FR2890978A1 - Procede de detection, dans un echantillon biologique de mycobacteries, et en particulier de mycobacteries caracteristiques de la tuberculose. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend une étape d'amplification avec un couple d'amorces de PCR et un couple de sondes FRET issus du gène hsp 65 et la détection de la fluorescence émise.

Description

La présente invention est relative à une méthode de détection dans un

échantillon biologique, des mycobactéries en particulier, celles responsables de la tuberculose.

La tuberculose demeure l'un des problèmes majeurs de santé publique dans le monde. En France, c'est une maladie qui reste d'actualité avec, chez les personnes migrantes, une incidence 13 fois supérieure au reste de la population et qui augmente de 8% chaque année depuis 1997. La multirésistance touche surtout les migrants (82%), mais bien que limitée (1,4%), elle a presque doublé en deux ans.

Il est très difficile de combattre la tuberculose, ainsi que les autres infections dues aux mycobactéries. Il existe donc un besoin de méthodes rapides, spécifiques et sensibles permettant de diagnostiquer ces infections. En particulier, la détection rapide et exacte du complexe Mycobacterium tubercu/osis (Mt-Cc) est essentielle pour le traitement précoce et la réduction de la transmission. Le complexe Mycobacterium tubercu/osis (Max) comprend 5 espèces de mycobactéries, à savoir M, tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti et M. canettii. Le genre Mycobacterium comprend, quant à lui, plus de 100 espèces.

La détection de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) dans des frottis préparés à partir de prélèvements biologiques a été la base de l'identification rapide d'individus potentiellement porteurs de la tuberculose. Néanmoins, le frottis manque de spécificité et de sensibilité. C'est pourquoi la mise en culture demeure indispensable. Cependant, l'obtention d'une croissance bactérienne peut demander plusieurs semaines.

Les essais d'amplification d'acide nucléique sont de plus en plus utilisés dans les tests de diagnostic. La détection par PCR (de l'anglais polymerase chain reaction ) d'ADN spécifique d'espèces ou du genre mycobactéries constitue donc une approche très prometteuse.

Le principe de base d'un essai diagnostique moléculaire quelconque est d'effectuer une hybridation d'une séquence d'acide nucléique spécifique à la bactérie que l'on souhaite détecter, à une séquence complémentaire nommée sonde, puis de réaliser une détection de l'hybride.

Les tests mettant en oeuvre la PCR pour la détection de Mtbc sont proches de la sensibilité et de la spécificité de la culture, mais présentent l'avantage d'être plus rapides. En raison de sa capacité à amplifier spécifiquement des quantités infimes d'acides nucléiques, la PCR a été appliquée avec un grand succès dans des diagnostics cliniques.

La PCR est généralement réalisée sur une matrice d'ADN préalablement extraite de l'échantillon biologique. Des procédures relativement simples, bien connues de l'homme de l'art, permettent d'extraire des acides nucléiques à partir de spécimens cliniques. Néanmoins, les acides nucléiques extraits peuvent contenir des impuretés qui inhibent les essais d'amplification d'acide nucléique. Des résultats négatifs n'indiquent, alors, pas nécessairement l'absence de l'acide nucléique recherché. En raison de cette possibilité de réactions faussement négatives, l'utilisation de tests d'amplification d'acide nucléique a été remise en question.

Par ailleurs, la PCR a connu des progrès récents, avec le développement de la PCR en temps réel qui a simplifié et accéléré considérablement la PCR. Pour plus de précisions sur cette technique, on pourra se référer à Reviews in Biology and Biotechnology, 2(23), 2002, 2-11. Le système LightCycler , commercialisé par Roche Diagnostics, combine la PCR avec la détection en temps réel des produits d'hybridation à l'aide de deux sondes d'hybridation fluorogènes qui utilisent le principe de transfert d'énergie de résonance par fluorescence (FRET) et qui permet d'obtenir des résultats beaucoup plus rapides. Ce système a été utilisé avec succès pour la détection ou l'identification rapide de différents micro- organismes (virus, parasites, champignons et bactéries). Il a été également démontré que la PCR en temps réel avec des sondes fluorogènes est utile pour la détection de mycobactéries, comprenant le complexe M. tubercu/osis Les travaux utilisant la technique de PCR en temps réel amplifient, soit le gène 16S (Shrestha N. K. et J. Clin. Microbiol. 2003; 41:5121-6, Lachnick J. et J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3364-73, Burggraf S. et a/., J. Clin. Microbiol. 2005; 43:1564-9), soit I'ITS (Kraus G. et Molecular and Cellular probes. 2001; 15: 375-83, Bruijnesteijn van Coppenraet E. S. et a/., J. Clin. Microbiol.

2890978 3 2004; 42: 2644-50), soit l'IS 6110 (Cleary T. J. et al., 3. Clin. Microbiol. 2003; 41:4783-6, Lemaitre N. et J. Clin. Microbiol. 2004; 42:4307-9). Pour l'instant, les travaux basés sur le gène hsp 65, ont permis soit d'identifier les mycobactéries par séquençage, mais sans utilisation de la technique PCR en temps réel (Ringuet H. et J. Clin. Microbiol. 1999; 37:852-7), soit seulement de différencier les souches de M. abscessus de M. the%onae(Sedlacek L. et J. Clin. Microbiol. 2004; 42:3284-7).

