FR2966844A1 - Procede d'analyse genomique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN. Ce procédé permet notamment l'obtention de signatures pour de longs fragments d'ADN. Il permet également l'analyse et la comparaison des différences génomiques entre différents individus.

Description

Procédé d'analyse génomique

L'invention concerne un procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN. Ce procédé permet notamment l'obtention de signatures pour de longs fragments d'ADN. Il permet également l'analyse et la comparaison des différences génomiques entre différents individus.

Introduction: A l'heure actuelle, dans le domaine du diagnostic médical lié aux altérations génétiques structurales (en anglais Copy Number Variants, CNV), les besoins sont principalement satisfaits par deux approches complémentaires: la technologie d'hybridation génomique comparative (ou "Comparative Genomic Hybridisation", (CGH)) ou la technologie de séquençage de génome individuel.

La CGH sur chromosomes en métaphase est relativement peu coûteuse mais présente des limites. Le débit et la précision de cette technique sont faibles. Seules les modifications chromosomiques non équilibrées de plus de 1 millions de bases sont détectées. Des aberrations chromosomiques structurales telle que les translocations réciproques ou les inversions ne seront pas détectées. De plus, cette technique ne donne pas d'information concernant la ploïdie. Ainsi, des tétraploïdes ne présentant pas de réarrangements déséquilibrés apparaîtront normaux. Il existe également une technique de CGH sur fragments d'ADN fixés sur une puce (ou CGH array). Cette technologie est plus résolutive (jusqu'à 5 ou 10 kb) mais elle ne peut découvrir d'anomalie impliquant de l'ADN qui n'est pas présent sur la puce, et elle est insensible aux translocations et aux inversions.

Plus récemment, des technologies de séquençage à très haut débit ont permis dans des cas isolés, en recherche fondamentale, de séquencer l'ADN du génome de patients. Les fragments obtenus par séquençage sont très courts (de 35 à 300 pb) et doivent être alignés sur un génome de référence pour retrouver leurs positions respectives. Les anomalies de type CNV sont identifiées en comptant le nombre de fragments alignés à une position et en le comparant au nombre moyen de lecture alignés par base dans le génome entier. Si le nombre de fragments alignés sur une région correspond à 0% ou 50% de cette moyenne, on diagnostiquera une délétion complète (homozygote) ou partielle (hétérozygote) de la région. Si le nombre correspond à 150% ou plus, on conclura à une duplication. En pratique cette approche est limitée par la difficulté à tenir compte des biais de séquençage, qui biaisent localement le nombre de fragments obtenus. De plus, seulement 60% environ des régions du génome correspondant aux gènes et 45% des autres régions peuvent êtres "vues" par cette technologie. Finalement le coût du séquençage d'un génome humain reste encore prohibitif.

Des procédés basés sur l'utilisation d'enzymes reconnaissant des séquences spécifiques d'ADN ont également été proposés pour produire des signatures de molécules d'ADN. On peut notamment citer l'étude de Neely et al., 2010. Cet article concerne un procédé de cartographie de l'ADN du bactériophage par marquage fluorescent au niveau de séquences consensus reconnues par la méthyltransférase M. HhaI. L'ADN marqué est ensuite immobilisé et la fluorescence est observée au microscope pour établir une signature qualifiée de "fluorocode" par les auteurs de l'article. Cette technique ne permet pas d'obtenir une signature spécifique d'une molécule d'ADN, puisqu'un même fluorocode pourrait être obtenu pour différentes molécules d'ADN, par exemples des molécules d'ADN avec des séquences consensus dans des positions relatives équivalentes. Elle nécessite en outre plusieurs "lectures" de la molécule d'ADN marquée pour obtenir un fluorocode.

Il serait donc avantageux de disposer d'un procédé permettant l'obtention d'une signature spécifique d'un ADN donné. De préférence, un tel procédé permettrait l'étude de longues molécules d'ADN. Il serait également avantageux de disposer de techniques permettant le séquençage à l'échelle de la molécule unique.

Résumé de l'invention La présente demande décrit un procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN. Selon l'invention, deux molécules différentes auront des signatures différentes. A une séquence d'ADN correspond une signature spécifique unique. La signature obtenue par le procédé selon l'invention permet donc de reconnaître de manière spécifique et reproductible des molécules d'ADN identiques et de distinguer des molécules d'ADN différentes.

Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN, comprenant: a) le marquage d'une molécule d'ADN - par incorporation d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une réaction de polymérisation d'ADN, le nucléotide modifié étant détectable, ou étant susceptible d'être modifié de manière à être détectable; ou - par hybridation d'un ou plusieurs oligonucléotides marqués, lesdits oligonucléotides 5 étant de taille comprise entre 10 et 15 nucléotides; ou - par mise en contact de l'ADN avec une molécule intercalante fluorescente ; b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide ; c) la détection du marquage le long de l'ADN au moyen d'un dispositif optique adapté; moyennant quoi une signature spécifique de ladite séquence ADN est obtenue. 10 Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'identification d'une molécule d'ADN, le procédé comprenant: i) l'obtention de la signature de ladite molécule d'ADN selon le procédé décrit ci-dessus; et ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) à des signatures prédéterminées de 15 molécules d'ADN de référence; la comparaison permettant d'identifier la molécule d'ADN.

L'invention a également pour objet un procédé d'identification d'une anomalie génomique chez un sujet, ledit procédé comprenant: 20 i) l'obtention de la signature moléculaire d'une molécule d'ADN génomique d'un tissu ou d'une cellule d'un sujet, selon le procédé d'obtention décrit ci-dessus; ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) aux signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence provenant d'un sujet sain afin d'identifier ladite molécule d'ADN génomique ; 25 une anomalie génomique étant détectée si la signature de la d'ADN génomique du sujet diffère des signatures des molécules d'ADN de référence.

