FR2805280A1 - Methode de detection d'une inteine specifique de mycobacterium tuberculosis et son utilisation pour le diagnostic de la tuberculose - Google Patents
Methode de detection d'une inteine specifique de mycobacterium tuberculosis et son utilisation pour le diagnostic de la tuberculose Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une méthode de détection et/ ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon, caractérisée en ce que l'on détecte dans ledit échantillon la présence d'une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis à l'aide d'un réactif qui est spécifique de ladite localisation, et éventuellement en ce que l'on quantifie le signal détecté.
Description
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METHODE DE DETECTION D'UNE INTEINE SPECIFIQUE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ET SON UTILISATION POUR LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE.
La présente invention concerne la détection de Mycobacterium tuberculosis en vue du diagnostic de la tuberculose chez un patient. La méthode de détection de l'invention est fondée sur la recherche dans un échantillon biologique d'un patient d'une intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis. L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre de ladite méthode.
Mycobacterium tuberculosis est un parasite strict de l'homme mais capable d'infecter quelques espèces animales vivant à ses côtés. Il constitue l'agent responsable de la tuberculose humaine. L'infection, principalement par voie aérienne, se manifeste le plus souvent par une infection pulmonaire.
La tuberculose fait partie des infections qui entraînent le plus de décès, et il a été reporté que le nombre de décès augmente chaque année de 10% (Bloom, B.R. and C. J. Murray. Science (1992) 257, 1055-1064). La tuberculose pose un problème de santé publique car non seulement un grand nombre d'enfants dans les pays en voie de développement a déjà été infecté ou le sera avant d'atteindre l'âge adulte, mais la tuberculose fait aussi partie des infections opportunistes développées par les malades atteints du Sida. Par ailleurs, Mycobacterium tuberculosis présente un grand nombre de résistances à divers antibiotiques (Shankar, P. N., Lakshmi, R., Aditi, B., Seth, P. et Shriniwas. Lancet (1990) 335,423-42), ce qui rend son traitement d'autant plus difficile.
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Les techniques conventionnelles de diagnostic de Mycobacterium tuberculosis reposent sur un examen microscopique ou sur la culture d'échantillon. La détection par culture des microorganismes est sensible mais chère et le temps de détection par cette méthode prend quelques semaines. Les procédures de coloration directe sont en revanche rapides, mais manquent de sensibilité et de spécificité.
Des méthodes moléculaires comme l'amplification par PCR ou l'hybridation de sondes spécifiques de Mycobacterium tuberculosis correspondant par exemple à la sous-unité de l'ARNr 16S ont largement été décrites pour détecter les infections de tuberculose.
Cependant, ces méthodes présentent des difficultés énumérées dans la demande WO 99/35284. Combiné à l'analyse sur gel de polyacrylamide, le diagnostic par PCR semble plus efficace d'après la demande Wo 99/35284.
Toutefois, cette méthode de diagnostic n'est exemplifiée que sur des échantillons provenant de culture cellulaire.
Le but de la présente invention est précisément d'offrir de nouveaux moyens de diagnostic rapides, sensibles et spécifiques d'une infection par Mycobacterium tuberculosis. Ce but est atteint selon l'invention grâce à la détection d'une ou plusieurs intéines spécifiques de Mycobacterium tuberculosis.
Les intéines sont des introns protéiques qui sont intégrées dans des protéines. L'épissage protéique de ces introns est nécessaire à la survie de l'organisme auquel elles appartiennent. Ainsi des intéines ont été décrites chez Mycobacterium tuberculosis notamment au niveau des protéines RecA, Pps1 et de DnaB.
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Le brevet US No. 5 795 731 rapporte une méthode de criblage d'antibiotiques ou d'antifongiques, capables d'inhiber l'épissage protéique de l'intéine de RecA de Mycobacterium tuberculosis, mais ce document ne concerne pas une méthode de diagnostic. De plus, cette méthode de criblage d'antibiotique passe par le clonage préalable de l'intéine de RecA dans un gène rapporteur. Il s'agit d'une méthode relativement lourde à mettre en #uvre qui de plus nécessite une étape de culture cellulaire.
Les inventeurs ont maintenant découvert qu'il existait des intéines spécifiques de Mycobacterium tuberculosis. Il s'agit plus particulièrement d'intéines susceptibles d'être présentes chez plusieurs types de mycobactéries mais dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.-
Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis d'identifier plusieurs intéines dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Il s'agit par exemple des intéines localisés au niveau : - du site ppsl(b) de la séquence nucléotidique codante pour Pps1 (n d'accession 2791395), - du site dnaB(a) de la séquence nucléotidique codante pour DnaB (n d'accession 3250719) - du site recA(a) de la séquence nucléotidique codante pour RecA (n d'accession X58485).
Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis d'identifier plusieurs intéines dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Il s'agit par exemple des intéines localisés au niveau : - du site ppsl(b) de la séquence nucléotidique codante pour Pps1 (n d'accession 2791395), - du site dnaB(a) de la séquence nucléotidique codante pour DnaB (n d'accession 3250719) - du site recA(a) de la séquence nucléotidique codante pour RecA (n d'accession X58485).
