WO2014170614A1 - Méthode de caractérisation des mutations chromosomiques des gènes codant les topoisomérases bactériennes - Google Patents

Méthode de caractérisation des mutations chromosomiques des gènes codant les topoisomérases bactériennes Download PDF

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WO2014170614A1
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seq
primers
degenerate
probe
hybridized
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PCT/FR2014/050939
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Inventor
Thomas GUILLARD
Antoine GRILLON
Christophe DE CHAMPS
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Universite De Reims Champagne-Ardenne
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/107—Maxam and Gilbert method, i.e. sequential release and detection of nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a method for the characterization of chromosomal mutations which are at the origin of the resistance of certain microorganisms, in particular enterobacteria, to antibiotics belonging to the family of quinolones.
  • the present invention will find its application mainly in the field of human medicine, especially in hospitals, as well as in the field of veterinary medicine.
  • the characterization method proposed here makes it possible in particular to rapidly diagnose a resistance of a microorganism to quinolones, which makes it particularly advantageous to be able to adapt the antibiotic treatment in the event of infection.
  • Antibiotics are synthetic or natural molecules, for example produced by fungi, which have been used since the end of the Second World War, to destroy bacteria (bactericidal effect) or prevent their growth (bacteriostatic effect).
  • Fluoroquinolones when a fluorine atom is added to the molecule, are broad-spectrum antibiotics and are one of the three most commonly prescribed families of antibiotics in the world to treat infections caused by certain enterobacteria, and resistance from these to the quinolones continues to increase.
  • quinolone antibiotics target certain enzymes that play a role in the bacterial DNA (deoxyribonucleic acid) replication mechanisms, such as class II and IV topoisomerases, and in particular DNA gyrase and topoisomerase. type IV.
  • topoisomerase enzymes allow control of the structure of DNA by generating transient cleavages in the DNA double helix and catalyze the passage of DNA segments in these transient cleavages before closing them.
  • DNA gyrase belongs to the family of topoisomerases of class II, and is formed of two subunits A and two subunits B, respectively coded by the genes gyrA and gyrB.
  • DNA gyrase allows supercoiling of bacterial chromosomal DNA by introducing negative supertours into the DNA double helix. The supertours will facilitate the progress of the DNA during the process of replication and transcription of it.
  • topoisomerases and in particular DNA gyrase, are essential enzymes for bacterial cell life, in particular because they are involved in essential processes such as the replication and transcription of DNA.
  • topoisomerases are excellent targets for drug agents, particularly antibiotics such as quinolones, which will cause a stop of bacterial multiplication.
  • quinolone chromosome resistance in enterobacteria results from mutations in the gyrA, gyrB, parC, and parE genes encoding topoisomerase enzymes. For each of them, the region where the mutations causing the quinolone resistance are located is called QRD for Quinolone Resistance Determining Region.
  • patent document WO 9 950 458 discloses a method for detecting enterobacteria in a sample by the use of specific probes obtained from a coding sequence of the gyrA gene. The method described here also proposes to determine the status of enterobacteria, sensitive or resistant, vis-à-vis the quinolones.
  • the document proposes the use of probes specific to different species of enterobacteria, and more particularly to the coding region of the gyrA gene to determine, on the one hand, the presence of one or the other of these bacteria in a sample, and, on the other hand, the resistance or sensitivity of these bacteria to quinolones.
  • the present DNA in the sample is first amplified using a pair of specific primers for amplification of the gyrA gene.
  • the specific probes of the different species of bacteria E. coli, C.freundii, etc.
  • the detection of the hybridization is carried out using a confocal laser microscope or by application of a controlled electric field. It is also possible to add a reagent to facilitate the detection of hybridization. The absence of hybridization when adding the specific probe indicates the presence of quinolone resistance in the test sample.
  • the method proposed in this document focuses solely on the gyrA gene while other genes, encoding topoisomerases, are likely to undergo mutations generating resistance of microorganisms to quinolones.
  • the proposed method is not exhaustive and it does not make it possible to characterize the mutations of the different genes coding for topoisomerases.
  • Patent document EP 0 688 873 proposes the use of three primers, each specific for a particular mutation of the gyrA gene, these primers being used in combination with a fourth primer specific for the complementary strand for amplification. The amplification is then detected by electrophoresis or by revelation of the fluorescence.
  • 2,364,054 a method for amplification of the region called QRDR using half-degenerate oligonucleotides, i.e. one of whose 3 'ends is degenerate, having a variable sequence, while the second end 5 'is constant.
  • the method proposed here comprises a first step of preparing a composition comprising on the one hand the for and reverse oligonucleotides, also called oligonucleotides left and right or sense and antisense respectively, half degenerate and, secondly, a sample that may contain a QRDR region.
  • the second step is to amplify the QRDR region. It is also possible to carry out a sequencing of this amplification product, after a cloning step in a plasmid, to compare it with a second amplification product obtained according to the same procedure.
  • the invention offers the possibility of overcoming the various disadvantages of the state of the art by proposing a method for the characterization of chromosomal gene mutations.
  • gyrA, gyrB, parC and parE responsible for the resistance of enterobacteria to quinolones, wherein after amplification of one or more portions of these genes with at least one pair of forward and reverse primers which can be degenerate, a reaction is carried out method of pyrosequencing using a plurality of pyrosequencing primers, hereinafter referred to as "probes" or “degenerate probes" for the sake of understanding, said probes being codon-specific capable of being substituted and thus mutated.
  • the present invention relates to a method for the characterization of chromosomal mutations of each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes encoding bacterial topoisomerases, these mutations possibly being responsible for the resistance of bacteria to quinolones, in which:
  • the bacterial DNA is extracted from a sample or a colony
  • the bacterial DNA extracted during the preceding step is brought into contact with at least one pair of primers specific to each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes;
  • each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes are amplified, independently of one another, by a polymerase chain reaction (PCR), to obtain at least one amplification product for each of the gyrA genes, gyrB, parC and parE;
  • PCR polymerase chain reaction
  • a pyrosequencing reaction of each of the amplification products of the gyrA, gyrB, parC and parE genes obtained in the preceding step is carried out using at least one degenerate probe specific to each of said amplification products to initiate pyrosequencing.
  • At least one of the primers of each pair of primers used for the polymerization chain reaction is a degenerate primer comprising at least one degenerate nucleotide which can be positioned indifferently on the nucleotide sequence of said primer;
  • the degenerate probe (s), used to initiate the pyrosequencing comprise (s) at least one degenerate nucleotide which can be positioned indifferently on the nucleotide sequence of said probe; interestingly, one of the primers, each of the pairs of primers, is biotinylated;
  • PCRs polymerase chain reactions
  • the gyrA, gyrB, parC and parE genes are amplified from at least one kind of gram-negative enterobacterium selected from the group consisting of Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella and Serratia;
  • At least six independent PCRs for amplifying the gyrA gene, labeled PCRlgyrA at PCR6 gyrA, are carried out, each of said PCRs being carried out from at least one pair of primers as defined later in the description.
  • At least one of the pairs of primers allows the amplification of at least a portion of gyrA in enterobacteria belonging to the genera Proteus, Providencia, Morganella and Serratia.
  • the pyrosequencing reactions of gyrA are then advantageously initiated from degenerate probes whose sequences will be described below and included in the sequence listing.
  • At least three independent PCRs for amplifying the gyrB gene, labeled PCRlgyrB with PCR3gyrB, are carried out, each of said PCRs being carried out from at least one pair of primers as defined later in this document. description.
  • At least one of these pairs of primers allows the amplification of at least one portion of gyrB in enterobacteria belonging to the genera Prote s, Providencia and Morganella.
  • the pyrosequencing reactions of gyrB are then advantageously initiated from degenerate probes whose sequences will be described below and included in the sequence listing.
  • At least three independent PCRs are performed to amplify the parC gene, denoted PCRlparC with PCR3parC, each of said PCRs being carried out starting from at least one pair of primers as defined later in the description.
  • At least one of these pairs of primers allows the amplification of at least a portion of parC in enterobacteria belonging to the genera Proteus, Providencia and Morganella.
  • At least five independent PCR PCR PCR PCR reactions are preferably carried out with each of said PCRs being carried out from at least one pair of primers, the set of pairs of 'primers will be defined below.
  • At least one of these pairs is intended to allow the amplification of at least a portion of parE in enterobacteria belonging to the Proteus genus,
  • the present invention also relates to an oligonucleotide primer for the amplification of one of the gyrA, gyrB, parC and parE genes.
  • the invention also relates to a degenerate oligonucleotide probe for the pyrosequencing of one of the gyrA, gyrB, parC and parE genes.
  • the present invention has many advantages. On the one hand, it makes it possible to determine extremely rapidly, and exhaustively, the mutations present at the level of the genes of interest and which lead to an increase in the resistance of microorganisms, in particular enterobacteria, to the antibiotics of the family of quinolones. As an indication, the present method makes it possible to characterize these mutations in less than 5 hours after extraction of the bacterial DNA from the sample to be tested.
  • primers some of which may contain degenerate nucleotides, and degenerate probes, respectively for the PC reaction and for the pyrosequencing reaction, makes it possible to target several bacterial genera that may be found in organisms infected.
  • FIG. 1 is a schematic illustration of an embodiment of certain polymerase chain reaction (PCR) reactions that can be performed to amplify different fragments of the gyrA gene, specifying, for each PCR reaction, the pair of primers used and illustrating also the positioning of the degenerate probes used for the pyrosequencing reaction;
  • FIG. 2 is a schematic illustration of an embodiment of certain PC reactions performed to amplify different fragments of the gyrB gene, specifying, for each PCR reaction, the pair of primers used and also illustrating the positioning of the degenerate probes used. for the pyrosequencing reaction;
  • PCR polymerase chain reaction
  • FIG. 3 is a schematic illustration of an embodiment of certain PCR reactions that can be performed to amplify different fragments of the parC gene, specifying, for each PCR reaction, the pair of primers used and also illustrating the positioning of the probes. degenerates used for the pyrosequencing reaction;
  • FIG. 4 is a schematic illustration of an embodiment of certain PCR reactions that can be performed to amplify different fragments of the parE gene, specifying, for each PCR reaction, the pair of primers used and also illustrating the positioning of the probes. degenerates used for the pyrosequencing reaction.
  • primer or “primer” are understood to mean a short single-stranded oligonucleotide sequence comprising between 10 and 40 nucleotides, usually obtained by the implementation of a chemical synthesis method, but not obligatorily.
  • the primers are complementary to a nucleic acid sequence to be amplified and are therefore able to hybridize to this sequence to serve as a starting point for the synthesis of the complementary strand of this sequence.
  • a "forward" primer also called a left primer or a sense primer
  • a “reverse” primer also called a right primer or an antisense primer
  • primers of a gene means a pair comprising a forward primer and a reverse primer, each being capable of hybridizing to a sequence of said gene, the forward primer being complementary to one of the strands. of the DNA while the reverse primer is complementary to the other strand, so as to allow the initiation of the amplification reaction of this gene or a portion of this gene.
  • degenerate primer or “degenerate primer” is intended to mean a mixture of primers (or primers) of similar sequence but exhibiting nucleotide variations at one or more positions.