Dans ce contexte, un des objectifs de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode de détection du complexe M. tubercu/osis qui présente une sensibilité améliorée par rapport aux techniques PCR existantes (104 105 CFU/ml).

La nouvelle méthode de détection selon l'invention se doit également d'être d'un emploi aisé, et d'être au moins aussi rapide que les techniques actuelles qui sont consommatrices de temps et de réactifs.

Dans ce contexte, la présente invention a pour objet principal un procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend les étapes suivantes: (i) amplification de l'ADN de l'échantillon biologique, avec un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, l'une des amorces présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 1: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 2: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, et un couple de sondes FRET du Mtbc constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et - d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur et (ii) détection de la fluorescence émise pour en déduire la présence éventuelle de bactéries que l'on cherche à détecter.

Le procédé selon l'invention permet de détecter la présence des bactéries appartenant à Mtbc.

Selon une première variante préférée, le procédé de détection selon l'invention permet également de détecter les autres espèces du genre 15 Mycobacterium. Dans ce cas, lors de l'étape (i), on utilise un deuxième couple de sondes FRET du genre Mycobacterium constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.

Selon une autre variante préférée, le procédé selon l'invention utilise un contrôle interne (CI). Dans ce cas, lors de l'étape (i), l'ADN de l'échantillon biologique est également mis en présence d'un CI d'une part et d'un troisième couple de sondes FRET spécifique du CI d'autre part, avantageusement constitué : 2890978 5 d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.

Selon une autre variante préférée, lorsqu'une fluorescence résultant de l'hybridation des sondes du genre Mycobacterium, est détectée, ce qui signifie qu'une espèce de mycobactéries est détectée dans l'échantillon, alors qu'aucune fluorescence résultant de l'hybridation des sondes spécifiques de Mtbc, n'est détectée, l'identification de l'espèce présente est alors réalisée par séquençage grâce à une amorce de séquençage qui comprend de 18 à 28 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A. L'Invention a également pour objet les différentes variantes du procédé telles que définies aux revendications 2 à 11.

L'invention concerne également une trousse de diagnostic pour la 25 détection in vitro de mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tub ercu/osis dans un échantillon biologique comprenant: - un couple d'amorces, nommées amorces de PCR, dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, l'une des amorces présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 1: 5'- ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présentant au moins 90%, 2890978 6 préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 2: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification d'un fragment d'acides nucléiques présentant une zone spécifique du genre Mycobacterium et éventuellement une zone spécifique du complexe Mycobacterium tubercu/osis à l'aide des dites amorces, - un couple de sondes FRET spécifique de Mtbc constitué : É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.

Selon une variante préférée, la trousse de diagnostic comprend également un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué : d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine et d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.

Selon une autre variante préférée, la trousse de diagnostic comprend également un contrôle interne (CI) et un couple de sondes FRET spécifique du CI. De façon préférée, le contrôle interne est une séquence nucléotidique double brin de séquences: SEQ ID N 10: 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' et le couple de sondes FRET spécifiques du CI est constitué : - d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, - et d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 8: 5'CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome 20 accepteur, avantageusement LC Red705.

La présente invention a également pour objet les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec l'une des séquences suivantes: SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G et SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, particulièrement adaptés pour servir de sondes d'hybridation.

En particulier, l'invention a également pour objet lesdits oligonucléotides marqués avec un fluorochrome et en particulier: - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GM GGT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC R.ed640; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.

L'invention a également pour objet les oligonucléotides de 18 à 28 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% 2890978 9 et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A. Ces oligonucléotides sont particulièrement adaptés au séquençage des produits d'amplification obtenus dans le cadre de l'invention, qui correspondent à l'ADN d'une espèce appartenant au genre Mycobacterium.

L'invention va maintenant être décrite en détails.

Les termes acide nucléique , séquence nucléique , séquence d'acide nucléique , séquence nucléotidique , oligonucléotide seront employés indifféremment dans la présente description, pour désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, qui peut correspondre aussi bien à un ADN double brin, qu'à un ADN ou ARN simple brin ou aux produits de transcription desdits ADNs. De préférence, et sauf mention contraire, ces termes désigneront de préférence un ADN simple brin.

Le pourcentage d'identité de séquences, est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences nucléiques, réalisées après alignement. Les alignements de séquences sont réalisés, par exemple, avec le logiciel SeaView (Galtier et a/. Comput. Applic. Biosci., 12, 543-548, 1996) qui utilise le programme d'alignement Clustal_w, développé par Thompson et a/. Nucleic Acid Res. 22, 4673- 4680, 1994). Après alignement, le pourcentage d'identité de séquence est alors calculé entre les deux fragments alignés de même longueur, en comptant manuellement ou à l'aide d'un logiciel commercial, le nombre de bases identiques et en le divisant par la longueur du fragment x 100 sur lequel la comparaison a été réalisée.

