ciertas realizaciones. El proceso comienza en la etapa 202. En la etapa 204, se forma un primer complejo reversible entre una sonda fijada sobre una superficie de sensor y un pseudo-ligando. El pseudo-ligando puede ser parcialmente complementario a la sonda, y tener una carga que sea opuesta a la de la sonda. En la etapa 206, se pone en contacto una muestra que puede contener el analito con el primer complejo situado en la superficie del sensor. Si el analito esta presente en la muestra, en la etapa 208 el analito desplaza el pseudo-ligando, y se forma un segundo complejo. En ciertas realizaciones, el analito desplaza el pseudo-ligando, y se forma un segundo complejo entre el analito y la sonda. En ciertas realizaciones, el analito desplaza el pseudo-ligando y se forma un segundo complejo entre el analito y el pseudo-ligando. En la etapa 210, se detecta la presencia del segundo complejo, que indica que el analito esta presente en la muestra. El proceso termina en la etapa 212. Debe comprenderse que las etapas del proceso 200 son meramente ilustrativas, y que ciertas etapas pueden efectuarse y/o realizarse de forma simultanea en otro orden adecuado, sin apartarse del alcance de la invencion. En ciertas realizaciones, el proceso 200 tambien incluye una etapa de comunicacion del resultado de la deteccion (no se muestra), por ejemplo mostrando visualmente un indicador (por ejemplo, representando un texto, slmbolo, o indicador codificado por color) a un usuario del proceso. En ciertas realizaciones, la etapa de comunicacion de los resultados incluye almacenar el resultado en una memoria local o remota asociada con el proceso 200, o enviar un mensaje a un usuario del proceso 200.

La FIG. 3A muestra una realizacion ilustrativa que se sometio a prueba usando un sistema indicador electrocatalltico, que proporciona una senal proporcional a la magnitud del cambio de carga en las superficies de electrodo. Para medir el cambio de la carga en la superficie del sensor, se utilizo un sistema indicador catalltico 300, [Ru(NH3)6]3+/[Fe(CN)6]3", para generar una senal que pueda monitorizarse mediante voltametrla diferencial de impulsos (DPV) en presencia, por ejemplo, de una molecula 310 de bajo peso molecular, tal como un nucleotido y un analogo de nucleotido, una droga ilegal, una droga terapeutica, y un contaminante del medio ambiente. En este sistema ilustrativo, el aceptor de electrones primario 308, que puede ser cualquier aceptor de electrones adecuado tal como [Ru(NH3)6]3+, se ve atraldo electrostaticamente a la superficie 302 de electrodo en proporcion a la cantidad de acido nucleico 304 portador de fosfato. Cuando se utiliza [Fe(CN)6]3- durante la lectura electroqulmica, la formacion de un ciclo redox por parte de [Fe(CN)6]3- regenera qulmicamente Ru(III), lo que amplifica la senal de manera significativa. Esta realizacion ilustrativa esta libre de etiquetas covalentes y no requiere el procesamiento previo de las muestras. Cabe esperar corrientes catallticas altas cuando solo se inmovilizan sondas de aptamero de ADN 304 sobre los sensores 302, debido a la afinidad electrostatica de Ru(III) con los grupos fosfato de la cadena principal de ADN, sin embargo, en los ensayos probados estas corrientes se velan fuertemente atenuadas en la presencia del neutralizador 306. Este sistema indicador puede utilizarse con microelectrodos nanoestructurados, que pueden fabricarse sobre la superficie de un chip.

