ES2206493T3 - Superficies altamente especificas para reacciones biologicas, procedimiento para su preparacion y procedimiento para su utilizacion. - Google Patents

Superficies altamente especificas para reacciones biologicas, procedimiento para su preparacion y procedimiento para su utilizacion.

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ES2206493T3
ES2206493T3 ES95909007T ES95909007T ES2206493T3 ES 2206493 T3 ES2206493 T3 ES 2206493T3 ES 95909007 T ES95909007 T ES 95909007T ES 95909007 T ES95909007 T ES 95909007T ES 2206493 T3 ES2206493 T3 ES 2206493T3
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Aaron Bensimon
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Institut Pasteur de Lille
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE PARTICULARMENTE A UNA SUPERFICIE ALTAMENTE ESPECIFICA PARA REACCIONES BIOLOGICAS, CARACTERIZADA POR QUE LLEVA UN SOPORTE QUE PRESENTA EN SUPERFICIE AL MENOS UNA CAPA ESENCIALMENTE COMPACTA DE UN COMPUESTO ORGANICO QUE PRESENTA, EN EL EXTERIOR DE LA CAPA, UN GRUPO EXPUESTO QUE LLEVA UNA DOBLE ENLACE ETILENICO QUE TIENE UNA AFINIDAD PARA UN TIPO DE MOLECULA CON ACTIVIDAD BIOLOGICA EN CIERTAS CONDICIONES DE REACCION, SIENDO LOS OTROS ELEMENTOS DE LA CAPA ESENCIALMENTE NO ACCESIBLES PARA DICHAS MOLECULAS EN DICHAS CONDICIONES DE REACCION.

Description

Superficies altamente específicas para reacciones biológicas, procedimiento para su preparación y procedimiento para su utilización.
La presente invención se refiere en particular a unas superficies muy altamente específicas utilizables en biología así como a sus aplicaciones y a unos procedimientos para su preparación.
Es conocida desde hace tiempo la especificidad tan elevada y la selectividad tan elevada de determinadas reacciones biológicas, en particular las reacciones antígenos/anticuerpos, las reacciones de hibridación de ADN o de ARN, las reacciones interproteínas o de tipo avidina/estreptavidina/biotina, así como las reacciones de los ligandos y de sus receptores.
En la actualidad se sabe sacar partido de dichas especificidades, en particular para poner de manifiesto la presencia o la ausencia de uno de los elementos del par de reacción en una muestra o bien eventualmente para separar uno de los elementos de un par de un medio más complejo.
Sin embargo, cuando se desea detectar la presencia de una molécula a una concentración muy baja en un medio muy complejo, los procedimientos conocidos actualmente proporcionan a veces unos resultados muy aleatorios, teniendo en cuenta el problema de los ruidos de fondo que intervienen en el momento de las etapas de separación y/o de detección.
Por dicha razón, lo que se denominará en lo sucesivo "pesca molecular", es decir la posibilidad de poder poner de manifiesto cada una de las moléculas que se investigan cuando se encuentran a unas concentraciones muy bajas, no ha sido posible hasta el momento.
A título de ejemplo, el análisis de una muestra de ADN pasa por la utilización de una sonda denominada de "hibridación" correspondiente a la secuencia complementaria de la secuencia investigada. En estas condiciones, el problema planteado es aislar el híbrido del medio y detectar con una buena proporción señal/ruido (S/N) el número eventualmente reducido de reacciones positivas.
Por dicha razón se utiliza actualmente, en la mayoría de los casos, una etapa intermedia destinada a amplificar la secuencia que se quiere detectar, por ejemplo utilizando el método PCR o unos métodos de amplificación que conducen a los mismos resultados, en estas condiciones se aumenta la concentración de la secuencia a determinar en la muestra y dicha detección es evidentemente mucho más cómoda.
Sin embargo, la etapa de amplificación es sensible a los contaminantes y conduce a unos errores que le son propios.
Sería por lo tanto preferible, en la medida de lo posible, poder detectar la presencia de la secuencia de ácido nucleico sin una fase de amplificación.
Se ha propuesto utilizar, de manera que se ponga de manifiesto la reacción de hibridación específica, una etapa intermedia de anclaje del producto de hibridación sobre una superficie sólida que presenta determinadas especificidades. Por ejemplo, es posible utilizar determinadas superficies pretratadas que permiten fijar determinadas proteínas o ADN, haya sido modificado o no.
Dichas superficies se encuentran comercialmente disponibles (Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal por ejemplo) en forma de bolas o de pozos que presentan en su superficie unos grupos COOH, NH_{2} u OH por ejemplo.
Se ha propuesto asimismo, para obtener dichos grupos, utilizar una etapa intermedia que presenta un grupo vinilo que se oxida a continuación para presentar unos grupos COOH u OH (documento USA 4.539.061 y documento EP 435 785).
El documento EP 0 388 940 describe unas partículas magnéticas a base de poliacrilamida o de poliestireno recubiertas por una capa monomolecular que comprende una parte hidrófila (radicales COOH, NH_{2}, OH...) y una parte hidrófoba (olefina tal como vinileno o vinilideno). Estas partículas permiten la absorción de anticuerpos y se utilizan en unos ensayos de inmuno-aglutinación.
Se puede por lo tanto funcionalizar el ADN con un grupo reactivo, amina por ejemplo, y proceder a una reacción con estas superficies. Estos métodos necesitan sin embargo una funcionalización particular del ADN a fijar.
Se ha descrito asimismo una técnica que permite el anclaje sin tratamiento previo del ADN. Dicho procedimiento consiste en hacer reaccionar el fosfato libre del extremo 5' de la molécula con una amina secundaria (superficie NH Covalink).
Se puede asimismo fijar el ADN a un grupo o una proteína P_{0} para hacerla reaccionar con una superficie recubierta por un grupo o una proteína P_{1}, susceptible de reaccionar específicamente con P_{0}. El par P_{0}/P_{1} puede ser un par del tipo biotina/estreptavidina o digoxigenina/anticuerpo dirigido contra la digoxigenina, (anti-DIG) por ejemplo.
Tales superficies son, sin embrago, en la mayoría de los casos insuficientemente específicas (V. Lund et al., Nucl. Acids Res., 16, 1861 (1988)). De este modo, la presencia de interacciones parásitas, incluso débiles, de tipo adsorción no específica conduce a unas adsorciones ineficaces para unas moléculas largas, capaces de establecer con el sólido un gran número de puntos de interacción débil. Dichas superficies conducen a unas aplicaciones potenciales que carecen de sensibilidad y/o con una gran tasa de ruido de fondo en el caso de un pequeño número de moléculas a pescar. Además, algunas de estas superficies muestran una elevada tasa de fluorescencia parásita potencialmente molesta en el momento de la detección.
Por lo que se refiere a la detección propiamente dicha, en particular para la puesta de manifiesto del ADN, la patente francesa 78 10975 describe un procedimiento que une la sonda a un enzima que permite la revelación con la ayuda de un sustrato cromógeno. Es, además, posible cuantificar la reacción mediante una medición de colorimetría.
Una técnica no se adapta como ésta directamente a la detección de trazas, por lo cual, aquí también, debe ser precedida en la mayoría de los casos por una etapa de amplificación de la cantidad de ácido nucleico investigado, por ejemplo mediante el método PCR.
Este procedimiento de detección denominado "por sonda fría" se ha desarrollado para evitar la utilización de marcadores radioactivos que proporcionan unos resultados que en sensibilidad son cercanos pero que evidentemente presentan unos problemas de manipulación, teniendo en cuenta la presencia de productos radioactivos y unos problemas de tiempo de revelado largos si se desea una gran sensibilidad.