  • the degenerate nucleotides may be located at any position of the nucleotide sequence of the primer.
  • probe or "oligonucleotide probe” is intended to mean a short oligonucleotide sequence, comprising between 5 and 30 nucleotides, and capable of hybridizing to an amplification product for initiating the pyrosequencing reaction.
  • degenerate probe or “degenerate oligonucleotide probe” is used in the remainder of the description to mean a mixture of probes of similar sequence but exhibiting nucleotide variations at one or more positions.
  • the degenerate nucleotides can be positioned at any position of the nucleotide sequence of the probe.
  • primers and probes used in this method were developed based on the nucleotide sequences available in the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) as well as in the literature. . They are listed in the sequence listing below.
  • Quinolones means a family of broad spectrum antibiotics effective in the treatment of many infections, including those caused by Gram bacteria. negative.
  • the term “quinolones” includes first, second, third and fourth generation quinolones, as well as fluoroquinolones.
  • the present invention relates to a method for enabling rapid, reliable and exhaustive characterization of mutations of the gyrA, gyrB, parC and parE genes.
  • the gyrA and gyrB genes each encode two subunits of the bacterial DNA gyrase, respectively called subunit A and subunit B.
  • This gyrase belongs to the class II topoisomerases and is involved in the DNA replication and transcription mechanisms. bacterial.
  • the parC and parE genes encode the subunits of topoisomerase IV, which also belong to class II topoisomerases.
  • Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae
  • Enterobacteriaceae are one of the most important families of bacteria, and contain more than 40 very ubiquitous genera.
  • the microorganisms belonging to the genera Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella and Serratia are examples of enterobacteria of clinical interest on which the method according to the invention can be used. to determine the presence of mutations and to characterize them. Indeed, these microorganisms are frequently encountered in human or veterinary infectious pathology, and in particular in nosocomial infections.
  • the method according to the invention is also of interest in epidemiology or research. Indeed, this method allows a complete characterization of the mutations of the genes encoding the enterobacterial topoisomerases from large collections of strains, and this very quickly.
  • the invention thus also presents a particular interest in the context of the study of the evolution of bacterial resistance to antibiotics.
  • one or more portions of each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes are amplified, independently of one another, at least one amplification product is thus obtained for each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes; a pyrosequencing reaction is then carried out for each of the PC products obtained during the amplification step; to initiate the pyrosequencing reaction, at least one degenerate probe specific to each of the amplification products is used.
  • the extraction step of the bacterial DNA, contained in a sample or in a colony can be carried out by any means known to those skilled in the art and suitable for this purpose.
  • the extraction of the bacterial DNA comprises a step during which the bacterial cells are lysed, followed by an actual extraction step, for destroying the membrane and denaturing the proteins to isolate and recover the lysate.
  • DNA The proteins are then generally separated from the DNA by phenol-chloroform extraction, for example.
  • a precipitate containing the proteins is then obtained while the DNA remains in solution and can be recovered by decantation or centrifugation, before undergoing a precipitation step by addition of ethanol or isopropanol. After a new centrifugation step, which makes it possible to recover the DNA, it is usually dissolved in an appropriate buffer for the rest of the process.
  • samples that can be tested by the method according to the invention are, in particular but without limitation, biological samples from an infected individual or organism, which are normally sterile and located anatomically at the infectious site.
  • the extracted bacterial DNA is subsequently placed in the presence of at least one pair of primers specific to each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes whose mutations are capable of give the bacterium resistance to antibiotics belonging to the family of quinolones.
  • the bacterial DNA can be brought into contact with one or more specific primer pairs for each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes.
  • gyrA gene By taking the gyrA gene as an example, it is thus possible to use a first pair of primers for amplifying a first portion of this gene, a second pair of primers for amplifying a second portion of gyrA, etc. It is the same for the genes gyrB, parC and parE.
  • each of the primer pairs is mixed with bacterial DNA extracted during the first step of the process.
  • Each of the mixtures is made separately from the other mixtures; in other words, for each pair of primers specific to one of the genes, a mixture comprising in particular these primers and the bacterial DNA is carried out.
  • the amplification of at least a portion of each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes is carried out by carrying out a PCR reaction.
  • a PCR reaction it is possible to independently amplify several portions of a given gene using two or more pairs of different and specific primers of this gene, as illustrated in the accompanying figures. It is also conceivable to independently amplify the entirety of a gene and possibly one or more portions of this same gene. Such an embodiment makes it possible in particular to obtain the complete sequence of the gene and to compare it with the results obtained by the proposed method.
  • At least one amplification product is obtained for each of the gyrA, gyrB, parC and parE genes to be tested.
  • This amplification product generally corresponds to only a portion of this gene, depending on the pair of primers used.
  • PCRs will make it possible to characterize subsequently, by the pyrosequencing reaction, one or more particular codons of the gyrA gene capable of carrying mutations conferring on the bacterium resistance to quinolones.
  • At least one of the primers, of the pair of primers, used to initiate the PCR reaction is a degenerate primer, having at least one degenerate nucleotide, and preferably several nucleotides degenerate, that is to say variables.
  • Such a feature allows PCR amplification of genes of interest gyrA, gyrB, parC and parE, or portions thereof, in different bacterial genera, between which there may be differences in these genes.
  • the method according to the invention proposes to characterize the mutations of these genes in enterobacteria of clinical interest likely to be responsible for infections.
  • enterobacteria of clinical interest which are targeted by the method according to the invention belong to the genera Escherichia, Shlgella, Cltrobacter, Klebsiella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella and Serratia.
  • enterobacteria of clinical interest which are targeted by the method according to the invention belong to the genera Escherichia, Shlgella, Cltrobacter, Klebsiella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella and Serratia.
  • the present method makes it possible to characterize the mutations of the genes encoding the topoisomerases in at least one species selected from the group comprising Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Shigella spp., Citrobacter spp. Salmonella spp. , Enterobacter spp. , Proteus spp. , Providencia spp. , Morganella spp. , Serratia spp.
  • one of the primers, each of the pairs of primers used to initiate the PCR reaction is biotinylated.
  • the forward primer or the reverse primer can be biotinylated, depending on the positioning of the pyrosequencing probe on the ad hoc amplification product.
  • biotinylation of a nucleotide sequence consists in binding to this sequence a biotin molecule, the latter having an extremely important affinity for streptavidin or avidin.
  • biotinylation of one of the primers used in the PCR reaction makes it possible to bind one of the strands of the amplification product, for example to beads on which streptavidin is bound in particular, said strand thus serving as a matrix. for the pyrosequencing reaction.
  • the pyrosequencing reaction which is the last step of the method according to the invention, it is performed on each of the amplification products obtained during the PCR amplification step. More precisely, to initiate this pyrosequencing reaction, at least one degenerate probe specific to each of said amplification products is used as a function of the codon to be characterized. It is thus possible to use several specific degenerate probes for an amplification product, as illustrated in particular in Figure 1 attached. It is also possible to use at least one degenerate probe and a probe of constant sequence for pyrosquencing an amplification product.
  • specific degenerate probe of an amplification product means a probe capable of hybridizing at one of the strands of said amplification product to initiate the pyrosequencing reaction.
  • the degenerate probe used to initiate the pyrosequencing reaction, has at least one degenerate nucleotide, and preferably several degenerate nucleotides, which can be located at any position of the nucleotide sequence of the degenerate probe. .
  • Pyrosequencing allows rapid sequencing of a sequence, with direct reading of the results.
  • the principle of pyrosequencing is based on an addition of nucleotides A, T, G, and C one after the other; when the added nucleotide is complementary to the nucleotide of the DNA molecule to be sequenced, it is incorporated into the strand that is being synthesized, and a release of a pyrophosphate molecule that will be transformed by an ATP will occur phosphorylase, ATP (adenosine triphosphate).
  • luciferase catalyzes the coupling reaction of this ATP to a luciferin molecule, resulting in the production of oxyluciferin and a light signal due to the emission of photons.
  • This signal is then detected by a sensor which will convert it into a peak represented at a pyrogram, the height of said peak being a function of the intensity of the signal picked up. The sequence is thus deduced from the peaks obtained during the incorporation of the nucleotides and the height of these peaks.
  • the PSQ96MA pyrosequencer (Qiagen) was used, and the manufacturer's recommendations for the implementation of pyrosequencing were followed.
  • the use of degenerate probes to initiate the pyrosequencing reaction is particularly advantageous.
  • each of the probes is designed to allow the sequencing of one or more codons capable of being mutated and thus to confer resistance to quinolones. This is why, in some cases, several degenerate probes are used to pyrosequencer an amplification product, said probes positioning themselves, by complementarity, at different locations on said amplification product.
  • the set of codons of the QRDR region can be characterized. It is possible to characterize the only codons, described as predominantly incriminated in quinolone resistance (designated by the term "hot spots") or the entire QRDR region by using one or more probes.
  • the use of degenerate probes facilitates the hybridization of the probe to gyrA, gyrB, parC and parE amplification products belonging to different microorganisms, in particular to different species of enterobacteria of clinical interest.
  • the genes encoding bacterial topoisomerases may exhibit variations between the different species of enterobacteria, but the method according to the invention advantageously allows the pyrosequencing of these genes for several species of enterobacteria, without having recourse to as many probes as species or genera of enterobacteria for which the characterization of the QRDR mutations is performed.
  • the method according to the invention will make it possible to amplify the genes of interest in the all these bacteria and sequencing all these genes, by pyrosequencing, to determine the presence of resistance to quinolones and to characterize the mutation or mutations responsible for this resistance.
  • at least six PCR reactions, labeled PCR1gyrA with PCR6gyrA, are carried out, independent of each other, from the following six pairs of primers:
  • PCRlgyrA and PCR2gyrA with the primers having SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2;
  • PCR3gyrA and PCR4gyrA with primers having SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
  • PCR5gyrA with the primers having SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14;
  • PCR6gyrA with the primers having SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and / or with the primers having the sequences SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77.
  • the first corresponds to the forward primer (or sense) and the second corresponds to the reverse primer (antisense).
  • the primers having the SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, as well as the primers having the sequences SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77 preferentially allow the amplification of at least a portion of the gyrA gene in enterobacteria belonging to the genera Prote s, Providencia, Morganella and Serratia, as illustrated in more detail in Figure 1.
  • enterobacteria carry gyrA genes whose nucleotide sequences are likely to be different from those of the gyrA genes of the other species of enterobacteria listed above.
  • the amplification product of PCRlgyrA is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4;
  • the amplification product of PCR2gyrA is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6;
  • the amplification product of PCR3gyrA is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 9, SEQ
  • the amplification product of PCR4gyrA is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 12; the amplification product of PCR5gyrA is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 15; the amplification product of the PCR6gyrA obtained with the primers of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 18 and / or the amplification product of the PCR6gyrA obtained with primers with SEQ sequences
  • SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 78.
  • PCRlgyrB labeled PCRlgyrB, PCR2gyrB and PCR3gyrB, which are independent of each other, are carried out from the following pairs of primers. :
  • PCRlgyrB with primers having SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and / or primers having SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 81;
  • PCR2gyrB with primers having SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 and / or primers having SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 81;
  • PCR3gyrB with the primers having SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 81.