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Las FIGS. 3B y 3C muestran un sensor ilustrativo utilizado en una realizacion ejemplar. Para fabricar el sensor, se utilizo estampado fotolitografico para producir un chip microelectronico 320 con un conjunto de sensores 322. Los chips utilizados en este estudio poselan veinte sensores. Con el uso de una oblea 324 de silicio recubierta con una capa 326 de oro (Au) y una capa 328 de SiO 2 como base, se estamparon terminales de contacto y conectores sobre chips individuales. Se utilizo entonces una sobrecapa de Si3N4 para pasivar la superficie del chip. Para proporcionar una plantilla para el crecimiento de sensores electrodepositados, se utilizo a continuacion fotolitografla para abrir unas aberturas 330 de 5 pm en el Si3N4. A continuacion, se empleo electrodeposicion de oro para hacer crecer unas microestructuras fractales 332, cuyo tamano y morfologla puede modularse mediante el tiempo de deposicion, la potencial concentracion de Au, un electrolito de soporte, y un protocolo de recubrimiento mediante metodos conocidos en la tecnica. Dado que las nanoestructuras aumentan la sensibilidad del ensayo de manera significativa, se recubrieron estructuras de Au con una capa delgada de Pd, para formar unos sensores finamente nanoestructurados (FIG. 3C). Debe comprenderse que los materiales, dimensiones y procesos utilizados para generar los sensores son meramente ilustrativos y que pueden usarse otros materiales, procesos, o dimensiones adecuados sin apartarse del alcance de la divulgacion.

En ciertas realizaciones, se fabricaron chips utilizando varias obleas de silicio de 2,54 cm, que se pasivaron con una gruesa capa de dioxido de silicio formada termicamente. A continuacion, se depositaron 25 nm de Ti. Posteriormente se deposito sobre el chip una capa de oro de 350 nm, usando evaporacion de oro asistida por haz de electrones, y se modelo usando fotolitografla estandar y un proceso aditivo. A continuacion, se deposito una capa de 5 nm de Ti. Se deposito una capa de 500 nm de Si3N4 aislante mediante deposicion de vapor qulmico. A continuacion se imprimieron unas aberturas de 5 mm fueron sobre los electrodos, usando fotolitografla estandar, y se expusieron unas areas de conexion de 0,4 mm x 2 mm mediante fotolitografla estandar.

Para fabricar los sitios de prueba de ensayo de determinadas realizaciones, los chips se limpiaron mediante sonicacion en acetona durante 5 min, se enjuagaron con alcohol isopropllico y agua desionizada (DI), y se secaron con un flujo de nitrogeno. La electrodeposicion se realizo a temperatura ambiente; se usaron aberturas de 5 pm en los electrodos fabricados a modo del electrodo de trabajo, y se hizo contacto con las mismas usando las areas de conexion expuestas. Se fabricaron sensores de Au (oro) usando una solucion de deposicion que contenla 50 mM de soluciones de HAuCU y 0,5 M de HCl. Se formaron estructuras de Au de 100 pm y 20 pm utilizando amperometria de CC a 0 mV durante 100 segundos, y a 0 mV durante 20 segundos, respectivamente. Despues de un lavado con agua DI y un secado, se recubrieron con Pd los sensores de Au para formar nanoestructuras mediante reelectrodeposicion en una solucion de 5 mM de H2PdCl4 y 0,5 M de HClO4, a -250 mV durante 10 segundos (para una estructura de 100 micras) y durante 5 segundos (para una estructura de 20 micras).

En ciertas realizaciones, se utilizo un protocolo ejemplar para preparar los ensayos. En este protocolo, se desprotegieron aptameros tiolados y sondas de aDn tioladas usando ditiotreitol (DTT), y posteriormente una purificacion con HPLC. A continuacion se liofilizaron las sondas purificadas con HPLC y se almacenaron a -20 °C. Se incubo con sensores una solucion tampon de fosfato (25 mM, pH 7) que contenla una sonda tiolada de 5 pM, 25 mM de NaCl, y 50 mM de MgCl2 durante 1 hora, en una camara humeda y oscura a temperatura ambiente, para inmovilizar la sonda sobre la superficie de ensayo. A continuacion, se lavo dos veces el chip durante 5 minutos con una solucion tampon de fosfato (25 mM) que contenla 25 mM de NaCl. Los sensores se incubaron despues con una solucion tampon de fosfato (25 mM) que contenla 10 pM de neutralizador y 25 mM de NaCl durante 30 minutos, a temperatura ambiente, y posteriormente se lavaron tres veces durante 5 minutos con el mismo tampon. Con fines de demostrar la deteccion, se trataron entonces los chips con diferentes analitos, a lo que siguio un lavado.