Para determinadas aplicaciones particulares, en particular los métodos derivados de la captación de imagen ex-vivo, se ha propuesto un método directo de observación de la reacción acoplando el producto de hibridación a unas microbolas, en particular PMMA, convenientemente tratadas químicamente en su superficie. El método reside en la identificación directa bajo un microscopio de barrido electrónico de la presencia de estas microbolas de un diámetro típico de 60 nm y además reside en las técnicas de anclaje sobre sólidos conocidas pero insuficientemente específicos, tal como se ha descrito anteriormente.
Las técnicas anteriores evidentemente no se limitan a la detección de ácidos nucleicos. Con el mismo espíritu, se ha propuesto por ejemplo la detección de anticuerpos. Se trata de unos ensayos de tipo ELISA que no serán descritos de nuevo y que, para resumir, permiten acoplar la presencia de un anticuerpo a un anclaje asociado de una molécula de antígeno sobre un sólido. De nuevo, se plantean los problemas de especificidad y de reacciones parásitas. La fase de detección puede basarse a continuación en un acoplamiento con una reacción cromógena que presenta sus propios problemas de sensibilidad.
En resumen, los métodos de la técnica anterior o sus combinaciones adolecen de un determinado número de inconvenientes, en particular:
-
o bien son potencialmente peligrosos debido a la utilización de productos radioactivos,
-
o bien necesitan unos tiempos de revelado demasiado largos;
-
o bien son interferidos por unos problemas específicos a nivel de la fase de amplificación,
-
o bien pasan por unas superficies sólidas insuficientemente específicas,
-
o bien son demasiado poco sensibles,
-
o bien, por último, necesitan además de la fase de enganchado sobre un sólido la utilización poco cómoda, evidentemente, de un microscopio electrónico.
Por último, en la mayoría de los casos, los procedimientos conocidos no permiten reconocer sobre una molécula determinada la posición específica del grupo buscado. Ahora bien, este tipo de reconocimiento es importante cuando se quiere realizar una cartografía, en particular en el marco de la cartografía del genoma, se intenta conocer en un primer momento la posición espacial aproximada con respecto a un extremo de la molécula de un gen determinado sobre un ADN o un ARN.
La presente invención que se intenta evitar los inconvenientes de los procedimientos anteriores radica en la utilización de superficies altamente específicas que en el momento de su utilización conducen a unos ruidos de fondo excesivamente limitados, en particular debido a que eliminan las fijaciones parásitas.
Más particularmente, la presente invención se refiere a una superficie altamente específica para unas reacciones biológicas, caracterizada porque comprende un soporte que presenta en la superficie por lo menos una capa esencialmente compacta de un compuesto orgánico que presenta, en el exterior de la capa, un grupo expuesto que muestra un doble enlace etilénico, en particular un grupo vinilo, que presenta una afinidad por un tipo de molécula con actividad biológica en determinadas condiciones de reacción, en particular de pH o de contenidos iónicos, siendo los otros elementos de la capa esencialmente inaccesibles para dichas moléculas en dichas condiciones de reacción.
Por "afinidad", debe entenderse en la presente memoria, tanto una reactividad química como una adsorción de un tipo cualquiera, y ello en las condiciones de fijación de dichas moléculas biológicas.
Por "soporte", se entiende que designa tanto un soporte sólido como un soporte constituido por un elemento no sólido tal como una partícula líquida o gaseosa que presenta, en particular, una capa compacta tal como se ha descrito anteriormente.
La superficie es "esencialmente compacta", es decir que limita el acceso de la molécula con actividad biológica a las capas inferiores y/o al soporte, entendiendo que los defectos de cobertura de la superficie son tolerables.
Estas superficies altamente específicas para reacciones biológicas, comprenden un soporte que presenta en superficie unos grupos de doble enlace, en particular vinilo (-CH=CH_{2}, en lo sucesivo superficies C=C) accesibles en la solución. Son capaces de anclar directamente unas moléculas de interés biológico (ADN, ARN, PNA, proteínas, lípidos, sacáridos) en determinadas condiciones de pH o de contenido iónico del medio. En particular, dichas superficies no necesitan ninguna modificación química particular ni de la superficie, ni de las moléculas biológicas a anclar. No existen documentos que mencionen tal utilización de la superficie en grupos vinilo.
Por "anclaje", hay que entender en la presente memoria una fijación mediante un enlace covalente resultante de una reactividad química, o un enlace no covalente resultante de interacciones fisicoquímicas tales como una adsorción de cualquier tipo, y ello en las condiciones de pH o de contenido iónico del medio de fijación de dichas moléculas biológicas.
Las superficies según la presente invención pueden ser obtenidas mediante la utilización de diversos procedimientos. Se pueden mencionar a título de ejemplo:
(A)
una capa de polímero carbonado, eventualmente ramificado, de por lo menos 1 mm de espesor, que comprende:
\bullet
unos grupos que presentan un doble enlace etilénico,
\bullet
estando el resto de la capa constituido por grupos hidro- o fluorocarbonados;
(B)
unas superficies obtenidas mediante el depósito o anclaje sobre un sólido de una o diversas capas moleculares, estas capas pueden ser obtenidas mediante la formación de capas sucesivas fijadas mediante enlaces no covalentes, del tipo película de Langmuir-Blodget, o mediante autoensamblaje molecular, permitiendo la formación de una capa fijada mediante un enlace covalente.
En el primer caso, la superficie puede ser obtenida mediante la polimerización de por lo menos un monómero que genera en la superficie del polímero dicho grupo que presenta un doble enlace etilénico, o bien mediante la despolimerización parcial de la superficie de un polímero para generar dicho grupo, o bien mediante el depósito de polímero.
En este procedimiento, el polímero formado presenta unos enlaces vinilos tal como un derivado poliénico, en particular unas superficies de tipo caucho sintético, tal como polibutadieno, el poliisopreno o el caucho natural.
En el segundo caso, la superficie altamente específica para reacciones biológicas según la presente invención comprende:
-
sobre un soporte, una capa sensiblemente monomolecular y compacta de un compuesto orgánico de estructura alargada que presenta por lo menos:
\bullet
un grupo de fijación que presenta una afinidad por el soporte, y
\bullet
un grupo expuesto que presenta un doble enlace etilénico, que no muestra o muestra poca afinidad por dicho soporte y por dicho grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que muestra una afinidad por un tipo de molécula biológica.
Con el fin de obtener una capa esencialmente compacta, los diferentes compuestos orgánicos son, preferentemente, susceptibles de reaccionar entre ellos fuera del grupo expuesto para crear unos enlaces transversales, se obtiene de este modo una capa monomolecular "esencialmente" compacta gracias a la cual el soporte no se vuelve o se vuelve poco accesible para las reacciones parásitas.
Preferentemente, el compuesto orgánico presenta un grupo de fijación en un extremo y un grupo expuesto en el otro extremo. Evidentemente, es posible prever unos modos de realización diferentes en los cuales, por ejemplo, el grupo de fijación estaría situado en medio de la molécula, disponiendo éste en cada uno de sus extremos de un grupo expuesto.
Las superficies se puede analizar según:
a)
el soporte,
b)
la molécula que presenta un grupo expuesto y un grupo de fijación sobre el soporte,
c)
la interacción entre el soporte y dicha molécula que asegura la fijación.
La fijación puede ser en primer lugar de tipo no covalente, en particular de tipo hidrófilo/hidrófilo y hidrófobo/hidrófobo, como en las películas de Langmuir-Blodgtet (K.B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935) y el documento US 5.102.798.)
En este caso, el grupo de fijación será, o bien hidrófilo, o bien hidrófobo, en particular unos grupos alquilos o halogenoalquilos tales como CH_{3}, CF_{3}, CHF_{3}, CH_{2}F.
La fijación puede asimismo ser de tipo covalente, el grupo de fijación reaccionará entonces químicamente sobre el soporte.
Determinadas superficies de estructura similar se han mencionado con anterioridad en el campo electrónico, en particular cuando las fijaciones son covalentes, L. Netzer y J. Sagiv. J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) y el documento US-A- 4 539 061.