  • the primers having SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, as well as primers having SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 81 specifically allow the amplification of at least a portion of gyrB in enterobacteria belonging to the genera Prote s, Providencia, Morganella.
  • the amplification product of PCRlgyrB obtained with the primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 and / or the amplification product of PCRlgyrB obtained with the primers of SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 81 is hybridized with at least one probe selected from the group consisting of degenerate probes of SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84; the amplification product of the PCR2gyrB obtained with the primers of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 30 and / or the amplification product of the PCR2gyrB obtained with
  • NO: 81 is hybridized with at least one probe selected from the group consisting of degenerate probes of SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87; the amplification product of PCR3gyrB is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89.
  • FIG. 2 One of the embodiments of the method according to the invention on the gyrB gene is illustrated in FIG. 2 attached. The position of certain primers at the level of the gene, as well as that of certain probes and each of the sequences, are visible in this figure.
  • Primers that end with the "biot" suffix are those that are advantageously biotinylated to subsequently bind the template DNA strand for pyrosequencing.
  • PCR3parC at least three PCR3 PCR reactions, PCR3parC, independent of each other, are carried out from the following pairs of primers, in order to determine the mutations of this gene:
  • PCR3parC with the primers having SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 and / or primers showing the
  • the primers having SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, and the primers having SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 95, make it interesting to specifically amplify at minus a portion of parC in enterobacteria belonging to the genera Prote s, Providencia, Morganella.
  • the amplification product of PCRlparC is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40;
  • the amplification product of PCR2parC is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43;
  • the product of amplification of the PCR3parC obtained with the primers having the SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 46 and / or the product of amplification of the PCR3parC obtained with the primers having SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 95 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 96.
  • Figure 3 One of the embodiments of the present method, implemented on the parC gene, is illustrated in Figure 3 attached. The position of certain primers at this gene, as well as that of certain probes and sequences, are visible in this figure. As for the other figures, the primers that end with the suffix "biot" are those which are advantageously biotinylated to bind the DNA strand as a template for pyrosequencing.
  • PCRlparE and PCR2par with primers having SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48;
  • PCR3 with the primers having SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65 and / or primers having SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 106;
  • PCR4 with the primers having SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 and / or primers having SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 106;
  • the primers having SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72, as well as the primers having SEQ ID NO: 110 and SEQ ID NO: 111 specifically allow the amplification of at least a portion of parE in enterobacteria belonging to the genera Prote s, Providencia, Morganella.
  • the amplification product of PCR1parE is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 101;
  • the amplification product of PCR2parE is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 and SEQ ID
  • the PCR3 amplification product obtained with the primers of SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65 is hybridized with at least one probe selected from the group comprising the degenerate probes of SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70 and / or the amplification product of PCR3par obtained with the primers of SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 106 is hybridized with at least one probe selected from the group consisting of degenerate probes of SEQ ID NO: 107 and SEQ ID NO: 108;
  • the product of amplification of the PCR4parE obtained with the primers of SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 is hybridized with at least one degenerate probe capable of allowing the initiation of pyrosequencing of said amplification product and / or the product amplification of the PCR4parE obtained with the primers of SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 106 is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 109; the amplification product of PCR5parE is hybridized with at least one degenerate probe of SEQ ID NO: 112.
  • FIG. 4 A particular embodiment of the method according to the invention, implemented on the PARE gene, is illustrated in FIG. 4 attached. The position of certain primers at this parE gene, for the PCR reactions 1, 2 and 3 as well as the position of certain probes and each of the sequences, are visible in this figure. The PCR 4 and PCR 5 reactions are not shown in this figure.
  • the primers that end with the "biot" suffix are those that are advantageously biotinylated to bind the DNA strand of the amplified template gene for pyrosequencing.
  • a PCR reaction can be carried out with either pair of primers, or else with these two primer pairs independently. This is for example the case of PCR6gyrA, PCRlgyrB, etc.
  • the amplification products obtained are generally hybridized with different probes to initiate pyrosequencing, with a view to obtaining the most exhaustive characterization possible of the mutations of the Genoa.
  • each of these amplification products is then hybridized with at least one degenerate probe, or even a plurality of probes, at least one of which is degenerate, so as to initiate the pyrosequencing of each amplification product.
  • Each probe is elaborated in such a way that it will allow, in association with the specific pair of primers, the characterization of a particular codon of one of the genes of interest, said codon being capable of carrying a mutation that it is appropriate to characterize by the implementation of the method according to the invention.
  • degenerate probes and possibly degenerate primers, facilitates the simultaneous characterization of the mutations of these genes in several kinds of enterobacteria of clinical interest, that is to say likely to be found in infected organisms. .
  • the present invention proposes a rapid method, the results being obtained usually less than 5 hours after the step of extraction of the bacterial DNA, which makes it possible to ensure the possible presence of a quinolone-resistant seed and of quickly adapt the treatment to avoid administering ineffective antibiotics.
  • Example 1 Amplification of the gyrA gene - PCR and pyrosequencing conditions from at least one degenerate probe
  • FIG. 1 which illustrates the amplification of the gyrA gene by the method according to the invention, represents this gene as well as the different pairs of primers that can be used for the amplification of several portions of this gene and their positioning therein, as well as the positioning of different degenerate probes that are used to initiate the pyrosequencing reaction.
  • the gyrA gene At the top of FIG. 1 is represented the gyrA gene with the set of identified mutation points corresponding to the codons that may contain mutations.
  • PCR reactions numbered from PCR1 to PCR5, allow the amplification of different portions of the gyrA gene, for the characterization of precise mutation points:
  • PCRl (PCRlgyrA) with the primers of SEQ ID NO: 1 (also denoted gyrA-110-F) and SEQ ID NO: 2 (denoted gyrA-290-R-biot), the latter being advantageously biotinylated, more preferably allows the characterization of codons 51 and 81-87 of the gyrA gene using the degenerate probes of SEQ ID NO: 3 (denoted 51-So) and SEQ ID NO: 4 (denoted 81-87So4) to initiate the pyrosequencing reaction.
  • the probe of SEQ ID NO: 4 facilitates the characterization of the mutations present at codons 81 to 87 in enterobacteria belonging to the genus Klebsiella, in particular K. pneumoniae and K. oxytoca;
  • PCR2 (PCR2gyrA) with the primers of SEQ ID NO: 1 (denoted gyrA-110-F biot), the latter being advantageously biotinylated
  • SEQ ID NO: 2 (denoted gyrA-290-R) more preferably allows the characterization of the codons 67 to 73 and 81 to 87 of the gyrA gene using the degenerate probes of SEQ ID NO: 5 (denoted 67-73-So) and SEQ ID NO: 6 (denoted 81-87-So3) to initiate the pyrosequencing reaction;
  • PC 3 (PCR3gyrA) with the primers of SEQ ID NO: 7 (denoted gyrA-290-F-biot), the latter being advantageously biotinylated
  • SEQ ID NO: 8 (denoted gyrA-536-R) more preferably allows the characterization of codons 98 to 119 and 131 to 139 of the gyrA gene using the degenerate probes of SEQ ID NO: 9 (denoted 98-So2) and SEQ ID NO: 10 (denoted 119-So) and SEQ ID NO: 11 (noted 131-139-So2) to initiate the pyrosequencing reaction;
  • PCR4 (PCR4gyrA) with the primers of SEQ ID NO: 7 (denoted gyrA-290-F) and SEQ ID NO: 8 (denoted gyrA-536-R-biot), the latter being advantageously biotinylated, more preferably allows the characterization codon 106 of the gyrA gene using the degenerate probe of SEQ ID NO: 12 (denoted 106-So) to initiate the pyrosequencing reaction; the PCR5 (PCR5gyrA) with the primers of SEQ ID NO: 13 (denoted gyrA-536-F-biot), the latter being advantageously biotinylated, and SEQ ID NO: 14 (denoted gyrA-661-R) more preferably allows the characterization codon 196 of the gyrA gene using the degenerate probe of SEQ ID NO: 15 (denoted 196-S02) to initiate the pyrosequencing reaction.
  • FIG. 1 At the bottom of FIG. 1 is shown the gyrA gene with all the points of mutations identified for the microorganisms belonging to the following species of enterobacteria: Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp. and Serratia spp. (PPMS).
  • the PCR numbered 6 advantageously allows the amplification of the portion ensuring the characterization of codon mutations 81 to 87 of the gyrA gene in these enterobacteria.
  • PCR6 is initiated from the primers of SEQ ID NO: 16 (denoted gyrA-175-F) and SEQ ID NO: 17 (denoted gyrA-332-R-biot), the latter being advantageously biotinylated, and the pyrosequencing reaction is initiated using the degenerate probe of SEQ ID NO: 18 (denoted 81-87-PPS-So).
  • certain primers used in the PCR reaction are biotinylated (biot.).
  • biotinylation of one of the primers makes it possible to easily recover one strand of the amplification product, thanks to the affinity of biotin with avidin or streptavidin.
  • the amplified DNA strand thus recovered serves as a template for the subsequent pyrosequencing reaction.
  • sequences of the forward and reverse primers used in the PCR reaction 1 have identical nucleotide sequences to those of the forward and reverse primers used in the PCR reaction 2.
  • the reverse primer of SEQ ID NO: 2 is biotinylated whereas for PCR 2, it is the forward primer of SEQ ID NO: 1 which is biotinylated. It is the same for other primers used in the amplification of the gyrA gene. This advantageously enables one or the other strand of the amplification product resulting from the PCR reaction to be recovered for the subsequent pyrosequencing reaction.
  • composition of the mixtures as well as the temperature conditions for the different PCR reactions are detailed in the tables below.
  • PCR 1 for gyrA amplification The composition of the PCR1 mixture for the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR reaction are the primers of SEQ ID NO: 1 (denoted gyrA-110F in the table) and SEQ ID NO: 2 (denoted gyrA-290Rbiot).
  • the composition of the PCR2 mixture for the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR reaction are the primers of SEQ ID NO: 1 (denoted gyrA-11OFbiot) and SEQ ID NO: 2 (denoted gyrA-290R).
  • the composition of the PCR3 mixture of the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR are the primers of SEQ ID NO: 7 (denoted gyrA-290Fbiot) and SEQ ID NO: 8 (denoted gyrA-536R).
  • the composition of the PCR4 mixture of the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR are the primers of SEQ ID NO: 7 (denoted gyrA-290F) and SEQ ID NO: 8 (denoted gyrA-536Rbiot).
  • the composition of the PCR5 mixture of the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR are the primers of SEQ ID NO: 13 (denoted gyrA-536Fbiot) and SEQ ID NO: 14 (denoted gyrA-536Fbiot) and SEQ ID NO: 15 (denoted gyrA-536Fbiot) and SEQ ID NO: 16 (denoted gyrA-536Fbiot) and SEQ ID NO: 13 (denoted gyrA-536Fbiot) and SEQ ID
  • the composition of the PCR6 mixture of the gyrA gene is detailed below.
