FR3004728A1 - Methode de caracterisation des mutations chromosomiques des genes codant les topoisomerases bacteriennes - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle : - on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie ; - on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ; - on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaine (PCR), pour obtenir au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE ; - on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification des gènes gyrA, gyrB, parC et parE obtenus lors de l'étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier le pyroséquençage.

Description

- 1 - La présente invention concerne une méthode permettant la caractérisation des mutations chromosomiques qui sont à l'origine de la résistance de certains micro-organismes, notamment des entérobactéries, aux antibiotiques appartenant à la famille des quinolones. La présente invention trouvera son application principalement dans le domaine de la médecine humaine, notamment en milieu hospitalier, ainsi que dans le domaine de la médecine vétérinaire.

En effet, la méthode de caractérisation proposée ici permet notamment de diagnostiquer rapidement une résistance d'un microorganisme aux quinolones, ce qui permet d'une manière toute particulièrement avantageuse de pouvoir adapter le traitement antibiotique en cas d'infection.

Les antibiotiques sont des molécules de synthèse ou naturelles, par exemple produites par des champignons, qui sont utilisées depuis la fin de la Seconde Guerre Mondiale, pour détruire les bactéries (effet bactéricide) ou empêcher leur croissance (effet bactériostatique).

Cependant, une utilisation généralisée de grandes quantités de ces molécules d'antibiotiques, que ce soit dans des traitements préventifs ou curatifs, en tant que compléments alimentaires, dans l'alimentation animale, dans les élevages, etc., a abouti à un développement de bactéries antibiorésistantes engendrant ainsi, d'une part, une diminution de l'efficacité des antibiotiques et, d'autre part, l'augmentation du nombre d'infections nosocomiales en milieu hospitalier. L'apparition et le développement de bactéries résistantes à 30 un antibiotique a pour conséquence d'empêcher l'utilisation de celui-ci pour le traitement de l'infection causée par ces bactéries. Il est alors nécessaire d'adapter le traitement thérapeutique pour soigner au mieux le malade. Pour éviter de traiter un patient infecté par des germes 35 résistants avec un antibiotique inefficace, il est primordial de -2- pouvoir détecter rapidement, et de façon certaine, la résistance de ces germes aux antibiotiques utilisés. Les molécules appelées « quinolones », ou « fluoroquinolones » lorsqu'un atome de fluor est ajouté à la molécule, sont des antibiotiques à large spectre et constituent l'une des trois familles d'antibiotiques les plus prescrits dans le monde pour traiter des infections dues à certaines entérobactéries, et la résistance de ces dernières aux quinolones ne cesse d'augmenter.

Plus précisément, les antibiotiques de la famille des quinolones ciblent certaines enzymes jouant un rôle dans les mécanismes de réplication de l'ADN (acide désoxyribonucléique) bactérien, telles que les topoisomérases de classe II et IV, et notamment l'ADN gyrase et la topoisomérase de type IV.

Les enzymes topoisomérases permettent plus particulièrement un contrôle de la structure de l'ADN en générant des coupures transitoires dans la double hélice d'ADN et catalysent le passage de segments d'ADN dans ces coupures transitoires avant de les refermer.

L'ADN gyrase appartient à la famille des topoisomérases de classe II, et est formée de deux sous unités A et deux sous unités B, respectivement codées par les gènes gyrA et gyrB. L'ADN gyrase permet le surenroulement de l'ADN chromosomique bactérien en introduisant des supertours négatifs dans la double hélice d'ADN. Les supertours vont permettre de faciliter le déroulement de l'ADN au moment des processus de réplication et de transcription de celui-ci. En conséquence, les topoisomérases, et en particulier l'ADN gyrase, sont des enzymes indispensables à la vie cellulaire bactérienne, notamment car elles interviennent dans des processus essentiels tels que la réplication et la transcription de l'ADN. De ce fait, les topoisomérases constituent d'excellentes cibles d'agents médicamenteux, en particulier d'antibiotiques tels que les quinolones, qui vont entrainer un arrêt de la multiplication bactérienne. - 3 - Cependant, l'apparition de souches d'entérobactéries résistantes aux quinolones entraine une diminution de l'efficacité de cette famille d'antibiotiques ; notamment, l'apparition de mutations chromosomiques ponctuelles, au niveau des gènes codant les topoisomérases, est l'un des phénomènes à l'origine de la résistance aux quinolones chez les entérobactéries. Il est également possible que la résistance d'une bactérie à un antibiotique soit caractérisée par un support plasmidique, à l'origine d'une transmission horizontale de la résistance et d'une propagation de cette résistance à d'autres bactéries. Cependant, les résistances chromosomiques sont les plus fréquentes et confèrent un niveau de résistance plus important, restreignant alors les possibilités thérapeutiques.