El experto en la materia dispone de una gama muy amplia de grupos. A título de ejemplo no limitativo se mencionarán los grupos de tipo alcóxido de metal, tal como silano, cloruro de silano, etoxisilano, metoxisilano.
El grupo de fijación se selecciona evidentemente en función del soporte empleado. EL soporte según la invención puede estar constituido por lo menos en la superficie, por un polímero, un metal, un óxido de metal, un elemento semiconductor o un óxido de un elemento semiconductor tal como un óxido de silicio o una de sus combinaciones. Se menciona en particular, el vidrio y el sílice oxidado en superficie.
De entre los grupos de fijación hay que mencionar más particularmente los grupos de tipo alcóxido de metal tal como silano, clorosilano, clorosilano, silanol, metoxisilano, etoxisilano, silazano, fosfato, hidroxi, hidracida, hidracina, amina, amida, diazonio, piridina, sulfato, sulfónico, carboxílico, borónico, halógeno, halogenuro de ácido, aldehído.
Más particularmente, como grupo de fijación se preferirá utilizar unos grupos susceptibles de reaccionar transversalmente con un grupo equivalente, vecino, para proporcionar los enlaces transversales, se tratará por ejemplo de derivados de tipo silano, en particular diclorosilano, triclorosilano, dimetoxisilano, trimetoxisilano, dietoxisilano y trietoxisilano.
Estos enlaces transversales se pueden asimismo llevar a cabo en un punto cualquiera en el espesor de la monocapa polimerizándola con la ayuda de grupos reactivos eventualmente presentes sobre la cadena entre el sitio de fijación y el grupo expuesto. De este modo, los grupos diacetilénicos son conocidos para permitir una polimerización uni- o bidimensional de la monocapa.
La selección del grupo de fijación dependerá evidentemente de la naturaleza del soporte, los grupos de tipo silano se adaptan bien para la fijación covalente sobre el vidrio y el sílice.
Preferentemente, las cadenas que unen el grupo expuesto al grupo de fijación son unas cadenas que presentan por lo menos 1 átomo de carbono , preferentemente más de 6 y en general de 3 a 30 átomos de carbono. Cuando se produce la formación de un acoplamiento lateral en el interior mismo de la capa, aunque dicho acoplamiento sea iónico, de coordinación o covalente, se obtienen unas capas altamente ordenadas obtenidas por autoensambaje, incluso si la superficie inicial sólo presenta un número reducido de lugares de anclaje activos comparado con el número de moléculas obtenidas en una monocapa compacta.
Se puede utilizar ventajosamente, en el caso del vidrio o del sílice, las técnicas conocidas de funcionalización de superficie que utilizan unos derivados silanos, por ejemplo; Si-OH + Cl_{3}-Si-R-CH=CH_{2} proporciona Si-O-Si-R-CH=CH_{2}, siendo R por ejemplo (CH_{2})_{4}. Tal reacción es conocida en la literatura, con la utilización de solventes ultra puros. La reacción conduce a una serie de moléculas que presentan su extremo C=C en la superficie expuesta al exterior.
En el marco de la obtención de superficie de muy alta especificidad , la presente invención se refiere asimismo para tales reacciones de implantación de molécula de doble enlace C=C a la utilización de una fase gaseosa, que permita evitar la utilización de un solvente.
En el caso del oro, encontrándose éste eventualmente en forma de una capa fina sobre un sustrato, las técnicas conocidas de funcionalización de superficie utilizan unos derivados tioles, por ejemplo: Au + HS-R-CH=CH_{2} proporciona Au-S-R-CH=CH_{2}, siendo R por ejemplo (CH_{2})_{4}. Tal reacción se describe en un medio líquido y conduce, al igual que la reacción anterior triclorosilano-sílice, a una serie de moléculas que presentan su extremo C=C en la superficie expuesta al exterior.
Por supuesto, el término "soporte" engloba tanto una superficie única tal como una lámina, como también unas partículas ya se traten de polvo de sílice o de bolas de polímero, y asimismo cualesquiera formas tales como una barra, una fibra o un soporte estructurado, las cuales pueden por otra parte convertirse en magnéticas, fluorescentes o coloreadas, tal como es conocido en diferentes técnicas de dosificación.
Preferentemente, el soporte se seleccionará por no ser fluorescente o poco fluorescente cuando la detección se realice por fluorescencia.
Las superficies obtenidas según los modos (A) o (B) anteriores presentan una gran especificidad gracias a la presencia de sitios reactivos específicos procedentes, o bien de grupos expuestos, o bien de la molécula fijada.
Además, las superficies obtenidas según los modos (A) o (B) presentan las características inesperadas y destacables siguientes:
(i)
un anclaje específico de fuerte pH que depende del ADN por sus extremos sin necesidad de una funcionalización particular de la molécula, acompañado de una tasa muy débil de interacciones no específicas;
(ii)
la posibilidad de anclar en ellas unas proteínas y otras moléculas de interés biológico, sin modificación química particular,
(iii)
la posibilidad de preparar unas superficies específicas con respecto a un antígeno (por ejemplo digoxigenina) o a un ligando (por ejemplo biotina);
(iv)
una tasa de fluorescencia intrínseca muy baja, cuando se requiere, un ruido de fondo de fluorescencia (de un área típica de 100 x 100 \mum) más débil que la señal de fluorescencia de una sola molécula a detectar;
(v)
la posibilidad de detectar unas moléculas aisladas con una proporción S/N independiente del número de moléculas, que es posible gracias a diferentes técnicas con una gran proporción S/N descritas más adelante y basadas en la identificación de la presencia de un marcador macroscópico que presenta una débil interacción no específica con la superficie.
Las superficies obtenidas de este modo están, preferentemente, revestidas de una molécula con actividad biológica seleccionada de entre:
-
las proteínas,
-
los ácidos nucleicos,
-
los lípidos,
-
los polisacáridos y sus derivados.
De entre las proteínas, hay que mencionar los antígenos y los anticuerpos, los ligandos, los receptores, pero asimismo unos productos de tipo avidina o estreptavidina así como los derivados de estos compuestos.
De entre los ARN y los ADN, hay que mencionar igualmente los derivados \alpha, \beta así como los derivados tio y los compuestos mixtos tales como las PNA.
Se pueden asimismo fijar unos compuestos mixtos tales como los glicopéptidos y los lipopolisacáridos por ejemplo, o bien otros elementos tales como los virus, las células en particular, o los compuestos químicos tales como la biotina.
La fijación de las moléculas biológicas puede ser covalente o no covalente, por ejemplo, por adsorción, enlaces hidrogenados, interacciones hidrófobas, iónicas, por ejemplo, en cuyo caso se podrá proceder ventajosamente a un puente ("cross-linking") entre las moléculas implantadas mediante los métodos conocidos ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) y ello con el fin de reforzar su cohesión.
Con un grupo expuesto que presenta un radical -CH=CH_{2} que se denominará en lo sucesivo "superficie C=C" o "superficie con unión etilénica", es posible un anclaje directo, en particular del ADN o de las proteínas. En el marco de la presente invención, se ha demostrado que estas superficies presentan una reactividad fuerte pH dependiente. Esta particularidad permite anclar los ácidos nucleicos o las proteínas, en particular por su(s) extremo(s), utilizando una zona de pH determinada y frecuentemente a una velocidad de reacción que puede ser controlada por el pH.
De este modo, para el ADN a un pH de 5,5, la reacción de anclaje es total en una hora (si no se limita por la difusión) y se produce por los extremos. A un pH 8, por el contrario, el anclaje es muy débil (velocidad de reacción de 5 a 6 órdenes de magnitud más débil). Este efecto de anclaje pH dependiente y específico de los extremos, presenta una mejora en relación con las otras superficies que necesitan una funcionalización del ADN (biotina, DIG, NHS, ...) o de los reactivos específicos (carbodiimida, pimelidato de dimetilo) que realizan un enlace peptídico o fosforimido entre NH_{2} y -COOH o -POOH.