Selon une première variante, le procédé d'identification d'une anomalie génomique mentionné ci-dessus comprend en outre: 30 - l'obtention à l'étape i) de la signature de plusieurs fragments d'ADN génomique et leur concaténation sur la base de chevauchement de signatures; - le(s) concaténât étant ensuite comparé(s) aux séquences de références pour identifier le(s)dit(s) concaténât; une anomalie génomique étant détectée si un concaténât diffère de la molécule d'ADN de référence correspondante.

Selon une seconde variante, le procédé d'identification d'une anomalie génomique mentionné ci-dessus est utilisé pour identifier une molécule d'ADN complémentaire, la signature dudit ADN complémentaire étant comparée aux signatures d'un ensemble de molécule d'ADN complémentaire de référence.

En outre, l'invention a pour objet un procédé d'obtention de la séquence nucléotidique d'une 10 molécule d'ADN comprenant: a) le marquage d'une molécule d'ADN par incorporation d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une ou plusieurs réactions indépendantes de polymérisation d'ADN, le(s) nucléotide(s) modifié(s) étant détectable(s), ou étant susceptible(s) d'être modifié(s) de manière à être détectable(s); 15 b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide; c) la détection du marquage au moyen d'un dispositif optique et d'un moyen de traitement adapté pour obtenir une information de résolution inférieure ou égale à 0,5 nm.

Selon un mode particulier de réalisation de cet objet, le moyen de détection utilisé est la 20 technique TIRE couplée à un système STORM.

Description détaillée de l'invention Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN. Ce procédé comprend: 25 a) le marquage d'une molécule d'ADN - par incorporation au cours d'une réaction de polymérisation d'au moins un nucléotide modifié détectable ou susceptible d'être modifié de manière à être détectable; ou - par hybridation d'un ou plusieurs oligonucléotides marqués, lesdits oligonucléotides étant de taille comprise entre 10 et 15 nucléotides ; ou 30 - par mise en contact de l'ADN avec une molécule intercalante fluorescente; b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide; c) la détection du marquage le long de l'ADN au moyen d'un dispositif optique adapté; moyennant quoi une signature spécifique de ladite séquence ADN est obtenue.

Selon les procédés de marquage et d'immobilisation utilisées, la séquence des étapes a) et b) peut être inversée. Ainsi, dans une variante, le marquage précède l'immobilisation et l'étirement de la molécule d'ADN. Dans une seconde variante, l'immobilisation et l'étirement de la molécule d'ADN précède le marquage de ladite molécule d'ADN, en particulier dans le cas d'un marquage de la molécule d'ADN par hybridation avec des oligonucléotides marqués.

Dans le cadre de la présente invention, le terme "signature d'un ADN" désigne le marquage spécifique obtenu le long dudit ADN après lecture optique du signal émis par le marqueur employé à l'étape a) du procédé selon l'invention. Comme nous le décrivons ci-dessous, la signature peut notamment correspondre: - à la densité de marquage le long de la molécule d'ADN, convertie en unités de fluorescence, ou - à la séquence de distances successives entre les positions des molécules fluorescentes le long des molécules d'ADN, déterminées par utilisation d'une fonction PSF.

Ladite signature obtenue selon l'invention est "spécifique" en ce sens que, dépendant de la séquence primaire de ladite molécule d'ADN, la probabilité que deux molécules d'ADN puissent avoir la même signature est faible, voire nulle, contrairement aux signatures obtenues par des techniques reposant sur la reconnaissance de séquences consensus.

Molécule d'ADN étudiée La molécule d'ADN soumise au procédé selon l'invention peut être toute molécule d'ADN pour laquelle l'obtention d'une signature spécifique est souhaitable. Elle peut provenir d'une cellule d'un organisme unicellulaire ou pluricellulaire, et notamment être extraite d'un échantillon de cellules ou tissu d'un organisme pluricellulaire (par exemple échantillon de cheveu, de peau, de sang, etc.) La molécule d'ADN à étudier peut en particulier être une molécule de séquence inconnue.

L'ADN soumis au procédé selon l'invention peut être une molécule d'ADN, notamment une molécule d'ADN génomique, extraite d'une cellule eucaryote (par exemple une cellule de plante, de champignon, d'animal, notamment de mammifère, notamment une cellule humaine) ou procaryote, ou d'un virus, par exemple un virus de mammifère à génome ADN, notamment un virus humain, ou un bactériophage à génome ADN. Le procédé selon l'invention peut également être appliqué à une molécule d'ADN complémentaire. La molécule d'ADN à étudier peut également être une molécule d'ADN isolé ou contenue dans une banque d'ADN.

L'ADN génomique peut notamment provenir d'un patient susceptible d'être atteint d'une maladie impliquant une anomalie dans son génome, par exemple une maladie génétique ou un cancer. L'ADN génomique peut également provenir d'un sujet sain, notamment en vue d'une mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour obtenir les signatures de molécules d'ADN "de référence" (cf. ci-dessous).

Le procédé selon l'invention peut notamment comprendre, dans un mode particulier de réalisation, l'extraction préalable de l'ADN à partir des cellules de l'organisme dont on souhaite analyser le génome. A titre illustratif, dans le cas de mammifères (par exemple l'homme ou un autre animal), l'ADN peut être extrait de lymphocytes contenus dans un échantillon de sang. Les techniques de prélèvement de tissus ou cellules (notamment par biopsie, frottis, prélèvement sanguin, ...) et d'extraction de l'ADN sont bien connues de l'homme du métier.