Bien entendu cette liste est non limitative et l'invention s'entend de toute intéine dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
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Ainsi, l'intéine de RecA de Mycobacterium tuberculosis est localisée au niveau du site recA(a) alors que les intéines de RecA de Mycobacterium leprea, M. chitae, M. fallax, M. flavescens, M. gastri, M. thermoresistibile, M. shimoidei, quand elles sont présentes, sont localisées au niveau du site recA(b) comme le montre le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
<tb>
<tb> recA
<tb> Espèce <SEP> Référence <SEP> Taille <SEP> de <SEP> Site
<tb> l'intéine <SEP> d'insertion
<tb> Pb <SEP> ( <SEP> aa <SEP> ) <SEP>
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> X58485 <SEP> 1320 <SEP> (440) <SEP> recA-a
<tb> M. <SEP> leprea <SEP> X73822 <SEP> 1095 <SEP> (365) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> chitae <SEP> IP <SEP> 14116001 <SEP> + <SEP> 1092 <SEP> (364) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> fallax <SEP> CITP <SEP> 8139 <SEP> + <SEP> 1089 <SEP> (363) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> flavescens <SEP> ATCC <SEP> 14474 <SEP> + <SEP> 1092 <SEP> (364) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> gastri <SEP> HB <SEP> 4389 <SEP> + <SEP> 1104 <SEP> (368) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> thermoresistibile <SEP> ATCC <SEP> 19527 <SEP> + <SEP> 1095 <SEP> (365) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> shimoidei <SEP> ATCC <SEP> 27962 <SEP> + <SEP> 1092 <SEP> (364) <SEP> recA-b
<tb>
<tb> recA
<tb> Espèce <SEP> Référence <SEP> Taille <SEP> de <SEP> Site
<tb> l'intéine <SEP> d'insertion
<tb> Pb <SEP> ( <SEP> aa <SEP> ) <SEP>
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> X58485 <SEP> 1320 <SEP> (440) <SEP> recA-a
<tb> M. <SEP> leprea <SEP> X73822 <SEP> 1095 <SEP> (365) <SEP> recA-b
<tb> M. <SEP> chitae <SEP> IP <SEP> 14116001 <SEP> + <SEP> 1092 <SEP> (364) <SEP> recA-b
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<tb> M. <SEP> shimoidei <SEP> ATCC <SEP> 27962 <SEP> + <SEP> 1092 <SEP> (364) <SEP> recA-b
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La séquence du gène recA de Mycobacterium tuberculosis, désigné aussi Mtu recA, est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le SEQ ID N0.1, et la séquence de la protéine correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le SEQ ID NO.2. Cette séquence comprend sans le gène de l'intéine 1053 nucléotides. Le site recA(a) au niveau duquel est inséré l'intéine de recA de Mycobacterium tuberculosis est situé entre les nucléotides aux positions 753 et 754. La séquence du gène de l'intéine de Mtu recA comprend 1320 nucléotides et est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le SEQ ID NO. 3 et la séquence de la protéine correspondante est représentée dans la liste de séquences
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en annexe sous le SEQ ID NO.4. La séquence du gène recA de Mycobacterium tuberculosis comprenant le gène de l'intéine est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le SEQ ID NO.5 et la séquence de la protéine correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le SEQ ID NO.6. Cette séquence comprend 2373 nucléotides.
L'intéine de recA(a) de Mycobacterium tuberculosis est une protéine multifonctionnelle, qui est non seulement capable d'épissage protéique (Davis et al., (1992). Cell 71,201-210 ; Kenneth et al. (1998). PNAS 95 (7), 3543-3548), mais qui possède également une activité endonucléase spécifique et une activité protéine ligase.
L'intéine de RecA de M. tuberculosis clive spécifiquement un site entre les nucléotides en position 10 et 11 de la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.7.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis aux inventeurs de concevoir une méthode de diagnostic rapide, spécifique et sensible de Mycobacterium tuberculosis fondée sur la localisation spécifique d'intéines de Mycobacterium tuberculosis.
L'invention a donc pour objet une méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon, caractérisée en ce que l'on détecte dans ledit échantillon la présence d'une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis à l'aide d'un réactif qui est spécifique de ladite localisation, et éventuellement en ce que l'on quantifie le signal détecté.
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On entend selon la méthode de l'invention par intéine, tant la détection d'une intéine que de plusieurs intéines simultanément ou successivement.
La détection de la présence d'une intéine localisée au niveau d'un site qui est spécifique de Mycobacterium tuberculosis peut être effectuée par toute technique de biologie connue de l'homme du métier comprenant ou non la comparaison avec des témoins. Parmi celles-ci, l'invention envisage plus particulièrement, des techniques d'hybridation avec des sondes marquées capables de s'hybrider spécifiquement avec tout ou partie du gène codant pour une intéine si celle-ci est insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis. De telles sondes peuvent être préparées à partir des séquences des sites des gènes où sont insérés les séquences codant pour les intéines chez Mycobacterium tuberculosis.