Las superficies según la invención pueden anclar unas proteínas directamente (proteína A, anti-DIG, anticuerpos, estreptavidina, etc...). Se ha observado que (i) la actividad de la molécula se puede preservar y (ii) que la reactividad de la superficie preparada (inicialmente C=C) se oculta totalmente para dar lugar a la reactividad única de la molécula de interés. Es posible por lo tanto, a partir de una reactividad inicial relativamente elevada, pasar a una superficie que presenta una reactividad muy altamente específica, por ejemplo la de los sitios específicos sobre una proteína.
Anclando un anticuerpo específico sobre la superficie (por ejemplo anti-DIG), se crea una superficie cuya reactividad se limita al antígeno (por ejemplo el grupo DIG). Todo ello indica que los grupos químicos iniciales están todos ocultado por los anticuerpos anclados.
Se puede asimismo anclar sobre las superficies reactivas (químicamente o bioquímicamente) otras moléculas con actividad biológica, virus u otros componentes: membranas, receptores de membranas, polisacáridos, PNA, en particular.
Asimismo es posible fijar el producto de una reacción de interés biológico (por ejemplo PCR) sobre las superficies preparadas.
La presente invención se refiere asimismo a las superficies obtenidas mediante la utilización de los procedimientos según la presente invención y a todos los procedimientos que utilizan este tipo de superficie, aunque se trate de procedimientos que permiten la puesta de manifiesto y/o la cuantificación de moléculas biológicas, pero asimismo la separación de determinadas moléculas biológicas, en particular una extracción mediante la utilización de las técnicas de acoplamiento antígeno/anticuerpo y/o ADN, ADN/ARN.
La presente invención se refiere asimismo a unos procedimientos de preparación de las superficies altamente específicas para reacciones biológicas tales como las descritas anteriormente para la obtención de las capas según (A) y (B) y, en particular, el procedimiento caracterizado porque:
-
se fija sobre un soporte una capa sensiblemente monomolecular y compacta de un compuesto orgánico de estructura alargada que presenta por lo menos.
\bullet
un grupo de fijación que muestra una afinidad por el soporte, y
\bullet
un grupo expuesto que presenta un doble enlace etilénico, que no muestra o muestra poca afinidad por dicho soporte y el grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que muestra una afinidad por un tipo de molécula biológica.
La presente invención se refiere asimismo a las aplicaciones de las superficies tratadas para la detección de moléculas aisladas con la ayuda de reactivos específicos y de métodos de detección con proporción S/N independiente del número de moléculas detectadas.
De este modo, de forma general, la presente invención se refiere a un procedimiento de puesta de manifiesto y/o de dosificación de una molécula con actividad biológica en una muestra, caracterizado porque se utiliza una superficie tal como la descrita anteriormente, sobre la cual se encuentra fijada una molécula con actividad biológica capaz de reconocer la molécula de la muestra, y porque la puesta de manifiesto o la dosificación se llevan a cabo gracias a un reactivo fluorescente o no que detecta la presencia de la molécula fijada.
De entre los reactivos se distinguen los reactivos fluorescentes y los reactivos no fluorescentes.
Los reactivos fluorescentes contienen unas moléculas fluorescentes, seleccionadas ventajosamente por ser unas moléculas largas de un tamaño superior a 0,1 \mum y que reaccionan de forma específica directamente o indirectamente con las superficies pretratadas. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, una molécula de ADN de doble hebra teñida con la ayuda de unas sondas fluorescentes (bromuro de etidio, YOYO, nucleótidos fluorescentes, etc...) que pueden anclarse directamente sobre una superficie C=C, o mediante una modificación de la molécula (DIG, biotina, etc...) sobre una superficie que presenta unas proteínas complementarias (anti-DIG, estreptavidina, etc...).
Los reactivos no fluorescentes consisten, en particular, en unas bolas ancladas por medio de una molécula fijada de forma específica directamente o indirectamente a una superficie pretratada. Gracias al tratamiento de las superficies, estas bolas presentan una interacción no específica débil con la superficie. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, unas bolas Dynal recubiertas de estreptavidina y ancladas por medio de un ADN biotinilado a una superficie según la presente invención, que presentan unos sitios capaces de reaccionar con el otro extremo de la molécula de ADN.
Según si la molécula investigada se detecta directamente mediante fluorescencia o indirectamente con la ayuda de los reactivos anteriores, se hablará de "detección directa" o "mediante bandera".
Con el fin de limitar los problemas asociados a unos tiempos de reacción prohibitivamente lentos, se pueden reducir ventajosamente los tiempos de difusión de los reactivos hacia la superficie utilizando pequeños volúmenes de reacción. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, conduciendo la reacción a un volumen de algunos microlitros determinado por la separación entre dos superficies de las cuales una es tratada para presentar unos sitios reactivos según la presente invención y la otra es inerte o es tratada para no presentar sitios reactivos.
La detección del número de reacciones específicas que se han producido se puede llevar a cabo sobre un pequeño número de moléculas (típicamente 1 a 1000), mediante un ensayo físico macroscópico de ruido débil que no necesita ni microscopio electrónico ni radiactividad ni necesariamente PCR.
Los procedimientos de detección son susceptibles de ser utilizados por unas personas que posean una experiencia de laboratorio reducida.
Según el reactivo, se pueden emplear dos aplicaciones de la presente invención (modo X y modo Y) para la detección macroscópica de ruido débil de un pequeño número de reacciones de anclaje del reactivo.
En la utilización denominada del modo X de la presente invención, se obtiene directamente un ensayo del número de reacciones específicas producidas mediante una técnica de fluorescencia, que permite identificar para determinadas formas de realización de la presente invención individualmente el número de sitios que han reaccionado. En este caso, la superficie altamente específica se toma ventajosamente para presentar una tasa muy débil de fluorescencia, en particular el soporte debe presentar una fluorescencia débil.
Después del anclaje del reactivo fluorescente, la detección y el recuento del número eventualmente pequeño de reacciones de anclaje puede llevarse a cabo ventajosamente con la ayuda de un microscopio óptico de fluorescencia que utiliza un objetivo de gran apertura numérica, que permite localizar o bien directamente a simple vista, o bien después de la adquisición de la señal, el número de moléculas fluorescentes ancladas.
Se puede proceder ventajosamente a un barrido del campo de observación para explorar una superficie mayor que el campo fijo solo.
En la utilización denominada de modo Y de la presente invención, se detecta un reactivo macroscópico de tipo bola (fluorescente, magnética, coloreada, por ejemplo).
Tal técnica se deriva de Manning et al. en el sentido de que la reacción se ha revelado por la presencia o la ausencia de microbolas. En un modo de realización un nuevo procedimiento comprende:
(i)
la utilización de bolas de reactividad específica,
(ii)
la utilización de bolas de tamaño no nanoscópicos sino que se sitúa en la gama de 0,1 \mum a 200 \mum, visibles mediante una técnica macroscópica, y
(iii)
la ausencia de reacción no específica entre bolas y superficie debida a la utilización del producto según la presente invención.
El número de estas bolas macroscópicas que caracterizan cada una una reacción de anclaje se determina a continuación mediante un método físico macroscópico en el rango de las cuales, pero sin limitarse a ello, se puede mencionar la difusión de la luz sobre las bolas, la microscopia óptica y la fluorescencia de las bolas.
La especificidad de determinadas reacciones biológicas puede ser limitada. De este modo, en el marco de la hibridación, los híbridos pueden ser imperfectos (reacciones con otros sitios) presentando al mismo tiempo un número reducido de apareamiento y por lo tanto una calidad de enlace menor. La presente invención cubre asimismo la posible utilización de una etapa de ensayo de la calidad de los enlaces obtenidos. Este ensayo permite disociar los productos apareados de forma no específica débil, por adsorción, fuerzas hidrófobas, enlaces hidrogenados imperfectos, hibridación imperfecta, en particular.