  • the primers used for this PCR are the primers of SEQ ID NO: 16 (denoted GyrA-PPS 175F) and SEQ ID NO: 17 (denoted GyrA-PPS 332 Rbiot).
  • SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80 for the gyr B gene including enterobacteria belonging to the genera Proteus, Providencia and Morganella; SEQ ID NO: 90 and SEQ ID NO: 91 for the parC gene;

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Abstract

La présente invention est relative à une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle : - on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie; - on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE; - on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaine (PCR), pour obtenir au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE; - on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification des gènes gyrA, gyrB, parC et parE obtenus lors de l'étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier le pyroséquençage.

Description

Méthode de caractérisation des mutations chromosomiques des gènes codant les topoisomérases bactériennes
La présente invention concerne une méthode permettant la caractérisation des mutations chromosomiques qui sont à l'origine de la résistance de certains micro-organismes, notamment des entérobactéries , aux antibiotiques appartenant à la famille des quinolones .
La présente invention trouvera son application principalement dans le domaine de la médecine humaine, notamment en milieu hospitalier, ainsi que dans le domaine de la médecine vétérinaire .
En effet, la méthode de caractérisation proposée ici permet notamment de diagnostiquer rapidement une résistance d'un micro- organisme aux quinolones, ce qui permet d'une manière toute particulièrement avantageuse de pouvoir adapter le traitement antibiotique en cas d'infection.
Les antibiotiques sont des molécules de synthèse ou naturelles, par exemple produites par des champignons, qui sont utilisées depuis la fin de la Seconde Guerre Mondiale, pour détruire les bactéries (effet bactéricide) ou empêcher leur croissance (effet bactériostatique) .
Cependant, une utilisation généralisée de grandes quantités de ces molécules d'antibiotiques, que ce soit dans des traitements préventifs ou curatifs, en tant que compléments alimentaires, dans l'alimentation animale, dans les élevages, etc., a abouti à un développement de bactéries antibiorésistantes engendrant ainsi, d'une part, une diminution de l'efficacité des antibiotiques et, d'autre part, l'augmentation du nombre d'infections nosocomiales en milieu hospitalier .
L'apparition et le développement de bactéries résistantes à un antibiotique a pour conséquence d'empêcher l'utilisation de celui-ci pour le traitement de l'infection causée par ces bactéries . Il est alors nécessaire d' adapter le traitement thérapeutique pour soigner au mieux le malade. Pour éviter de traiter un patient infecté par des germes résistants avec un antibiotique inefficace, il est primordial de pouvoir détecter rapidement, et de façon certaine, la résistance de ces germes aux antibiotiques utilisés.
Les molécules appelées « quinolones », ou
« fluoroquinolones » lorsqu'un atome de fluor est ajouté à la molécule, sont des antibiotiques à large spectre et constituent l'une des trois familles d'antibiotiques les plus prescrits dans le monde pour traiter des infections dues à certaines entérobactéries, et la résistance de ces dernières aux quinolones ne cesse d'augmenter.
Plus précisément, les antibiotiques de la famille des quinolones ciblent certaines enzymes jouant un rôle dans les mécanismes de réplication de l'ADN (acide désoxyribonucléique) bactérien, telles que les topoisomérases de classe II et IV, et notamment l'ADN gyrase et la topoisomérase de type IV.
Les enzymes topoisomérases permettent plus particulièrement un contrôle de la structure de l'ADN en générant des coupures transitoires dans la double hélice d'ADN et catalysent le passage de segments d'ADN dans ces coupures transitoires avant de les refermer .
L'ADN gyrase appartient à la famille des topoisomérases de classe II, et est formée de deux sous unités A et deux sous unités B, respectivement codées par les gènes gyrA et gyrB. L'ADN gyrase permet le surenroulement de l'ADN chromosomique bactérien en introduisant des supertours négatifs dans la double hélice d'ADN. Les supertours vont permettre de faciliter le déroulement de l'ADN au moment des processus de réplication et de transcription de celui-ci.
En conséquence, les topoisomérases, et en particulier l'ADN gyrase, sont des enzymes indispensables à la vie cellulaire bactérienne, notamment car elles interviennent dans des processus essentiels tels que la réplication et la transcription de l'ADN. De ce fait, les topoisomérases constituent d'excellentes cibles d'agents médicamenteux, en particulier d'antibiotiques tels que les quinolones, qui vont entraîner un arrêt de la multiplication bactérienne.
Cependant, l'apparition de souches d' entérobactéries résistantes aux quinolones entraine une diminution de l'efficacité de cette famille d'antibiotiques ; notamment, l'apparition de mutations chromosomiques ponctuelles, au niveau des gènes codant les topoisomérases, est l'un des phénomènes à l'origine de la résistance aux quinolones chez les entérobactéries .
II est également possible que la résistance d'une bactérie à un antibiotique soit caractérisée par un support plasmidique, à l'origine d'une transmission horizontale de la résistance et d'une propagation de cette résistance à d'autres bactéries. Cependant, les résistances chromosomiques sont les plus fréquentes et confèrent un niveau de résistance plus important, restreignant alors les possibilités thérapeutiques.
Plus précisément, la résistance chromosomique aux quinolones chez les entérobactéries résulte de mutations au niveau des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les enzymes topoisomérases. Pour chacun d'entre eux, la région où se localisent les mutations à l'origine de la résistance aux quinolones est appelée QRD , pour Quinolone Résistance Determining Région.
On connaît pour l'instant, du document de brevet WO 9 950 458, une méthode de détection des entérobactéries dans un échantillon, par l'utilisation de sondes spécifiques obtenues à partir d'une séquence codante du gène gyrA. La méthode décrite ici propose également de déterminer le statut des entérobactéries, sensible ou résistant, vis-à-vis des quinolones .
Plus précisément, le document propose l'utilisation de sondes spécifiques à différentes espèces d' entérobactéries, et plus particulièrement à la région codante du gène gyrA pour déterminer d'une part la présence de l'une ou l'autre de ces bactéries dans un échantillon, et, d'autre part, la résistance ou la sensibilité de ces bactéries aux quinolones. L'ADN présent dans l'échantillon est dans un premier temps amplifié en utilisant un couple d'amorces spécifiques permettant l'amplification du gène gyrA. On utilise ensuite les sondes spécifiques des différentes espèces de bactéries (E. coll, C. freundii, etc.) pour déterminer leur présence et d'autres sondes spécifiques pour déterminer leur statut vis-à-vis des quinolones, par détection de l'hybridation de ces sondes avec l'ADN amplifié. La détection de l'hybridation est effectuée à l'aide d'un microscope confocal laser ou par application d'un champ électrique contrôlé. Il est également possible d'ajouter un réactif pour faciliter la détection de l'hybridation. L'absence d'hybridation lors de l'ajout de la sonde spécifique indique la présence d'une résistance aux quinolones dans l'échantillon testé.
Cependant, une telle méthode n'est pas totalement satisfaisante. D'une part, elle est fastidieuse à mettre en œuvre car elle nécessite une sonde spécifique pour la détection de chaque espèce d' entérobactérie visée, et une sonde spécifique pour déterminer la résistance ou la sensibilité de cette espèce vis-à-vis des quinolones .
D'autre part, la méthode proposée dans ce document se focalise uniquement sur le gène gyrA tandis que d'autres gènes, codant les topoisomérases, sont susceptibles de subir des mutations engendrant une résistance des micro-organismes aux quinolones .
Ainsi, la méthode proposée n'est pas exhaustive et elle ne permet pas de caractériser les mutations des différents gènes codant pour les topoisomérases .
Le document de brevet EP 0 688 873 propose l'utilisation de trois primers, chacun spécifique d'une mutation particulière du gène gyrA, ces primers étant utilisés en combinaison avec un quatrième primer spécifique au brin complémentaire pour l'amplification. On détecte ensuite l'amplification par électrophorèse ou par révélation de la fluorescence.
Cette méthode permet donc uniquement de déterminer la présence ou l'absence de trois mutations particulières du gène gyrA. En conséquence, le document ne permet pas non plus de déterminer et de caractériser de manière exhaustive l'ensemble des mutations des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases .
II est encore proposé, dans le document de brevet GB
2 364 054 une méthode pour l'amplification de la région appelée QRDR en utilisant des oligonucléotides à moitié dégénérés, c'est-à-dire dont l'une des extrémités 3' est dégénérée, présentant une séquence variable, tandis que la seconde extrémité 5' est constante.
Plus précisément, la méthode proposée ici comporte une première étape consistant à préparer une composition comportant d'une part les oligonucléotides for ard et reverse, également appelés oligonucléotides gauche et droit ou sens et antisens respectivement, à moitié dégénérés et, d'autre part, un échantillon susceptible de contenir une région QRDR. La seconde étape consiste à procéder à une amplification de la région QRDR. Il est également possible de procéder à un séquençage de ce produit d'amplification, après une étape de clonage dans un plasmide, pour le comparer à un second produit d'amplification obtenu selon le même mode opératoire .
Cette technique, bien que plus intéressante que les autres techniques décrites ci-dessus pour déterminer les mutations de la région QRDR, ne permet pas non plus une caractérisation exhaustive, très précise et très fiable de l'ensemble des codons mutés des gènes gyrA, gyrB, parC et parE des entérobactéries . En outre, une telle approche n'est pas utilisable dans le cadre du diagnostic ou d'études épidémiologiques à grande échelle.
Ainsi, il n'existe, à l'heure actuelle, aucune méthode rapide et fiable permettant de caractériser de manière spécifique et exhaustive les mutations, dans les gènes gyrA, gyrB, parC et parE des entérobactéries, qui sont à l'origine des résistances des entérobactéries aux quinolones.
L'invention offre la possibilité de pallier les divers inconvénients de l'état de la technique en proposant une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques des gènes gyrA, gyrB, parC et parE responsables de la résistance des entérobactéries aux quinolones, dans laquelle, après une amplification d' une ou plusieurs portions de ces gènes avec au moins un couple d' amorces forward et reverse pouvant être dégénérées, on réalise une réaction de pyroséquençage en utilisant une pluralité d'amorces de pyroséquençage, dénommées ci après « sondes » ou « sondes dégénérées » pour des raisons de compréhension, lesdites sondes étant spécifiques des codons susceptibles de subir des substitutions et donc d'être mutés.
A cet effet, la présente invention concerne une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle :
on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie ;
on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ;
on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , pour obtenir au moins un produit d' amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ;
on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification des gènes gyrA, gyrB, parC et parE obtenus lors de 1 ' étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier le pyroséquençage .
Selon d' autres caractéristiques particulières de la présente méthode : avantageusement, au moins l'une des amorces de chaque couple d'amorces, utilisée pour la réaction de polymérisation en chaîne, est une amorce dégénérée comportant au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite amorce ;
préférentiellement la (ou les) sonde (s) dégénérée (s) , utilisée (s) pour initier le pyroséquençage, comporte (nt) au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite sonde ; de façon intéressante, l'une des amorces, de chacun des couples d'amorces, est biotinylée ;
de préférence, l'on effectue au moins deux réactions de polymérisation en chaîne (PCR) indépendantes pour amplifier plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE en utilisant deux couples d'amorces différents ;
avantageusement, les gènes gyrA, gyrB, parC et parE sont amplifiés à partir d'au moins un genre d' entérobactérie à Gram négatif choisi parmi le groupe consistant en Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia ;
Selon un mode de réalisation particulier, l'on effectue au moins six PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrA, notées PCRlgyrA à PCR6 gyrA, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'au moins un couple d'amorces tel que défini plus loin dans la description.