La réaction de PCR en temps réel est réalisée sur l'ADN d'un échantillon biologique. Cet ADN peut être soit directement extrait de l'échantillon biologique, soit c'est l'ARN de l'échantillon biologique qui peut être extrait et transformé en ADN par une enzyme de transcription inverse. Les techniques d'extraction d'ADN ou d'ARN sont bien connues de l'homme du métier.

Par échantillon biologique, on entend un échantillon contenant de la matière biologique. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement biologique effectué chez un être vivant (patient humain, animal, végétal), d'une culture bactérienne ou d'un prélèvement effectué dans le sol, des eaux... En particulier, tous les types de prélèvements cliniques ou cultures biologiques pouvant contenir des populations bactériennes comme des cellules, des tissus, des sécrétions biologiques ou des liquides biologiques sont utilisables dans le procédé objet de l'invention. Les échantillons biologiques selon l'invention sont avantageusement issus de prélèvements broncho-pulmonaires de patients.

La présente invention utilise la technique de PCR en temps réel, qui peut notamment être mise en oeuvre sur l'appareil LightCycler 2.0, commercialisé par Roche Diagnostics. Tout autre appareil permettant de réaliser une PCR en temps réel peut bien entendu être utilisé. La PCR en temps réel permet en une seule expérience, de réaliser à la fois l'amplification génique et la détection, ce qui entraîne un gain de temps considérable.

Chaque amplification génique de l'ADN cible comprend son hybridation avec un couple de sondes FRET et un couple d'amorce et son extension avec une ADN polymérase. Plus précisément, chaque cycle de PCR en temps réel comprend les étapes successives suivantes: - une étape de dénaturation, durant laquelle l'ADN double brin contenu dans le mélange réactionnel est chauffé pour provoquer la séparation des 2 brins d'ADN. L'ADN cible, les amorces et les sondes sont alors simple brin. Le fluorochrome donneur est excité, dans le cas de la fluorescéine par une lumière bleue à 470nm, et émet une lumière verte à 530 nm dans le cas de la fluorescéine.

- une étape d'hybridation réalisée à une température plus basse pendant laquelle, les amorces de la PCR ainsi que les sondes d'hybridation s'hybrident à leurs régions complémentaires. Le fluorochrome donneur vient alors à proximité du fluorochrome accepteur et l'énergie émise par le fluorochrome donneur excite le fluorochrome récepteur qui émet alors dans la lumière rouge, notamment à 610, 640, 670, 705 nm, en fonction du fluorochrome sélectionné. La lumière rouge émise est alors mesurée.

2890978 11 - une étape d'extension, dans laquelle, après l'hybridation sur les régions cibles, l'ADN cible est amplifié à partir des amorces par une ADN polymérase. A la fin du cycle, la quantité d'ADN cible a doublé et une fois que l'élongation approche de la fin, l'ADN est double brin. Les sondes d'hybridation ont été déplacées de leur zone cible, - une étape de détection de la fluorescence émise.

En général, au moins 30, de préférence au moins 45 cycles de PCR sont réalisés pour obtenir une mesure de fluorescence satisfaisante.

Dans le cadre de l'invention, c'est une partie du gène hsp65 (Telenti et J. Clin. Microbiol. 1993, 31:175-8) qui a été choisi pour être amplifié. L'amplification d'une partie du gène hsp65, comportant une partie spécifique du genre Mycobacterium qui inclut une sous-partie spécifique de Mtbc, est réalisée, de préférence, à partir du couple d'amorces suivant: SEQ ID N 1: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et SEQ ID N 2: 5'CTTGTCGAACCGCATACCCT.

La détection par sondes FRET est réalisée en utilisant deux sondes marquées par deux fluorochromes différents: une sonde d'ancrage, porteuse d'un fluorochrome ou fluorophore donneur (par exemple, la fluorescéine), de préférence en position 3', c'est-à-dire émetteur de photons; cette sonde va venir s'hybrider sur une zone de la séquence d'acides nucléiques cible dont on cherche à détecter la présence, et - une sonde d'hybridation qui s'hybride avec la séquence d'acides nucléiques cible, dont on cherche à détecter la présence, qui est très proche, le plus souvent séparée de une ou deux paires de nucléotides, de la zone sur laquelle se lie la sonde d'ancrage; cette sonde d'hybridation est porteuse, de préférence en position 5', d'un autre fluorochrome, nommé accepteur ou quencher (par exemple, des dérivés de rhodamine tels que LC Red640, LC Red670, LC Red705, commercialisés par Roche Diagnostics ou des dérivés de cyanine tels que Cy5, Cy5.5 commercialisés par Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) qui va capter les photons du fluorochrome donneur et les réémettre à une autre longueur d'onde. Concernant les fluorochromes donneurs et accepteurs pouvant être utilisés, on pourra, par exemple, se référer à la demande de brevet US2004/0076979 décrivant de tels fluorophores. Le florophore LC Red-640 présente, par exemple, la formule: et ci et le couplage avec I'oligonucléotide se faisant par l'intermédiaire de la fonction / -succinimide.