Il s'agit de préférence de sondes marquées capables de s'hybrider spécifiquement avec : - une partie de la séquence codant pour l'inteine, et - une région flanquante du site où est insérée ladite intéine et dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
A titre d'exemple, dans le cas de l'intéine de recA de Mycobacterium tuberculosis, on recherche la présence de l'intéine de recA au niveau du site recA(a) de Mycobacterium tuberculosis par d'hybridation avec une sonde marquée capable de s'hybrider spécifiquement avec une partie de la séquence codant pour l'intéine de recA et une région flanquante du site recA(a) ou est insérée ladite
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intéine et dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
Il peut aussi s'agir d'une détection par des techniques d'amplification mettant en oeuvre des séquences, notamment des amorces spécifiques, des régions flanquantes du site d'insertion de l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Comme techniques d'amplification, on peut citer par exemple la PCR, la NASBA, le rolling circle etc....
Une forme de mise en #uvre préférée de la méthode de diagnostic de Mycobacterium tuberculosis selon la présente invention consiste à exprimer in vitro l'intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis, puis à la détecter et/ou la quantifier à l'aide d'un test fonctionnel spécifique de l'activité de ladite intéine exprimée i n vitro.
A titre d'exemple, dans le cas de l'intéine de recA de Mycobacterium tuberculosis, on exprime in vitro, à partir des acides nucléiques contenus dans l'échantillon, l'intéine de recA de Mycobacterium tuberculosis si elle est présente au niveau du site recA(a), puis on la détecte et/ou la quantifie à l'aide d'un test fonctionnel spécifique de l'activité de ladite intéine exprimée in vitro.
Le test fonctionnel mis en #uvre dans la méthode de l'invention peut être basée notamment sur: - L'activité endonucléase de l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
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- L'activité protéine ligase de l'intéine spécifique de M. tuberculosis (Kenneth et al. (1998). PNAS 95 (7), 3543-3548).
- L'épissage protéique de l'intéine spécifique de M. tuberculosis (Davis et al., (1992). Cell 71,201- 210) .
Cette détection par la fonction permet d'éviter les faux-positifs. En effet, en PCR on constate qu'il existe toujours un risque sur la nature de l'amplicon. Ce qui peut induire des faux-positifs très préjudiciables dans le cadre du diagnostic.
L'invention a donc tout particulièrement pour objet une méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la préparation à partir dudit échantillon, de molécules d'acides nucléiques comprenant une séquence polynucléotidique codant au moins pour une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis et les éléments de contrôle nécessaires à la transcription et à la traduction in vitro de ladite intéine ; b) la transcription et la traduction in vitro des molécules d'acides nucléiques préparées à l'étape (a) ; c) la détection et/ou la mesure d'une fonction de l'intéine spécifique exprimée à l'étape (b).
L'échantillon à partir duquel est réalisée la méthode de l'invention peut être tout échantillon biologique susceptible de contenir Mycobacterium
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tuberculosis. Il peut s'agir bien entendu d'un échantillon biologique brut comme le sang, des tissus ou à un liquide corporel comme les crachats, la salive et les expectorations. Ces échantillons peuvent également correspondre à des produits de toutes méthodes d'amplification de l'ADN ou de l'ARN ou tous produits d'acides nucléiques issus de traitement couramment utilisés dans le domaine de la biologie.
Par commodité, on entend par Mycobactérie tant le microorganisme Mycobacterium tuberculosis lui-même que son information génétique.
On entend en outre par fonction toute propriété de l'intéine spécifique, comme une activité enzymatique propre à l'intéine de Mycobacterium tuberculosis. Comme indiqué précédemment, cette fonction peut correspondre par exemple à l'activité endonucléase de l'intéine ou à l'activité protéine ligase ou à sa capacité d'épissage protéique.
De façon avantageuse, la méthode de détection et/ou de quantification selon l'invention est effectuée en présence d'une ou plusieurs substances susceptibles de modifier l'activité de l'intéine.
La méthode de l'invention offre en outre l'avantage d'être très sensible. Cette sensibilité s'explique par le coefficient multiplicateur des étapes (b) et (c) correspondant respectivement à la transcription, à la traduction du ou des gènes préparés à l'étape (a), codant pour l'intéine, puis à la détection et/ou la mesure de la fonction correspondant à la ou aux protéines produites à l'étape (b). De plus, pour augmenter la sensibilité, la méthode de l'invention peut passer après
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l'étape de transcription par une étape d'amplification des transcrits par toute technique connue de l'homme de métier comme la NASBA (nucleic Acid Sequence-based Amplification), ou la TMA (Transcription Mediated Amplification) avant l'étape de traduction.
La méthode de l'invention est en outre rapide et reproductible, car toutes les réactions sont réalisées in vitro en quelques heures.
La méthode de l'invention permet non seulement de mettre en évidence la présence et/ou de quantifier une intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis et donc de réaliser un diagnostic spécifique de Mycobacterium tuberculosis, mais elle permet également de caractériser ladite intéine. On entend par exemple par caractérisation, la définition du spectre d'inhibition de l'intéine spécifique par des inhibiteurs spécifiques ou la définition d'une gamme de pH dans laquelle l' intéine est active. Ce mode particulier de mise en #uvre du procédé de l'invention permet de définir de nouveaux antibiotiques ou des substances capables d'inhiber des fonctions de l'intéine spécifique et plus particulièrement l'épissage protéique nécessaire à la survie de l'organisme auquel elle appartient.