De préférence, au moins l'un des couples d'amorces permet l'amplification d'au moins une portion de gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella et Serratia.
Les réactions de pyroséquençage de gyrA sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci-après et reprises dans le listage de séquences .
Selon un exemple de réalisation intéressant, l'on effectue au moins trois PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrB, notées PCRlgyrB à PCR3gyrB, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'au moins un couple d'amorces tel que défini plus loin dans la description.
Préfèrentiellement, au moins l'un de ces couples d'amorces permet l'amplification d'au moins une portion de gyrB chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia et Morganella .
Les réactions de pyroséquençage de gyrB sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci-après et reprises dans le listage de séquences.
De façon avantageuse, l'on effectue au moins trois PCR indépendantes pour amplifier le gène parC, notées PCRlparC à PCR3parC, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d' au moins un couple d'amorces tel que défini plus loin dans la description .
Préfèrentiellement , au moins l'un de ces couples d'amorces permet l'amplification d'au moins une portion de parC chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella .
Les réactions de pyroséquençage de parC sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci après .
En ce qui concerne l'amplification du gène parE, l'on effectue préférentiellement au moins cinq PCR indépendantes, notées PCRlparE à PCR5par£ chacune desdites PCR étant effectuées à partir d'au moins un couple d'amorces, l'ensemble des couples d' amorces seront définis ci-après .
Selon un exemple intéressant, au moins l'un de ces couples est destiné à permettre l'amplification d'au moins une portion de parE chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus,
Providencia et Morganella . Les réactions de pyroséquençage de parE sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci après .
La présente invention est également relative à une amorce oligonucléotidique pour l'amplification de l'un des gènes gyrA, gyrB, parC et parE.
L'invention est encore relative à une sonde oligonucléotidique dégénérée pour le pyroséquençage de l'un des gènes gyrA, gyrB, parC et parE.
La présente invention comporte de nombreux avantages. D'une part, elle permet de déterminer extrêmement rapidement, et de manière exhaustive, les mutations présentes au niveau des gènes d'intérêt et qui conduisent à l'augmentation de la résistance des micro-organismes, notamment des entérobactéries , aux antibiotiques de la famille des quinolones . A titre indicatif, la présente méthode permet de caractériser ces mutations en moins de 5h après extraction de l'ADN bactérien de l'échantillon à tester. De plus, l'utilisation d'amorces, dont certaines peuvent contenir des nucléotides dégénérés, et de sondes dégénérées, respectivement pour la réaction de PC et pour la réaction de pyroséquençage, permet de cibler plusieurs genres bactériens susceptibles d' être retrouvés dans les organismes infectés .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre des modes de réalisation non limitatifs de l'invention, en référence aux figures annexées dans lesquelles :
la figure 1 est une illustration schématique d'un mode de réalisation de certaines réactions de polymérisation en chaîne (PCR) pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène gyrA, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ; la figure 2 est une illustration schématique d'un mode de réalisation de certaines réactions de PC effectuées pour amplifier différents fragments du gène gyrB, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ;
la figure 3 est une illustration schématique d'un mode de réalisation de certaines réactions de PCR pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène parC, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ;
la figure 4 est une illustration schématique d'un mode de réalisation de certaines réactions de PCR pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène parE, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage .
Dans la suite de la description, on entend par les termes « amorce » ou « primer », une courte séquence oligonucléotidique simple brin comportant entre 10 et 40 nucléotides, usuellement obtenue par la mise en œuvre d'une méthode de synthèse chimique, mais pas obligatoirement . Les amorces sont complémentaires à une séquence d'acide nucléique à amplifier et sont donc aptes à s'hybrider à cette séquence pour servir de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette séquence. On utilise une amorce « forward » (également appelée amorce gauche ou amorce sens) et une amorce « reverse » (également appelée amorce droite ou amorce antisens) , chacune étant complémentaire de l'extrémité de l'un des brins pour permettre la synthèse et l'amplification de la séquence nucléotidique entre chacune de ces extrémités et obtenir un produit d'amplification.
On entend par « couple d'amorces spécifique » d'un gène un couple comportant une amorce forward et une amorce reverse, chacune étant apte à s'hybrider à une séquence dudit gène, l'amorce forward étant complémentaire de l'un des brins de l'ADN tandis que l'amorce reverse est complémentaire à l'autre brin, de sorte à permettre l'initiation de la réaction d'amplification de ce gène ou d'une portion de ce gène.
On entend par les termes « amorce dégénérée » ou « primer dégénéré » un mélange d'amorces (ou de primers) de séquence similaire mais présentant des variations de nucléotides au niveau d'une ou de plusieurs positions. Les nucléotides dégénérés peuvent être situés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de l'amorce.
On entend par le terme « sonde » ou « sonde oligonucléotidique », une courte séquence oligonucléotidique, comportant entre 5 et 30 nucléotides, et apte à s'hybrider à un produit d' amplification pour initier la réaction de pyroséquençage .
On entend par le terme « sonde dégénérée » ou « sonde oligonucléotidique dégénérée », dans la suite de la description, un mélange de sondes de séquence similaire mais présentant des variations de nucléotides au niveau d'une ou de plusieurs positions . Les nucléotides dégénérés peuvent être positionnés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de la sonde .
Les amorces et les sondes utilisées dans la présente méthode ont été élaborées en se basant sur les séquences nucléotidiques disponibles dans la base de données Genbank (http : //www . ncbi . nlm. nih . gov/pubmed/) ainsi que dans la littérature . Elles sont listées dans le listage de séquences ci après .
On entend par « quinolones » une famille d'antibiotiques à large spectre efficaces dans le traitement de nombreuses infections, notamment celles qui sont dues à des bactéries Gram négatif. Le terme « quinolones » inclut les quinolones de première, deuxième, troisième et quatrième générations, ainsi que les fluoroquinolones .
La présente invention est relative à une méthode destinée à permettre une caractérisâtion rapide, fiable et exhaustive, des mutations des gènes gyrA, gyrB, parC et parE.
Les gènes gyrA et gyrB codent chacun deux sous unités de l'ADN gyrase bactérienne, respectivement appelées sous unité A et sous unité B. Cette gyrase appartient aux topoisomérases de classe II et est impliquée dans les mécanismes de réplication et de transcription de l'ADN bactérien.
Les gènes parC et parE codent les sous-unités de la topoisomérase IV, celle-ci appartenant également aux topoisomérases de classe II .
Des mutations au niveau de ces gènes entraînent une augmentation de la résistance aux quinolones chez certaines bactéries, en particulier chez les entérobactéries , dont les infections sont traitées par cette famille d'antibiotique.
Les entérobactéries (Enterobacteriaceae) constituent l'une des plus importantes familles de bactéries, et regroupent plus de 40 genres très ubiquitaires . Ainsi, les micro-organismes appartenant aux genres Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia sont des exemples d' entérobactéries d'intérêt clinique sur lesquelles la méthode selon l'invention peut être mise en œuvre pour déterminer la présence de mutations et caractériser ces dernières. En effet, ces micro-organismes sont fréquemment rencontrés en pathologie infectieuse humaine ou vétérinaire, et notamment dans les infections nosocomiales .
A titre d'exemple, en France, approximativement 15% des souches appartenant à l'espèce Escherichia coli, isolées d'hémocultures, sont résistantes aux quinolones (données du European Antimicrobial Résistance Surveillance System : http : //ww . ecdc . europa . eu) . Ce pourcentage monte à 25% aux Etats-Unis. En ce qui concerne l'Asie, la résistance des entérobactéries aux antibiotiques quinolones est quasiment endémique .
En conséquence, il devient primordial de pouvoir détecter le plus rapidement possible, et de manière fiable et exhaustive, les mutations notamment chromosomiques des gènes gyrA, gyrB, parC et parE responsables de l'acquisition de la résistance bactérienne aux quinolones. Cela permet, de manière particulièrement avantageuse, de pouvoir rapidement adapter le traitement thérapeutique de sorte à soigner le patient de manière adéquate, en évitant de lui administrer un traitement inefficace et souvent lourd.
La méthode selon l'invention présente également un intérêt en épidémiologie ou en recherche. En effet, cette méthode permet une caractérisation exhaustive des mutations des gènes codant pour les topoisomérases des entérobactéries provenant de grandes collections de souches, et ce de façon très rapide. L'invention présente ainsi également un intérêt particulier dans le cadre de l'étude de l'évolution de la résistance bactérienne aux antibiotiques .
Pour en revenir à présent plus particulièrement aux différentes étapes mises en œuvre dans la méthode selon l'invention, celles-ci sont les suivantes :
dans un premier temps, il convient d'extraire l'ADN bactérien notamment contenu dans un échantillon ou provenant d'une colonie individuelle, par exemple cultivée sur gélose ;
l'on met ensuite, en présence de l'ADN bactérien extrait, au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ;
- on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, indépendamment les unes des autres on obtient alors au moins un produit d' amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ; on effectue ensuite une réaction de pyroséquençage pour chacun des produits de PC obtenus lors de l'étape d'amplification ; pour initier la réaction de pyroséquençage on utilise au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun des produits d' amplification .
L'étape d'extraction de l'ADN bactérien, contenu dans un échantillon ou dans une colonie, peut être effectuée par tout moyen connu par l'homme du métier et apte à cet effet.
Généralement, l'extraction de l'ADN bactérien comprend une étape au cours de laquelle les cellules bactériennes sont lysées, suivie d'une étape d'extraction à proprement dite, destinée à détruire la membrane et à dénaturer les protéines pour isoler et récupérer l'ADN. Les protéines sont ensuite généralement séparées de l'ADN par une extraction au phénol- chloroforme, par exemple. On obtient alors un précipité contenant les protéines tandis que l'ADN reste en solution et peut être récupéré par décantation ou centrifugation, avant de subir une étape de précipitation par addition d' éthanol ou encore d' isopropanol . Après une nouvelle étape de centrifugation, qui permet de récupérer l'ADN, celui-ci est habituellement dissout dans un tampon adéquat pour la suite du procédé .
Cependant, un tel mode d'extraction ne doit pas être compris comme étant limitatif, et l'ADN bactérien peut également être extrait à l'aide de kits commerciaux adaptés ou de tout autre moyen prévu à cet effet .
Les échantillons susceptibles d'être testés par la méthode selon l'invention sont, en particulier mais non limitativement , des échantillons biologiques provenant d'un individu ou d'un organisme infecté, normalement stériles et localisés anatomiquement au foyer infectieux.
L'ADN bactérien extrait est par la suite mis en présence d' au moins un couple d' amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE dont les mutations sont susceptibles de conférer à la bactérie une résistance aux antibiotiques appartenant à la famille des quinolones .