L'utilisation d'un couple de sondes FRET permet de réaliser une courbe de fusion après chauffage progressif, jusqu'à une température de 80-90 C par exemple, des produits d'amplification obtenus en fin de PCR. Les doubles brins des produits d'amplifications et, notamment ceux porteurs des sondes marquées se dissocient. La fluorescence diminue jusqu'à disparition totale. La fluorescence ainsi mesurée, pendant ce chauffage progressif, va produire une courbe dont l'appareil calcule la dérivée première pour avoir une courbe en cloche . Cette courbe permet de définir un Tm (température de fusion du produit d'amplification) qui est une caractéristique du produit d'amplification obtenu dans les conditions expérimentales. Le procédé selon l'invention, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacterium ou Mtbc, comportera avantageusement une étape de détermination de la courbe de fusion du produit d'amplification et une détermination de la température de fusion du produit d'amplification obtenu.

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Les sondes FRET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du complexe Mtbc: - en tant que sonde d'ancrage: séquence nucléotidique de séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplée de préférence en 5 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, - en tant que sonde d'hybridation: séquence nucléotidique de SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplée de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.

Lorsque le procédé selon l'invention permet également la détection 10 d'espèces du genre Mycobacterium, autres que Mtbc, les sondes FRET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du genre Mycobacterium: - en tant que sonde d'ancrage: séquence nucléotidique de SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, couplée de préférence en 3' à un 15 fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, - en tant que sonde d'hybridation: séquence nucléotidique de SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, couplée de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.

Selon une variante préférée de l'invention, on utilise un contrôle interne (CI) pour vérifier l'amplification. Le CI est une cible, autre que l'ADN cible spécifique de l'espèce que l'on souhaite détecter. Aussi, une détection positive du produit d'hybridation du CI démontre que la réaction d'amplification a bien eu lieu, et valide alors une réponse négative.

On qualifie de réponse négative, une absence de détection de fluorescence à la longueur d'onde où le fluorochrome accepteur du couple de sondes correspondant aurait émis, si le dit couple de sondes s'était hybridé sur un ADN cible. De même, on qualifie de réponse positive, une détection de fluorescence à cette même longueur d'onde.

Ce CI permet de vérifier si la détection est négative, par absence d'ADN cible ou par inhibition de l'amplification. La construction de ce CI synthétique peut être réalisée avec, d'une part des régions identiques aux amorces utilisées pour l'amplification des fragments spécifiques des espèces dont on souhaite détecter la présence et, d'autre part, une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui différencie le CI de l'acide nucléique cible amplifié. C'est-à-dire que la région de liaison est choisie de manière telle qu'elle ne s'hybride pas avec les sondes spécifiques de Mtbc et de Mycobacterium. Un segment d'ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) flanquée à ses deux extrémités par deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces ou à leurs séquences inverses est avantageusement choisi en tant que témoin interne.

En particulier, on utilisera un CI double brin, de séquences: SEQ ID N 10: 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGIIIIGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' Le contrôle interne peut être un vecteur d'expression tel qu'un plasmide contenant les séquences des amorces nécessaires à l'amplification de Mtbc, ainsi qu'une zone nucléotidique qui ne correspond pas à une zone de l'ADN des mycobactéries et pour laquelle une sonde FRET a été construite. L'insertion dans un plasmide, avantageusement d'Escherichia co/i, permet d'améliorer sa conservation.

Un nombre limité de molécules de CI, avantageusement de l'ordre de 3 à 6 copies, est ajouté à chaque échantillon d'ADN extrait et co-amplifié avec 25 l'acide nucléique cible.

Les sondes FRET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du CI: - en tant que sonde d'ancrage, un oligonucléotide deséquence nucléotidique de SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, couplé de préférence en 3', à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, - en tant que sonde d'hybridation, un oligonucléotide de séquence nucléotidique de SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.

Quand différents couples de sondes sont utilisés (par exemple un pour Mtbc complexe et un pour le genre Mycobacterium et/ou un pour le CI), les différentes sondes d'hybridation sont, marquées avec des fluorochromes accepteurs différents, pour pouvoir distinguer lors de la détection les différents complexes d'hybridation éventuellement obtenus. Dans le cas où l'on souhaite détecter plusieurs fragments spécifiques amplifiés (par exemple un fragment spécifique de Mtbc complexe, fragment spécifique de Mycobacterium, fragment spécifique du CI), les différents couples de sondes sont ajoutés au mélange réactionnel contenant l'ADN bactérien extrait, avant de réaliser l'amplification.

Dans la variante préférée de l'invention, trois couples de sondes FRET, décrites ci-dessus sont utilisés simultanément: un couple de sondes pour Mtbc complexe, un couple de sondes pour le genre Mycobacterium et un couple de sondes pour le CI.