En ciertas realizaciones, se efectuaron experimentos electroqulmicos utilizando un potenciostato Epsilon de Bioanalytical Systems (West Lafayette, Indiana) con un sistema de tres electrodos que presentaba un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de alambre de platino. Se midieron las senales electroqulmicas en una solucion tampon de 25 mM de fosfato (pH 7) que contenla 25 mM de NaCl, 10 pM de [Ru(NH3)6]Cl3, y 4 mM de K3[Fe(CN)6]. Se obtuvieron senales de voltametrla diferencial de impulsos (DPV) con una etapa de potencial de 5 mV, una amplitud de impulso de 50 mV, un ancho de impulso de 50 mseg, y un periodo de impulso de 100 mseg. Se calcularon los cambios de senal correspondientes al reemplazo del neutralizador, por objetivo especlfico, con corrientes de fondo restadas: AI% = (Idespues - Iantes)/Iantes x 100 (en donde Idespues = corriente tras el reemplazo del neutralizador, Iantes = corriente antes del reemplazo del neutralizador). En estas realizaciones ilustrativas, se obtuvieron imagenes de microscopio electronico de barrido utilizando un 3025 SEM de Aspex (Delmont, Pennsylvania).

La FIG. 4 muestra un sistema ejemplar de deteccion de un analito de acuerdo con ciertas realizaciones. El sistema de deteccion 400 tiene una camara de deteccion 402 que incluye uno o mas electrodos. En la FIG. 4, la camara de deteccion incluye un electrodo de trabajo 404, un contraelectrodo 406, y un electrodo de referencia 408. Sin embargo, puede utilizarse cualquier cantidad o tipos adecuados de electrodos. La camara de deteccion 402 tambien tiene una entrada 410 para hacer fluir hacia dentro una muestra, para su contacto con el electrodo de trabajo 404, y una salida 412 para hacer fluir la muestra hacia el exterior. Si la muestra contiene el analito de interes, el analito puede formar un complejo sonda-analito 414 sobre la superficie del electrodo de trabajo 404. En ciertas realizaciones, una vez que la muestra entra en la camara de deteccion 402 a traves de la entrada 410, puede asignarse cierta cantidad de tiempo para facilitar la formacion del complejo sonda-analito 414. En ciertas

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realizaciones, una muestra que contenga el analito puede fluir hacia el exterior a traves de la salida una vez que se haya asignado suficiente tiempo para que se forme el complejo sonda-analito 414. Posteriormente puede hacerse fluir hacia el interior una solucion de lavado a traves de la camara 402 de muestra, para eliminar los materiales no deseados que puedan estar presentes en la muestra.

El sistema de deteccion 400 mostrado en la FIG. 4 incorpora una configuracion ilustrativa de potenciostato con tres electrodos, sin embargo, debe comprenderse que puede utilizarse cualquier configuracion adecuada de los componentes. El contraelectrodo 406 esta conectado al resistor 418, que a su vez esta conectado a la salida del amplificador de control 416. Un modulo de deteccion 420 esta conectado a traves del resistor 418 para proporcionar una medicion de la corriente. El modulo de deteccion 420 puede estar configurado para proporcionar la medicion de la corriente a tiempo real, en respuesta a cualquier forma de onda de entrada. El electrodo de referencia 408 esta conectado al terminal inversor del amplificador de control 416. Un generador de senales 422 esta conectado a la terminal no inversora del amplificador de control 416. Esta configuracion mantiene un potencial constante en el electrodo de trabajo al tiempo que permite mediciones precisas de la corriente. En ciertas realizaciones, la camara de deteccion 402 puede contener una pluralidad de electrodos para detectar multiples analitos. Por ejemplo, la camara de deteccion 402 puede incluir multiples electrodos de trabajo, cada uno con un tipo diferente de sonda fijada para la complejacion con diferentes objetivos presentes en la muestra. En ciertas realizaciones, el sistema de deteccion 400 puede estar configurado para dedicarse a los electrodos de trabajo individualmente uno por uno, al tiempo que utiliza un contraelectrodo y un electrodo de referencia comunes.