L'ADN génomique peut notamment être extrait par lyse alcaline des cellules en prenant les précautions nécessaires lors de la manipulation pour minimiser la fragmentation des molécules d'ADN. En effet, selon un mode particulier de réalisation, les molécules d'ADN soumises au procédé selon l'invention sont des molécules de haut poids moléculaire, de préférence de taille supérieure à 50 kb, en particulier supérieure à 60 kb, en particulier supérieure à 100 kb, plus particulièrement supérieure à 200 kb. L'homme du métier pourra prendre en compte la densité du marquage obtenu pour déterminer la taille de fragment la plus adaptée. Ainsi, une signature spécifique peut notamment être obtenue pour un fragment de 60kb pour une densité de marquage de 50 % de l'une des quatre bases de l'ADN (A, T, C ou G), c'est-à-dire pour un marquage de 12,5 % de la molécule d'ADN en moyenne. L'homme du métier connaît les techniques permettant d'obtenir des molécules d'ADN de taille comprise adéquate. Par exemple, cette opération peut être réalisée en isolant les cellules dans des blocs d'agarose dans lesquels diffusent les solutions de lyse cellulaire et de digestion de l'ADN, suivi par une séparation des molécules d'ADN par électrophorèse, la découpe d'un bloc d'agarose correspondant à la taille souhaitée et la digestion de l'agarose par une agarase.

L'ADN à étudier peut être ancré ou non ancré à la surface solide avant étirement. Dans un mode particulier de réalisation, l'ADN à étudier est modifié de manière à permettre son immobilisation sur une surface solide (par exemple en exploitant le système biotinestreptavidine). L'ancrage par une extrémité peut avantageusement permettre d'obtenir une distribution particulière des molécules sur la surface solide.

Selon un autre mode de réalisation, les molécules d'ADN sont peignées « telles quelles » à partir d'une solution d'ADN non modifié à l'une de ses extrémités (étant entendu que l'ADN peut être un ADN modifié à l'une de ses extrémités, mais la modification n'étant pas réalisée en vue de son ancrage sur la surface).

Marquage de l'ADN Selon un mode particulier de réalisation, l'ADN est marqué par incorporation d'analogues de nucléotides au cours d'une réaction de polymérisation, selon des techniques bien connues de 15 l'homme du métier. Ces techniques mettent en oeuvre une ADN polymérase.

L'homme du métier a plusieurs techniques à sa disposition pour réaliser ce marquage.

On peut ainsi notamment marquer l'ADN par synthèse in vitro en utilisant une ADN 20 polymérase recombinante. De préférence, on utilise une ADN polymérase suffisamment processive pour incorporer des nucléotides modifiés dans un ADN de haut poids moléculaire. De préférence, l'ADN polymérase utilisée est une polymérase à haute fidélité. L'ADN polymérase Phi29 disponible à la vente notamment chez New England Biolabs est un exemple de polymérase qui réunit ces propriétés et qui peut être utilisée dans le cadre de la 25 présente invention.

Selon un mode particulier de réalisation, la synthèse in vitro est mise en oeuvre en réalisant un seul cycle de synthèse, de manière à obtenir des molécules d'ADN marquées sur un seul de leurs deux brins. L'incorporation peut être réalisée à partir d'extraits de cytosol de cellules en culture, de préférence de cellules humaines, contenant les composants de la machinerie réplicative. Typiquement, ces composants sont extraits à partir de cellules (type cellules HeLa) en culture, sont complétés avec les nucléotides modifiés que l'on souhaite incorporer dans l'ADN et mis 30 en contact avec de l'ADN, par exemples de l'ADN génomique, que l'on souhaite marquer. Ces techniques sont connues de l'homme du métier (par exemple Marheineke et al., 2009).

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'ADN que l'on souhaite marquer est de l'ADN situé dans le noyau de cellules en culture, dans lesquels des nucléotides fluorescents sont introduits par micro-injection. Les nucléotides modifiés sont alors incorporés dans l'ADN in vivo par la machinerie réplicative native des cellules. Ces techniques sont connues de l'homme du métier (Zink et al., 1998).

La réaction de polymérisation est réalisée en présence des quatre bases de l'ADN dATP, dTTP, dGTP et dCTP. Selon un mode de réalisation, l'un ou plusieurs des nucléotides peuvent être remplacés par un analogue. Par exemple le dUTP peut remplacer le dTTP. Selon l'invention, l'étape de marquage peut être réalisée par incorporation d'au moins un analogue d'un nucléotide, ledit analogue étant soit un analogue fluorescent, soit un analogue susceptible d'être modifié pour le rendre fluorescent. Selon une variante, la polymérisation est réalisée en présence des quatre bases de l'ADN, complétées de ou des analogue(s) à incorporer dans l'ADN. Selon une autre variante, le ou les analogue(s) à incorporer sont utilisés en remplaçant totalement la base correspondante non modifiée dans le mélange réactionnel.

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend le marquage de l'ADN avec au moins un analogue fluorescent d'un nucléotide choisi parmi dATP, dTTP (ou dUTP), dGTP et dCTP. Selon une variante spécifique de ce mode de réalisation, un seul analogue fluorescent est employé. Lorsque plusieurs analogues différents de différents nucléotides sont employés, le marqueur fluorescent utilisé est identique ou différent pour chacun de ces analogues. De préférence le marqueur fluorescent est différent pour chacun des analogues utilisés.

Les analogues fluorescents de nucléotides sont bien connus de l'homme du métier et sont disponibles dans le commerce. Tout fluorophore susceptible d'être lié à un nucléotide soit directement, soit par l'intermédiaire d'un espaceur (par exemple (CH2)') peut être utilisé dans la présente invention. On peut citer notamment les analogues de nucléotides marqués à la diéthylaminocoumarine, la fluorésceine, une cyanine, notamment la cyanine 3 ou la cyanine 5, la tétraméthylrhodamine, la Lissamine®, au Texas Red®, à l'alexa ou encore à un marqueur de la famille ATTO (notamment ATTO647N, ATTO 550, ATTO565 disponibles chez Jena BioSciences couplés à des nucléotides (ou analogues) selon différentes variantes). Différents fournisseur commercialisent ce type d'analogues fluorescents, notamment Perkin Elmer, Amersham, etc.