La PCR est avantageusement de type touchdown , c'est-à-dire que dans les premiers cycles de PCR, l'hybridation est réalisée à une température d'hybridation élevée et donc spécifique. Après un certain nombre de cycles, la température d'hybridation est abaissée jusqu'à la température optimale d'hybridation des amorces, pendant un nombre de cycles suffisant pour obtenir suffisamment d'ADN amplifié. Dans le cadre de l'invention, dans les premiers cycles de PCR (par exemple dans les 16 premiers cycles), la température d'hybridation diminue, de préférence, de 68 C à 60 C, température optimale pour les cycles suivants.

De façon avantageuse, lorsque la détection montre la présence de mycobactéries qui ne correspondent pas à Mtbc, le procédé selon l'invention, comprend une étape de séquençage qui permet d'identifier l'espèce bactérienne, notamment les mycobactéries atypiques, ou l'espèce non cultivable M. /eprae. Le séquençage est, de préférence, réalisé, avec l'amorce nucléotidique de SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A. Bien entendu, les amorces et sondes selon l'invention peuvent être préparées selon des techniques de synthèse chimique classique.

Le procédé selon l'invention, dans sa variante la plus complète, permet donc l'amplification de toutes les mycobactéries avec: 1. une détection spécifique du Mtbc, avec un premier couple de sondes FRET' ; 2. une détection spécifique du genre Mycobacterium, avec un deuxième couple de sondes FRET; 3. une fiabilité des résultats de détection obtenus par utilisation d'un contrôle interne qui permet de s'assurer de la réelle négativité des résultats; 4. l'identification des Mycobactéries autres que celles de Mtbc qui est réalisée par séquençage du produit d'amplification, directement à partir de l'ADN du capillaire du LightCycler.

Les résultats obtenus à partir de suspensions bactériennes et à partir de crachats enrichis en bactéries, montrent que la sensibilité de la méthode selon l'invention, est d'environ 5 x 103 CFU/ml, soit 2x103 CFU par prise d'essai de 400 pl.

Les sondes pour la détection de Mtbc ont été testées et ont abouti à un résultat: 1. positif chez tous les membres de Mycobacterium tuberculosis corn plex, 2. négatif pour 83 Mycobactéries atypiques des 100 espèces décrites, ainsi que pour 16 espèces de Corynebacter/um, 4 espèces de Nocardia et 2 espèces de Prop/onibacterium (acnes et granu/osum).

La sensibilité obtenue, pour la détection de Mtbc, à partir de l'analyse de 158 échantillons cliniques était de 93,1% avec une spécificité de 92, 2%.

La durée totale de l'analyse avec la méthode selon l'invention peut être de 3 heures, dont 1 heure pour l'extraction, alors que les techniques classiques de PCR nécessitent en moyenne 8 heures. Par ailleurs, les techniques en temps réel, précédemment utilisées, ne permettent pas la détection simultanée du contrôle interne, des Mycobactéries et de Mtbc.

La description qui va suivre, en référence aux FIGURES 1A et 1B annexées, est relative à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention avec une PCR multiplexe réalisée sur un appareil LightCycler 2.0, commercialisé par la société Roche Diagnostics (Meylan France) permet d'illustrer l'invention, mais n'a aucun caractère limitatif.

Souches La plupart des souches bactériennes proviennent de la collection CIP (Collection Institut Pasteur de Paris), à l'exception de Mycobacterium /eprae identifiée par séquençage direct du gène hsp65 à partir de deux échantillons humains positifs.

Extraction L'ADN bactérien de souches de référence est extrait en utilisant une solution d'achromopeptidase à 5 Ulm! (15 min à 55 C). Après une brève centrifugation, le lysat brut est utilisé en tant que matrice pour la détermination de la spécificité.

Pour la détermination de la sensibilité, une dilution en série de 109 bactéries par ml est effectuée. Les dilutions sont extraites avec le réactif High Pure PCR Template Preparation kit (Roche Diagnostics Meylan France) ainsi que tous les échantillons. Pour augmenter la sensibilité, 400 pl d'échantillon sont extraits, conformément aux instructions du fabricant, sauf pour l'élution d'ADN qui est effectuée avec 50 pl de tampon d'élution au lieu de 200 pl.

Détection de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tubercu/osis et au genre Mycobacterium Amorces et sondes de PCR Pour l'amplification du gène hsp65, un fragment de 439 pb est amplifié 30 en utilisant des amorces Tb11 de SEQ ID N 1 et Tb12 de SEQ ID N 2.

Des sondes ont été conçues par comparaison des séquences hsp65 de différentes mycobactéries précédemment publiées. Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du complexe Mtbc: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA-fluorescéine (SEQ ID N 3- fluorescéine) en tant que sonde d'ancrage et: LC Red640-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT-phosphate (LC Red640-SEQ ID N 4) en tant que sonde d'hybridation.

Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du genre Mycobacterium: 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG -fluorescéine (SEQ ID N 5fluorescéine) en tant que sonde d'ancrage et: LC Red670-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT -phosphate (LC Red670-SEQ ID N 6) en tant que sonde d'hybridation.

Construction du Cl Une séquence est construite en insérant une séquence d'ADN du CI dans un plasmide d'ADN.

Un segment d'ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) flanquée à ses deux extrémités de deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces est choisi en tant que contrôle interne.

