FR3011557A1 - Methode de detection et d'identification d'especes de mycobacteries - Google Patents

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Jean-Christophe Avarre
Phung Thu Nguyet
Domenico Caruso
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

L'invention concerne un procédé permettant la détection et l'identification des mycobactéries au niveau de l'espèce, ainsi qu'un couple d'amorces et un kit permettant la détection et l'identification des espèces de mycobactéries.

Description

METHODE DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION D'ESPECES DE MYCOBACTERIES La présente invention concerne une méthode de détection et d'identification d'espèces 5 de mycobactéries. Les mycobactéries sont des bactéries Gram-positives aérobies qui appartiennent à l'ordre Actinomycetales. Certaines d'entre elles, dites mycobactéries atypiques ou mycobactéries non-tuberculeuses (non-tuberculous mycobacteria, NTM), sont à 10 l'origine de nombreuses pathologies, chez l'homme et chez les animaux, comme la mycobactériose de poisson, une maladie chronique pouvant entraîner des mortalités élevées principalement chez les poissons d'élevage et les poissons d'aquarium. La mycobactériose affecte près de 200 espèces ichtiques d'eau douce et d'eau salée. Si Mycobacterium marinum, M fortuitum et M chelonae ont longtemps été considérées 15 comme les principaux agents étiologiques, il est aujourd'hui reconnu qu'une vingtaine d'espèces de Mycobacterium sont concernées. Il est également reconnu que certaines de ces espèces sont responsables d'infections chez l'homme, et que leur émergence en milieu clinique pose de plus en plus de problèmes, notamment en termes de résistances aux antibiotiques. 20 Compte tenu de l'incidence élevée de cette maladie, de ses conséquences économiques et en matière de santé publique, il existe un réel besoin de tests de diagnostic rapides et peu onéreux, qui permettraient à la fois la détection et l'identification des espèces de mycobactéries non-tuberculeuses. En effet, le diagnostic des mycobactérioses repose aujourd'hui encore essentiellement sur la mise en culture des tissus infectés, ce qui nécessite entre 1 et 6 semaines selon la vitesse de croissance de la souche pathogène (Stahl et Urbance, J Bacteriol. 172 :116124, 1990). A l'heure actuelle, il existe seulement deux tests de diagnostic moléculaire commercialisés, et ces derniers reposent sur de l'hybridation sur bandelettes. Le premier discrimine 25 espèces (Makinen et al., Clin. Microbiol, Infect, 12:481-483, 2006), tandis que le second permet l'identification de 44 espèces (Pourahmad et al., J Fish Dis. 25 30 31:931-940, 2008). Dans les deux cas, l'analyse d'un échantillon est relativement onéreuse et nécessite une journée de travail, ainsi qu'une mise en culture préalable des mycobactéries. Ces deux tests ne répondent donc pas aux exigences de rapidité et de coût d'un test de diagnostic permettant l'analyse d'un grand nombre d'échantillons.
La fusion d'ADN à haute résolution (high resolution melting, HRM) est une technologie émergente qui présente un fort potentiel pour le diagnostic moléculaire (Reed et al., Pharmacogenomics 8:597-608, 2007). La fusion (ou dénaturation) de l'ADN est quantifiée par une décroissance de fluorescence (F) en fonction de la température (T).
Ainsi, la mesure de la relation F = f(T) permet d'accéder à un "profil" de fusion, ainsi qu'à une température de fusion (melting temperature, Tm), qui sont uniques pour une molécule d'ADN donnée. En 2005, Odell et al. décrivait pour la première fois la différentiation par HRM de deux espèces de mycobactéries (Clin. Chem. 49:396-406, 2005). Presque 8 ans après, et malgré le succès de la HRM, cette approche ne permet toujours pas la discrimination d'un grand nombre d'espèces simultanément. Ceci est principalement dû à la limitation des logiciels d'analyse existants, qui n'offrent pas la possibilité de différencier plus de 6 profils de fusion simultanément. Pour cette raison, les essais actuellement développés en HRM pour identifier un grand nombre d'espèces font appel à des stratégies complexes, rendant les tests plus longs à réaliser et surtout plus onéreux (El Hajj et al., J. Clin. Microbiol. 47:1190-1198, 2009). Dans ce contexte, les Inventeurs ont développé un test simple et rapide permettant la 25 détection et l'identification fiable des mycobactéries, jusqu'à une résolution correspondant à l'espèce mycobactérienne. L'un des aspects de l'invention est donc de proposer un procédé permettant la détection et l'identification des espèces mycobactériennes. 30 La présente invention permet ainsi la détection et l'identification rapides et simultanées d'un grand nombre d'espèces mycobactériennes. Un autre aspect de l'invention est de proposer des couples d'amorces permettant la détection et l'identification des espèces mycobactériennes.
Un autre aspect de l'invention est également de proposer un kit permettant la détection et l'identification d'une espèce mycobactérienne dans un échantillon. L'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la ^ détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de 10 l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 15 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA). 20 Les couples d'amorces identifiés par les Inventeurs permettent d'amplifier un fragment de la région ITS (internai transcribed spacer) de l'opéron ADNr 16S-23S chez différentes espèces de mycobactéries. La région ITS de l'ADNr 16S-23S correspond à une région d'ADN non codante située 25 entre les gènes codant les ADNr 16S et 23S chez les bactéries. De manière non limitative, le tableau 1 présente une séquence de la région 16S-23S pour chacune des espèces myctobactériennes suivantes M phlei, M bohemicum, M gastri, M pseudoshottsii, M smegmatis, M fortuitum ssp fortuitum, M rnarinum, M 30 chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium et M. haemophilum.