Por esta razón, la invención se refiere asimismo a un procedimiento de puesta de manifiesto o de dosificación tal como se ha descrito anteriormente, un procedimiento en el cual se somete el producto de la reacción entre la molécula con actividad biológica y la molécula de la muestra a una tensión con el fin de destruir los malos apareamientos antes de la detección.
Este procedimiento ofrece, además de la posibilidad de destruir los pares desapareados, la posibilidad de orientar los productos del acoplamiento, lo cual facilita las mediciones o las observaciones.
Se puede asimismo aplicar a las superficies, después de la fijación de los elementos complementarios, una tensión que puede estar constituida por la utilización simple o combinada de:
-
centrifugación,
-
gradiente de campo magnético aplicado a los reactivos no fluorescentes considerados para incluir unas microbolas magnetizables o magnéticas,
-
agitación,
-
derrame líquido,
-
paso de menisco,
-
electroforesis,
-
variación de temperatura, y/o gradiente de temperatura.
Se determina entonces mediante las técnicas de detección de ruido débil descritas a continuación el número de sistemas que quedan íntegros o que están destruidos.
Conviene destacar que gracias a las superficies según la presente invención, es posible orientar las moléculas después de su fijación por lo menos en un punto mediante el paso del menisco aire/agua, en particular sobre el ADN. De este modo, debe observarse que el paso del menisco aire/agua sobre el ADN en solución y anclado en la superficie, resultaba en una extensión regular de las moléculas ancladas. Se presentan por lo tanto al aire libre en forma de bastoncillos fluorescentes alargados. Estas moléculas alargadas son estables al aire libre y pueden ser observadas incluso después de diversas semanas, sin presentar una degradación aparente.
Estas observaciones destacables e inesperadas sugieren una posibilidad de contar el número de moléculas de ADN ancladas a la superficie: por una parte, al ser las superficies poco fluorescentes, la relación señal/ruido (S/N) es buena, por otra parte, al buscar un objeto muy correlacionado (forma de bastoncillos), es muy fácil aumentar la relación S/N. Es decir, ignorar el polvo, las inhomogeidades, que no presentan una correlación espacial particular. Hay que citar que en solución, las moléculas en pelota fluctúan térmicamente, lo cual implica unas variaciones muy importantes de su señal de fluorescencia recogida, en general, con una débil profundidad de campo y limita su observación. La presente invención cubre asimismo esta técnica de alineación y de inmovilización que permite por lo tanto la observación de moléculas aisladas con una gran relación S/N.
Es destacable que esta relación es independiente del número de reacciones de anclaje. La relación S/N propuesta por la detección de una molécula es la misma que para 10.000. Además, esta técnica de estirado permite discriminar holgadamente entre unas moléculas de longitudes variadas.
Se puede proceder ventajosamente a las etapas siguientes para mejorar aún la relación S/N:
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Al estar la molécula inmóvil, se puede integrar su señal de fluorescencia.
-
La observación al microscopio presenta un campo reducido (típicamente 100 \mum x 100 \mum con un objetivo de x 100 de inmersión, N.A. = 1,25). Para una muestra de 1 cm^{2} se puede o bien proceder a un barrido, o bien se puede prever la utilización de objetivos de aumentos menores (x 10 o x 20) pero con una apertura numérica elevada.
-
Al ser los bastoncillos siempre paralelos, se puede prever un método de filtrado espacial óptico para aumentar más la relación S/N.
-
Se pueden prever otros métodos de fluorescencia global (documento EP nº 103426).
-
La alineación de las moléculas se observa tanto en el marco de una implantación química (C=C) como en el caso de enlaces de tipo inmunológico (DIG/anti DIG).
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Una vez la superficie está al aire libre, las moléculas de ADN son estables (permanecen íntegras, incluso después de varias semanas) y siguen fluorescentes. Se puede utilizar ventajosamente esta propiedad para diferenciar la etapa de anclaje de la etapa de localización/recuento de las moléculas ancladas, si dicha detección se hace por ejemplo, pero sin limitarse a ello, por microscopia de fluorescencia. Tal utilización está cubierta por la presente invención.
-
Una técnica de doble (o multi) fluorescencia puede servir eventualmente para mejorar la relación S/N o para detectar una doble o multi funcionalidad.
-
Es posible extender el menisco aire/agua utilizado en la presente invención con el fin de estirar la molécula a otros sistemas tales como aceite/agua o agua/surfactante/aire, en particular.
Se puede asimismo utilizar una orientación dinámica de las moléculas en solución ancladas en un extremo, por electroforesis o flujo en una o diversas direcciones sucesivas, pudiendo esta técnica de este modo conducir a una detección sincrónica de la presencia de moléculas en una dirección determinada, mediante el análisis de las variaciones temporales de la señal de fluorescencia correspondiente a una dirección determinada (por ejemplo, pero sin limitarse a ello, mediante la utilización de un filtro espacial óptico convenientemente dispuesto, que permite obtener una señal preferente para determinadas orientaciones de las moléculas observadas.)
Sin embargo, los resultados observados muestran que dicha técnica, en su versión más simple (estiramiento en una sola dirección, sin detección sincrónica) es mucho más rentable que la utilización del menisco.
Las superficies y/o los reactivos y/o las técnicas de detección descritos en la presente invención se pueden utilizar para numerosas aplicaciones de entre las que, pero sin limitarse a ellas:
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La identificación de uno o diversos elementos de secuenciación del ADN o del ARN que se puede utilizar ventajosamente para el diagnóstico de patógenos o la cartografía genética;
-
la medición del tamaño de fragmentos de ADN que se pueden utilizar ventajosamente para la cartografía genética;
-
la mejora de la sensibilidad de las técnicas ELISA con la posibilidad de detectar un número bajo (eventualmente inferior a 1.000) de reacciones inmunológicas.
La identificación de secuencias de ADN/ARN se puede realizar en primer lugar mediante la reacción en el volumen de la solución de moléculas de ADN/ARN con unas sondas complementarias (por ejemplo por hibridación o con la ayuda de proteínas específicas del segmento buscado). Por lo tanto son posibles dos formas de realización.
Las descripciones que siguen a continuación se realizarán, en determinados casos, refiriéndose a las figuras adjuntas en las cuales:
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la figura 1 esquematiza la detección de un patógeno en una molécula de ADN fluorescente mediante la hibridación con una molécula ancla;
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la figura 2 esquematiza la cartografía genética por extensión del ADN y la utilización de un ADN marcador;
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la figura 3 esquematiza la detección de una reacción inmunológica (ELISA) con la ayuda de una molécula "bandera": un ADN fluorescente utilizado como marcador de la reacción;
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la figura 4 es una microfotografía de fluorescencia que muestra la extensión de ADN de fago \lambda mediante el avance del menisco, a la izquierda se perciben unas moléculas de ADN en solución estiradas mediante el flujo de evaporación paralelo al menisco, a la derecha unas moléculas de ADN al aire libre después de su estirado perpendicularmente al menisco;
-
las figuras 5 (a) y 5 (b) son unas microfotografías de fluorescencia que muestran, respectivamente, un ADN marcado con la digoxigenina (DIG) sobre una superficie recubierta de anti-DIG y estirada por el menisco, y, en control, un ADN no marcado sobre una superficie anti-DIG, se resaltará la especificidad tan grande de las superficies y la ausencia de anclaje no específico;
-
la figura 6 es una microfotografía de fluorescencia que muestra una superficie comercial clásica tal como NUNC, se observarán las grandes inhomogeneidades de fluorescencia que convierten dichas superficies en imposibles de utilizar para la detección fluorescente de una sola molécula.