Des amorces hybrides CIBK1 et CIBK2 sont synthétisées avec des amorces de hsp65 précédemment décrites par Telenti et al. 1993, supra. 20 CIBK1 (sens) : SEQ ID N 11: ACCAACGATGGTGTGTCCATGCACAGAACGAAAAAGGTGAGC et CIBK2 (antisens) : SEQ ID N 12: CTTGTCGAACCGCATACCCTAGAAAACGGGCGTAAACCTT Les caractères gras indiquent les amorces de gène hsp65 externes et les caractères normaux indiquent les amorces pour l'ADN du phage lambda.

L'ADN hybride est amplifié à partir des amorces CIBK1 et CIBK2 avec l'ADN de phage lambda en tant que matrice (Roche Diagnostics), de l'ADN polymérase (pureTaq Ready to Go PCR -Amersham Biosciences) à l'aide d'un thermocycleur conventionnel (95 C, 2 min, puis 35 cycles avec 94 C 30 s, 60 C 1 min, 72 C 1 min puis 72 C 10 min pour assurer une réaction complète).

Les produits amplifiés (5 pl) sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (gels E-Gel Agarose 1,2 %, Invitrogen Life Technologies) puis visualisés sous lumière UV pour contrôler l'amplification d'ADN.

Le fragment hybride résultant (300 pb) consiste en une séquence 5 double brin de phage lambda pf (216 pb) flanquée aux deux extrémités par deux séquences courtes de Mtbc (20 pb).

SEQ ID N 10 (sens) : 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGIIIIGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' Les séquences de bordure (en gras) sont complémentaires des amorces Tbll et Tb12 et sont des cibles pour ces amorces.

Afin d'améliorer sa conservation, l'ADN hybride phage lambda-Mtbc est ensuite cloné dans un plasmide d'Escherichia co/i (plasmide pCR 2.1-TOPO 3,9 kb; kit de clonage TOPO TA, Invitrogen Life Technologies, 95613 Cergy Pontoise) conformément aux instructions du fabricant. Après une croissance exponentielle, E. col/ est ensemencé sur des milieux sélectifs contenant de l'ampicilline et X-Gal (LB Agar Amp IPTG/X-Gal E. coli FastMediaTM MBI Fermentas) et incubées 18 heures à 35 C.

Environ dix colonies blanches contenant le segment d'insertion sont cultivées pendant 6 heures dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (LB Liquid Amp E. coli FastMediaTM MBI Fermentas).

Les plasmides contenant le segment d'insertion sont purifiés avec le kit miniprep Wizard Plus (Promega Charbonnières-les-Bains - France) et linéarisés avec l'enzyme Xba/ (Promega). L'enzyme est dénaturée à 94 C pendant 10 min. Le segment d'insertion est purifié avec le kit miniprep Wizard Plus (Promega). Les produits (5 pl) sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (gels E-Gel Agarose 1,2 %, Invitrogen Life Technologies). Le gel est visualisé sous lumière UV.

2890978 20 La concentration optimale du plasmide est déterminée par dilution de 10-1 à 10-10, afin de réduire au minimum la compétition entre l'ADN cible spécifique de Mtbc complexe et l'ADN cible du CI durant l'amplification.

Le programme d'amplification est le même que pour Mycobacterium 5 tubercu/osis complexe.

Des sondes sont conçues par comparaison à une séquence précédemment décrite de phage lambda.

Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du CI: 5'AGTACGCCCCACGCTGACGG-fluorescéine (SEQ ID N 7- fluorescéine), en tant que sonde d'ancrage et LC Red705-CTAACCTGTACGGTATGGTCAC-phosphate (LC Red705SEQ ID N 8) en tant que sonde d'hybridation.

Protocole LightCycler Le mélange réactionnel (LC FastStart DNA Master Hybridisation Probes (Roche Biochemicals) contenant la polymérase Taq FastStart, le tampon de réaction, des désoxynucléosides triphosphates est complété avec MgCl2 de façon à obtenir 2,5mM en final. Après avoir ajouté les amorces à une concentration finale de 0,53 pM et les trois couples de sondes d'ADN à 0,2 pM chacune et le CI à raison de 3 à 6 copies, le mélange réactionnel est introduit dans une cuve de réaction située audessus d'un capillaire en verre (20 pl). Après l'ajout de la matrice d'ADN, les capillaires en verre sont remplis par une brève centrifugation pour déplacer le liquide au fond du capillaire.

Le programme d'amplification commence par une étape de dénaturation de 10 min à 95 C, suivie par 55 cycles de PCR avec 1 cycle de dénaturation (15 s à 95 C), une hybridation "touchdown" (30 s à une température allant de 68 C à 60 C, pas de 0,5 C/cycle) et extension (30 s à 72 C). La vitesse de transition de température est de 20 C/s pour la dénaturation et l'hybridation et de 2 C/s pour l'extension. Le programme d'amplification est suivi par un refroidissement de 30 s à 40 C.