Mycobacteriztm GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC phlei AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT (SEQ ID NO: TTCTAAGGAGCACCTTCAACATGTTCCCCCGTGCCTCGC 5) CAGATGTGAGGGTTCATCGCGGTTGGGAGAGTCGCCGGC GCCTGTAGTGGGTTGTCCGGTGGGTGCACAACAAACGTT TGTCGTTCGGTGGGGAAAGCCGGGCGGCGGGACTGCCA GACACACTATTGGGCTTTGAGACAACAGGCCCGTTTGGC CCCCTGGTGTGGGGGTGGTGTCCCGGTTGCGGGGTGCCG GTGTGTTGTTGCCCTGCTTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTT GATTCGTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTGATACTTGAGG GCTCCTTTTTTGGGGGTTCTTGGGTGTTCGAATGCAATTT CTTCTGATTTTTGTGTTTGT Mycobctcterium GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC marinurn AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT (SEQ ID NO: TTCTAAGGAGCACCACGAGAAACACTCCAATTGGTGGG 6) GTGTAAGCCGTGAGGGGTTCTCGTCTGTAG TGGACGGAAGCCGGGTGCACAACAACAAGCAAGCCAGA CACACTATTGGGTCCTGAGGCAACATCTCTGTTGGTTTC GGGATGTTGTC C CAC CATCTTGGTGGTGGG GTGTGGTGT TTGAGAATTGGATAGTGGTTGCGAGCATCAATTGGATGC GCTGCCTTTTGGTGGCGTGTTCTGTTGTGCAATTTTATTC TTTGGTTTTTGTGT Mycobacterium GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC abscessus AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT (SEQ ID NO: TTCTAAGGAGCACCATTTCCCAGTCGAATGAACTAGGGA 7) ACATAAAGTAGGCATCTGTAGTGGATATCTACTTGGTGA ATATGTTTTGTAAATC CTGTC CAC C C C GTGGATGGGTAG TC GG CAAAAC GTC GGACTGTCATAAGAATTGAAAC GCTG GCACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACGTTGTGTTGTCA CCCTGCTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTTGACTTCTGAAT AGTGGTTGCGAGCATCTAAACATAGCCTCGCTCGTTTTC GAGTGGGGCTGGTTTTTGCAATTTTATT Mycobacterium bohemicum (SEQ ID NO: GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCACGAAAAACACCCCAATTGGTGGG GTGTGAGCCGTGAGGGGTTCCTGCCTGTAG TGGGCGGGGGCCGGGTGCGCAACAGCAAACGTTCGCCA GACACACTATTGGGCCCTGAGACAACACTCGGTCTGTCC CATTCGGGTCGGCACAGTGGTGTCCCTCCATC TTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGTATTGGATAGTGGT TGCGAGCATCTAATGAATGCGCTGCCCCTTGGCGCGTAT TCATTTGTGT 8) Mycobacterium chelonae GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCATTTCCCAGCCGAATGAGCTTGGGA ACATAAAGCGAGTTTCTGTAGTGGTTACTCGCTTGGTGA ATATGTTTTATAAATC CTGTC CAC C CC GTGGATAG GTAG TC GG CAAAAC GTC GGACTGTCAATAGAATTGAAAC GCTG GCACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACATTGTGTTGTCA CCCTGCTTGGTGGTGGGGTGTGGTCTTTGACTTATGGAT AGTGGTTGC GAGCATCTAACAAAC CTC GCTC GTTTAC GA GTGAGGTTAGTTTTTGCAATTTATT (SEQ ID NO: 9) Mycobacterium fortuitum (SEQ ID NO: GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCGATTCGATTCCCCCGCCGTCCGCGA AGTCGTGGGCAGTAGTGCGGTTGGGATATTTCAGCCAGG CCCTGTAGTGGGTGTCTGGTGGGTGCAAATGACAAACGT TGAGCCGGCGCGGGAAAGCGCTGGTGATGGAACTGCCA GACACACTATTGGGCTTTGAGACAACAGGCCCGTGCCCC TTTTTTGGGGGGTGGCATCCGGTTGCGGGTGTCGGCGTG TTGTTGCCTCACTTGTTGGGGGCTCA 10) Mycobacterium smegmatis (SEQ ID NO: GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCACGAGAGACACTCTCCGTTGGGGAC 11) GGTGTGAGCCGTGAGGAGCTGGAGCGCTGTAGTGGCGC CGGCTTGGTGCACAGCAAACGTTGAGATGCGGTGTGGG AAACGCTGTTTCGATGGACTGCCAGACACACTATTGGGC CCTGAGACAACAGGCCCGTTGTTCCCTGGCCACTGTGTG TGGTGGGAGGCGTGTTGTTGCCCTGCTTTGGTGGTGGGG TGTGGTGTTTGATTTGTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA GTTCGTAAGAGTGTGGCTGCCGGCCTTTGAGGTTGGGTG GCGCATTGTTGCGGACAAATTGATGTGCCATTTTTCTTCT GATTATTGGTTT Mycobacterium gordonae (SEQ ID NO: GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCACGAGAAGCACTCCAATTGGTGGG GTGCAAGCCGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG TGGACGAAGACCGGGTGCACGACAACAAGCAAAGCCAG ACACACTATTGGGTCCTGAGGCAACACCCTCGGGTGCTG TCCCCCCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACT GGATAGTGGTTGCGAGCATCAAAATGTATGCGTTGTCGT TCGCGGCAACGTGTTCTTTTTGTGCAATTTTTATTCTTTG GTTTTTGTAGTGTTTGTAAGTGTCT 12) Mycobacterium gastri GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCACGAAAAACACCCCAACTGGTGGG GTGTAAGCCGTGAGGGGCTCCCGTCTGTAG TAGACGGGCGCCGGGTGCGCAACAGCAAGCGAGCCAGA CACACTATTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGGCTTGTCTT GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCCCACCATC TTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAATTGGATAGTGGT TGCGAGCATCAAATGGATGCGTTGCCCGCAGGGTAGCGT GTTCTTTTGTGCAATTTTATTCTTTGGTTTTTGTGT (SEQ ID NO: 13) Mycobacterium avium GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC (SEQ ID NO: AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT TTCTAAGGAGCACCACGAAAAGCACCCCAACTGGTGGG 14) GTGC GAGCCGTGAGGGGTTCC CGTCTGTAG TGGACGGGGGCCGGGTGCGCAACAGCAAATGATTGCCA GACACACTATTGGGCCCTGAGACAACACTCGGTCCGTCC GTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTT TGAGTATTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTAGATGAGCGC ATGGTCTTCGTGGCCGGCGTTCATCGAAATGTGTAATTT CTTTTTTAACTCTTGTGTGTAAGTAAG Mycobacterium haemophilum (SEQ ID NO : GTC GAAGGTGGGAT C G GC GATTGGGACGAAGTC GTAAC AAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCT 15) TTCTAAGGAGCACCACGAAAAACACTCCAATTGGTGGG GTGTAAGCCGTGAGGGGTTCTCATCTGTAGTGGACGAGA GCCGGGTGCACAACAGCAAATGAATCGCCAGACACACT GTTGGGTCCTGAGGCAAAACTCAGGCTTGTCCCATGTTG GGCTTGATCGGGTGCTGTCCCCCCATCTTGGTGGTGGGG TGTGGTGTTTGAGTATTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA AATGGATACGTTGCCAGTAATGGTGGCGTGTTCATTGAA AATGTGTAATTTTCTTCTTTGGTTTTGTGTGTAAGTAAGT GCTTAAGGGCGCATGGTGGATGCCTTGGCATCGAGAGCC GATGAAGGACGTGGGAGGCTGCGATATGCCTCGGGGAG CTGTCAACCGAGCGTGGATCCGAGGATTTCCGAATGGGG AAACCCAGCACGAGTGATGTCGTGTTACCCGTATCTGAA TATATAGGGTGCGGGAGGGAACGCGGGGAA Mycobacterium GTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC pseudoshottsii AAGGTAGCCGTACC GGAAGGTGCGGCTGGATCACCTC CT (SEQ ID NO: TTCTAAGGAGCACCACGAGAAACACTCCAATTGATGGG 16) GTGTAAGCCGTGAGGGGTTCTCGTCTGCAGTGGACGGAA GCCGGGTGCACAACAACAAGCAAGCCAGACACACTATT GGGTCCTGAGGCAACATCTCTGTTGGTTTCGGGATGTTG TCCCACCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAATT GGATAGTGGTTGCGAGCATCA ATTGGATGCGCTGCCTTTTGGTGGCGTGTTCTGTTGTGCA ATTTTATTCTTTGGTTTTTGTG Tableau 1. Séquence de la région 16S-23S de l'ADNr chez 12 espèces myeobactériennes Dans l'invention, un "échantillon biologique" correspond à tout type d'échantillon 5 contenant, ou susceptible de contenir, de la matière biologique. De préférence, il s'agit d'échantillons susceptibles de contenir des mycobactéries, c'est-à-dire des échantillons susceptibles de contenir de l'ADN, ou des traces d'ADN de mycobactéries. Etant donné que l'utilisation définie ci-dessus permet simultanément la détection et 10 l'identification des mycobactéries, l'invention peut être utilisée pour analyser des échantillons dans lesquels il est connu que des mycobactéries sont présentes, mais également des échantillons pour lesquels on ignore s'ils contiennent ou non des mycobactéries. 15 De manière non limitative, les échantillons biologiques peuvent par exemple correspondre à des prélèvements de tissus ou des prélèvements sanguins, ou encore des prélèvements d'eau. De préférence, les échantillons biologiques correspondent à des prélèvements de tissus de poissons, en particulier les branchies, le foie, la rate ou encore le rein. 20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, 25 dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : 30 - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre' 5 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion et/ou une température de fusion dudit produit d'amplification. Dans l'invention, la technique de biologie moléculaire dite de « fusion d'ADN à haute 10 résolution » est également nommée "HRM" (high resohttion melting). Cette technique HRM est réalisée à partir d'ADN double brin. Avant l'analyse par HRM, un fragment de l'ADN, dans lequel sont susceptibles d'être localisées des mutations d'intérêt, est amplifié par une réaction PCR (polymerase chain reaction). L'échantillon contient alors un grand nombre de copies du fragment d'ADN ciblé et amplifié par la réaction PCR. 15 L'analyse HRM consiste ensuite à chauffer de manière précise et contrôlée le fragment d'ADN amplifié par PCR pour provoquer sa dénaturation. Le suivi de la dénaturation de l'ADN, lors de l'analyse HRM, permet ainsi de déterminer une température de fusion et/ou un profil de fusion spécifique du fragment d'ADN cible. 20 La température de fusion ou "Tm" correspond à la température à laquelle 50% d'une molécule d'ADN est dénaturé, c'est-à-dire sous la forme simple brin. Le profil de fusion correspond à l'évolution de la dénaturation d'une molécule d'ADN en fonction de la température. 25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, 30 dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit 10 produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion et une température de fusion dudit produit d'amplification. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne 15 appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit 20 échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et 25 - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit 30 produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion dudit produit d'amplification. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de 5 l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 10 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre 15 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir une température de fusion dudit produit d'amplification. L'invention repose sur la double observation inattendue faite par les Inventeurs qu'il 20 existe, d'une part un fragment spécifique du génome suffisamment conservé chez les mycobactéries pour être amplifié par PCR chez différentes espèces, mais suffisamment variable pour discriminer les mycobactéries au niveau de l'espèce, et d'autre part qu'il est possible de mettre en évidence ces variations génétiques par une technique HRM. 25 En utilisant la technique HRM, il est ainsi possible d'obtenir pour une espèce de mycobactérie déterminée, d'une part un profil de fusion de référence, et d'autre part une température de fusion de référence. Ce profil de fusion de référence et cette température de fusion de référence correspondant à une espèce mycobactérienne déterminée aura été obtenu de préférence 30 à partir d'un échantillon comprenant de l'ADN pur de la dite espèce mycobactérienne. Pour être utilisés pour l'identification de cette espèce mycobactérienne déterminée dans un échantillon à tester, le profil de fusion de référence et la température de fusion de référence auront été de préférence obtenus dans les mêmes conditions expérimentales que le profil de fusion et la température obtenus à partir de l'échantillon à tester. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-5 dessus dans laquelle le dit au moins un couple d'amorces est constitué : 10 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit au moins un couple d'amorces est constitué d'une amorce 15 consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) et d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR comprend la répétition du cycle constitué des 3 20 étapes suivantes : une étape à une température de 90°C à 99°C, pendant 5 à 30 secondes, suivie d'une étape à une température de 58°C à 64°C, pendant 5 à 30 secondes, suivie d'une étape à une température de 70 à 74°C, pendant 5 secondes à 1 25 minute. Les trois étapes constituant le cycle de PCR correspondent respectivement à des étapes : - de dénaturation de l'ADN (de 90°C à 99°C), - d'hybridation de l'ADN avec les amorces (de 58°C à 64°C), 30 - et d'élongation de l'ADN par l'ADN polymérase à partir des amorces (de 70°C à 74°C). - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et la séquence SEQ ID NO : 3 - d'une amorce consistant en (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR comprend la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : une étape à 95°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite répétition du cycle est une répétition de 40 à 50 fois, de 10 préférence 45 fois. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est précédée d'une étape de dénaturation initiale de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, de préférence à 95°C 15 pendant 10 minutes. Cette étape de dénaturation initiale est une étape de chauffage effectuée avant le cycle PCR. Elle permet de préparer l'ADN de l'échantillon, qui va servir de matrice durant la réaction d'amplification, notamment en déshybridant complètement l'ADN double brin, 20 en cassant les structures secondaires de l'ADN ou encore en activant l'ADN polymérase. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange 25 réactionnel comprenant au moins : l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgCl2 à raison de 1 à 5 mM, et les amorces à raison de 0,1 à 1 1.1.M. 30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : - l'ADN contenu dans l'échantillon biologique - du MgCl2 à raison de 3 mM, et les amorces à raison de 0,4 p,M. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus dans laquelle ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgCl2 à raison de 3 mM, les amorces à raison de 0,4 p,M, et au moins une unité d'ADN polymérase. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgCl2 à raison de 3 mM, les amorces à raison de 0,4 p.M, au moins une unité d'ADN polymérase, et - du tampon d'amplification.
De préférence, le tampon d'amplification comprend 10 mM de Tris-HC1, 50 mM KC1 et 0,1% de triton ou de gélatine. Un tel tampon d'amplification peut également contenir d'autres constituants supplémentaires susceptibles de favoriser la réaction PCR.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : - l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgC12 à raison de 3 mM, les amorces à raison de 0,4 p,M, et - du Master Mix® utilisé en concentration 1X (Rochee). '5 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion et/ou une température de fusion dudit produit d'amplification. Cette étape de chauffage progressif correspond à un chauffage de l'échantillon réalisé de manière contrôlée, au cours duquel la température augmente progressivement par paliers au cours du temps, comme par exemple une augmentation de 0,2°C/seconde.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit chauffage progressif est réalisé avec un palier de 0,2°C/seconde.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle la dénaturation dudit produit d'amplification est suivie à l'aide d'un marqueur fluorescent, de préférence choisi parmi le LC Green, le LC Green Plus, le ResoLight, l'EvaGreen, le Chromofy, le SYTO 9.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus contenant une étape de traitement des données à l'aide d'un logiciel informatique. La sensibilité de la technique HRM réside dans une combinaison de paramètres qui 25 incluent entre autres la taille et la nature du fragment d'ADN amplifié, la composition du mélange réactionnel (en particulier la quantité de sels), le protocole de chauffage, ainsi que les paramètres mathématiques utilisés pour l'analyse. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-30 dessus dans laquelle ladite espèce bactérienne du genre Mycobacterium est une espèce non tuberculeuse, en particulier une espèce pathogène non tuberculeuse.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite espèce bactérienne du genre Mycobacterium est une espèce choisie parmi le groupe consistant en M. phlei, M bohemicum, M gastri, pseudoshottsii, M smegmatis, M fortuitum ssp fortuitum, M marinum, M chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium, M haemophilum, et M malmoense. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon biologique d'origine animale.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon biologique issu d'un poisson.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon biologique d'origine humaine. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation in vitro d'au moins un couple 20 d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de 25 l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion et/ou une température de fusion dudit produit d'amplification. 30 Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé in vitro permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, comprenant : a) une première étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique par une réaction PCR à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, ledit couple d'amorces spécifiques étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 10 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), pour obtenir un produit d'amplification, b) une seconde étape de détermination d'un profil de fusion et/ou d'une température de fusion du produit d'amplification obtenu à l'étape a), c) une troisième étape de comparaison entre : 15 - le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, et - un profil de fusion et/ou une température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans lequel, lorsque le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit 20 d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique et le profil de fusion et/ou la température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium sont similaires, le dit échantillon biologique contient ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium. 25 Le procédé de détection et d'identification des mycobactéries par HRM tel que défini ci-dessus présente donc l'avantage de permettre l'analyse de plusieurs échantillons simultanément, en 3-4 heures seulement, et surtout sans nécessiter la mise en culture préalable des mycobactéries. 30 L'analyse HRM permettant la distinction de séquences d'ADN qui ne diffèrent entre elles que d'une seule mutation, la plupart des espèces de mycobactéries présentent un profil de fusion unique et spécifique, permettant leur identification. L'obtention de deux profils similaires indique ainsi qu'il s'agit vraisemblablement d'une seule et même espèce de mycobactérie. Dans l'invention, le caractère similaire de deux profils de fusion est admis lorsque ceux-ci sont superposables l'un avec l'autre.