Compte tenu de la facilité, du faible coût et de la rapidité de la méthode de l'invention, un suivi d'une infection par M. tuberculosis peut être mis en #uvre de manière à effectuer périodiquement la détection et/ou la quantification d'une fonction de l'intéine spécifique dans un organisme ayant suivi un traitement ou non par un antibactérien. La comparaison des résultats obtenus à
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différents temps et leur interprétation permet un suivi dans le temps de l'évolution de l'infection.
Ce type de suivi permet au praticien de comprendre le développement d'une infection par M. tuberculosis. L'interprétation des résultats offre alors une aide considérable à la décision.
A titre d'intéines particulières dont l'insertion est localisée au niveau de site spécifique de de Mycobacterium tuberculosis, l'invention s'intéresse plus particulièrement aux intéines localisées au niveau : - du site ppsl(b) de la séquence nucléotidique codante pour Pps1 (n d'accession 2791395), - du site dnaB(a) de la séquence nucléotidique codante pour DnaB (n d'accession 3250719) - du site recA(a) de la séquence nucléotidique codante pour RecA (n d'accession X58485).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description qui suit de chacune des étapes du procédé préféré de l'invention. Par commodité, on désignera aussi par intéine spécifique une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
1) Étape (a) de préparation de l'échantillon.
Lorsque la méthode de l'invention consiste en une détection de Mycobacterium tuberculosis, on prépare à l'étape (a) une molécule d'acide nucléique codant pour une intéine spécifique de manière à pouvoir l'exprimer ultérieurement in vitro.
Lorsque la méthode de l'invention consiste en une détection de Mycobacterium tuberculosis, on prépare à l'étape (a) une molécule d'acide nucléique codant pour une intéine spécifique de manière à pouvoir l'exprimer ultérieurement in vitro.
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Tout préférentiellement, lorsque la méthode de l'invention consiste en une quantification de Mycobacterium tuberculosis, on prépare à l'étape (a) une quantité de molécules d'acides nucléiques proportionnelles à la quantité de mycobactéries éventuellement présentes dans l'échantillon.
La préparation de l'échantillon à l'étape (a) de la méthode de l'invention consiste à placer une séquence d'acides nucléiques codant au moins pour l'intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis sous le contrôle d'éléments nécessaires à la transcription et à la traduction in vitro dudit gène.
Ainsi, à l'étape (a), les séquences de contrôle du polynucléotide codant pour l'intéine spécifique selon le procédé de l'invention sont pour la transcription : - un promoteur d'ARN polymérase en 5' - éventuellement un terminateur d'ARN polymérase en 3', et pour la traduction : - un site de fixation des ribosomes - un codon initiateur de la traduction en phase avec le premier codon du gène de l'intéine - un codon stop de traduction suivi de quelques nucléotides comme par exemple de 5 à 10 nucléotides.
Le promoteur (en 5') et le terminateur (en 3') s'il est présent, d'une ARN polymérase, sont par exemple ceux de l'ARN polymérase des phages T7, SP6, Qss ou #.
Une forme de mise en #uvre avantageuse de l'étape (a) de la méthode de l'invention consiste à
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préparer la molécule d'acide nucléique par une réaction d'amplification du gène codant pour l'intéine spécifique, à partir des acides nucléiques de l'échantillon. Il peut s'agir d'une amplification par PCR ou par des techniques dérivés de la PCR comme par exemple la nested PCR ou des techniques différentes de la PCR du type NASBA ou SDA ou autres. Avantageusement cette préparation met en #uvre au moins deux oligonucléotides ou au moins deux amorces, dont deux sont situées respectivement aux bornes de la séquence nucléotidique codant pour l'intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
Cette préparation par amplification (par exemple PCR ou NASBA) est réalisée à l'aide d'amorces pouvant correspondre par exemple : - pour la ou les amorces sens à au moins les éléments suivants correspondants à un promoteur d'ARN polymérase, un site de fixation des ribosomes, un codon initiateur de la traduction en phase avec le premier codon du gène de l'intéine et la séquence s'hybridant au moins en 5' du polynucléotide codant pour l'intéine spécifique, et - pour la ou les amorces antisens à au moins les éléments suivants comprenant la séquence s'hybridant au moins en 3' du polynucléotide codant pour l'intéine spécifique, un codon stop de traduction suivi de quelques nucléotides comme par exemple 5 à 10 et éventuellement un terminateur d'ARN polymérase.
La préparation de la molécule d'acide nucléique de l'étape (a) peut être réalisée par toute autre méthode connue de l'homme du métier comme une coupure de restriction permettant de récupérer l'intéine spécifique
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d'intérêt suivi d'une ligature orientée avec les éléments de contrôle nécessaires à la transcription et à la traduction in vitro indiqués précédemment.
Dans le cas de l'utilisation d'un couple d'amorces à l'étape (a) de préparation de molécules d'acides nucléiques, ces deux amorces sont capables de s'hybrider respectivement aux bornes de la séquence codante pour une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
Les parties des amorces s'hybridant au moins au gène codant pour une intéine spécifique ont une longueur de 7 à 150 nt de long, avantageusement une longueur de 7 à 50 et préférentiellement de 10 à 25 nt.