Selon un mode particulier de réalisation, les marqueurs sont des molécules photoactivables en fonction des conditions oxydo-réductrices du milieu réactionnel. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux dans le cadre de la mise en oeuvre de la technologie STORM décrite ci-dessous.

L'analogue de nucléotide utilisé peut également alternativement ne pas être lui même fluorescent, mais être porteur d'un groupement susceptible d'être modifié pour le rendre fluorescent. Le couplage des fluorophores peut être covalent ou transitoire (pour pallier d'éventuelles limitations stériques). Dans le cas d'un couplage transitoire, on utilise des molécules fluorescentes possédant une affinité pour l'analogue de nucléotide incorporé dans l'ADN. On peut notamment citer à titre illustratif les bromo-, iodo-, fluoro-, aminoallyl-dUTP.

Selon un mode particulier de réalisation, le marquage est réalisé par réplication d'une molécule d'ADN (ADN matrice) telle que décrite ci-dessus avec l'ADN polymérase Phi29, en présence de dATP, dTTP (ou alternativement dUTP), dCTP et dGTP non modifiés et d'un ou plusieurs analogues de nucléotides fluorescents ou susceptibles d'être rendus fluorescents. Selon une variante de ce mode de réalisation, l'analogue de nucléotide remplace complètement la base non modifiée correspondante dans le milieu réactionnel. La réaction de polymérisation est réalisée à la température requise pour le fonctionnement de l'enzyme selon les recommandations du fournisseur (30°C pour la Phi29) et pendant un temps suffisant pour permettre l'incorporation de nucléotides modifiés sur plusieurs dizaines de kilobases sur une partie au moins des molécules matrices.

Selon un second mode de réalisation de l'invention, le marquage est réalisé par hybridation de la molécule d'ADN avec un ou plusieurs oligonucléotides simple brin marqués, de taille comprise entre 10 et 15 nucléotides. La séquence de ces oligonucléotides est choisie de sorte qu'elle soit répartie de manière à peu prés uniforme dans le génome d'intérêt, tout en permettant l'obtention d'un marquage spécifique d'une molécule d'ADN donné. Dans le cas du génome humain, ces oligonucléotides sont choisis en fonction de la composition du génome, et de leur répartition. La séquence des oligonucléotides pourra être de la forme NNX1X2X3X4X5X6X7X8NN, dans laquelle XIX2X3X4X5X6X7X8 est une séquence déterminée et N est une base aléatoire. De cette façon la séquence déterminée de l'oligonucléotide sera suffisamment courte (par exemple 8 bases) pour avoir de nombreuses occurrences dans le génome, et suffisamment longue par addition de bases aléatoires (par exemple 8+4=12 bases ici) pour s'hybrider de manière stable.

Les oligonucléotides peuvent notamment être marqués par incorporation d'une ou plusieurs molécules fluorescentes à leur extrémité, selon des procédures bien connues de l'homme du métier. Selon un aspect particulier de ce second mode de réalisation, le marquage par hybridation est réalisé après immobilisation et étirement de la molécule d'ADN à étudier.

Selon un troisième mode particulier de réalisation, le marquage de la molécule d'ADN est 15 réalisé par mise en contact dudit ADN avec un agent intercalant capable de se lier à l'ADN double brin et qui émet un signal fluorescent lorsqu'il est ainsi lié. De nombreux agents intercalants sont connus de l'homme du métier. On peut citer à titre illustratif le bromure d'éthidium, l'iodure de propidium, le Sybr Green, le TOTO (1,1 '-(4,4,7,7-tetramethyl-4,7-diazaundecamethylene)-bis-4-[3 -methyl-2,3-dihydro-(benzo- 1,3 -thiazole)-2- methylidene]- 20 quinolinium tetraiodide) ou l'oxazole orange (YOYO).

L'agent intercalant peut être utilisé pour marquer la molécule d'ADN avant ou après immobilisation sur support solide. De préférence, le marquage est réalisé avant immobilisation de la molécule d'ADN, en particulier en utilisant la molécule YOYO. Immobilisation et étirement de l'ADN L'étape b) du procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN comprend l'immobilisation et l'étirement dudit ADN sur un support solide.

30 De préférence, l'ADN marqué est immobilisé et étiré par la technique du peignage moléculaire. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. On en trouvera une description détaillée notamment dans la demande WO9521939. En résumé, cette technique exploite le mouvement d'un ménisque de solvant qui étire et oriente les molécules d'ADN en solution dans la direction du mouvement, tout en appliquant 25 localement une force qui plaque les molécules d'ADN sur la surface solide. Un taux d'étirement de 1 base/0,5 nm peut être obtenu avec cette technique.

La surface sur laquelle les molécules d'ADN sont immobilisées est rigide (par exemple du verre) ou semi-rigide (par exemple une feuille de polymère flexible). La surface peut notamment être composée ou recouverte d'un polymère organique ou inorganique, d'un métal, oxyde de métal, semi-conducteur, ou une combinaison de ces matières.

Selon un mode particulier de réalisation, la surface est recouverte, dans sa totalité ou en partie, de groupements susceptibles de réagir avec une extrémités des molécules d'ADN en solution et ainsi de la fixer. Bien entendu, l'homme du métier connaît les différents systèmes utilisables pour fixer une molécule d'ADN et saura dans quels cas la molécule d'ADN doit être fonctionnalisée en parallèle de la surface. On peut citer à titre d'exemple le système streptavidine-biotine, un système anticorps-antigène, etc.

Selon un autre mode particulier de réalisation, l'ADN n'est pas modifié en vu de son ancrage. On utilise alors par exemple des lames de verre silanisées qui n'ont pas subi un traitement supplémentaire et la molécule d'ADN est alors immobilisé par application de la technique de peignage moléculaire. Selon une variante de ce mode de réalisation, le support peut également être un support composé ou recouvert d'un polymère synthétique, de polyacrylamide, de polycarbonates, etc.