Dans les rares cas où deux espèces de mycobactéries différentes présentent un profil de fusion similaire, il est possible de les identifier spécifiquement en déterminant leur température de fusion, car le Tm constitue également un critère discriminant les espèces mycobactériennes.
Dans l'invention, le caractère similaire de deux Tms est admis lorsque les Tms sont différents de moins de 0,1°C. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel le dit au moins un couple d'amorces est constitué : d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et la séquence SEQ ID NO: 3 - d'une amorce consistant en (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ledit au moins un couple d'amorces est constitué d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) et d'une amorce 25 consistant en la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite réaction PCR de l'étape a) comprend la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : 30 une étape à 95°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes. 20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite répétition du cycle est une répétition de 40 à 50 fois, de préférence 45 fois.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite réaction PCR de l'étape a) est précédée d'une étape de dénaturation initiale de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, de préférence à 95°C pendant 10 minutes.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : - l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgC12 à raison de 3 mM, et les amorces à raison de 0,41_1,M. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins : l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgCl2 à raison de 3 mM, les amorces à raison de 0,4 p,M, et du Master Mix® utilisé en concentration 1X (Roche)).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel l'étape b) comprend une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation du produit d'amplification obtenu à l'étape a).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ledit chauffage progressif est réalisé avec un palier de 0,2°C/seconde.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel l'étape b) comprend une étape de suivi de la dénaturation du produit d'amplification obtenu à l'étape a) à l'aide d'un marqueur fluorescent, de préférence choisi parmi le LC Green, le LC Green Plus, le ResoLight, l'EvaGreen, le Chromofy, le SYTO 9. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite étape b) et/ou l'étape c) contient une étape de traitement des données à l'aide d'un logiciel informatique.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite espèce bactérienne du genre Mycobacterium est une espèce pathogène non tuberculeuse.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite espèce bactérienne du genre Mycobacterium est une espèce choisie parmi le groupe consistant en M phlei, M bohernicum, M gastri, M pseudoshottsii, smegmatis, M fortuitum ssp fortuiturn, M marinum, M chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium, M haemophilum et M. malmoense.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon biologique d'origine animale. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus 25 dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon biologique issu d'un poisson. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon biologique d'origine humaine. 30 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé in vitro permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, comprenant : a) une première étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique par une réaction PCR à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques d'un 5 fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, ledit couple d'amorces spécifiques étant constitué d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1 GCTGGATCACCTCCTTTCTA et d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT), 10 ladite réaction PCR comprenant la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : une étape à 95°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes, pour obtenir un produit d'amplification, 15 b) une seconde étape de détermination d'un profil de fusion et/ou d'une température de fusion du produit d'amplification obtenu à l'étape a), c) une troisième étape de comparaison entre : - le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, et 20 - un profil de fusion et/ou une température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium dans lequel, lorsque le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique et le profil de fusion et/ou la température de fusion préalablement associés à ladite espèce 25 bactérienne appartenant au genre Mycobacterium sont similaires, le dit échantillon biologique contient ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé in vitro permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre 30 Mycobacterium, choisie parmi le groupe consistant en M phlei, M bohemicum, M gastri, M pseudoshottsii, M smegmatis, M fortuitum ssp fortuitum, M marinum, M chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium, M haemophilum, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, comprenant : a) une première étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique par une réaction PCR à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne appartenant 5 au genre Mycobacterium, ledit couple d'amorces spécifiques étant constitué d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1 GCTGGATCACCTCCTTTCTA et d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT), ladite réaction PCR comprenant la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : 10 - une étape à 95°C pendant 10 secondes, - suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, - suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes, pour obtenir un produit d'amplification, b) une seconde étape de détermination d'un profil de fusion et/ou d'une température 15 de fusion du produit d'amplification obtenu à l'étape a), c) une troisième étape de comparaison entre : - le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, et - un profil de fusion et/ou une température de fusion préalablement associés à ladite 20 espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans lequel, lorsque le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique et le profil de fusion et/ou la température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium sont similaires, le dit échantillon 25 biologique contient ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé in vitro permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, choisie parmi le groupe consistant en M phlei, M bohemicum, M 30 gastri, M pseudoshottsii, M smegmatis, M fortuitum ssp fortuitum, M marinum, M chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium, M haemophilum, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, comprenant : a) une première étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique par une réaction PCR à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, ledit couple d'amorces spécifiques étant constitué d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) et d'une amorce correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT), ladite réaction PCR comprenant la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : - une étape à 95°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes, pour obtenir un produit d'amplification, b) une seconde étape de détermination d'un profil de fusion et/ou d'une température de fusion du produit d'amplification obtenu à l'étape a), c) une troisième étape de comparaison entre : - le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, et - un profil de fusion choisi parmi ceux présentés dans la figure 4 et/ou une température de fusion choisie parmi celles présentées dans le tableau 3, préalablement 20 associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans lequel, lorsque le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique et le profil de fusion et/ou la température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium sont similaires, le dit échantillon 25 biologique contient ladite espèce bactérienne appartenant ,au genre Mycobacterium. Dans un autre aspect, l'invention concerne un couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S d'une espèce bactérienne du genre Mycobacterium choisi parmi les couples d'amorces suivants : 30 une amorce sens GCTGGATCACCTCCTTTCTA (SEQ ID NO: 1) et une amorce antisens AGATGCTCGCAACCACTAT (SEQ ID NO : 3), une amorce sens GCTGGATCACCTCCTTTCTA (SEQ ID NO: 1) et une amorce antisens GATGCTCGCAACCACTATCCA (SEQ ID NO : 4), ou une amorce sens ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC (SEQ ID NO : 2) et une amorce antisens AGATGCTCGCAACCACTAT (SEQ ID NO : 3). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S d'une espèce bactérienne du genre Mycobacterium constitué d'une amorce sens GCTGGATCACCTCCTTTCTA (SEQ ID NO: 1) et d'une amorce antisens AGATGCTCGCAACCACTAT (SEQ ID NO : 3).
Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne du genre Mycobacterium dans un échantillon biologique, comprenant au moins un couple d'amorces constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus comprenant au moins un couple d'amorces constitué : - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus 30 comprenant au moins un couple d'amorces constitué d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) et d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus comprenant un mélange réactionnel contenant du MgCl2 et de l'ADN polymérase. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus 5 comprenant un mélange réactionnel contenant du MgC12, de l'ADN polymérase, et tout autre composé nécessaire à l'amplification d'une molécule d'ADN par réaction PCR. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus comprenant un fascicule d'instructions pour réaliser une analyse HRM. 10 Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée. LEGENDES DES FIGURES 15 FIGURE 1. Spécificité des amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3. (A) Courbes d'amplification par PCR obtenues à partir de l'ADN génomique de M. marinum et M. fortuitum (environ 104 copies de génome) et de 16 bactéries non-mycobactéries (environ 106 copies de génome) en utilisant les amorces SEQ ID NO: 1 20 et SEQ ID NO : 3. L'axe des ordonnées représente la quantité d'ADN en unité arbitraire et l'axe des abscisses représente le nombre de cycles d'amplification. (B) Analyse par électrophorèse des produits d'amplification par PCR obtenus à partir de l'ADN génomique (environ 106 copies du génome) de M marinum et M. fortuitum et de 25 16 bactéries non-mycobactéries en utilisant les amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO : 3. (C) Analyse par électrophorèse des produits d'amplification par PCR obtenus à partir de l'ADN génomique (environ 106 copies du génome) de M. marinum et M fortuitum et de 16 bactéries non-mycobactéries en utilisant les amorces universelles 16S SEQ ID NO : 30 17 et SEQ ID NO: 18. Le puit 1 correspond au marqueur de poids moléculaire, et les puits 2 à 19 correspondent respectivement aux produits d'amplification obtenus à partir de Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortuitum, Carnobacterium piscicola, Streptococcus parauberis, Carnobacterium maltaromaticum, Enterococcus faecalis, Citrobacter freundii, Lactococcus garvieae, Nocardia sp., Flavobacterium psychrophilum, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Vibrio vulnificus, Citrobacter braaki, Shewanella putrefaciens, Photobacterium damselae et Chryseobacterium indologenes. FIGURE 2. Sensibilité des amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO : 3. (A) Courbes d'amplification par PCR obtenues à partir de l'ADN génomique de M fortuitum (haut) et M. marinum (bas) en utilisant les amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID 10 NO : 3. Les réactions PCR ont été réalisées à partir de dilutions de 100 ng d'ADN génomique de poisson, à savoir 106, 105, 104, 103, 102, 10 et 1 copies de génome. L'axe des ordonnées représente la fluorescence en unité arbitraire et l'axe des abscisses représente le nombre de cycles d'amplification. (B) Analyse par électrophorèse des produits d'amplification correspondants 15 Le puit 1 correspond au marqueur de poids moléculaire, les puits 2 à 8 correspondent au produit d'amplification obtenus à partir de 106, 105, 104, 103, 102, 10 et 1 copies de génome, le puit 9 correspond au contrôle négatif sans ADN. FIGURE 3. Courbes standard d'amplification PCR obtenues à partir de dilutions 20 en série de l'ADN de M. fortuitum et M. marinum. (A) L'ADN de M. fortuitum (losange) et M. marinum (triangle) a été dilué dans de l'eau. (B) L'ADN de M. fortuitum (losange) et M marinum (triangle) a été dilué dans 100 ng d'ADN de poisson resuspendu dans du tampon Tris-EDTA. 25 L'axe des ordonnées représente le nombre de cycles d'amplification et l'axe des abscisses représente la quantité de copies de génomes. Les amplifications PCR ont toutes été réalisées à l'aide des amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO :3. 30 FIGURE 4. Discrimination de 12 espèces de mycobactéries par analyse HRM. Les profils de fusion ont été obtenus après un ajustement de température sur les courbes de fusion normalisées, et en utilisant la courbe obtenue de fusion pour M. pseudoshottsii comme courbe de référence.
Les 12 espèces de mycobactéries analysées sont respectivement M. abscessus, marinum, M chelonae, M haemophilum, M gordonae, M fortuitum ssp fortuitum, M gastri, M avium, M phlei, M smegmatis, M pseudoshottsii et M bohemicum. Ces 12 espèces ont été regroupées en 9 groupes correspondant à 9 profils de fusion distincts. Par souci de clarté, les groupes 1 à 5 sont présentés dans la figure (A) et les groupes 6 à 9 sont présentés dans la figure (B). Lorsque deux espèces partagent le même profil de fusion, ces dernières peuvent être différenciées par leur Tm, comme c'est le cas dans le groupe 1 (M marinum et M gordonae), le groupe 2 (M phlei et M pseudoshottsii) et le groupe 3 (M. fortuitum et M haemophilum) L'axe des ordonnées représente la différence relative de fluorescence en unité arbitraire et l'axe des abscisses représente la température. Cette expérience a été reproduite 3 fois de manière indépendante avec le même résultat. Les amplifications PCR ont toutes été réalisées à l'aide des amorces SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3.
FIGURE 5. Reproductibilité des profils de fusion. (A) Chaque profil de fusion a été obtenu à partir de l'ADN d'une espèce de mycobactérie. Pour chaque espèce, 6 courbes distinctes ont été générées en utilisant 6 échantillons répliqués. Par souci de clarté, seulement 6 espèces sont présentées. (B) Les profils de fusion ont été obtenus à partir de dilutions en série de l'ADN de M marinum ou M fortuitum (de 106 à 10 copies de génomes/réaction), en utilisant 3 échantillons répliqués par dilution. L'axe des ordonnées représente la différence relative de fluorescence en unité arbitraire et l'axe des abscisses représente la température.
Les amplifications PCR ont toutes été réalisées à l'aide des amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO :3. FIGURE 6. Identification de mycobactéries dans des échantillons inconnus. (A) Les profils de fusion ont été générés pour 4 souches de référence analysées seules, 30 correspondant respectivement à M marinum, M fortuitum, M chelonae et M phlei, en utilisant la courbe obtenue pour M fortuitum comme référence. (B) Les profils de fusion ont été générés pour les 4 souches de référence ci-dessus, ainsi que pour 9 échantillons inconnus, identifiés comme M marinum et M phlei, en utilisant la courbe obtenue pour M fortuitum comme référence. L'axe des ordonnées représente la différence relative de fluorescence en unité arbitraire 5 et l'axe des abscisses représente la température. (C) La courbe de fusion d'un des échantillons présente deux inflexions avec des Tm comparables à ceux de M marinum et M phlei. Les amplifications PCR ont toutes été réalisées à l'aide des amorces SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3. 10 EXEMPLES 1) Matériels et méthodes Les souches bactériennes 15 Douze isolats de mycobactéries non-tuberculeuses ont été utilisés comme espèces de «référence». Une liste de ces isolats est présentée dans le tableau 2. Tous ces isolats ont été préalablement identifiés par des tests biochimiques et/ou par séquençage. Les mycobactéries ont été cultivées dans du milieu Lowenstein-Jensen (il), à 37 ° C pendant plusieurs jours à plusieurs semaines. 20 De plus, 16 autres isolats correspondant à des non-mycobactéries, comprenant des bactéries opportunistes et pathogènes de poisson, ont également été utilisés pour évaluer la spécificité du test (voir tableau 2). Ces bactéries, correspondant à 6 espèces Gram positif et 10 espèces Gram négatif, ont été cultivées dans leur milieu de culture spécifique. 25 Gram MYCOBACTERIES M phlei (CIP 105389T) M bohemicum (CIP 105811T) + M gastri (CIP 104530T) + M pseudoshottsii (CIP109775 T) + M smegmatis (CIP 104444 T) + M. fortuitum ssp fortuitum + + + + + + + M. marinum M chelonae M. abscessus M. gordonae M. avium M haemophilum BACTERIES NON-MYCOBACTERIENNES Flavobacteriurn psychrophilum - Pseudomonas fluorescens - Aeromonas sobria - Aeromonas hydrophila - Vibrio vulnificus - Citrobacter braaki - Shewanella putrefewiens - Photobacterium damselae - Chryseobacterium indologenes - Lactococcus garvieae + Carnobacterium piscicola + Streptococcus parauberis + Carnobacterium maltaromaticum + Enterococcus faecalis + Citrobacter freundit - Nocardia sp. + Tableau 2. Echantillons de tissus de poisson 10 échantillons de poissons ont été utilisés pour valider le test HRM, ainsi que 3 échantillons d'ADN extraits à partir des cultures de mycobactéries isolées de poissons. La liste des échantillons de poissons est présentée dans le tableau 3.