La version 4 du logiciel du LightCycler ajuste le gain dans chaque canal. Un essai de compensation de couleur est conduit et les données de compensation de couleur sont enregistrées dans le logiciel du LightCycler.

2890978 21 Chaque essai du LightCycler comprend un témoin négatif dans lequel la matrice est remplacée par de l'eau distillée pour contrôler la contamination croisée et par un témoin positif contenant l'ADN à 106 CFU/ml.

Résultats Sensibilité et spécificité de la détection de Mtbc Afin de déterminer la limite inférieure de détection, des essais PCR sont conduits sur des dilutions en série de suspensions de Mycobacterium tubercu/osis H37rv (de 108 à 10 UFC/ml) et avec un crachat négatif auquel sont ajoutées les mêmes dilutions. L'extraction est effectuée avec le kit de préparation de matrice High Pure PCR Template preparation kit (Roche Diagnostics).

Dans les deux cas, la limite de détection est de 5 x 103 CFU/ml. Toutes les amplifications ont été effectuées avec le CI.

L'essai PCR est évalué avec différentes mycobactéries et avec d'autres bactéries (Tableau 1).

Tableau 1: Liste des espèces bactériennes testées pour la spécificité SOUCHES Code CIP Résultats de (Code dans la PCR banque de l'Institut Pasteur ou dans la collection allemande

DSMZ

M. africanum 105147T + M. tuberculosis sp tuberculosis 10595T + M. bovis 105234T + M, bovis (BCG) 10550T + M. tuberculosis ssp caprae 105776T + M. microti 104256T + M. avium s. si/vat/cum 103317T - M. alvei 103464T -22 TABLEAU 1 (suite 1) M. avium s. avium 104244T - M. abscessus 104536T -M. austroafricanum 105395T - M. brumae 103465T - M. ch/orophenoliticum 104189 - M. che/onae 104535T - M. branderi 104592T - M. chitae 105383 - M. ce/atum 106109Y - M. flavescens 104533T - M. fortuitum s. fortuitum 104534T - M. du val// 104539T - M. diernhoferi 105384T - M. cook/i 105396T - M. conf/uentis 105510T - M. fa/fax 81.89T - M. gordonae 104529T - M. gastri 104530T - M. hiberniae 104537T - M. hodleri 104909T - M. haemoph//um 10549T - M. hassiacum 105218T - M. gadium 105388T - M. xenopi 104035T - M. aichiense DSMZ44147 - M. triviale DSMZ 44153 M. nonchromogenicum DSMZ 44164 - M. frederiksbergense DSMZ 44346 - M. g/lvum DSMZ 44503 - M. botniense DSMZ 44537 - 23 TABLEAU 1 (suite 2) M. farcinogenes DSMZ 43637 - M. interjectum DSMZ 44064 - M. shimoidei DSMZ 44152 - M. porcinum DSMZ 44242 - M. asiaticum DSMZ 44297 - M. doricum DSMZ 44339 - M. heckeshornense DSMZ 44428 - M. genavense DSMZ 44424 - M. /eprae Echantillons - Corynebacterium macginleyi 105127T - Corynebacterium mastidis 105509T - J Corynebacterium durum 105490T - Corynebacterium argentoratense 104296T - Corynebacterium mycetoides 55- 51T -Corynebacterium matruchoti/ 81-82T - Cotynebacterium confusum 105403T -Corynebacterium striatum 81-15T - Corynebacterium auriscanis 106629T -Corynebacterium vitaeruminis 82-07T - Corynebacterium simulans 106488T -Corynebacter/um phocae 105741T - Corynebacterium pilosum 103422T -Corynebacterium ulcerans 106504T - Corynebacter/um felinum 106704T Corynebacterium kroppensstedtii DSMZ44385 - Propionibacterium acnes Echantillon - Propion/bacterium granulosum Echantil lon - Nocardia brasiliens/s Echantilion - Nocardia farcinica Echantillon - Nocardia otid/s Echantillon - Nocardia asteroides Echantillon - A la fin du Protocole Light cycler, le produit d'amplification est chauffé 30 s à 45 C puis jusqu'à 75 C à raison de 0,1 C/s avec mesure en continu de la fluorescence et sa courbe de fusion est déterminée grâce au logiciel par calcul de la dérivée première de la courbe obtenue par chauffage de l'ADN amplifié. Les courbes présentées FIGURE 1A et 1B (correspondant respectivement à la courbe de fusion et à la dérivé première de la courbe de fusion) sont alors obtenues. La température de fusion Tm du produit d'amplification, ainsi calculée est de 59,3 C. Le Tm de Mt/x est de 64 C 2 C et les Tm des autres espèces de mycobactéries se situant entre 49 et 58 C à + 2 C.