Una unidad de control y comunicacion 424 esta acoplada operativamente al modulo de deteccion 420 y al generador de senales 422. La unidad de control y comunicacion 424 puede sincronizar las formas de onda de entrada y las mediciones de salida, y puede recibir y almacenar la entrada y salida en una memoria. En ciertas realizaciones, la unidad de control y comunicacion 424 puede ser una unidad separada que interconecte con el sistema de deteccion 400. Por ejemplo, el sistema de deteccion 400 puede ser un cartucho desechable con una pluralidad de terminales de entrada y de salida, que pueden conectar con una unidad 424 de control y comunicacion externa. En ciertas realizaciones, la unidad de control y comunicacion puede acoplarse de manera operativa a una unidad de visualizacion que muestre la salida como una funcion de la entrada. En ciertas realizaciones, la unidad de control y comunicacion 424 puede transmitir la informacion de entrada y de salida a un destino remoto, para su almacenamiento y visualizacion. Por ejemplo, la unidad de control y comunicacion 424 podrla ser un dispositivo movil o capaz de interconectar con un dispositivo movil. En ciertas realizaciones, la unidad de control y comunicacion 424 podrla alimentar el sistema de deteccion 400. El sistema 400 puede accionarse usando cualquier fuente de alimentacion adecuada, incluyendo una baterla o una fuente de alimentacion de CA enchufada.

En ciertas realizaciones, puede proporcionarse un sistema de deteccion como una composicion de ensayo para su uso en la deteccion de drogas. La composicion de ensayo puede presentar un primer complejo reversible que comprenda una molecula de sonda fijada en una superficie de sensor, que forme un complejo con un pseudo- ligando complementario o parcialmente complementario. La sonda puede tener afinidad con un farmaco de moleculas mas grandes que las del pseudo-ligando. En consecuencia, el farmaco puede desplazar el pseudo- ligando, formando un segundo complejo. El primer y segundo complejos pueden tener un primer y segundo estados de carga, respectivamente. En ciertas realizaciones, el sistema de deteccion puede proporcionarse como un kit, que incluya un dispositivo con una superficie de sensor y una sonda fijada en la superficie del sensor. El kit tambien puede tener un pseudo-ligando que pueda formar un complejo reversible con el pseudo-ligando. El pseudo-ligando del kit puede estar ya acomplejado con la sonda, o puede incluirse por separado con el kit para su posterior complejacion.

En diversas realizaciones, los neutralizadores se sintetizaron utilizando una propuesta de slntesis en fase solida en un sintetizador de peptidos automatizado de tipo Preludio (Protein Technologies, Inc.; Tucson, Arizona). En estas realizaciones, los productos de slntesis se confirmaron mediante espectroscopia de masas.

En ciertas realizaciones, para examinar la capacidad del ensayo para detectar moleculas pequenas, se selecciono ATP a modo del analito o ligando de union modelos. En la FIG. 5 se muestran una sonda y unas secuencias de aptamero de ATP ilustrativas. En la FIG. 6A se muestra una configuracion ilustrativa del ensayo 600 de neutralizador para deteccion de ATP. En estas realizaciones, en primer lugar se inmovilizan unos aptameros tiolados de union a ATP 602 sobre unos sensores 604 con Pd sobre sus superficies, y luego se introduce un neutralizador 606 parcialmente complementario. La porcion de APN 608 del neutralizador 606 es principalmente complementaria al aptamero 602. Sin embargo, se introdujeron dos emparejamientos incorrectos 610 para permitir liberar facilmente el neutralizador 606 al anadir el ATP 612. La presencia del neutralizador 606 reduce fuertemente la carga en la superficie del sensor 604, que se verla restaurada por el desplazamiento del neutralizador 610 por parte de una molecula diana.