Dans un mode particulier de réalisation, l'ADN marqué est immobilisé de manière individualisée. En d'autres termes, l'ADN marqué est dilué à une concentration adéquate pour obtenir, après immobilisation, des molécules d'ADN marqué séparées les une des autres. A titre illustratif, des fragments d'ADN de 50 à 200 kb de longueur sont utilisés à une concentration de 0,2 à 1 pM. La dilution peut être réalisée dans un tampon Tris 50mM, pH 8 ou MES 50mM, pH 5.5 par exemple.

Observation Après immobilisation, les molécules d'ADN étirées sont observées à l'aide d'un microscope optique afin de générer un signal fluorescent.

Le microscope peut notamment comprendre un système T1RF (Total Internai Reflection Fluorescence) pour minimiser le bruit autour de la molécule d'ADN à étudier.

Dans un mode particulier de réalisation, le microscope est équipé d'un objectif à 5 grossissement d'au moins 100X.

Dans un autre mode particulier de réalisation, le microscope et équipé d'une caméra CCD à haute résolution (par exemple 6,5 µm x 6,5 µm, soit 65 nm par pixel) à efficacité quantique élevée (de préférence supérieure à 65%). Dans ces conditions, un pixel de la caméra couvre 10 une longueur d'environ 130 paires de base d'ADN étiré et immobilisé sur la surface.

Selon un mode préféré de réalisation, le microscope utilisé comprend un système TIRF et est équipé d'un objectif à grossissement d'au moins 100X et d'une caméra CCD à haute résolution (par exemple 6,5 µm x 6,5 µm, soit 65 nm par pixel) à efficacité quantique élevée (de 15 préférence supérieure à 65%).

Les molécules fluorescentes sont excitées par un laser de longueur d'onde adaptée, connue de l'homme du métier. La lumière émise est capturée par la caméra fixée au microscope dont l'objectif est équipé d'un filtre optique adapté. Bien entendu, l'homme du métier pourra adapté l'équipement pour obtenir la meilleure résolution possible.

Selon un mode préféré de réalisation, la microscopie mise en oeuvre est une microscopie à 25 fluorescence de super-résolution. Selon un aspect préféré, la microscopie de super-résolution utilisée met en oeuvre une localisation successive de fluorophores individuels. Parmi les technologies disponibles, on peut citer le PALM (photoactivated localization microscopy) et le STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) qui permettent de s'affranchir de la limite de résolution imposée par la diffraction. Ces techniques sont décrites dans les articles 30 de Betzig et al., 2006 et Rust et al., 2006. Ces techniques implémentent une photoactivation des fluorophores incorporés dans l'ADN par des flashs de lumière qui excitent aléatoirement un petit nombre de molécules fluorescentes, plutôt que de les exciter en continu. 20 Selon un mode particulier de réalisation, la microscope utilisé comprend un système TIRF et un système STORM ou PALM, de préférence STORM.

Les signaux lumineux collectés sous forme d'images sont ensuite traités par un processus informatisé dans le but de localiser la position relative des fluorophores (et donc des bases modifiées dans l'ADN) les uns par rapport aux autres le long de l'axe linéaire des molécules d'ADN, et donc leur distance relatives les uns par rapport aux autres.

Dans un mode de réalisation de l'invention s'appuyant sur la technologie STORM ou PALM, une fonction d'étalement du point (ou Point Spread Function (PSF) en anglais), soit une fonction mathématique décrivant le signal émis par une molécule fluorescente unique, sera ajustée sur le signal lumineux afin de décomposer celui-ci en autant de PSFs que de molécules émettrices uniques. Cette opération permet de pointer le centre de chaque PSF et ainsi de positionner les molécules émettrices les unes par rapport aux autres le long de l'axe de la molécule d'ADN immobilisée et étirée (de préférence par peignage moléculaire). L'opération de pointage est réalisée grâce à des algorithmes bien connus de l'homme du métier (par exemple, Mortensen et al., 2010). Le centre de chaque PSF, correspondant à la position de chaque molécule fluorescente, pourra ainsi être localisé avec une précision dépendant du nombre de photons acquis, et non pas de la limite de diffraction de la lumière émise. La séquence de distances successives entre les positions des molécules fluorescentes le long des molécules d'ADN fournit ainsi une signature spécifique de chacune des molécules, exprimée en paire de base d'ADN.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le pointage des molécules individuelles produisant le signal lumineux n'est pas requis, le signal lumineux linéaire, exprimé en unités d'intensité arbitraire par nanométre, représentant directement la signature spécifique de chaque molécule d'ADN. Dans ce cas une opération de décomposition du signal peut être réalisée afin d'accroître la résolution de la signature. Cette opération peut être réalisée par des méthodes bien connues de l'homme du métier, comme les méthodes basées sur les ondelettes (Donoho et al., 1995) ou sur la déconvolution (Bertero et Boccacci, 1998).

Il est possible que des fragments différents représentant différentes copies d'une même séquence d'ADN soient immobilisés sur la surface dans le procédé selon l'invention. Le procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN peut alors comprendre en outre, après l'étape c) une étape de concaténation où des chevauchements de signature sont identifiés entre plusieurs fragments, indiquant que la même région du génome est observée. Dans ce cas, les deux signatures sont alors fusionnées pour générer une signature plus longue.

Autres objets de l'invention Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir la signature d'une molécule d'ADN. Cette signature peut avantageusement être mise en oeuvre pour constituer des banques de signatures de molécules d'ADN de référence.

Ainsi, selon l'un de ses aspects, l'invention concerne une signature spécifique d'un ADN donné obtenue selon le procédé détaillé ci-dessus.