L'ADN amplifié du tube correspondant à ces courbes a été séquencé grâce au protocole suivant: Les amplicons sont purifiés avec l'enzyme Exosapt- IT (Amersham, Les Ulis, France) et séquencés dans un seul sens à l'aide de l'amorce de séquence SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A (1pM) en utilisant le kit de séquençage Beckman Coulter Dye Terminator Cycle (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La réaction utilise le programme suivant sur le LightCycler: 5 cycles amplification à 95 C pendant 3 s, hybridation de l'amorce à 50 C pendant 4 s et extension à 60 C pendant 30 s. Les produits amplifiés et marqués sont purifiés avec le kit DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen (QlAgen,) avant d'être passés dans les colonnes d'un séquenceur CEQ 2000 XL (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La séquence obtenue est ensuite comparée à une base de données, ce qui permet l'identification de la Mycobactérie détectée.

La séquence obtenue après séquençage, correspondant à la courbe de fusion de la FIGURE 1A, correspond à l'ADN de Mycobacterium /eprae (Souche Réf: AL 583918).

Claims (13)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tubercu/osis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend les étapes suivantes: (i) amplification de l'ADN de l'échantillon biologique, avec un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, l'une des amorces présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 1: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 2: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, et un couple de sondes FRET spécifique de Mtbc constitué : - d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur et (ii) détection de la fluorescence émise pour en déduire la présence éventuelle de bactéries que l'on cherche à détecter.

2 - Procédé de détection selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il permet également de détecter la présence d'un membre du genre Mycobacterium, autres que Mtbc, dans lequel, à l'étape (i), l'échantillon biologique est également mis en contact avec un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.

3 - Procédé de détection, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape (i) est réalisée en présence d'un contrôle interne (CI) et d'un couple de sondes FRET spécifique du CI.

4 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique de Mtbc est: une sonde d'ancrage de séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA couplée en 3' à une fluorescéine - une sonde d'hybridation de séquence SEQ ID N 4: CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT couplée en 5' à LC Red640.

- Procédé de détection, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium est: une sonde d'ancrage de séquence SEQ ID N N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG couplée en 3' à une fluorescéine une sonde d'hybridation de séquence SEQ ID N 6: GCT GAG CTG GTC MG GAG GT couplée en 5' à LC Red670.

6 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le CI comprend des régions capables de s'hybrider avec les amorces et une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui ne s'hybride pas avec les sondes spécifiques de Mtbc et, ni avec celles spécifiques du genre Mycobacterium.

7 - Procédé de détection, selon la revendication 6, caractérisé en ce que le CI comprend un ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) couplée à ses deux extrémités à deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces de PCR ou à leurs séquences inverses.

8 - Procédé de détection, selon la revendication 7, caractérisé en ce que le CI est une séquence nucléotidique double brin de séquences: SEQ ID 10 N 10: 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGIIIIGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' 9 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 3 ou 6 à 8, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique du CI est constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.

- Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacterium et d'une détection négative de fluorescence correspondant à une absence d'hybridation des sondes spécifiques Mtbc, le mélange d'amplification obtenu est séquencé avec une amorce de séquençage qui comprend de 18 à 28 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A, pour identifier spécifiquement la séquence du membre du genre Mycobacterium présent.

11 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacterium et, éventuellement des sondes spécifiques Mtbc, il comprend une étape de détermination de la courbe de fusion du produit d'amplification obtenu et une détermination de la température de fusion du produit d'amplification.

12 - Trousse de diagnostic pour la détection in vitro de mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tubercu/osis dans un échantillon biologique comprenant: - un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, l'une des amorces présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 1: 5'ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 2: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, - les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification d'un fragment d'acides nucléiques présentant une zone spécifique du genre Mycobacterium et éventuellement une zone spécifique du complexe Mycobacterium tubercu/osis à l'aide des dites amorces, - un couple de sondes FRET spécifique de Mtbc constitué : É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.

13 - Trousse de diagnostic selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend également un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué : É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine et É d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N 6: 5'- GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.

14 - Trousse de diagnostic selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend également un contrôle interne (CI) et un couple de 25 sondes FRET spécifique du CI.

- Trousse de diagnostic selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le CI comprend des régions capables de s'hybrider avec les amorces de PCR et une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui ne s'hybride pas avec les sondes spécifiques de Mtbc et, ni avec celles spécifiques du genre Mycobacterium et correspond, de préférence, à une séquence nucléotidique double brin de séquences: SEQ ID N 10: 2890978 30 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCG I I I I CTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' 16 - Trousse de diagnostic selon la revendication 15, caractérisée en ce que le couple de sondes FRET spécifique du CI est constitué : - d'une sonde d'ancrage qui comprend de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marquée de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et d'une sonde d'hybridation qui comprend de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marquée de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.

17 - Oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec l'une des séquences suivantes: SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, SEQ ID N 4: CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, SEQ ID N 5: 5'AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, SEQ ID N 6: GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G et SEQ ID N 8: CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C. 18 - Oligonucléotides selon la revendication 17 précédente marqués avec un fluorochrome.

19 - Oligonucléotides selon la revendication 18, choisis parmi: -les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GM GGT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 5: 5'-AGG ACC GTA CGA GM GAT CGG, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 6: 5'-GCT GAG CTG GTC MG GAG GT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670; - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et - les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.

- Oligonucléotides de 18 à 28 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A, particulièrement adaptés au séquençage des produits d'amplification du genre Mycobacterium.