En el modo "diagnóstico", las sondas (los "anclajes") presentan un grupo reactivo (DIG, biotina, etc...) capaz de anclarse de forma específica en una superficie según la presente invención (presentando por ejemplo como sitio de anclaje un anticuerpo anti-DIG o la estreptavidina). La detección de la reacción de anclaje se puede realizar directamente mediante la detección de la fluorescencia de la molécula de ADN teñida por unas moléculas fluorescentes (bromuro de etidio, YOYO, nucleótidos fluorescentes) (figura 1). Se puede asimismo realizar indirectamente mediante la detección de una "molécula bandera": un reactivo según la presente invención capaz de fijarse sobre la molécula de ADN/ARN (por ejemplo por hibridación, interacción proteína-ADN, etc...), pero que no muestra afinidad por los sitios de anclaje de la sonda.
En el modo "cartografía", las sondas complementarias se pueden acoplar directamente a un reactivo fluorescente según la presente invención. Se puede tratar por ejemplo de una hebra simple de ADN complementaria que presenta unas bases modificadas para ser fluorescentes o de una doble hebra larga de ADN teñida con un fluoróforo A y que se termina en un segmento de hebra simple complementario de la secuencia buscada. Para unas sondas diferentes, se puede utilizar unos fluoróforos diferentes. Se puede asimismo, ventajosamente, teñir la molécula de ADN sobre la que se van a hibridar las sondas con fluoróforo de otro color. El híbrido ADN-sondas se ancla en uno de sus extremos y se estira mediante uno de los métodos descritos anteriormente. La distancia del punto de anclaje a los puntos de hibridación, o entre los puntos de hibridación, se determina mediante la detección de la fluorescencia de la sonda, según los métodos descritos anteriormente (figura 2).
Por ejemplo, sin limitarse a ello, un ADN marcador, de aproximadamente 3.000 pares de bases y que presenta en una de sus extremos un segmento de hebra simple complementario del gen buscado, se tiñe con un fluoroforo A (por ejemplo YOYO 1). Este ADN se híbrida y posteriormente se liga con el ADN de hebra simple a cartografiar, después este último se tiñe con un segundo fluoroforo B (POPO 1) (después de la reacción por "random primming", para transformarlo en un ADN de doble hebra). La molécula se ancla por lo tanto por uno de sus extremos (por ejemplo por enlace DIG/anti DIG) y se estira mediante la acción del menisco. La distancia entre el extremo de la molécula y la posición del gen marcado, observable al microscopio por doble fluorescencia (2 colores A y B) permite establecer la posición de un gen buscado con una precisión del orden de 1.000 pares de bases (0,3 \mum).
La identificación de secuencias de ADN/ARN se puede realizar asimismo por la reacción entre la secuencia investigada y los sitios reactivos de una superficie según la presente invención (por ejemplo unos oliginucleótidos complementarios o el sitio de reacción de una proteína específica del segmento investigado). La detección de la reacción de anclaje se puede realizar entonces directamente o indirectamente (con la ayuda de una "molécula bandera") tal como se ha descrito anteriormente.
Se entiende que la identificación de las secuencias de ADN/ARN según la presente invención puede servir tanto para unos fines de diagnóstico (por ejemplo la detección de la presencia o la ausencia de un patógeno viral o cromosómico) como para unos fines de cartografía genética. Puede estar precedida de una etapa de amplificación mediante un método cualquiera, en particular PCR.
Por otra parte, tal como ha mencionado K.R. Allan et al. (documento US 84 114), la cartografía genética se puede llevar a cabo mediante la medición del tamaño de los fragmentos de ADN. Ahora bien el acoplamiento entre las superficies según la presente invención y las técnicas originales de estirado de las moléculas descritas anteriormente (en particular y ventajosamente el estirado por el menisco) permite una medición de la longitud de las moléculas estiradas y ello sobre una muestra muy pequeña (algunos miles de moléculas).
Se puede, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, proceder de la siguiente forma:
Se fragmenta una muestra de ADN (con la ayuda de enzimas de restricción), se tiñe con un fluoróforo y posteriormente se ancla sobre una superficie que presenta unos grupos reactivos (por ejemplo las superficies C=C). Las moléculas se estiran a continuación por el menisco y se determina el tamaño de los fragmentos estirados por microscopia óptica de fluorescencia con una resolución y un tamaño límite del orden de 1000 bp (0,3 \mum).
Las superficies según la presente invención se pueden utilizar para la aplicación de los procedimientos conocidos que permiten la puesta de manifiesto y/o la cuantificación de un antígeno o de un anticuerpo, en particular los métodos ELISA que utilizan unos sistemas enzimáticos o unos métodos de tipo RIA que utilizan unos marcadores radioactivos. Se trata de tecnologías que no serán descritas de nuevo en detalle.
Se puede asimismo y ventajosamente utilizar las superficies según la presente invención como un soporte de reacciones inmunológicas de un procedimiento ELISA que presenta una etapa de anclaje de un reactivo según la presente invención ("bandera") sobre uno de los reactivos ELISA (figura 3). La detección puede realizarse naturalmente de forma global mediante la medición de fluorescencia. Es posible asimismo proceder al recuento del número de reacciones, lo cual puede realizarse ventajosamente siguiendo los métodos de detección descritos en la presente invención, en particular la extensión del menisco, y ello gracias a la débil tasa de fluorescencia y de interacción no específica del producto de la presente invención. Ello permite la detección de un número pequeño de reacción, eventualmente inferior a 1.000) con una excelente relación S/N.
Se puede por lo tanto, mediante una modificación menor de los métodos ELISA en sándwich (anticuerpo-antígeno-anticuerpo modificado, por ejemplo biotinilado), implantar sobre la superficie un reactivo según la presente invención, por ejemplo ADN fluorescente anclado a la estreptavidina.
Todas las variantes de la técnica ELISA se aplican con una sensibilidad mucho mejor. Unas técnicas de medición de fluorescencia global se han utilizado con anterioridad para determinar la calidad de las reacciones ELISA. Sin embargo, el procedimiento según la invención permite una detección mucho mejor porque es sensible a la señal de fluorescencia de una sola molécula.
Evidentemente, es posible utilizar estas superficies como unas superficies de fijación de por lo menos un producto de una reacción de interés biológico, a título de ejemplo sin limitarse a él, unos productos de la reacción de amplificación, ya sea PCR u otro método parecido y, por último, es posible utilizar este tipo de superficies como soporte para una cromatografía de afinidad, ya sea preparativa o bien de detección.
En tal caso, se puede por ejemplo implantar una población de oligonucleótidos sobre unas bolas de sílice que constituirán la fase estacionaria de una columna de cromatografía.
La etapa de cromatografía debe permitir una especificidad particular de la columna con respecto a los eluyentes, por ejemplo una mezcla de ADN de los cuales algunos presentan unas secuencias complementarias o muy próximas al oligonucleótido implantado.
La presente invención se refiere por último a la utilización de las superficies según la presente invención en unos estuches de diagnóstico o de separación.
Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la lectura de los ejemplos siguientes.
Materiales y métodos
El ADN-\lambda y el anticuerpo monoclonal (anti-DIG) proceden de Boehringer-Mannheim. Los triclorosilanos proceden de Roth-Sochiel. Las sondas nucleicas fluorescentes (YOYO1, YOYO3 y POPO1) proceden de Molecular Probes. Las láminas de vidrio ultralimpias proceden de Erie Scientific (Laminas (ESCO). Las partículas magnéticas proceden de Dynal. El microscopio es un microscopio invertido Diaphot de NIKKON, equipado con una lámpara Xenon para la epifluorescencia y con una cámara CCD intensificada Hamamatsu para la visualización.