En la FIG. 6B, un grafico de DPV 620 muestra senales obtenidas en los sensores antes de la neutralizacion 622, despues de la neutralizacion 624, y despues de la introduccion 626 de ATP. Para la deteccion de ATP, se incubaron los sensores con una solucion tampon de fosfato (25 mM) que contenla 25 mM de NaCl y diferentes concentraciones de ATP durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los barridos de aptameros inmovilizados no acomplejados revelaron una elevada corriente catalltica, consistente con la fuerte atraccion electrostatica de Ru(III)

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con la estructura de ADN del aptamero. La corriente observada se reduce en > 80 % cuando la molecula del neutralizador se hibrida con el aptamero. Sorprendentemente, el pico de reduccion tambien se desplaza hacia potenciales mas negativos. Esto puede deberse a la desaceleracion de la cinetica de transferencia de electrones cuando el neutralizador esta presente. Cuando el analito de ATP se liga a la sonda de aptamero, un cambio estructural del aptamero provoca la liberation del neutralizador, lo que conlleva un aumento de la corriente catalltica. Como se muestra en el grafico de concentration 630 de la FIG. 6C, el cambio observado en la corriente antes de la union de ATP y despues de la union de ATP estaba directamente relacionado con la concentracion de ATP en la solution. Las llneas discontinuas horizontales 632 muestran la senal generada en ausencia del ATP.

Para evaluar la dependencia del tiempo de la respuesta del sensor en ciertas realizaciones, se introdujo el ATP en la solucion catalltica de [Ru(NH3)6]3+/[Fe(CN)6]3" y se midieron cambios de senal a tiempo real. La FIG. 6d muestra un grafico de tiempo 640 ilustrativo, que contiene datos que indican que los cambios de senal en la presencia 642 de ATP se producen dentro de un periodo de 1 min, y el cambio de senal en la ausencia 644 de ATP no es significativo incluso tras 20 min. Estos resultados indican claramente que la respuesta del sensor es rapida, y que el complejo sonda-neutralizador es estable.

La FIG. 7A muestra una realization ilustrativa de un ensayo 700 con cocalna que se llevo a cabo usando una propuesta similar a la descrita anteriormente para el ATP, con unos aptameros 702 que se inmovilizaron sobre unos sensores 704, y especlficos para una molecula de cocalna 712. El grafico de DPV 720 de la FIG. 7B muestra que la elevada corriente inicial del aptamero de union a la cocalna disminuyo tras la hibridacion 722 del neutralizador. En la FIG. 5 se muestran secuencias ilustrativas para el aptamero 702 y el neutralizador 706 utilizados en el ensayo 700 para cocalna. En esta realizacion, el neutralizador 706 presenta una portion 708 que es complementaria al aptamero 702, y dos emparejamientos incorrectos 710 que permiten liberar facilmente el neutralizador 706 al anadir la cocalna 712. Cuando se provoco el complejo de aptamero-neutralizador con la cocalna 712, el cambio estructural resultante del aptamero 702 libero el neutralizador 706 y resulto en una elevada corriente catalltica 724. Para la detection de cocalna en esta realizacion ilustrativa, se incubaron los sensores 704 con una solucion tampon de fosfato (25 mM) que contenla 25 mM de NaCl y diferentes concentraciones de cocalna, durante 2 min a temperatura ambiente. El grafico de concentracion 730 de la FIG. 7C muestra el cambio observado en la corriente (en puntos porcentuales), sobre el eje Y frente a la concentracion de cocalna (en pg/mL) sobre el eje X. Las llneas discontinuas horizontales 732 muestran la senal generada en ausencia de la cocalna. El cambio observado en la corriente antes de la union de la cocalna y tras la union de la cocalna estaba directamente relacionado con la concentracion de cocalna en la solucion. El cambio de senal para 1 pg/mL de cocalna fue > 60 % mayor que en ausencia de la cocalna, o en presencia de un analito no objetivo. Este nivel de sensibilidad es comparable con pruebas comerciales y es suficiente para la deteccion de drogas.

Despues de haber establecido un alto nivel de rendimiento con analitos de moleculas pequenas, se evaluo el rendimiento del ensayo para determinar si proporcionaba una sensibilidad cllnicamente relevante (femtomolar o mejor) contra analitos de acido nucleico, dado que otros intentos de desarrollar sistemas de deteccion universales no han logrado con exito una buena sensibilidad con esta clase de analitos.