Echantillon de poisson Concentration Identification des NTM 1 7,41E+05 M phlei 2 6,17E+06 M. marinum 3 1,61E+07 Mélange de M. phlei I M. marinum 4 1,67E+06 M. phlei 1,04E+07 M. phlei 6 1,45E+06 M malmoense 7 3,89E+06 M. phlei 8 2,07E+06 M phlei 9 5,39E+06 M. marinum 2,49E+07 M marinum Echantillons d'ADN 11 M. abseessus 12 M. marinum 13 M. marinum Tableau 3. Isolement de l'ADN génomique 5 L'ADN des échantillons (souches bactériennes et tissus de poissons) a été purifié en utilisant le kit de purification d'ADN génomique Wizard0 (Promega), suivant les instructions du fabricant. Pour les bactéries Gram positif, un protocole légèrement modifié a été utilisé. Les colonies bactériennes ont été remises en suspension dans 480 pl de solution EDTA (50 mM, pH 8). Après addition de 120 pl de lysozyme (10 10 mg/m1), les cellules bactériennes ont été incubées pendant 1 heure à 37°C, centrifugées pendant 5 min à 13000 g, remises en suspension dans 600 pl de solution de lyse des noyaux, incubées à nouveau pendant 10 min à 100°C, puis refroidies à la température ambiante. Ce lysat a ensuite été complété par 20 pl de protéinase K (20 mg/mi) et incubé pendant 3 heures à 55°C, sous agitation douce. Le reste de la procédure a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. L'ADN des isolats Gram négatif et des tissus du poisson a été extrait en suivant les instructions du fabricant fournies dans le kit. Dans tous les cas, l'ADN a été élué dans 70 pl d'une solution de Tris-EDTA, et la concentration en ADN a été mesurée par spectrométrie UV. L'ADN génomique bactérien a été ajusté à environ 0,5x104 ou 0,5x106 d'équivalents génome/.t1 (en considérant une taille moyenne de génome de 6,6 Mb), tandis que l'ADN de poisson a été dilué à 10 ng/pl.
Conception du test HRM Puisque le test HRM vise à être aussi simple que possible, celui-ci s'appuie sur l'utilisation d'un fluorophore intercalant de l'ADN double brin (et donc non-spécifique d'une séquence) pour mesurer les différences des profils de fusion des produits d'amplification PCR. Dans ces conditions, la région génomique ciblée doit (i) être distincte pour chacune des espèces étudiées et (ii) héberger des séquences conservées à ses extrémités autorisant l'amplification de cette région pour les bactéries du genre Mycobacterium. Des alignements multiples de différentes régions génomiques (dont l'opéron ribosomique 16S-23S, la f3 sous-unité de l'ARN polymérase (rpoB), la protéine de choc thermique de 65 kDa (hsp65) et la sous-unité B de l'ADN gyrase (gyrB)) ont été réalisés avec ClustaIX v2 sur des séquences importées à partir des bases de données non redondantes. Les alignements ont révélé que la région ITS de l'ADNr 163-23S de la région pourrait répondre à ces exigences. A partir de ces alignements, des amorces ont ensuite été conçues pour amplifier un fragment d'environ 220 à 320 pb dans toutes les espèces mycobactériennes ciblées. Les étapes d'amplification et de fusion ont été réalisées en utilisant le kit de fusion haute résolution LightCycler0 480 master kit (Roche). Le mélange réactionnel est composé de 2X Master Mix, MgC12, d'amorces sens et antisens, d'ADN génomique et d'eau, dans un volume final de 10 pi. La procédure d'amplification consiste en une dénaturation initiale suivie par 45 cycles de dénaturation, hybridation et élongation. Après amplification, le programme de fusion est réalisé par chauffage à 95°C pendant 1 minute, refroidissement à 40°C pendant 1 min, suivi de l'application d'une augmentation de température de 65 à 95°C avec une vitesse de palier de 0,2°C/s et d'une mesure de la fluorescence en continu. Chaque réaction a été effectuée en triple dans des plaques à 96 puits, avec le système LightCycler0 480 (Roche). Chaque analyse HRM inclut un contrôle négatif où la matrice d'ADN a été remplacée par de l'eau.
Sensibilité et spécificité de l'analyse HRM Pour déterminer la sensibilité du test, des dilutions d'ADN génomique de M. fortuitum et M. marinum ont été préparés en série au 1/10ème dans (i) de l'eau distillée stérilisée 5 et (ii) 100 ng d'ADN génomique extrait de foie de poisson Pangasianodon hypophtalmus. Le nombre d'équivalents génome a été estimé à partir des concentrations mesurées de l'ADN et de la taille du génome de M. marinum séquencé (6,66 Mb). Des dilutions successives de l'ADN de M fortuitum et de M marinum ont permis de couvrir la gamme de 106 à 1 équivalent génome, et des courbes standards ont été établies à 10 partir de ces mesures effectuées dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Etant donné que les génomes de mycobactéries peuvent porter 1 ou 2 opéron d'ADN ribosomal, les résultats étaient toujours exprimés en copies de génome ou en équivalents de génome, et non pas en copies de l'ADNr 16S-23S. 15 La spécificité du test a été évaluée sur 16 isolats non-mycobactériens, dont 6 espèces Gram positif et 10 espèces Gram négatif (voir tableau 1). La quantité d'ADN nonmycobactérien dans chaque réaction a été ajustée à environ 106 équivalents génome (basé sur une taille de génome moyenne de 6 Mb). Les contrôles positifs correspondent à 2 espèces de mycobactéries (M marinum et M fortuitum) et leur quantité d'ADN a 20 été fixée à environ 104 équivalents génome. Pour vérifier l'intégrité de ces 18 ADN génomiques, ils ont ensuite été amplifiés avec une paire d'amorces universelles 16S. Les mélanges réactionnels de PCR contiennent 5 0 de master mix 2X (kit PCR FastStart, Roche), 0,8 M d'amorces (GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG) (SEQ ID: 17) et (GCCCGGGAACGTATTCACCG) (SEQ ID: 18) et 2 0 d'ADN matrice, dans un 25 volume final de 10 0. Le programme d'amplification PCR est composé de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation (95°C, 30 sec), une étape d'hybridation (60°C, 30 sec) et une étape d'élongation de l'ADN (72°C, 30 sec). Les produits d'amplification PCR ont été observés sur un gel d'électrophorèse 1% contenant du marqueur SYBR Safe DNA gel (Invitrogen). 30 Analyse HRM L'outil logiciel LightCycler® 480 (version 1.5.0.39) a été utilisé à la fois pour les analyses PCR et HRM. Après chaque cycle, les cycles de quantification (Cq) ont été calculés de manière à ce que chaque matrice d'ADN soit amplifiée. Toutes les amplifications qui ont abouti à des valeurs de Cq > 30 ont été arbitrairement considérées comme négatives et ont donc été exclues des analyses ultérieures. Les profils de fusion ont été analysés avec la fonction "gene scanning", de manière standardisée. Tout d'abord, des courbes de fusion ont été normalisées dans les régions de pré-fusion et de post-fusion, les gammes des températures de normalisation sont respectivement de 81 à 81,5°C et de 92 à 92,5°C. Ensuite, un décalage de température est appliqué sur les courbes normalisées avec un seuil fixé à 5% de la fluorescence normalisée. Finalement, les courbes de fusion ont été classées dans des groupes avec une sensibilité par défaut F de 0,3 à l'aide de la fonction de groupement automatique. De cette manière, les courbes montrant des formes presque similaires ont été regroupées. Cependant, puisque le logiciel permet une classification en un maximum de 6 groupes seulement, une mesure du Tm a également été effectuée afin d'enregistrer la température de fusion de chaque produit. Les espèces bactériennes ont été ensuite identifiées en fonction à la fois de leur profil de fusion et de leur température de fusion (Tm). Validation du test avec des échantillons biologiques Pour évaluer la capacité du test HRM pour détecter et identifier des espèces de mycobactéries dans des échantillons biologiques, 30 tissus provenant de poissons infectés ou de poissons capturés dans des étangs infectés, ainsi que 3 échantillons d'ADN extraits à partir de cultures de mycobactéries isolées de certains poissons, ont été étudiés (voir tableau 2). L'ADN de ces échantillons a été soumis en aveugle à une analyse HRM, avec les 12 espèces Mycobacterium de référence (M marinum , fortuiturn , M chelonae , M gordonae , Msmegmatis , M phlei , M bohemicum , M pseudoshottsii , M abscessus , M haemophilum , M avium, M gastrite) et un contrôle négatif (sans ADN). Le rendement d'amplification a été vérifié et les échantillons qui présentaient une valeur Cq < 30 ont été provisoirement attribué à une espèce par l'analyse successive du profil de fusion et du Tm. Pour confirmation, les échantillons qui présentaient un produit d'amplification unique ont été séquencés. 