Dans un mode particulier de mise en #uvre, ces amorces possèdent un segment d'au moins 7 bases contiguës qui sont complémentaires au moins à 70% à une séquence cible de 7 nucléotides contigus situés de part et d'autre du polynucléotide codant pour au moins l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
Toujours dans le cas de l'utilisation d'un couple d'amorces à l'étape (a) de préparation de molécules d'acides nucléiques, différentes formes de mise en #uvre de la méthode de l'invention peuvent être réalisées. Il est possible de combiner dans un seul tube ou non au moins deux réactions de détection et/ou quantification. Une des réactions de détection et/ou de quantification concerne Mycobacterium tuberculosis. L'autre réaction de détection et/ou de quantification dite associée concerne un organisme ou un processus qu'il est utile de détecter en parallèle de Mycobacterium tuberculosis. Cette détection parallèle fait intervenir également la fonction associée d'un organisme ou
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d'un processus, exprimée in vitro. Cet organisme peut également correspondre à une mycobactérie.
2) L'étape (b) de transcription et de traduction.
Les réactions de transcription et de traduction (étape b) peuvent être simultanées, ce qui signifie que la phase de traduction est réalisée simultanément avec la transcription, ou décomposée en deux étapes distinctes de transcription et de traduction.
Le découplage permet l'emploi d'extraits de traduction différents selon l'origine de l'ADN criblé. En effet, la phase de traduction du transcrit est avantageusement réalisée avec un extrait de traduction d' origine mycobactérienne ou d'une origine proche de celle de l'échantillon biologique sur lequel est pratiqué le procédé de l'invention. Ainsi, on optimise l'adéquation entre l'origine des signaux de traduction des transcrits et l'extrait cellulaire pour une efficacité de traduction optimale. On peut citer à titre d'exemple l'utilisation d'un extrait de traduction préparé à partir de mycobactéries non pathogènes pour la traduction de polynucléotides codant pour l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis pathogène. Ces extraits respectifs sont susceptibles d'améliorer l'efficacité du procédé. Ces extraits sont choisis pour leur capacité à traduire les transcrits.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il met en #uvre une adéquation entre la ponctuation d'expression des transcrits et les extraits de traduction utilisés. Ces extraits de traduction sont aussi
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caractérisés en ce que soit ils ne contiennent pas la propriété recherchée, soit ils la contiennent mais qu'elle n'est pas détectable dans les conditions de test réalisées pour détecter la fonction recherchée.
Une mise en #uvre particulière du procédé de l'invention consiste à utiliser à l'étape (b) un extrait de traduction préparé à partir de souche bactérienne modifiée. Cet extrait peut également correspondre à un mélange de plusieurs extraits de traduction préparés à partir de souches bactériennes modifiées ou non. Il peut s'agir par exemple d'extrait de traduction de E. coli surexprimant une protéine chaperon A mélangé avec un extrait de traduction de E. coli surexprimant une protéine chaperon B. Tout type de mélange est envisageable du moment qu'il correspond aux caractéristiques décrites ci-dessus.
De la même manière, il est possible d'utiliser un extrait de traduction dans lequel sont rajoutés un ou plusieurs tRNAs spécifiques d'un ou de plusieurs codons. Les extraits de traduction ainsi obtenus permettent alors de traduire des mRNA comportant ces codons spécifiques. Le traitement de l'étape (b) avec un extrait de traduction peut aussi être réalisé avec un extrait standard de traduction quelle que soit l' origine de l'échantillon comme par exemple un extrait d'E. coli et/ou tout (s) autre(s)extrait(s) cellulaire(s) supplémentés ou non par des molécules intéressantes comme celles, par exemple, indiquées précédemment (tRNA, chaperon...).
Il est également possible d'ajouter à l'extrait de traduction de l'étape (b) une ou plusieurs substances favorisant un repliement ou une maturation plus efficace des protéines exprimées, comme par exemple des chaperons,
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des détergents, des sulfobétaïnes, des extraits membranaires, etc....
3) Le test fonctionnel de l'étape (c).
Dans le cadre de la mise en évidence de la fonction de l'intéine spécifique et de toute autre protéine exprimée à l'étape (b), des substrats spécifiques peuvent être envisagés par l'homme de métier pour mettre en évidence la présence d'une fonction de l'intéine spécifique pouvant correspondre à titre d'exemple aux fonctions protéine ligase, endonucléase et épissage protéique.
L'homme de métier pourra par exemple se référer à des ouvrages comme Methods In Enzymology ou Annual Review Of Biochemistry, dans lesquelles un grand nombre de méthodes de dosage de l'activité des protéines et de préparation de substrats ont été décrites.
A titre d'exemple de la détection de l'activité endonucléase de l'intéine spécifique de RecA de Mycobacterium tuberculosis localisée au niveau du site recA(a) de la séquence nucléotidique, l'intéine néosynthétisée pourra cliver spécifiquement un polynucléotide, dont la coupure sera responsable d'une émission de fluorescence.