Les signatures des molécules d'ADN de référence peuvent avantageusement être utilisées pour identifier des molécules d'ADN inconnues. En conséquence, un autre aspect de l'invention concerne un procédé pour l'identification d'une molécule d'ADN comprenant: i) l'obtention de la signature de ladite molécule d'ADN selon le procédé d'obtention décrit ci-dessus; et ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) à des signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence; ladite comparaison permettant d'identifier la molécule d'ADN.

La signature obtenue à l'étape i) est comparée par un procédé informatique basé sur des corrélations statistiques.

Il est possible que des fragments différents issus d'une même molécule d'ADN soient immobilisés sur la surface dans le procédé selon l'invention. Comme mentionné ci-dessus, le procédé d'identification peut alors comprendre en outre, entre les étapes i) et ii) une étape de concaténation où des chevauchements de signature sont identifiés entre plusieurs fragments, indiquant que la même région du génome est observée. Dans ce cas, les deux signatures sont alors fusionnées pour générer une signature plus longue.

Les signatures de référence peuvent notamment correspondre aux signatures de molécules d'ADN obtenues à partir de sujets sains. On peut notamment citer de l'ADN génomique d'un sujet sain, ou de l'ADN complémentaire obtenu à partir du transcriptome d'une cellule ou d'un tissu d'un sujet sain. Dans le cas d'ADN complémentaire, des signatures de référence pourront être produite pour chaque tissu/type cellulaire.

Par "sujet sain", on désigne selon l'invention un sujet pour lequel on ne suspecte aucune altération génomique. Préférentiellement, les signatures de molécule d'ADN de sujet sain sont représentatives de la diversité des populations considérées, notamment humaines.

Les molécules d'ADN de référence peuvent correspondre à la signature de chromosomes, par exemple à la signature des 23 chromosomes humains. La signature complète d'un chromosome aura bien entendu été obtenue par concaténation des signaux chevauchant correspondant à ce chromosome, selon les modalités exposées ci-dessus.

Les signatures de référence peuvent également correspondre à des molécules d'ADN de patients souffrant de maladies génétiques diagnostiquées, ou souffrant d'un cancer documenté.

Ces signatures peuvent permettre l'identification des pathologies concernées.

Bien entendu, comme cela a été mentionné ci-dessus, les applications du procédé selon l'invention ne se limitent pas à l'étude du génome humain. L'ADN étudié peut notamment être extrait d'un animal, notamment un mammifère (dont l'homme), mais également d'une plante, d'un champignon, d'un procaryote, ou d'un virus, par exemple un virus de mammifère à génome ADN, notamment un virus humain, ou un bactériophage à génome ADN. En particulier, les signatures de référence peuvent correspondre à des molécules d'ADN provenant de chacun de ces organismes.

Le procédé selon l'invention peut donc notamment être un procédé d'identification d'un ADN extrait d'une plante que l'on cherche à identifier. Dans ce cadre, la signature de l'ADN étudié sera comparée à des signatures de référence provenant de différentes plantes ou variétés de plantes. Selon un mode particulier de réalisation, les signatures de référence comprennent en tout ou partie des signatures d'ADN de plantes génétiquement modifiées. Ainsi, le procédé selon l'invention peut également permettre de déterminer si une plante donnée est génétiquement modifiée.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour l'identification d'une anomalie génomique chez un sujet comprenant: i) l'obtention de la signature moléculaire d'une molécule d'ADN génomique d'un tissu ou d'une cellule d'un sujet; ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) aux signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence provenant d'un sujet sain afin d'identifier ladite molécule 5 d'ADN génomique ; une anomalie génomique étant détectée si la signature de l'ADN génomique du sujet diffère des signatures des molécules d'ADN de référence. Ces différences comprennent notamment des délétions, des inversions, des duplications de segments de chromosomes.

10 Selon un autre mode de réalisation, l'ADN obtenu à l'étape i) est comparé à des signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence provenant de sujets malades, dont la maladie est le résultat d'une altération dans le génome d'une ou plusieurs cellules dudit patient, une anomalie génomique pouvant être suspectée si la signature obtenue à l'étape i) correspond à l'une des signatures de référence. L'invention concerne donc également un 15 procédé pour l'identification d'une anomalie génomique chez un sujet comprenant: i) l'obtention de la signature moléculaire d'une molécule d'ADN génomique d'un tissu ou d'une cellule d'un sujet; ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) aux signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence provenant de sujets malades, dont la maladie est le résultat 20 d'une altération génétique, afin d'identifier ladite molécule d'ADN génomique ; une anomalie génomique étant détectée si la signature de l'ADN génomique du sujet testé correspond à au moins l'une des signatures de référence.

Par ailleurs, l'invention peut notamment avantageusement être utilisée pour diagnostiquer une 25 altération génétique dans le cadre d'une amniocentèse. Ce procédé permet une identification plus fine d'altérations génétiques (inversion, délétions, duplications, translocations au niveau d'un ou plusieurs chromosomes) que le caryotypage par cytogénétique. Le procédé pour l'identification d'une anomalie génomique selon l'invention peut être mis en oeuvre indépendamment ou en complément d'un tel caryotypage. 30 Compte tenu des résolutions obtenues grâce aux techniques de microscopie de super-résolution, il est également décrit un procédé d'obtention de la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN, comprenant: a) le marquage d'une molécule d'ADN par incorporation d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une ou plusieurs réactions indépendantes de polymérisation d'ADN, le(s) nucléotide(s) modifié(s) étant détectable(s), ou étant susceptible(s) d'être modifié(s) de manière à être détectable(s); b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide; c) la détection du marquage au moyen d'un dispositif optique et d'un moyen de traitement adapté pour obtenir une information de résolution inférieure ou égale à 0,5 nm.

Cette résolution peut notamment être atteinte par l'utilisation des technologies TIRF couplées 10 à un système STORM ou PALM décrits ci-dessus, et analysé par pointage des PSF comme également décrit ci-dessus.