Cela signifie que l'ADN bactérien peut être mis en présence d'un ou de plusieurs couples d'amorces spécifiques pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE.
En prenant pour exemple le gène gyrA, il est ainsi possible d'utiliser un premier couple d'amorces permettant d'amplifier une première portion de ce gène, un deuxième couple d'amorces pour l'amplification d'une seconde portion de gyrA, etc. Il en est de même pour les gènes gyrB, parC et parE.
Plus particulièrement, chacun des couple d'amorces est mélangé à de l'ADN bactérien extrait lors de la première étape du procédé . Chacun des mélanges est réalisé à part des autres mélanges ; en d'autres termes, pour chaque couple d'amorces spécifique à l'un des gènes, un mélange comportant notamment ces amorces et l'ADN bactérien est effectué.
Dans la suite de la méthode selon l'invention, l'on réalise l'amplification d'au moins une portion de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE en mettant en œuvre une réaction de PCR. Comme évoqué plus haut, il est possible d'amplifier indépendamment plusieurs portions d'un gène donné en utilisant deux, ou plus de deux, couples d' amorces différents et spécifiques de ce gène, comme illustré sur les figures annexées. Il est également envisageable d'amplifier indépendamment l'intégralité d'un gène et éventuellement une ou plusieurs portions de ce même gène. Un tel mode de réalisation permet notamment d' obtenir la séquence complète du gène et de comparer celle-ci aux résultats obtenus par la méthode proposée.
Suite à la mise en œuvre de la réaction de PCR sur les mélanges comportant l'ADN bactérien et les couples d'amorces, on obtient au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE à tester. Ce produit d'amplification correspond généralement à une portion seulement de ce gène, en fonction du couple d'amorces utilisé.
A titre d'exemple, si l'on se réfère à la figure 1, illustrant le gène gyrA et un mode de réalisation de la méthode selon l'invention pouvant être appliqué à ce gène, on remarque qu'il est possible de réaliser par exemple 6 PCR en utilisant différents couples d'amorces.
Chacune de ces PCR va permettre de caractériser ultérieurement, par la réaction de pyroséquençage , un ou plusieurs codons particuliers du gène gyrA susceptible de porter des mutations conférant, à la bactérie, la résistance aux quinolones .
Il est également illustré, sur cette figure 1, la possibilité d' amplifier au moins une portion du gène gyrA des bactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella et Serratia, noté gyrA PPMS sur cette figure, en utilisant un couple d'amorces ad hoc. Ce point particulier sera évoqué plus en détail dans la suite de la description.
Selon un exemple de réalisation intéressant de la méthode selon l'invention, au moins l'une des amorces, du couple d'amorces, utilisée pour initier la réaction de PCR est une amorce dégénérée, présentant au moins un nucléotide dégénéré, et de préférence plusieurs nucléotides dégénérés, c'est-à-dire variables .
Une telle caractéristique permet une amplification PCR des gènes d' intérêt gyrA, gyrB, parC et parE, ou de portions de ceux-ci, chez différents genres bactériens, entre lesquels il peut exister des différences au niveau de ces gènes .
Plus particulièrement, la méthode selon l'invention se propose de caractériser les mutations de ces gènes chez des entérobactéries d'intérêt clinique susceptibles d'être responsables d' infections .
Plus préfèrentiellement, les entérobactéries d'intérêt clinique qui sont visées par la méthode selon l'invention appartiennent aux genres Escherichia, Shlgella, Cltrobacter, Klebsiella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia. Ainsi, avantageusement, l'utilisation de certaines amorces dégénérées permet l'amplification des gènes, ou portion de gènes, chez l'ensemble de ces entérobactéries. Selon un exemple de réalisation particulier, la présente méthode permet de caractériser les mutations des gènes codant les topoisomérases chez au moins une espèce choisie dans le groupe comportant Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Shigella spp., Citrobacter spp . , Salmonella spp . , Enterobacter spp . , Proteus spp . , Providencia spp . , Morganella spp . , Serratia spp .
A titre indicatif, certaines portions de gènes sont conservées entre ces différents genre ou espèces d' entérobactéries expliquant que toutes les amorces ne sont pas dégénérées .
Selon un mode de réalisation particulier, l'une des amorces, de chacun des couples d'amorces utilisés pour initier la réaction de PCR, est biotinylée. L'amorce forward ou l'amorce reverse peut être biotinylée, selon le positionnement de la sonde de pyroséquençage sur le produit d'amplification ad hoc.
La biotinylation d'une séquence nucléotidique consiste à lier, à cette séquence, une molécule de biotine, cette dernière présentant une affinité extrêmement importante pour la streptavidine ou l'avidine. Ainsi, la biotinylation de l'une des amorces utilisée dans la réaction de PCR permet la fixation d'un des brins du produit d'amplification, par exemple à des billes sur lesquelles est notamment liée de la streptavidine, ledit brin servant alors de matrice pour la réaction de pyroséquençage .
Pour en revenir à présent à la réaction de pyroséquençage, qui constitue la dernière étape de la méthode selon l'invention, celle-ci est effectuée sur chacun des produits d'amplification obtenus lors de l'étape d'amplification par PCR. Plus précisément, pour initier cette réaction de pyroséquençage, on utilise au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification en fonction du codon à caractériser. Il est ainsi envisageable d'utiliser plusieurs sondes dégénérées spécifiques pour un produit d'amplification, comme cela est illustré notamment sur la figure 1 ci-jointe. Il est également possible d'utiliser au moins une sonde dégénérée et une sonde de séquence constante pour pyroséquencer un produit d' amplification .
Dans le cas où plusieurs sondes sont utilisées, on effectue une réaction de pyroséquençage à partir de chacune de ces sondes .
On entend par « sonde dégénérée spécifique » d'un produit d'amplification une sonde apte à s'hybrider au niveau de l'un des brins dudit produit d'amplification pour initier la réaction de pyroséquençage .
De façon particulièrement avantageuse, la sonde dégénérée, utilisée pour initier la réaction de pyroséquençage, présente au moins un nucléotide dégénéré, et de préférence plusieurs nucléotides dégénérés, ces derniers pouvant être situés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de la sonde dégénérée.
Le pyroséquençage permet un séquençage rapide d'une séquence, avec une lecture directe des résultats. Plus précisément, le principe du pyroséquençage repose sur un ajout des nucléotides A, T, G, et C les uns après les autres ; lorsque le nucléotide ajouté est complémentaire au nucléotide de la molécule d'ADN à séquencer, il est incorporé dans le brin qui est en cours de synthèse, et il se produit une libération d'une molécule de pyrophosphate qui va être transformée, par une ATP phosphorylase, en ATP (adénosine tri-phosphate) . Une enzyme, la luciférase, catalyse la réaction de couplage de cet ATP à une molécule de luciférine, entraînant la production d' oxyluciférine et d'un signal lumineux, dû à l'émission de photons . Ce signal est alors détecté par un capteur qui va le convertir en un pic représenté au niveau d'un pyrogramme, la hauteur dudit pic étant fonction de l'intensité du signal capté. La séquence est ainsi déduite des pics obtenus lors de l'incorporation des nucléotides et de la hauteur de ces pics .
Dans un exemple de réalisation de la méthode selon l'invention, le pyroséquenceur PSQ96MA (Qiagen) a été utilisé, et les recommandations du fabricant pour la mise en œuvre du pyroséquençage ont été suivies . L'utilisation de sondes dégénérées pour initier la réaction de pyroséquençage est particulièrement avantageuse. D'une part, chacune des sondes est élaborée pour permettre le séquençage d'un ou plusieurs codons susceptibles d'être mutés et donc de conférer la résistance aux quinolones . C'est pourquoi, dans certains cas, l'on utilise plusieurs sondes dégénérées pour pyroséquencer un produit d'amplification, lesdites sondes se positionnant, par complémentarité, à différents endroits sur ledit produit d'amplification. Ainsi, l'ensemble des codons de la région QRDR, potentiellement mutés ou non, peut-être caractérisé. Il est possible de caractériser les seuls codons, décrits comme majoritairement incriminés dans la résistance aux quinolones (désignés par le terme « hot spots ») ou toute la région QRDR par utilisation d'une ou plusieurs sondes.
D'autre part, l'utilisation de sondes dégénérées facilite l'hybridation de la sonde à des produits d'amplification de gènes gyrA, gyrB, parC et parE appartenant à différents microorganismes, en particulier à différentes espèces d' entérobactéries d'intérêt clinique, qui ont déjà été mentionnées ci-dessus dans la description. En effet, les gènes codant les topoisomérases bactériennes peuvent présenter des variations entre les différentes espèces d' entérobactéries, mais la méthode selon l'invention permet avantageusement le pyroséquençage de ces gènes pour plusieurs espèces d' entérobactéries, sans avoir recours à autant de sondes que d'espèces ou genres d' entérobactéries pour lesquels la caractérisation des mutations QRDR est effectuée.
Ainsi, quelle que soit l'espèce d' entérobactérie, telle que définie ci-dessus, contenue dans l'échantillon biologique ou constituant la colonie à tester, la méthode selon l'invention permettra d'amplifier les gènes d'intérêt chez l'ensemble de ces bactéries et de séquencer l'ensemble de ces gènes, par pyroséquençage, afin de déterminer la présence d'une résistance aux quinolones et de caractériser la ou les mutations responsables de cette résistance. Préférentiellement , pour obtenir des résultats optimaux pour la caractérisation des mutations du gène gyrA, on réalise au moins six réactions de PCR, notées PCR1gyrA à PCR6gyrA, indépendantes les unes des autres, à partir des six couples d' amorces suivants :
PCRlgyrA et PCR2gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:l et SEQ ID NO: 2 ;
PCR3gyrA et PCR4gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 ;
- PCR5gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 ;
PCR6gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17 et/ou avec les amorces présentant les séquences SEQ ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77.
A titre de remarque, pour chacun des couples d'amorces mentionnés ci-dessus, et dans le reste de la description, la première correspond à l'amorce forward (ou sens) et la seconde correspond à l'amorce reverse (antisens).
En particulier, les amorces présentant les SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17, ainsi que les amorces présentant les séquences SEQ ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77, permettent préférentiellement l'amplification d'au moins une portion du gène gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia, Morganella et Serratia, comme illustré plus en détail sur la figure 1.
En effet, ces quatre genres d' entérobactéries portent des gènes gyrA dont les séquences nucléotidiques sont susceptibles d' être différentes de celles des gènes gyrA des autres espèces d' entérobactéries listées ci-dessus .
En ce qui concerne les réactions de PCR effectuées indépendamment mais avec des couples d'amorces identiques, notamment les PCRlgyrA et PCR2gyrA, il est envisageable que, pour la PCRlgyrA, l'amorce reverse de SEQ ID NO: 2 soit biotinylée tandis que, pour la PCR2gyrA, c'est l'amorce forward de SEQ ID NO:l qui le soit. Ces réactions de PC , indépendantes et avec des couples d'amorces identiques, permettent d'obtenir avantageusement des produits d' amplifications de séquences identiques qui seront ensuite mis en présence de sondes différentes pour la réaction de pyroséquençage .