Tratamiento de superficie
Unas láminas de vidrio se limpian durante una hora por irradiación UV bajo una atmósfera de oxígeno (por formación de ozono). A continuación se depositan inmediatamente en un desecador previamente purgado de trazas de agua por una corriente de argón. Un volumen de aproximadamente 100 a 500 \mul del triclorosilano adecuado (H_{2}C=CH-(CH_{2})_{N}-SiCl_{3}) se introduce en el desecador, del que se retiran las superficies después de aproximadamente 12 horas (n = 6) ó 1 hora (n = 1). Al salir, las superficies están limpias y no húmedas.
Las láminas así funcionalizadas pueden reaccionar con unas proteínas. Un volumen de 300 \mul de una solución acuosa (20 \mug/ml) de proteínas (proteína A, estreptavidina, etc...) se deposita sobre una lámina funcionalizada en grupos (H_{2}C=CH-). Esta lámina se incuba aproximadamente dos horas a temperatura ambiente, posteriormente se aclara tres veces en agua ultrapura. Las superficies así tratadas son nítidas y húmedas. Las superficies tratadas con la proteína A pueden reaccionar a continuación con un anticuerpo, por ejemplo anti-DIG, por incubación en una solución de 20 \mug/ml de anticuerpo.
Anclaje de ADN nativo sobre una superficie de doble enlace
Una gota de 2 \mul de una solución de ADN-\lambda marcado por fluorescencia (YOYO1, POPO1 o YOYO3, pero sin terminación particular) de concentración variable y en diferentes tampones (número total de moléculas < 10^{7}) se deposita sobre una lámina pretratada (H_{2}C=CH-) y recubierta con una lámina de vidrio no tratada (diámetro 15 mm). La preparación se incuba aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente en una atmósfera saturada de vapor de agua. En un tampón de 0,05 M MES (ph = 5,5) se observa un anclaje casi general de las moléculas de ADN. Al contrario, en un tampón de 0,01 M Tris (ph = 8) no hay casi ninguna molécula anclada (relación > 10^{6}). Esta dependencia puede permitir el control de la activación/desactivación de las superficies (en relación con el ADN) por medio del pH.
Detección del anclaje por la acción del menisco
Transfiriendo la preparación anterior a una atmósfera seca, la solución al evaporarse estirará las moléculas de ADN, ancladas en la superficie, perpendicularmente al menisco. La fuerza capilar sobre la molécula de ADN (algunas decenas de picoNewtons) es en efecto suficiente para estirar completamente la molécula (mayor que las fuerzas de la elasticidad entrópica), pero demasiado débil para romper el enlace entre el extremo de la molécula y la superficie tratada. Al estar el ADN marcado por fluorescencia, se observan individualmente y cómodamente las moléculas estiradas (longitud total aproximadamente 22 \mum). Al estar anclaje entre la superficie y el ADN limitando los extremos, se ha podido estirar tanto unos ADN del fago \lambda, como de YAC o de E.coli (longitud total superior a 400 \mum). Esta preparación de ADN estirada, fluorescente y al aire libre es estable durante varios días y se puede observar de forma no destructiva, por epifluorescencia (microscopio invertido Nikkon Diaphot con un objetivo x100, O.N: 1,25).
Detección del anclaje por electroforesis
Una célula electroforética está formada por una anilla de parafina (espesor aproximadamente 100 \mum) puesta entre una lámina tratada y una lámina de vidrio no tratado entre las cuales se insertan dos electrodos de platino. El conjunto se convierte en solidario fundiendo brevemente el anillo de parafina. Gracias a dos aberturas practicadas en la anilla de parafina se introduce la solución de ADN en esta célula por capilaridad, posteriormente se sellan las dos aberturas con parafina. Se incuba, como anteriormente, a temperatura ambiente. Aplicando una tensión débil (algunos voltios) entre los dos electrodos de platino, se observa por fluorescencia un movimiento de las moléculas de ADN libre (algunas decenas de micrones por segundo) y una extensión en la dirección del flujo de las moléculas ancladas que se puede de este modo identificar cómodamente e individualmente por microscopia de epifluorescencia.
Anclaje y detección específicos
Tratando las superficies tal como se ha descrito anteriormente con un anticuerpo monoclonal específico, se puede controlar muy precisamente su especificidad. De este modo, se ha ensayado la especificidad de superficies tratadas anti-DIG frente al ADN \lambda hibridado con un oligonucleótido complementario de una de los extremos Cos y que presenta un grupo digoxigenina (DIG) y frente al ADN no hibridado. En el primer caso, se ha observado una extensión, por acción del menisco, casi general de las moléculas ancladas. En el segundo caso, sólo se han observado algunas moléculas de ADN (< 10) ancladas en toda la muestra. Se estima por lo tanto que la especificidad del método según la invención es mejor que 10^{6}.
Sensibilidad de la detección
Con el fin de determinar la sensibilidad del método de detección por extensión del menisco, se ha depositado sobre unas superficies de doble enlace unas gotas de 2,5 \mul de una solución de ADN- \lambda en 0,05 M MES (pH = 5,5) que contienen un total de 10^{5}, 10^{4} y 1000 moléculas. El anclaje se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente. Las láminas se observan a continuación en un microscopio por epifluorescencia, para determinar la densidad de las moléculas ancladas. Esta corresponde a la estimada: aproximadamente 4-6 moléculas de ADN por campo de visión (100 \mum x 100 \mum) para un total de 10^{5} moléculas de ADN. Para la concentración más baja, se ha podido observar una decena de moléculas extendidas por acción del menisco. Este número está limitado esencialmente por el gran número de campos de visión necesarios para cubrir toda la muestra (aproximadamente 25.000), lo que representa una investigación manual difícil, pero que puede ser ventajosamente realizada automáticamente o también con un objetivo más débil, pero a un campo mucho mayor. En conclusión, la sensibilidad del método según la invención permite una detección y un recuento individual de menos de 1.000 moléculas de ADN.

Claims (52)

1. Superficie altamente específica para reacciones biológicas, caracterizada porque comprende un soporte que presenta en superficie por lo menos una capa esencialmente compacta de un compuesto orgánico que presenta en el exterior de la capa, un grupo expuesto que presenta un doble enlace etilénico que muestra una afinidad por un tipo de molécula con actividad biológica en determinadas condiciones de pH o de contenido iónico, siendo los otros elementos de la capa esencialmente inaccesibles para dichas moléculas en dichas condiciones de reacción.
2. Superficie según la reivindicación 1, caracterizada porque el soporte es un soporte sólido.
3. Superficie altamente específica según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el grupo expuesto es un grupo vinilo.
4. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se obtiene mediante polimerización de por lo menos un monómero que genera en la superficie del polímero de doble enlace etilénico dicho grupo expuesto, por depósito del polímero sobre el soporte o por despolimerización parcial de la superficie de un polímero para generar dicho grupo expuesto.
5. Superficie según la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero es una poliolefina o un derivado poliénico.
6. Superficie altamente específica según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque presenta:
-
sobre un soporte una capa sensiblemente monomolecular y compacta de un compuesto orgánico de estructura alargada que presenta por lo menos:
\bullet
un grupo de fijación que muestra una afinidad por el soporte, y
\bullet
un grupo expuesto que presenta un doble enlace etilénico, que no muestra o muestra poca afinidad por dicho soporte y dicho grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que muestra una afinidad por un tipo de molécula biológica.
7. Superficie según la reivindicación 6, caracterizada porque la fijación es de tipo no covalente.
8. Superficie según la reivindicación 7, caracterizada porque la fijación se lleva a cabo por unas interacciones hidrófilas o hidrófobas.
9. Superficie según la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula biológica es capaz de anclarse directamente por adsorción sobre dicha superficie en determinadas condiciones de pH o de contenido iónico del medio.
10. Superficie según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque el grupo de fijación se selecciona de entre los grupos alquilo y alquilo halogenado para realizar unos enlaces hidrófobos.