Selon le procédé d'obtention de la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN selon l'invention, l'ADN étudié peut être un ADN génomique ou un ADN complémentaire. 15 Légendes des figures Figure 1: exemple d'image obtenue après marquage d'un ADN avec un extrait de cytoplasme d'oeuf de xénope, peignage et acquisition de la fluorescence Figure 2: signal lumineux converti en unités de florescence arbitraires par un logiciel 20 d'analyse d'image (ImageJ; courbe rose (courbe du haut)) tandis qu'un échantillon représentatif du bruit de fond environnant est représenté par la courbe bleue (courbe du bas).

Exemples Exemple 1. Marquage par des extraits de système réplicatif d'oeufs de Xenopus laevis 25 1 °) Marquage de l'ADN La technique de marquage est décrite en détail dans Marheineke et al., 2009 et est basée sur un protocole initialement décrit dans Blow et al., 1986. Brièvement, le protocole requiert l'extraction de cytosol d'oeufs de xénopes. Pour cela des oeufs sont récoltés sur des femelles de xénopes et rincés dans de l'eau déionisées pendant 5 minutes. Les oeufs sont ensuite 30 dissociés par une solution appropriée (solution « dégelante ») et activés par une solution appropriée (solution de Barth) additionnée de 0,25 µg/ml de calcium ionophore A23187. Après rinçage, les oeufs sont centrifugés à 2°C à une vitesse de 350 x g pendant 1 minute pour permettre l'élimination de toute trace de solution liquide puis à 20000 x g pendant 15 minutes pour les casser. Parmi les trois phases liquides qui résultent, la phase centrale correspond à l'extrait de cytoplasme, qui est récoltée à l'aide d'une seringue, puis transférée dans un tube placé sur la glace jusqu'à utilisation. Pour le marquage, on réalise un mélange de 1/20 d'extrait de cytosol, 1/20 de solution de créatine phosphate, 1/50 de solution de cycloheximide, 1/50 de solution de dUTP-rhodamine. Après complétion de la réaction, celle- ci est arrêtée par l'addition de solution de PBS glacé. L'ADN est centrifugé à 1000 x g pendant 7 minutes et resuspendu dans 50 µl de PBS. 2°) Préparation des lamelles de verre pour le peignage moléculaire La préparation des lames pour le peignage est décrite en détail dans Marheineke et al. Premièrement les lamelles sont soigneusement nettoyées par traitement dans un four à plasma afin de les débarrasser de toute trace de matière organique. Les lamelles sont ensuite soniquées dans de l'heptane pur pendant 10 minutes puis une couche de silane est déposée par incubation pendant 16 heures dans une solution de 100 ml d'heptane additionnée de 100 µl de octenyltrichlorosilane. Les lamelles sont ensuite soniquées 5 minutes chaque fois dans une succession de liquide : heptane, eau, 50% méthanol/eau, eau, chloroforme, eau, 50% méthanol/eau, eau puis 2 minutes dans du chloroforme. Les lamelles sont finalement séchées à l'air. 3°) Peignage moléculaire L'ADN marqué à l'étape 1 dans un volume de 50 µl est incubé pendant 30 minutes à 65°C, refroidi, puis incubé 30 minutes à température ambiante. L'ADN est dilué dans 1.2 ml de solution MES à pH 5.7-6.2. Le mélange est introduit dans le réservoir de l'appareil à peignage. Une lamelle préparée à l'étape 2°) est fixée à l'emplacement prévu dans l'appareil à peignage et immergée dans la solution d'ADN pendant 5 minutes. La lamelle est retirée à vitesse constante de 300 µm / s, ce qui provoque le peignage de l'ADN sur les deux faces de la lamelle. Celle-ci est ensuite séchée à l'air et fixée sur une lame de verre. Le peignage de l'ADN est visualisé au microscope optique équipé d'un objectif 100X, une immersion à l'huile et un filtre FITC. 4°) Acquisition des images Les lamelles sont placées sous l'objectif 100X d'un microscope optique équipé d'une caméra CCD (type CoolSnap HQ, Photometrics) possédant une grille de 512 x 512 photocapteurs de 6,5 µm . Une lumière excitatrice de 510 nm est appliquée par une lumière laser, et un filtre adapté est utilisé pour collecter les signaux. Des images 16-bit TIFF sont capturées et transmises pour analyse aux systèmes informatiques (figure 1). 5°) Analyse d'image Un exemple d'image obtenue par cette méthode est donné en figure 1, et un exemple de résultat d'analyse de l'image est donné en figure 2. La trace lumineuse convertie en unités de fluorescence représente la signature numérique de cette molécule d'ADN.

On observe une trace rectiligne verticale correspondant à une molécule individuelle d'un fragment d'ADN d'environ 30000 bases marqué par des molécules de rhodamine fluorescentes fixées de manière covalentes sur des bases dUTP, un analogie de la thymidine (figure 1). Les points lumineux épars correspondent à du bruit de fond. Sur la figure 2, le signal lumineux a été converti en unités de florescence arbitraires par un 10 logiciel d'analyse d'image (ImageJ; courbe rose - courbe du haut) tandis qu'un échantillon représentatif du bruit de fond environnant est représenté par la courbe bleue (courbe du bas).