Ainsi, de façon préférentielle, suite aux réactions de PCR en présence des amorces telles que définies plus haut, et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification obtenus pour le gène gyrA :
- le produit d' amplification de la PCRlgyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO : 4 ;
le produit d'amplification de la PCR2gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 ;
le produit d' amplification de la PCR3gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10 et SEQ ID NO: 11;
le produit d'amplification de la PCR4gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 12 ; le produit d' amplification de la PCR5gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 15 ; le produit d' amplification de la PCR6gyrA obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 18 et/ou le produit d'amplification de la PCR6gyrA obtenu avec les amorces présentant les séquences SEQ
ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 78.
La caractérisation des mutations sur le gène gyrA, dont le positionnement de certaines amorces pour les réactions de PCR, et le positionnement de certaines sondes pour le pyroséquençage, est illustrée sur la figure 1 qui est décrite plus en détail dans l'exemple 1 ci-dessous.
De façon toute particulièrement avantageuse, pour obtenir des résultats optimaux pour la caractérisation des mutations du gène gyrB, on réalise au moins trois réactions de PCR, notées PCRlgyrB, PCR2gyrB et PCR3gyrB, indépendantes les unes des autres, à partir des couples d'amorces suivants :
PCRlgyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 ;
PCR2gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 ;
PCR3gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81.
Plus avantageusement encore, les amorces présentant les SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29, ainsi que les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81, permettent spécifiquement l'amplification d'au moins une portion de gyrB chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia, Morganella .
Préférentiellement , suite aux réactions de PCR, et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification obtenus pour le gène gyrB :
- le produit d' amplification de la PCRlgyrB obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:27 et/ou le produit d'amplification de la PCRlgyrB obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84; le produit d'amplification de la PCR2gyrB obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 30 et/ou le produit d'amplification de la PCR2gyrB obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 79 et SEQ ID
NO: 81 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 et SEQ ID NO: 87 ; le produit d' amplification de la PCR3gyrB est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 88 et SEQ ID NO: 89.
L'un des modes de réalisation de la méthode selon l'invention sur le gène gyrB est illustré sur la figure 2 ci- jointe. La position de certaines amorces au niveau du gène, ainsi que celle de certaines sondes et chacune des séquences, sont visibles sur cette figure.
Les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer ultérieurement le brin d'ADN servant de matrice pour le pyroséquençage .
En ce qui concerne à présent le gène parC, l'on effectue au moins trois réactions de PCR, notées PCRlparC à PCR3parC, indépendantes les unes des autres, à partir des couples d'amorces suivants, et ce dans l'optique de déterminer les mutations de ce gène :
PCRlparC et PCR2parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 31 et SEQ ID NO: 32 ;
PCR3parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45 et/ou avec les amorces présentant les
SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95.
Les amorces présentant les SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45, et les amorces présentant les SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95, permettent de façon intéressante d' amplifier spécifiquement au moins une portion de parC chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia, Morganella .
Préférentiellement , suite aux réactions de PCR et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification obtenus pour le gène parC :
le produit d' amplification de la PCRlparC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 40 ; le produit d' amplification de la PCR2parC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 et SEQ ID NO: 43 ;
- le produit d' amplification de la PCR3parC obtenu avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 46 et/ou le produit d'amplification de la PCR3parC obtenu avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 96.
L'un des modes de réalisation de la présente méthode, mise en œuvre sur le gène parC, est illustré sur la figure 3 ci- jointe. La position de certaines amorces au niveau de ce gène, ainsi que celle de certaines sondes et séquences, sont visibles sur cette figure. De même que pour les autres figures, les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer le brin d'ADN servant de matrice pour le pyroséquençage .
Enfin, selon un mode de réalisation préférentiel, et pour caractériser au mieux les mutations du gène parE, on réalise au moins cinq réactions de PCR, notées PCRlparE à PCR5par£, indépendantes les unes des autres, à partir des couples d' amorces suivants : PCRlparE et PCR2par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO: 48 ;
PCR3par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 64 et SEQ ID NO: 65 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 ;
PCR4par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 ;
PCR5par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 110 et SEQ ID NO: 111.
Plus préfèrentiellement , les amorces présentant les SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72, ainsi que les amorces présentant les SEQ ID NO: 110 et SEQ ID NO: 111, permettent spécifiquement l'amplification d'au moins une portion de parE chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia, Morganella .
Préférentiellement , suite aux réactions de PCR et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification obtenus pour le gène parE :
- le produit d' amplification de la PCRlparE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 et SEQ ID NO: 101 ;
- le produit d' amplification de la PCR2parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 et SEQ ID
NO: 104 ;
le produit d' amplification de la PCR3par£ obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 64 et SEQ ID NO: 65 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 et SEQ ID NO: 70 et/ou le produit d'amplification de la PCR3par£ obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 107 et SEQ ID NO: 108 ;
le produit d' amplification de la PCR4parE obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée apte à permettre l'initiation de pyroséquençage dudit produit d'amplification et/ou le produit d' amplification de la PCR4parE obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 109 ; - le produit d' amplification de la PCR5parE est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 112. Un mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, mise en œuvre sur le gène parE, est illustré sur la figure 4 ci-jointe. La position de certaines amorces au niveau de ce gène parE, pour les réactions de PCR 1, 2 et 3 ainsi que la position de certaines sondes et chacune des séquences, sont visibles sur cette figure. Les réactions de PCR 4 et de PCR 5 ne sont pas illustrées sur cette figure.
De même que pour les figures illustrant les réactions effectuées sur les trois autres gènes, les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer le brin d'ADN du gène amplifié servant de matrice pour le pyroséquençage .
Le fait d' amplifier chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE en utilisant une pluralité de couples d'amorces différents, spécifiques à chacun de ces gènes, et pouvant comporter des oligonucléotides dégénérés le cas échéant, permet d'obtenir plusieurs produits d'amplification pour chaque gène, chacun de ces produits correspondant à au moins une partie du gène d'intérêt à amplifier. Une réaction de PCR peut être effectuée avec un ou l'autre couple d'amorces, ou alors avec ces deux couples d'amorces de manière indépendante. C'est par exemple le cas de la PCR6gyrA, de la PCRlgyrB, etc. Dans le cas où une réaction est effectuée avec deux couples d'amorces différents, les produits d' amplification obtenus sont généralement hybridés avec des sondes différentes pour initier le pyroséquençage, dans l'optique d'obtenir une caractérisation la plus exhaustive possible des mutations des gènes.
En effet, chacun de ces produits d'amplification est ensuite hybridé avec au moins une sonde dégénérée, voire une pluralité de sondes dont l'une au moins est dégénérée, de sorte à initier le pyroséquençage de chaque produit d'amplification. Chaque sonde est élaborée de telle manière qu'elle va permettre, en association avec le couple d'amorces spécifique, la caractérisation d'un codon particulier de l'un des gènes d'intérêt, ledit codon étant susceptible de porter une mutation qu'il convient de caractériser par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention.
II découle de cette méthode la possibilité de caractériser, d'un point de vue moléculaire, et de façon toute à fait exhaustive, l'ensemble des points de mutations retrouvés au niveau de chaque portion QRDR des gènes gyrA, gyrB, parC et parE.
L'utilisation de sondes dégénérées, et éventuellement d'amorces dégénérées, facilite la caractérisation simultanée des mutations de ces gènes chez plusieurs genres d' entérobactéries d'intérêt clinique, c'est-à-dire susceptibles d'être retrouvés dans des organismes infectés .
La présente invention propose une méthode rapide, les résultats étant obtenus usuellement moins de 5h après l'étape d'extraction de l'ADN bactérien, ce qui permet de s'assurer de la présence éventuelle d'un germe résistant aux quinolones et d'adapter rapidement le traitement, de sorte à éviter d'administrer des antibiotiques inefficaces. Exemple 1 : Amplification du gène gyrA - conditions de PCR et de pyroséquençage à partir d' au moins une sonde dégénérée La figure 1 ci jointe, illustrant l'amplification du gène gyrA par la méthode selon l'invention, représente ce gène ainsi que les différents couples d' amorces pouvant être utilisés pour l'amplification de plusieurs portions de ce gène et leur positionnement au niveau de celui-ci, ainsi que le positionnement des différentes sondes dégénérées qui sont utilisées pour initier la réaction de pyroséquençage.
En haut de la figure 1 est représenté le gène gyrA avec l'ensemble des points de mutation identifiés, correspondant aux codons susceptibles de comporter des mutations .
Les réactions de PCR, numérotées de PCRl à PCR5, permettent l'amplification de différentes portions du gène gyrA, pour la caractérisation de points de mutations précis :
la PCRl (PCRlgyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:l (notée également gyrA-110-F) et SEQ ID NO : 2 (notée gyrA-290-R-biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, permet plus préférentiellement la caractérisation des codons 51 et 81 à 87 du gène gyrA en utilisant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 3 (notée 51-So) et de SEQ ID NO: 4 (notée 81-87So4) pour initier la réaction de pyroséquençage. De façon avantageuse, la sonde de SEQ ID NO: 4 facilite la caractérisation des mutations présentes au niveau des codons 81 à 87 chez les entérobactéries appartenant au genre Klebsiella, notamment K. pneumoniae et K. oxytoca ;
la PCR2 (PCR2gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:l (notée gyrA-110-F biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO: 2 (notée gyrA-290-R) permet plus préférentiellement la caractérisation des codons 67 à 73 et 81 à 87 du gène gyrA en utilisant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 5 (notée 67-73-So) et SEQ ID NO : 6 (notée 81-87- So3) pour initier la réaction de pyroséquençage ;
la PC 3 (PCR3gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO: 7 (notée gyrA-290-F-biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO: 8 (notée gyrA-536-R) permet plus préfèrentiellement la caractérisation des codons 98 à 119 et 131 à 139 du gène gyrA en utilisant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 9 (notée 98-So2) et SEQ ID NO: 10 (notée 119-So) et SEQ ID NO: 11 (notée 131-139-So2) pour initier la réaction de pyroséquençage ;
la PCR4 (PCR4gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO: 7 (notée gyrA-290-F) et SEQ ID NO: 8 (notée gyrA-536-R- biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, permet plus préférentiellement la caractérisation du codon 106 du gène gyrA en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO: 12 (notée 106-So) pour initier la réaction de pyroséquençage ; la PCR5 (PCR5gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO: 13 (notée gyrA-536-F-biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO: 14 (notée gyrA-661-R) permet plus préférentiellement la caractérisation du codon 196 du gène gyrA en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO: 15 (notée 196-So2) pour initier la réaction de pyroséquençage.
En bas de la figure 1, est représenté le gène gyrA avec l'ensemble des points de mutations identifiés pour les microorganismes appartenant aux espèces d' entérobactéries suivantes : Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp. et Serratia spp. (PPMS) .
La PCR numérotée 6 permet avantageusement l'amplification de la portion assurant la caractérisation des mutations des codons 81 à 87 du gène gyrA chez ces entérobactéries.