La FIG. 8A ilustra una representation esquematica 800 de un ensayo ejemplar aplicado de cara a un acido nucleico objetivo 812. Se inmovilizo una sonda tiolada 802 de ADN sobre el sensor 804. La corriente 822 catalltica de la sonda de ADN 802 no acomplejada fue inicialmente alta, y se suprimio significativamente en 824 tras anadir el neutralizador 806, como se muestra en la grafica de DPV 820 de la FIG. 8B. Tras la exposition a 1 pM de un oligonucleotido complementario objetivo de 20 mer, la corriente 826 aumento en > 300 %. En la FIG. 5 se muestran las secuencias para la sonda de ADN 802, el neutralizador 806 de la sonda de ADN, y el ADN objetivo 812. El neutralizador 806 tiene una porcion 808 que es complementaria a la sonda de ADN 802, y dos emparejamientos incorrectos 810 que permiten liberar facilmente el neutralizador 806 tras anadir el ADN objetivo 812.

En ciertas realizaciones, se estudio la dependencia de la concentracion de un ensayo de acido nucleico usando el ADN objetivo sintetico de 20 mer y un objetivo no complementario, que se uso para evaluar los niveles de fondo y evaluar la especificidad. En la FIG. 5 se muestra una secuencia ilustrativa para el objetivo no complementario. Para este ADN objetivo sintetico, se incubaron los sensores con una solucion tampon de fosfato (25 mM) que contenla 25 mM de NaCl, 10 mM de MgCh, y diferentes concentraciones de objetivo, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para identificar el llmite de deteccion del ensayo ejemplar, la concentracion de ADN objetivo vario entre 10 pM y 10 aM, como se muestra en el grafico de concentracion 830 de la FIG. 8C. La senal aumento con el aumento de concentracion del objetivo, dentro de un intervalo que abarca 5 ordenes de magnitud. La llnea discontinua horizontal 832 indica las corrientes promedio de 100 nM del objetivo no complementario. El cambio de senal para 10 aM de ADN objetivo, aun cuando estaba por encima de los 100 nM del objetivo no complementario, no fue lo suficientemente elevado como para ser estadlsticamente significativo, lo que indica que el llmite de deteccion de este ensayo para un objetivo de 20 mer es de entre 100 y 10 aM.

Tambien se evaluo el rendimiento de ciertas realizaciones del ensayo con muestras heterogeneas complejas en forma de ARN total de E. coli. La sonda de ADN se diseno para la polimerasa de ARN mARN (rpoB), una transcription altamente expresada en bacterias y que no se conserva entre especies. En la FIG. 5 se muestran secuencias ilustrativas para la sonda de ADN y el neutralizador. Como se muestra en el grafico de concentracion

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840 de la FIG. 8D, la senal producida por este ensayo ilustrativo depende de la concentracion de una mezcla heterogenea de ARN total de E. coli, en el que la llnea discontinua horizontal 842 muestra la senal observada en la ausencia del ARN de E. coli. En los casos del ARN total de E. coli, se incubaron unos sensores con PBS esteril y sin RNasa que contenla diferentes concentraciones del objetivo, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectaron con exito 10 pg/pL de ARN total de E. coli, lo que indica que el ensayo ilustrativo puede alcanzar altos niveles de sensibilidad con un exceso de material no complementario.

Tambien se proporcionaron y probaron ciertas realizaciones del ensayo que usan lisados bacterianos no procesados. En la prueba de estas realizaciones, se generaron lisados bacterianos no procesados al introducir suspensiones que contenlan cantidades conocidas de E. coli en una camara de lisis, en la que unos fuertes campos electricos lisaron las bacterias. A continuation, se utilizo este lisado sin purification o amplification adicional. En la FIG. 5 se muestran secuencias ilustrativas utilizadas para la sonda de lisado bacteriano y el neutralizador de lisado bacteriano. El grafico de concentracion 850 de la FIG. 8E ilustra la dependencia de la senal de ensayo a la cantidad de E. coli utilizada para producir los lisados no procesados, y muestra que la senal aumento con el aumento de la concentracion de la bacteria E. coli en las suspensiones iniciales. En estos estudios, se incubaron sensores con lisado de E. coli en PBS esteril y sin ARNasa, durante 30 minutos a temperatura ambiente. La llnea horizontal discontinua 852 de la FIG. 8 representa la senal promedia para un lisado de 150 ufc/pL de Staphylococcus saprophyticus, cuyos componentes eran no complementarios a la sonda. Sorprendentemente, el llmite de detection para la bacteria E. coli fue 0,15 ufc/pL. Este llmite de deteccion de sensibilidad no tiene precedentes en el analisis directo de muestras sin procesar, y es cllnicamente relevante para la deteccion de bacterias halladas en muestras cllnicas. La cinetica del ensayo de estas realizaciones ilustrativas permite detectar rapidamente la presencia de bacterias con una sensibilidad y especificidad elevadas, requiriendo menos de 30 minutos desde la adquisicion de la muestra hasta el resultado.