11. Superficie según la reivindicación 10, caracterizada porque el grupo de fijación se selecciona de entre: -CH_{3}, CF_{3}, -CH_{2}F, CHF_{2}.
12. Superficie según la reivindicación 6, caracterizada porque la fijación es de tipo covalente.
13. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque los compuestos orgánicos son susceptibles de reaccionar entre ellos fuera del grupo expuesto para crear unos enlaces transversales.
14. Superficie según una de las reivindicaciones 6 a 13, caracterizada porque el compuesto orgánico presenta un grupo de fijación con un extremo y un grupo expuesto en el otro extremo.
15. Superficie según una de las reivindicaciones 6 a 14, caracterizada porque el grupo de fijación se selecciona de entre los grupos de tipo alcóxido de metal tal como silano, clorosilano, metoxisilano y etoxisilano, silanol, silazano, de tipo fosfato, hidroxi, hidracida, hidracina, amina, amida, diazonio, piridina, sulfato, sulfónico, carboxílico, borónico, halógeno, halogenuro de ácido, aldehído.
16. Superficie según la reivindicación 15, caracterizada porque el grupo de fijación se selecciona de entre los silanos tales como el mono-, di- o tri- clorosilano, mono, di o tri- etoxisilanos y mono -, di o tri -metoxisilanos.
17. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque el grupo expuesto está o bien unido directamente al grupo de fijación, o bien mediante unas cadenas que presentan por lo menos un átomo de carbono y preferentemente de 3 a 30 átomos.
18. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque el soporte está constituido por lo menos en superficie por un polímero, un metal o un óxido de metal, un elemento semiconductor, un óxido de elemento semiconductor, en particular un óxido de sílice, o una de sus combinaciones.
19. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el soporte está constituido por lo menos en superficie por vidrio o sílice.
20. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque el soporte está en forma de placa de bola, de fibra o de partículas.
21. Superficie según la reivindicación 20, caracterizada porque dichas partículas son magnéticas, fluorescentes o coloreadas.
22. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque la molécula con actividad biológica se selecciona de entre:
-
las proteínas,
-
los ácidos nucleicos,
-
los lípidos,
-
los polisacáridos y sus derivados.
23. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque la molécula con actividad biológica es un compuesto químico que presenta una actividad biológica.
24. Superficie según una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque la molécula con actividad biológica se selecciona de entre:
-
las proteínas,
-
el ADN,
-
el ARN y sus derivados.
25. Superficie según la reivindicación 24, caracterizada porque la molécula con actividad biológica se selecciona de entre:
-
los anticuerpos,
-
los antígenos,
-
los ADN y ARN,
-
los ligandos o sus receptores así como sus derivados.
26. Procedimiento de preparación de una superficie altamente específica para reacciones biológicas según una de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque:
-
se fija sobre un soporte sólido una capa sensiblemente monomolecular y esencialmente compacta de un compuesto orgánico de estructura alargada que presenta por lo menos.
-
un grupo de fijación que muestra una afinidad por el soporte, y
-
un grupo expuesto que no muestra o muestra poca afinidad por dicho soporte y el grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que muestra una afinidad por un tipo de molécula con actividad biológica.
27. Superficie revestida por una molécula con actividad biológica, caracterizada porque presenta una superficie altamente específica para reacciones biológicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, sobre la que se fija dicha molécula con actividad biológica.
28. Superficie según la reivindicación 27, caracterizada porque la molécula con actividad biológica se selecciona de entre:
-
las proteínas,
-
los ácidos nucleicos,
-
los lípidos,
-
los polisacáridos y sus derivados.
29. Superficie según la reivindicación 28, caracterizada porque el ADN fijado presenta la secuencia complementaria de una secuencia de ADN a aislar de una muestra.
30. Superficie según la reivindicación 28, caracterizada porque la proteína fijada es capaz de reconocer y fijar específicamente una proteína a aislar de una muestra.
31. Superficie según una de las reivindicaciones 28 y 29, caracterizada porque dicha molécula con actividad biológica se selecciona de entre la biotina, la avidina, la estreptavidina o sus derivados.
32. Procedimiento de identificación de la presencia de un ADN o de un ARN que utiliza una superficie según una de las reivindicaciones 1 a 31.
33. Procedimiento de identificación de la presencia de una proteína o de un anticuerpo que utiliza una superficie según una de las reivindicaciones 1 a 31.
34. Procedimiento de puesta de manifiesto y/o de dosificación de una molécula con actividad biológica en una muestra, caracterizado porque se utiliza una superficie según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 sobre la cual se encuentra fijada una molécula con actividad biológica capaz de reconocer la molécula de la muestra, y porque la puesta en evidencia o la dosificación se llevan a cabo gracias a un reactivo fluorescente o no que detecta la presencia de la molécula fijada.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, caracterizado porque la superficie presenta una fluorescencia débil y porque el reactivo es fluorescente.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado porque el reactivo está constituido por unas bolas.
37. Procedimiento según una de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado porque la detección se realiza por microscopia.
38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 34 a 37, caracterizado porque se somete el producto de reacción entre la molécula con actividad biológica y la molécula de la muestra a una tensión con el fin de destruir los malos apareamientos antes de la detección.
39. Procedimiento de puesta de manifiesto de una secuencia de ADN o de una proteína en una muestra, caracterizado porque:
-
se utiliza una superficie altamente específica según una de las reivindicaciones 1 a 31;
-
se pone la muestra en contacto con la superficie en unas condiciones de formación del híbrido ADN/ADN, ADN/ARN o proteína/proteína.
-
al estar el híbrido marcado, se le estira por cualquier medio físicoquímico para orientar las moléculas y se realiza una medición o la observación de las moléculas orientadas de este modo.
40. Procedimiento según una de las reivindicaciones 38 y 39, caracterizado porque se estira el híbrido o producto de la reacción por el paso de un menisco en el sentido del estirado.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, caracterizado porque el menisco es un menisco aire/agua.
42. Procedimiento según una de las reivindicaciones 38 y 39, caracterizado porque el estirado se lleva a cabo mediante un campo eléctrico que actúa sobre las moléculas o un campo magnético que actúa sobre una partícula magnetizable o magnética.
43. Procedimiento según una de las reivindicaciones 38 y 39, caracterizado porque el estirado se lleva a cabo por vía mecánica.
44. Procedimiento según una de las reivindicaciones 38 a 43, caracterizado porque el ADN fijado y el ADN de la muestra son "coloreados" de forma diferente y porque, después del estiramiento, se mide la posición de la secuencia complementaria con respecto al extremo del ADN de la muestra.
45. Procedimiento según la reivindicación 44, destinado a la cartografía de genes.
46. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 45, caracterizado porque se trata de un método ELISA o RIA.
47. Procedimiento según una de las reivindicaciones 44 a 45, caracterizado porque la muestra es el producto de una amplificación de ácido nucleico.
48. Procedimiento de fijación de un ácido nucleico o de una proteína sobre una superficie tal como la definida según una de las reivindicaciones 1 a 25, en el cual se realiza un anclaje por adsorción del ADN o de la proteína en particular por un extremo poniendo el ADN o la proteína en presencia de la superficie en una zona de pH determinada.
49. Procedimiento de fijación del ADN sobre una superficie que presenta unos grupos con doble enlace etilénico según la reivindicación 48, caracterizado porque se pone el ADN en presencia de la superficie a un pH inferior a 8.
50. Procedimiento de fijación según la reivindicación 49, caracterizado la reacción se realiza a un pH comprendido entre 5 y 6 y posteriormente es detenida a pH 8.
51. Estuche de diagnóstico, caracterizado porque comprende por lo menos una superficie altamente específica según una de las reivindicaciones 1 a 33.
52. Estuche de diagnóstico según la reivindicación 51, caracterizado porque comprende, además, un reactivo fluorescente o un reactivo que presenta unas bolas.
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