Plus particulièrement, la PCR6 (PCR6gyrA) est initiée à partir des amorces de SEQ ID NO: 16 (notée gyrA-175-F) et SEQ ID NO: 17 (notée gyrA-332-R-biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, et la réaction de pyrosequençage est initiée en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO: 18 (notée 81-87-PPS-So) .
Comme indiqué dans leur dénomination sur la figure 1, certaines amorces utilisées dans la réaction de PCR sont biotinylées (biot . ) . Comme déjà évoqué plus haut dans la description, la biotinylation de l'une des amorces permet de récupérer aisément un brin du produit d'amplification, grâce à l'affinité de la biotine avec l'avidine ou la streptavidine . Le brin d'ADN amplifié ainsi récupéré sert de matrice pour la réaction de pyroséquençage ultérieure.
Il est à noter que les séquences des amorces forward et reverse utilisées dans la réaction de PCR 1 présentent des séquences nucléotidiques identiques à celles des amorces forward et reverse utilisées dans la réaction de PCR 2. Cependant, dans la réaction de PCR 1, l'amorce reverse de SEQ ID NO:2 est biotinylée tandis que pour la PCR 2, c'est l'amorce forward de SEQ ID NO:l qui est biotinylée. Il en est de même pour d'autres amorces utilisées dans l'amplification du gène gyrA. Cela permet avantageusement de pouvoir récupérer l'un ou l'autre brin du produit d' amplification résultant de la réaction de PCR pour la réaction ultérieure de pyroséquençage.
Ainsi, l'on peut amplifier, par la méthode selon l'invention, deux fois la même portion de l'un des gènes et récupérer un des brins d'ADN sur un produit d'amplification et le second brin d'ADN sur le second produit d'amplification, chacun de ces brins étant ensuite pyroséquencé en utilisant avantageusement des sondes différentes pour initier la réaction. Un tel mode de réalisation est également visible sur la figure 1, pour les PCR1 et 2 d'une part et pour les PCR 3 et 4 d'autre part .
La composition des mélanges ainsi que les conditions de températures pour les différentes réactions de PCR sont détaillées dans les tableaux ci-après .
PCR 1 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR1 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette réaction de PCR sont les amorces de SEQ ID NO:l (notée gyrA-110F dans le tableau) et SEQ ID NO : 2 (notée gyrA-290Rbiot)
Figure imgf000032_0002
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après :
Figure imgf000032_0003
PCR 2 pour amplification gyrA
La composition du mélange pour la PCR2 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette réaction de PCR sont les amorces de SEQ ID NO:l (notée gyrA-llOFbiot) et SEQ ID NO: 2 (notée gyrA-290R)
Figure imgf000032_0001
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn dénaturation 94°C 0,30 mn
35 cycles : hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale : 72°C 5 mn
PCR 3 pour amplification gyrA
La composition du mélange pour la PCR3 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO : 7 (notée gyrA-290Fbiot) et SEQ ID NO : 8 (notée gyrA-536R) .
Figure imgf000034_0001
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après :
Figure imgf000034_0002
PCR 4 pour amplification gyrA
La composition du mélange pour la PCR4 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO: 7 (notée gyrA-290F) et SEQ ID NO: 8 (notée gyrA-536Rbiot) .
Figure imgf000034_0003
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn
dénaturation 94°C 0,30 mn
35 cycles : hybridation 61°C 0,30 mn
élongation 72°C 0,30 mn
élongation finale : 72°C 5 mn
PCR 5 pour amplification gyrA
La composition du mélange pour la PCR5 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO: 13 (notée gyrA-536Fbiot) et SEQ ID
(notée gyrA-661R)
Figure imgf000035_0001
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après :
Figure imgf000035_0002
La composition du mélange pour la PCR6 du gène gyrA est détaillée ci-dessous . Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO: 16 (notée GyrA-PPS 175F) et SEQ ID NO: 17 (notée GyrA-PPS 332 Rbiot) .
Figure imgf000036_0001
Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PC sont précisées ci après :
Figure imgf000036_0002
Pyroséquençage des produits d'amplification obtenus pour le gène gyrA
En ce qui concerne la réaction de pyroséquençage, celle-ci a été réalisée grâce à un séquenceur PSQ96MA (Qiagen) et selon les indications du fabricant, en adaptant cependant les quantités de sondes en fonctions des cibles. Ainsi, ces quantités ont été multipliées par 2 par rapport aux recommandations du fabricant à l'exception de la sonde de SEQ ID NO: 5 (notée 67-73-So) pour laquelle les concentrations ont été multipliées par 4 par rapport aux recommandations du fabricant.
Les couples suivants d' amorces ont été utilisés pour effectuer un séquençage conventionnel des différents gènes, et ont permis de corroborer les résultats obtenus par le pyroséquençage :
- SEQ ID NO: 73 et SEQ ID NO: 74 pour le gène gyrA ;
SEQ ID NO: 75 et SEQ ID NO: 74 pour le gène gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia, Morganella et Serratia ;
- SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 80 pour le gène gyr B, y compris chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella ; - SEQ ID NO : 90 et SEQ ID NO: 91 pour le gène parC ;
SEQ ID NO: 92 et SEQ ID NO: 93 pour le gène parC chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia et Morganella ;
- SEQ ID NO: 97 et SEQ ID NO: 98 pour le gène parE ;
SEQ ID NO: 99 et SEQ ID NO: 100 pour le gène parE chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés et décrits précédemment qui peuvent présenter des variantes et modifications sans pour autant sortir du cadre de 1 ' invention .

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle :
on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie ;
- on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ;
on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , pour obtenir au moins un produit d' amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ;
- on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d' amplification des gènes gyrA, gyrB, parC et parE obtenus lors de 1 ' étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier le pyroséquençage .
2. Méthode selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une des amorces de chaque couple d'amorces, utilisée pour la réaction de polymérisation en chaîne, est une amorce dégénérée comportant au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite amorce .
3. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la sonde dégénérée, utilisée pour initier le pyroséquençage, comporte au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite sonde.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'une des amorces, de chacun des couples d'amorces, est biotinylée.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins deux réactions de polymérisation en chaîne (PCR) indépendantes pour amplifier plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE en utilisant deux couples d'amorces différents.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les gènes gyrA, gyrB, parC et parE sont amplifiés à partir d' au moins un genre d' entérobactérie à Gram négatif choisi parmi le groupe consistant en Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serrâtla .
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins six PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrA, notées PCRlgyrA à PCR6 gyrA, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'au moins un couple d'amorces, défini comme suit :
PCRlgyrA et PCR2gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:l et SEQ ID NO: 2 ;
- PCR3gyrA et PCR4gyrA avec les amorces présentant les
SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 ;
PCR5gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 ;
PCR6gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17 et/ou avec les amorces présentant les
SEQ ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77.
8. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17 et les amorces présentant les SEQ ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77 permettent l'amplification d'au moins une portion de gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella et Serratia .
9. Méthode selon la revendication 7 ou la revendication 8 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage :
le produit d' amplification de la PCRlgyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ;
le produit d'amplification de la PCR2gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 ;
le produit d' amplification de la PCR3gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 11;
le produit d'amplification de la PCR4gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 12 ; le produit d' amplification de la PCR5gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 15; le produit d' amplification de la PCR6gyrA obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17 est hybridé avec au moins une sonde de SEQ ID NO: 18 et/ou le produit d' amplification de la PCR6gyrA obtenu avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 76 et SEQ ID NO: 77 est hybridé avec au moins une sonde de SEQ ID NO: 78.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins trois PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrB, notées PCRlgyrB, PCR2gyrB, et PCR3gyrB chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'au moins un couple d'amorces, défini comme suit : PCRlgyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 ;
VCRlgyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29 et/ou avec les amorces présentant les
SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 ;
PCR3g rB avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81.
11. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29 et les amorces présentant les SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 permettent l'amplification d'au moins une portion de gyrB chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia et Morganella.
12. Méthode selon la revendication 10 ou la revendication
11 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage :
le produit d' amplification de la PCRlgyrB obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:27 et/ou le produit d'amplification obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 et SEQ ID NO: 84 ;
le produit d'amplification de la PCR2gyri3 obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 30 et/ou le produit d'amplification obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 79 et SEQ ID NO: 81 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 et SEQ ID NO: 87 ;
le produit d' amplification de la PCR3gyrB est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 88 et SEQ ID NO: 89.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins trois PCR indépendantes pour amplifier le gène parC, notées PCRlparC à PCR3parC, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d' au moins un couple d'amorce, défini comme suit
PCRlparC et PCR2parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 31 et SEQ ID NO: 32 ;
PCR3parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95.
14. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45 et les amorces présentant les SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95 permettent l'amplification d'au moins une portion de parC chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella .
15. Méthode selon la revendication 13 ou la revendication 14 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage,
le produit d' amplification de la PCRlparC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 40 ; le produit d' amplification de la PCR2parC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 et SEQ ID NO: 43 ; le produit d' amplification de la PCR3parC obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 45 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 46 et/ou le produit d'amplification de la PCR3parC obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO : 95 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 96.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins cinq PCR indépendantes, notées PCRlparE à PCR5parE pour amplifier le gène parE, chacune desdites PCR étant effectuées à partir d' au moins un couple d'amorces, défini comme suit :
PCRlparE et PCR2par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 47 et SEQ ID NO: 48 ;
PCR3par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 64 et SEQ ID NO: 65 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106;
PCR4par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72 et/ou avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106;
PCR5par£ avec les amorces présentant les SEQ ID NO: 110 et SEQ ID NO: 111.
17. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72 et les amorces présentant les SEQ ID NO: 110 et SEQ ID NO: 111 permettent l'amplification d'au moins une portion de parE chez les entérobactéries appartenant aux genres Prote s, Providencia et Morganella .
18. Méthode selon la revendication 16 ou 17 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage :
le produit d' amplification de la PCRlparE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 et SEQ ID NO: 101 ; le produit d' amplification de la PCR2par£ est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID
NO: 63, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 et SEQ ID NO: 104 ;
le produit d' amplification de la PC 3par£ obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 64 et SEQ ID NO: 65 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 et SEQ ID NO: 70 et/ou le produit d'amplification de la PCR3par£ obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO: 107 et SEQ ID NO: 108;
le produit d' amplification de la PCR4parE obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée apte à permettre l'initiation du pyroséquençage dudit produit d'amplification et/ou le produit d' amplification de la PCR4par£ obtenu avec les amorces de SEQ ID NO: 105 et SEQ ID NO: 106 est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 109 ; le produit d' amplification de la PCR5par£ est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO: 112.
19. Amorce oligonucléotidique pour l'amplification de l'un des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, ladite amorce étant choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71 et SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110 et SEQ ID NO: 111.
20. Sonde oligonucléotidique dégénérée pour le pyroséquençage de l'un des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, ladite sonde étant choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID NO: 3 à 6, SEQ ID NO: 9 à 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 à 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 à 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49 à 63, SEQ ID NO: 66 à 70, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 à 89, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101 à 104, SEQ ID NO: 107 à 109 et SEQ ID NO: 112.
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