Se caracterizaron ciertas realizaciones para verificar que el formato de ensayo descrito en el presente documento, en conexion con diversas realizaciones, podrla detectar biomarcadores de protelnas, utilizando trombina como sistema modelo. El aptamero de union a trombina es una secuencia bien caracterizada, conocida porque se pliega para formar una estructura de cuarteto de G y fija la trombina en el exositio 1. En la FIG. 5 se muestran secuencias ilustrativas para el aptamero de union a trombina y el neutralizador del aptamero de trombina. La FIG. 9A muestra un metodo de deteccion 900 de protelnas ilustrativo de acuerdo con ciertas realizaciones. Se deposito un aptamero tiolado 902 de union a trombina sobre una superficie de sensor 904 y, posteriormente, se acomplejo con un neutralizador 906 de aptamero de trombina, que neutraliza al menos parcialmente la carga cerca de la superficie de sensor 904. El neutralizador 906 tiene una portion 908 que es complementaria al aptamero 902 y dos emparejamientos incorrectos 910 que permiten liberar facilmente el neutralizador 906 al anadir la trombina 912. La union de la trombina 912 al aptamero 902 de union a trombina, que forma un complejo de aptamero-trombina 914, desplaza el neutralizador 906 de aptamero de trombina y restaura la carga, lo que resulta en un cambio detectable en la respuesta del sensor.

En la FIG. 9B, grafico de DPV 920 muestra las corrientes electrocatallticas solo del aptamero 922, del complejo aptamero-neutralizador 924, y del complejo aptamero-trombina 926. La corriente electrocatalltica se vio claramente suprimida al unirse el neutralizador al aptamero de trombina. Cuando se trato con 100 pM de trombina, se observo un gran aumento de la corriente catalltica. Por el contrario, el grafico de DPV 930 de la FIG. 9C muestra que el cambio de senal era insignificante cuando se trato con 100 nM de BSA (una protelna no especlfica), lo que indica que el ensayo era especlfico para la trombina. Como se muestra en el grafico de concentracion 940 de la FIG. 9D, la senal observada era directamente proporcional a la concentracion de trombina, y mostro que podia detectarse claramente una cantidad tan baja de trombina de hasta 10 fM. Las lineas discontinuas horizontales 942 muestran la senal generada en ausencia de la trombina.

La FIG. 10 muestra una realization ilustrativa de un ensayo de acido nucleico 1000, en el que el analito desplaza el pseudo-ligando mediante la formation de un complejo con el pseudo-ligando en lugar de con la sonda. En esta realizacion, el neutralizador 1006 tiene una mayor afinidad con el analito 1012 que con la sonda 1002, lo que resulta en la formacion de un complejo 1014 entre el analito 1012 y el neutralizador 1006. En el ensayo 1000, el neutralizador 1006 es especifico para el analito 1012 e incorpora uno o mas emparejamientos incorrectos 1010 de pares de base con la sonda 1002, y una porcion 1008 que es complementaria a la sonda 1002. En esta realizacion, la senal observada despues de que el neutralizador 1006 hibride con la sonda 1002 se incrementa al eliminar el neutralizador 1006 incorrectamente emparejado de la sonda 1002, debido a la hibridacion con un objetivo 1012 perfectamente emparejado que esta en solution. Esto conlleva la restauracion de la carga en la superficie 1004 de deteccion de electrodo en la ausencia de un complejo analito-sonda, en funcion de la elimination del neutralizador 1006 y de la restauracion de la carga de la sonda 1002 que esta fijada a la superficie 1004 de deteccion de electrodo. Debe comprenderse que, aunque esta realizacion se ha descrito en el contexto de la deteccion de acido nucleico, la realizacion no esta limitada a esto, y que puede utilizarse para detectar una amplia variedad de analitos.