2) Spécificité des amorces Testées sur l'ADN génomique extrait de cultures bactériennes pures, les amorces SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3, spécialement conçues pour ce test, amplifient le fragment d'ADN spécifique chez l'ensemble des 12 espèces de Mycobacterium analysées (voir tableau 1), y compris M. marinum, M fortuitum et M. chelonae (Voir Figure 1A). L'amplification PCR génère des produits d'amplification de la taille attendue, compris entre environ 220 et 320 pb.
Pour les espèces non mycobactériennes (voir Tableau 2), les amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 donnent toujours des valeurs Cq au dessus de 30, soit en dessous du seuil de détection, sans bande détectable par électrophorèse (voir Figure 1B). Il convient de noter que la quantité d'ADN génomique utilisée pour tester ces 16 souches non- mycobactériennes est élevée, car elle est d'environ 106 équivalents génomes. En comparaison, les deux principaux pathogènes M marinum et M fortuitum, testés à une concentration en ADN 100 fois inférieure (environ 104 copies de génome), génèrent des valeurs Cq autour de 19-20.
Quand les amorces universelles pour ADNr 16S ont été testées sur les mêmes ADN, toutes les souches ont donné un produit d'amplification de la même intensité, ce qui démontre qu'il n'y a pas eu dégradation de l'ADN ou inhibition de la PCR (voir Figure 1C). 3) La sensibilité de la technique HRNI Des tests de sensibilité ont été réalisés à partir de l'ADN de M marinum et M. fortuitum, en admettant que les résultats seraient comparables pour les autres souches, étant donné que l'utilisation de concentrations d'ADN équivalents génèrent des valeurs de Cq semblables pour toutes les souches testées. Comme décrit précédemment, le seuil de détection a été fixé à 30 cycles, parce que les valeurs Cq des contrôles négatifs ont toujours été comprises entre 30 et 35 cycles. En utilisant ce seuil, le test a été en mesure de détecter avec précision et de façon reproductible jusqu'à une limite basse de 10 copies de génomes de M. marinum et M fortuitum dans deux milieux expérimentaux, à savoir l'eau et l'ADN de poisson. La figure 2 présente les résultats d'amplification obtenus pour l'ADN de M marinum et M fortuitum dilué dans 100 ng d'ADN de poisson. De plus, la relation entre l'intensité de fluorescence et de la quantité d'ADN est linéaire sur 6 logs dans le cas des dilutions de l'ADN du poisson (R2 0,999 et 0,998, respectivement pour M marinum et M fortuitum), ainsi que pour les dilutions dans l'eau (R2 = 0,997 et 0.998, respectivement pour M. marinum et M. fortuitum) (voir Figure 3). Par conséquent, la présence d'ADN de poisson dans l'échantillon testé (ce qui reflète la constitution d'échantillons biologiques réels) ne modifie pas la sensibilité de la détection des mycobactéries par l'analyse HRM. 4) Analyse des profils de fusion 12 souches ont été testées selon leur capacité à être discriminées en fonction de leur profil de fusion et de leur température de fusion. L'analyse HRM montre la présence de 9 profils de fusion distincts, comme indiqué par les courbes présentées dans la figure 4.
Néanmoins, les mycobactéries qui partagent des profils de fusion identiques peuvent être différenciées car celles-ci présentent des Tm distincts (voir tableau 4), ce qui permet une discrimination totale des 12 espèces de mycobactéries. La fiabilité de cette classification des souches bactériennes a été évaluée par différents moyens. Premièrement, la reproductibilité des profils de fusion a été vérifiée par (i) 6 répétitions de chaque souche bactérienne et (ii) 6 dilutions successives de M. marinum et M fortuitum, chacune réalisée en triplicata. Comme l'indique la figure 5, les courbes obtenues pour les différentes répétitions et dilutions se superposent. Mieux encore, les profils de fusion, et donc la capacité de discrimination des mycobactéries, ne sont pas affectés par la concentration de l'ADN matrice. Deuxièmement, la mesure de la température de fusion pour chacune des 12 souches de mycobactéries (dans trois séries distinctes) révèlent une reproductibilité élevée, comme indiqué dans le tableau 3. Tous les écart-types (standard deviation, SD), sauf 3, sont < 0,04°C et l'écart-type maximum est de 0,12 ° C (pour M fortuitum). Enfin, lorsqu'elle est répétée 3 fois à partir de 3 essais indépendants, l'analyse HRM génère des discriminations et des regroupements des mycobactéries cohérents. Il est à noter que les 3 pathogènes de poissons les plus fréquents, à savoir Mycobacterium marinum, M fortuitum et M. chelonae, présentent des Tms différents. Par conséquent, leur identification peut être faite simplement en fonction de leur température de fusion (voir tableau 4).30 Mycobactéries Tmi Tm2 Tm3 Tm moyen ± (SD) M abscessus 86,12 86,07 86,09 86,10 ± 0,03 M. marinum 86,71 86,68 86,67 86,68 + 0,02 M. chelonae 87,31 87,23 87,26 87,27 + 0,04 M. haemophihnn 87,20 87,14 87,16 87,16 ± 0,03 M. gordonae 88,21 88,20 88,17 88,19 + 0,02 M. fortuitum ssp fortuitum 89,13 89,34 89,33 89,27 + 0,12 M. gastri 89,46 89,39 89,46 89,44 ± 0,04 M avium 89,05 88,87 88,88 88,94 + 0,10 M. phlei 90,92 90,92 90,82 90,89 + 0,06 M. smegmatis 90,12 90,11 90,10 90,11 + 0,01 M. pseudoshottsii 89,97 89,97 89,97 89,97 + 0,01 M. bohemicum 89,98 89,96 89,93 89,96+ 0,03 Tableau 4. 5) Détection des mycobactéries et identification des espèces dans des échantillons 5 biologiques en aveugle Parmi les 30 échantillons de tissus de poissons qui ont été testés, 10 ont généré un produit d'amplification par PCR avec les amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3. Les 20 autres ont donné des valeurs de Cq supérieures à 30. La concentration de ces 10 échantillons varie entre 20 et 1200 équivalents génomes par réaction, ou entre environ 1 10 et 60 équivalents génome par ng d'ADN génomique, car 20 ng d'ADN total ont été utilisés dans chaque réaction. Compte tenu de la quantité de tissu utilisée (20 mg) pour chaque extraction, ces concentrations correspondent à environ 7,5x105 2,5x107 de copies de génome par gramme de tissu. L'analyse HRM a permis l'identification de 3 de ces échantillons comme correspondant 15 à M marinum et 6 comme correspondant à M. phlei (Figure 6). Le séquençage des 9 produits d'amplification correspondants a confirmé l'identification des espèces pour 8 d'entre eux, tandis que le restant s'est avéré appartenir à M. malmoense, qui n'est pas inclus dans la présente analyse. Le dernier échantillon positif a présenté une courbe de fusion présentant une double 20 inflexion, avec des valeurs de Tm comparables à celles de M marinum (86,7°C) et M phlei (90,9°C), ce qui suggère la présence dans l'échantillon de ces 2 espèces (voir Figure 6C). En ce qui concerne les 3 échantillons d'ADN inconnus, 2 ont été identifiés sans ambiguïté comme correspondant à M. marinum, tandis que le troisième a été associé 5 avec M. abscessus. Le séquençage des produits d'amplification correspondants a confirmé cette identification des espèces pour les 3 échantillons. 10 15 20 25 30