La fonction épissage protéique pourra être mise en évidence en utilisant par exemple lors de la préparation de l'échantillon par amplification à l'étape (a) les amorces suivantes composées pour : - l'amorce sens, d'un promoteur d'ARN polymérase, d'un site de fixation des ribosomes, d'une partie d'un gène rapporteur comme celui codant pour la microperoxidase (Spee et al., (1996) Eur. J. Biochem 241,
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215-220 et Hirayama et al. (1997) Analytical Biochemistry 47,237-241) et d'une séquence s'hybridant en 5' de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique, ou en amont de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique ou sur une séquence en amont de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique et sur la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique, et - l'amorce antisens, de la séquence s'hybridant en 3' de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique, ou en aval de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique ou sur la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique et sur une séquence en aval de la séquence polynucléotidique codant pour une intéine spécifique, de l'autre partie du gène rapporteur pour la microperoxidase, d'un codon stop de traduction, et éventuellement d'un terminateur d'ARN polymérase.
L'intéine spécifique pourra alors s'exiser de la protéine néosynthétisée à l'étape (b) pour libérer la microperoxidase facilement détectable par un test fonctionnel à l'étape (c).
Le test fonctionnel à l'étape (c) peut être direct ou non.
La mesure de la fonction de l'intéine spécifique exprimée à l'étape (b), s'il y a lieu, peut être lue directement dans un lecteur de fluorimétrie si la mesure de la fonction met en #uvre un substrat correspondant à un fluorophore ou de colorimétrie si la mesure de la fonction met en #uvre un chromophore. Mais on peut également envisager des mesures par absorbance, par
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viscosimétrie, par spectrométrie de masse ou toute autre méthode liée à la mesure de la fonction à l'étape c. Il est également envisageable de réaliser une lecture en continu de la fonction, si cette dernière s'y prête.
4) Quantification de Mycobacterium tuberculosis selon l'invention.
Comme indiqué précédemment, l'invention concerne aussi une méthode de quantification de la fonction correspondant à une intéine spécifique, à partir des acides nucléiques présents dans ledit échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend : - les étapes (a) à (c) définies précédemment, l'étape (c) consistant en la mesure de la fonction de l'intéine spécifique, puis d) la comparaison de la mesure de la fonction de l'intéine spécifique éventuellement présente dans l'échantillon effectuée à l'étape (c) avec une valeur étalon ou un ensemble de valeurs étalons de ladite fonction mesurée sur un ou plusieurs échantillons étalons selon un procédé de mesure identique ou équivalent à celui de l'étape (c).
Un échantillon étalon pour la réalisation de l'étape (d) ci-dessus peut être tout échantillon contenant : - une quantité, avantageusement connue, du ou des gènes codant pour l'intéine spécifique pouvant être transcrits et traduits, et qui sera alors soumis à un traitement de transcription et de traduction comme à l'étape (b), puis la fonction de ladite intéine sera
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mesurée selon un procédé de mesure identique ou équivalent à celui de l'étape (c) ; - une quantité, avantageusement connue, de l'intéine spécifique, laquelle sera mesurée selon un procédé de mesure identique ou équivalent à celui de l'étape (c) ; - une quantité, avantageusement connue de Mycobacterium tuberculosis, qui sera mesurée selon un procédé de mesure identique ou équivalent à celui des étapes (a) (b) et (c) .
L'échantillon étalon peut provenir d'un milieu identique ou différent de celui sur lequel les étapes (a) à (c) de la méthode de l'invention sont réalisées. Il peut s'agir du même milieu mais prélevé à un moment différent.
La détection et/ou la quantification peut être évaluée notamment par rapport à un seuil prédéterminé ou par rapport à une courbe standard permettant la comparaison des mesures de la fonction de l'intéine spécifique avec celles d'échantillons étalons.
5) Automatisation et kit pour la mise en #uvre du procédé de l'invention.
Les étapes de la méthode de l'invention peuvent être réalisées successivement sans interruption par le même opérateur, avantageusement sur un dispositif automatisé intégrant chacune des étapes, ou peuvent être réalisées de façon discontinue, éventuellement par des opérateurs différents.
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La méthode de l'invention peut être avantageusement automatisée si le nombre d'échantillons à analyser est élevé. Les échantillons d'acides nucléiques sont alors placés sur un support pouvant correspondre par exemple à une puce ou une plaque de titration contenant plusieurs dizaines à plusieurs milliers d'emplacements. Ces supports sont conçus pour permettre : - la préparation des séquences cibles (étape a), - l'initiation des réactions de transcription et de traduction de l'intéine spécifique (étape b) et la révélation de ladite intéine (étape c).
En conséquence, l'invention concerne un dispositif comprenant un agencement d'un ou plusieurs supports, de robots et d'un lecteur desdits supports pour la réalisation des étapes de la méthode décrite précédemment .
L'invention concerne donc aussi un kit pour la mise en #uvre d'une méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis décrite précédemment .
Ledit kit comprend dans une première forme de réalisation : les moyens de révélation d'une fonction d'une intéine spécifique, une ARN polymérase, des séquences nucléotidiques permettant la préparation des molécules d'acides nucléiques (étape a) codant au moins pour l'intéine, les quatre nucléotides triphosphates, les mélanges nécessaires à ladite préparation, à la transcription et à la traduction, éventuellement des témoins et de quoi réaliser les étalons.