Exemple 2. marquage par hybridation d'oligonucléotides fluorescents Une signature spécifique de molécule d'ADN peut être obtenue par hybridation sur ces 15 molécules de courtes séquences d'ADN (oligoméres) marquées lors de leur synthèse et donc de manière covalente par une molécule fluorescente. Le procédé comprend quatre étapes principales : 1) le peignage de l'ADN de haut poids moléculaire (par exemple : ADN génomique) sur des lames de verre comme décrit ci-dessus (cet ADN n'est pas marqué par des molécules 20 fluorescentes. 2) l'hybridation de cet ADN par des oligoméres simple brin de 10 à 15 bases, associant des séquences connues et aléatoires comme décrit ci-dessus, et connues pour être répartie à peu prés uniformément dans le génome d'intérêt. Ces oligoméres comportent à l'une de leurs extrémités une ou plusieurs molécules fluorescentes. L'hybridation résulte en l'attachement, 25 par complémentarité de bases, des oligoméres sur les molécules d'ADN peignées, à des positions dépendantes de la séquence de celles-ci. 3) Des images des molécules d'ADN peignées sont réalisées en hyper résolution (Système TIRF et STORM). 4) une analyse informatique des images convertit la séquence des signaux lumineux générés 30 par les oligoméres, et la distance qui les sépare, en signature spécifique de chaque molécule d'ADN peigné. L'utilisation de différents types de fluorophores, chacun associé à une séquence d'oligonucleotide spécifique, peut permettre d'obtenir un signal d'une complexité accrue, qui à son tour augmente la spécificité des signatures.

Références Bertero et P. Boccacci, 1998, "Introduction to Inverse Problems in Imaging" (IOP Publishing, Bristol) Betzig et al., "Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution", Science, 2006, 1642-1645 Blow et al., "Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell free extract of Xenopus eggs", Cell, 1986, 47, 577 - 587 Donoho et al., "Nonlinear Solution of Linear Inverse Problem by Wavelet-Vaguelette Decomposition", Appl. Comput. Harmon. Anal., 2 (1995), 101-126 Marheineke, et al., "Use of DNA combing to study DNA replication in Xenopus and human cell free systems", Methods in Molecular Biology, DNA replication: Methods and Protocols, 2009, 521,575-60 Mortensen et al., "Optimized localization analysis for single-molecule tracking and superresolution microscopy", Nature Methods 7, 2010, 377 - 381 Neely et al., "DNA fluorocode: a single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution", Chem. Sci., 2010, 1, 453-460 Rust et al., "Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)", Nat Methods, 2006, 793-795 Zink et al., "Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo"; Hum Genet.; 1998 Feb; 102(2):241-51

Claims (13)

1. REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'une signature spécifique d'une molécule d'ADN, comprenant: a) le marquage d'une molécule d'ADN - par incorporation d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une réaction de polymérisation d'ADN, le nucléotide modifié étant détectable, ou étant susceptible d'être modifié de manière à être détectable; ou - par hybridation d'un ou plusieurs oligonucléotides marqués, lesdits oligonucléotides étant de taille comprise entre 10 et 15 nucléotides; ou - par mise en contact de l'ADN avec une molécule intercalante fluorescente ; b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide ; c) la détection du marquage le long de l'ADN au moyen d'un dispositif optique adapté, moyennant quoi une signature spécifique de ladite séquence ADN est obtenue. 15
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la molécule d'ADN a une taille supérieure à 50 kb, de préférence supérieure à 60 kb, de manière plus préférée supérieure à 100 kb, de manière encore plus préférée supérieure à 200 kb.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, l'étape a) de marquage comprenant l'incorporation 20 d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une réaction de polymérisation d'ADN in vitro avec la polymérase Phi29.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, la détection à l'étape c) mettant en oeuvre un système TIRF.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, la détection à l'étape c) mettant en oeuvre un système STORM.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'étape 30 d'immobilisation et d'étirement b) précède l'étape de marquage a).
7. 7. Procédé pour l'identification d'une molécule d'ADN comprenant: i) l'obtention de la signature de ladite molécule d'ADN selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 6; et 10 25ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) à des signatures prédéterminées de molécules d'ADN de référence; la comparaison permettant d'identifier la molécule d'ADN.
8. 8. Procédé pour l'identification d'une anomalie génomique chez un sujet comprenant: i) l'obtention de la signature moléculaire d'une molécule d'ADN génomique d'un tissu ou d'une cellule d'un sujet, selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 6; ii) la comparaison de la signature obtenue à l'étape i) aux signatures prédéterminées de 10 molécules d'ADN de référence provenant - d'un sujet sain et/ou - d'un sujets malades, leur maladie résultant d'une altération du génome d'une ou plusieurs de leurs cellules; afin d'identifier ladite molécule d'ADN génomique ; 15 une anomalie génomique étant détectée - si la signature de l'ADN génomique du sujet diffère des signatures des molécules d'ADN de référence dans le cas de molécules d'ADN de référence provenant de sujet sain, ou - si la signature de l'ADN génomique testé correspond à au moins l'une des signatures de référence provenant d'un sujet malade. 20
9. 9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre - l'obtention à l'étape i) de la signature de plusieurs fragments d'ADN génomique et leur concaténation sur la base de chevauchement de signatures; - le(s) concaténât étant ensuite comparé(s) aux séquences de références pour identifier 25 le(s)dit(s) concaténât; une anomalie génomique étant détectée si un concaténât diffère de la molécule d'ADN de référence ayant permis de l'identifier.
10. 10. Procédé selon la revendication 8, pour l'identification d'une molécule d'ADN 30 complémentaire, la signature dudit ADN complémentaire étant comparée aux signatures d'un ensemble de molécule d'ADN complémentaire de référence.
11. 11. Procédé d'obtention de la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN comprenant:a) le marquage d'une molécule d'ADN par incorporation d'au moins un nucléotide modifié au cours d'une ou plusieurs réactions indépendantes de polymérisation d'ADN, le(s) nucléotide(s) modifié(s) étant détectable(s), ou étant susceptible(s) d'être modifié(s) de manière à être détectable(s); b) l'immobilisation et l'étirement de l'ADN marqué sur une surface solide; c) la détection du marquage au moyen d'un dispositif optique et d'un moyen de traitement adapté pour obtenir une information de résolution inférieure ou égale à 0,5 nm.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la molécule d'ADN est un ADN génomique ou un ADN complémentaire.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel l'étape d'immobilisation et d'étirement est réalisé en utilisant la technique de peignage moléculaire.15