Claims (15)

  1. REVENDICATIONS1.Utilisation in vitro d'au moins un couple d'amorces pour la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, en mettant en oeuvre une analyse HRM, dans laquelle, le dit au moins un couple d'amorces permet, à l'aide d'une réaction PCR, d'obtenir un produit d'amplification correspondant à un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne, à partir de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, ledit au moins un couple d'amorces étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), notamment dans laquelle le dit au moins un couple d'amorces est constitué : - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA).
  2. 2.Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle ladite réaction PCR comprend la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : - une étape à 95°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes, notamment dans laquelle ladite répétition du cycle est une répétition de 40 à 50 fois, de préférence 45 fois.
  3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle ladite réaction PCR est suivie d'une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion et/ou une température de fusion dudit produit d'amplification, notamment dans laquelle ledit chauffage progressif est réalisé avec un palier de 0,2°C/seconde.
  4. 4.Procédé in vitro permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite espèce bactérienne, comprenant : a) une première étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique par une réaction PCR à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S de ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, ledit couple d'amorces spécifiques étant constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), pour obtenir un produit d'amplification, b) une seconde étape de détermination d'un profil de fusion et/ou d'une température de fusion du produit d'amplification obtenu à l'étape a), c) une troisième étape de comparaison entre : - le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, et - un profil de fusion et/ou une température de fusion préalablement associés à ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobacterium, dans lequel, lorsque le profil de fusion et/ou la température de fusion dudit produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique et le profil de fusion et/ou la température de fusion préalablement associés à ladite espècebactérienne appartenant au genre Mycobacterium sont similaires, le dit échantillon biologique contient ladite espèce bactérienne appartenant au genre Mycobctcterium.
  5. 5.Procédé selon la revendication 4 dans lequel le dit au moins un couple d'amorces est constitué : (GATGCTCGCAACCACTATCCA), notamment dans laquelle ledit au moins un couple d'amorces est constitué d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) et d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT).
  6. 6.Procédé selon la revendication 4 ou 5 dans lequel ladite réaction PCR de l'étape a) comprend la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : - une étape à une température de 90°C à 99°C, pendant 5 à 30 secondes, suivie d'une étape à une température de 58°C à 64°C, pendant 5 à 30 secondes, suivie d'une étape à une température de 70 à 74°C, pendant 5 secondes à 1 minute, notamment dans lequel la dite réaction PCR de l'étape a) comprend la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes : - une étape à 95°C pendant 10 secondes, - suivie d'une étape à 61°C pendant 10 secondes, suivie d'une étape à 72°C pendant 20 secondes.
  7. 7.Procédé selon la revendication 6 dans lequel ladite répétition du cycle est une répétition de 40 à 50 fois, de préférence 45 fois. d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et la séquence SEQ ID NO: 3 - d'une amorce consistant en (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4
  8. 8.Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 dans lequel ladite réaction PCR de l'étape a) est précédée d'une étape de dénaturation initiale de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, de préférence à 95°C pendant 10 minutes.
  9. 9.Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8 dans lequel ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins: l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, du MgC12 à raison de 1 à 5 mM, et les amorces à raison de 0,1 à 1 ILLM.
  10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 dans lequel ladite réaction PCR est effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins: l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgC12 à raison de 3 mM, et les amorces à raison de 0,4 laM, notamment dans lequel ledit mélange réactionnel comprend au moins: l'ADN contenu dans l'échantillon biologique du MgC12 à raison de 3 mM, les amorces à raison de 0,4 p,M, et du Master Mix0 utilisé en concentration 1X (Roche)).
  11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10 dans lequel l'étape b) comprend une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation du produit d'amplification obtenu à l'étape a), notamment dans lequel ledit chauffage progressif est réalisé avec un palier de 0,2°C/seconde.
  12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11 dans lequel ladite espèce bactérienne du genre Mycobacterium est une espèce non tuberculeuse, en particulier une espèce non tuberculeuse pathogène, notamment une espèce choisie parmi le groupe consistant en M. phlei, M bohemicum, M gastri, M pseudoshottsii,M smegmatis, M fortuitum ssp fortuitum, M marinum, M chelonae, M abscessus, M gordonae, M avium, M haemophilum et M malmoense.
  13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12 dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon biologique d'origine animale, notamment un échantillon biologique issu d'un poisson ou un échantillon biologique d'origine humaine.
  14. 14. Couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment de la région ITS de l'ADNr 16S-23S d'une espèce bactérienne du genre Mycobacterium choisi parmi les couples d'amorces suivants : une amorce sens GCTGGATCACCTCCTTTCTA (SEQ ID NO: 1) et une amorce antisens AGATGCTCGCAACCACTAT (SEQ ID NO : 3), une amorce sens GCTGGATCACCTCCTTTCTA (SEQ ID NO: 1) et une amorce antisens GATGCTCGCAACCACTATCCA (SEQ ID NO : 4), ou une amorce sens ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC (SEQ ID NO : 2) et une amorce antisens AGATGCTCGCAACCACTAT (SEQ ID NO : 3).
  15. 15. Kit permettant la détection et l'identification d'une espèce bactérienne du genre Mycobacterium dans un échantillon biologique, comprenant au moins un couple d'amorces constitué : - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou avec la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et - d'une amorce ayant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou avec la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), notamment comprenant au moins un couple d'amorces constitué : - d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 (GCTGGATCACCTCCTTTCTA) ou la séquence SEQ ID NO: 2 (ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC), et- d'une amorce consistant en la séquence SEQ ID NO : 3 (AGATGCTCGCAACCACTAT) ou la séquence SEQ ID NO: 4 (GATGCTCGCAACCACTATCCA), notamment comprenant un mélange réactionnel contenant du MgC12 et de l'ADN polymérase.
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