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Dans une seconde forme de réalisation un kit selon l'invention comprend : - éventuellement les produits et les séquences nucléotidiques nécessaires pour l'étape (a) de préparation de la séquence polynucléotidique codant au moins pour une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis, - tout support comme plaque de microtitration ou puce contenant les moyens de révélation d'une fonction d'une intéine spécifique, une ARN polymérase, les quatre nucléotides triphosphates, les mélanges de transcription et de traduction, des témoins et de les réactifs pour réaliser des étalons.
Les kits et les supports peuvent être envisagés pour la détection et/ou la quantification en plus de M. tuberculosis d'une ou plusieurs autres fonctions associées à un ou plusieurs autres organismes ou à un ou plusieurs processus.
La description qui suit se rapporte à des exemples de mises en #uvre de l'invention concernant (i) la la détection spécifique de Mycobacterium tuberculosis par PCR, et (ii) la détection spécifique de M. tuberculosis par la fonction de l'intéine insérée dans le site recA(a) du gène de la protéine RecA.
Exemple 1 : Détection spécifique de Mycobacterium tuberculosis par PCR.
Les souches suivantes M. chitae, M. fallax, M. gastri, M. thermoresistible, M. shimoideii ont été grattées sur milieu solide de Lôweinstein-Jensen et sont resuspendus dans 1 ml de tampon TE stérile (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1
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mM). 1 g de bille de verre 0,1 mm de diamètre (BioBlock) sont ajoutés et le mélange est vortexé pendant 2 min. pour casser les mycobactéries. La protéinase K (Sigma) est ajouté à une concentration de 50 ug/ml finale et les suspensions mycobactériennes sont incubées pendant 10 min. à 65 C puis pendant 10 min. à 95 C. Les lysats sont centrifugés pendant 10 min. à 5000 g pour culotter les débris et les billes de verre. Le surnageant contenant l'ADN est traité avec une solution de phenol/chloroform/alcool isoamylique (25/28/1) fraichement préparée et ensuite avec du chloroforme. Ces préparations d'ADN sont directement utilisées pour la PCR. L'ADN utilisé de M. leprea et M. tuberculosis a été donné par S.T. Cole.
Il est contenu dans des cosmides.
Les amorces pour la réaction d'amplification par PCR ont été dessinées pour pouvoir s'hybrider de part et d'autre du site recA(b) dans des zones conservées pour les espèces de mycobactéries. Ces amorces correspondent à
RecA-3' (5'AGGATGTCGAACTCGGCCAGCTTGAA 3') et à
R(a) (5'GCGTCGGTGCGCATGGACGTGCG 3') et sont capables de s'hybrider respectivement aux positions 765-791 et 658-681 du gène recA de Mycobacterium tuberculosis.
RecA-3' (5'AGGATGTCGAACTCGGCCAGCTTGAA 3') et à
R(a) (5'GCGTCGGTGCGCATGGACGTGCG 3') et sont capables de s'hybrider respectivement aux positions 765-791 et 658-681 du gène recA de Mycobacterium tuberculosis.
Les réactions d'amplification par PCR sont réalisées en utilisant : - 5 l de la préparation d'ADN génomique de M. chitae, M. fallax, M. gastri, M. thermoresistible et M. shimoidei préparées comme indiqué précédemment et de 50 ng de préparation de cosmide de M. tuberculosis et de M. leprea comme matrice d'ADN.
- 10 pmoles de chaque oligo - 0,2 mmolaires de dNTP
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- 5 l de tampon de réaction 10X (TrisHCl 100 mM pH8.3, MgCl2 15 mM, KCl 500 mM) - Taq ADN polymérase 1 u
Dans un volume final de 50 l.
Dans un volume final de 50 l.
Le cycle d'amplification est le suivant : - 10 min à 92 C - 30 cycles (1 min à 92 C + 1 min à 45 C + lmin30 à 72 C) - 5 min à 72 C.
Les produits d'amplification ont été déposés sur gel d'agarose 2% .
Après migration et coloration au BET, les résultats présentés sur la figure 1 ont été observés.
Un produit d'amplification de 133 pb est observé dans les cas où la matrice correspond à M. chitae, M. fallax, M. gastri, M. thermoresistibile, M. shimoide et M. leprea. Alors qu'un produit d'amplification de 1453 pb est observé si la matrice correspond à M. tuberculosis.
Seule la matrice correspondant à M. tuberculosis permet d'amplifier un fragment de 1453 pb correspondant à 133pb + la taille de l' intéine insérée au niveau du site recA(a), soit 1320 pb.
La mise en évidence de la présence de M. tuberculosis dans un échantillon peut donc se faire en utilisant des amorces spécifiques du site d'insertion recA(a) de l'intéine de RecA de cette mycobactérie.
Exemple 2 : Détection spécifique de M. tuberculosis par la fonction de l'intéine insérée dans le site recA(a) du gène de la protéine RecA.