Asi, se han descrito realizaciones y aplicaciones especificas de un biosensor sensible, aplicable a una amplia gama de moleculas biologicas. Por lo tanto, el objeto de la invention no estara limitado excepto por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Adicionalmente, al interpretar tanto la memoria descriptiva como las reivindicaciones, todos los terminos deberan interpretarse de la manera mas amplia posible de manera coherente con el contexto. En

particular, los terminos “incluye/n”, “que incluye/n”, “contiene/n”, “que contiene/n”, “tiene”, “tienen”, “que tiene/n”, “comprende/n” y “que comprende/n”, tal como se utilizan en el presente documento, deben interpretarse como una referencia a elementos, componentes o etapas de manera no exclusiva, indicando que los elementos, componentes o etapas referenciados pueden estar presentes, o utilizarse, o combinarse con otros elementos, componentes o 5 etapas a los que no se haga referencia expresa. El termino “pluralidad”, tal como se usa en el presente documento significa mas de uno, y puede incluir cualquier subconjunto definido o indefinido de dos o mas etapas, elementos o componentes. Adicionalmente, cuando una definicion o uso de un termino en una referencia es incompatible o contrario a la definicion de dicho termino incluido en el presente documento, se aplica la definicion de dicho termino proporcionado en el presente documento y no se aplica la definicion de dicho termino en la referencia.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para detectar un analito, que comprende:

poner en contacto una muestra con un primer complejo reversible que comprenda una sonda, fijada en una superficie de sensor, y un pseudo-ligando que tenga una carga opuesta a la de la sonda; y detectar la presencia del analito mediante la deteccion de un segundo complejo, formado por el desplazamiento del pseudo-ligando de la sonda por parte del analito, si esta presente en la muestra, en el que la deteccion

comprende comparar un estado de carga de la sonda, previo al desplazamiento del pseudo-ligando, con un

estado de carga de la sonda despues del desplazamiento del pseudo-ligando.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el primer complejo tiene un primer estado de carga y el segundo

complejo tiene un segundo estado de carga, y en el que la deteccion de la presencia del segundo complejo

comprende determinar una diferencia entre el primer estado de carga y el segundo estado de carga.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el segundo estado de carga tiene una mayor magnitud general que el primer estado de carga.
4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la deteccion de la presencia del segundo complejo comprende medir un cambio en la amplitud de corriente, provocado por la formacion del segundo complejo.
5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que un aumento en la amplitud de la corriente por encima de un umbral predeterminado es indicativo de la presencia del analito.
6. El metodo de las reivindicaciones 4 o 5, en el que la magnitud del cambio en la amplitud de la corriente es indicativa de la concentracion del analito en la muestra.
7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la deteccion comprende medir un cambio en la tension, causado por la formacion del segundo complejo.
8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la afinidad de la sonda con el pseudo-ligando es menor que la afinidad de la sonda con el analito.
9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la afinidad del pseudo-ligando con el analito es mayor que la afinidad de la sonda con el analito.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las estabilidades relativas del primer complejo y el segundo complejo se modifican mediante la manipulacion de la temperatura o la composicion del tampon.
11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el pseudo-ligando comprende un APN.
12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el APN comprende uno o mas grupos funcionales cationicos adjuntos.
13. El metodo de las reivindicaciones 11 o 12, en el que el APN comprende uno o mas emparejamientos incorrectos de pares de bases con una secuencia de acido nucleico de la sonda.
14. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente: (i) formar el segundo complejo entre el pseudo- ligando y el analito o (ii) formar el segundo complejo entre la sonda y el analito.
15. Un sensor para su uso en el metodo de deteccion de un analito de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, comprendiendo el sensor:

una superficie de sensor que comprende una pluralidad de electrodos; una sonda fijada sobre al menos uno de la pluralidad de electrodos; y

un pseudo-ligando que tiene una carga opuesta a la de la sonda, capaz de formar un primer complejo reversible con la sonda, de tal manera que un analito desplace el pseudo-ligando al entrar en contacto con el primer complejo.