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Un mode particulier de mise en #uvre de l'invention consiste à détecter Mycobacterium tuberculosis par l'intermédiaire de l'intéine insérée dans le site recA(a) du gène de la protéine RecA. Pour cela, le gène de l'intéine est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de M. tuberculosis à l'aide d'un jeu d'amorces permettant de mettre ce gène sous le contrôle du promoteur de transcription de l'ARN polymérase du phage T7, d'un site de fixation des ribosomes et d'un ATG. L'amorce reverse comporte un ou deux codons STOP. En parallèle, un témoin négatif est réalisé en effectuant la même PCR sur l'ADN génomique d'un micro-organisme autre que M. tuberculosis.
10 l de chacune de ces PCR sont alors ajoutés séparément dans un mélange de transcription de 50 l comme décrit par Pokrovskaya et al. (1994, Analytical Biochemistry, 220,420-423) à 37 C pendant 2 à 3 heures.
10 l de chacune de ces réactions de transcription sont alors ajoutés séparément à un mélange de traduction de 100 l final tel que décrit par Zubay (1973, Ann.
Revendication. Genet. 7,267-287) (ce mélange de traduction permettant de détecter in fine l'activité de l'intéine, et donc ne comprenant pas ou très peu d'activité similaire ou parasite telles que des endonucléases ou des exonucléases...) , et la réaction est incubée à 37 C pendant 2h00.
1 à 10 (il de chacune de ces réactions de traduction sont incubées indépendamment dans une solution tamponnée permettant une digestion de restriction (de 50 à 100 l final), en présence d'un plasmide linéarisé comportant le site de restriction de l'intéine. Après 20 minutes à 1 heure d'incubation, une fraction de cette
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réaction de restriction (éventuellement débarrassée de ses protéines par une extraction au phénol-chloroforme) est déposée sur un gel d'agarose 1% TAE. La traduction in vitro exprimant le témoin négatif ne montre aucune modification du plasmide linéarisé, alors que celle exprimant l'intéine de M. tuberculosis montre la coupure de ce plasmide en deux bandes.
Claims (11)
1) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon, caractérisée en ce que l'on détecte dans ledit échantillon la présence d'une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis à l' aide d'un réactif qui est spécifique de ladite localisation, et éventuellement en ce que l'on quantifie le signal détecté.
2) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détecte la présence d'une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis par hybridation avec une sonde marquée capable de s'hybrider spécifiquement avec tout ou partie du gène codant pour une intéine si celle-ci est insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
3) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détecte la présence d'une intéine localisée au niveau d'un site qui est spécifique de Mycobacterium tuberculosis par amplification mettant en oeuvre des séquences spécifiques des régions flanquantes du site d'insertion de l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
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4) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on exprime in vitro, l'intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis, puis en ce qu'on la détecte et/ou la quantifie à l'aide d'un test fonctionnel spécifique de l'activité de ladite intéine exprimée in vitro.
5) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la préparation à partir dudit échantillon, de molécules d'acides nucléiques comprenant une séquence polynucléotidique codant au moins pour une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis et les éléments de contrôle nécessaires à la transcription et à la traduction in vitro de ladite intéine ; b) la transcription et la traduction in vi tro des molécules d'acides nucléiques préparées à l'étape (a) ; c) la détection et/ou la mesure d'une fonction de l'intéine spécifique exprimée à l'étape (b).
6) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que la fonction détectée et/ou mesurée est basée sur : - L'activité endonucléase de l'intéine spécifique de Mycobacterium tuberculosis.
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- L'activité protéine ligase de l'intéine spécifique de M. tuberculosis.
- L'épissage protéique de l'intéine spécifique de M. tuberculosis.
7) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que ladite détection et/ou quantification est effectuée en présence d'une ou plusieurs substances susceptibles de modifier l'activité de ladite intéine.
8) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculoses dans un échantillon selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'à l'étape (a) lesdits éléments de contrôle sont pour la transcription : - un promoteur d'ARN polymérase en 5', - éventuellement un terminateur d'ARN polymérase en 3', et pour la traduction : un site de fixation des ribosomes un codon initiateur de la traduction en phase avec le premier codon du gène de l'intéine - un codon stop de traduction suivi de quelques nucléotides comme par exemple 5 à 10.
9) Méthode de détection et/ou de quantification de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'intéine est insérée au niveau d'un
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site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis choisie parmi : - le site ppsl(b) de la séquence nucléotidique codante pour Ppsl, - le site dnaB(a) de la séquence nucléotidique codante pour DnaB, - le site recA(a) de la séquence nucléotidique codante pour RecA.
10) Un kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : les moyens de révélation d'une fonction de l'intéine, une ARN polymérase, des séquences nucléotidiques permettant la préparation des molécules d'acides nucléiques de l'étape (a) codant au moins pour l'intéine, les quatre nucléotides triphosphates, les mélanges nécessaires à ladite préparation, à la transcription et à la traduction, éventuellement des témoins et des étalons.
11) Un kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : - éventuellement les produits et les séquences nucléotidiques nécessaires pour l'étape (a) de préparation de la séquence polynucléotidique codant au moins pour une intéine insérée au niveau d'un site dont la localisation est spécifique de Mycobacterium tuberculosis, - tout support comme plaque de microtitration ou puce contenant les moyens de révélation d'une fonction d'une intéine spécifique, une ARN polymérase, les quatre
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nucléotides triphosphates, les mélanges de transcription et de traduction, des témoins et de les réactifs pour réaliser des étalons.
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