Plus précisément, la résistance chromosomique aux quinolones chez les entérobactéries résulte de mutations au niveau des gènes gyrA, gyrB, parc et perE codant les enzymes topoisomérases. Pour chacun d'entre eux, la région où se localisent les mutations à l'origine de la résistance aux quinolones est appelée QRDR, pour Quinolone Resistance Determining Region. On connait pour l'instant, du document de brevet WO 9 950 458, une méthode de détection des entérobactéries dans un échantillon, par l'utilisation de sondes spécifiques obtenues à partir d'une séquence codante du gène gyrA. La méthode décrite ici propose également de déterminer le statut des entérobactéries, sensible ou résistant, vis-à-vis des quinolones. Plus précisément, le document propose l'utilisation de 30 sondes spécifiques à différentes espèces d'entérobactéries, et plus particulièrement à la région codante du gène gyrA pour déterminer d'une part la présence de l'une ou l'autre de ces bactéries dans un échantillon, et, d'autre part, la résistance ou la sensibilité de ces bactéries aux quinolones. L'ADN présent 35 dans l'échantillon est dans un premier temps amplifié en utilisant un couple d'amorces spécifiques permettant - 4 - l'amplification du gène gyrA. On utilise ensuite les sondes spécifiques des différentes espèces de bactéries (E. cou, C. freundii, etc.) pour déterminer leur présence et d'autres sondes spécifiques pour déterminer leur statut vis-à-vis des quinolones, par détection de l'hybridation de ces sondes avec l'ADN amplifié. La détection de l'hybridation est effectuée à l'aide d'un microscope confocal laser ou par application d'un champ électrique contrôlé. Il est également possible d'ajouter un réactif pour faciliter la détection de l'hybridation.

L'absence d'hybridation lors de l'ajout de la sonde spécifique indique la présence d'une résistance aux quinolones dans l'échantillon testé. Cependant, une telle méthode n'est pas totalement satisfaisante. D'une part, elle est fastidieuse à mettre en oeuvre car elle nécessite une sonde spécifique pour la détection de chaque espèce d'entérobactérie visée, et une sonde spécifique pour déterminer la résistance ou la sensibilité de cette espèce vis-à-vis des quinolones. D'autre part, la méthode proposée dans ce document se focalise uniquement sur le gène gyrA tandis que d'autres gènes, codant les topoisomérases, sont susceptibles de subir des mutations engendrant une résistance des micro-organismes aux quinolones. Ainsi, la méthode proposée n'est pas exhaustive et elle ne 25 permet pas de caractériser les mutations des différents gènes codant pour les topoisomérases. Le document de brevet EP 0 688 873 propose l'utilisation de trois primers, chacun spécifique d'une mutation particulière du gène gyrA, ces primers étant utilisés en combinaison avec un 30 quatrième primer spécifique au brin complémentaire pour l'amplification. On détecte ensuite l'amplification par électrophorèse ou par révélation de la fluorescence. Cette méthode permet donc uniquement de déterminer la présence ou l'absence de trois mutations particulières du gène 35 gyrA. En conséquence, le document ne permet pas non plus de déterminer et de caractériser de manière exhaustive l'ensemble - 5 - des mutations des gènes gyrA, gyrB, parc et perE codant les topoisomérases. Il est encore proposé, dans le document de brevet GB 2 364 054 une méthode pour l'amplification de la région appelée QRDR en utilisant des oligonucléotides à moitié c'est-à-dire dont l'une présentant une séquence extrémité 5' est constante. Plus précisément, la dégénérés, des extrémités 3' est dégénérée, variable, tandis que la seconde méthode proposée ici comporte une première étape consistant à préparer une composition comportant d'une part les oligonucléotides forward et reverse, également appelés oligonucléotides gauche et droit ou sens et antisens respectivement, à moitié dégénérés et, d'autre part, un échantillon susceptible de contenir une région QRDR. La seconde étape consiste à procéder à une amplification de la région QRDR. Il est également possible de procéder à un séquençage de ce produit d'amplification pour le comparer à un second produit d'amplification obtenu selon le même mode opératoire. Cette technique, bien que plus intéressante que les autres techniques décrites ci-dessus pour déterminer les mutations de la région QRDR, ne permet pas non plus une caractérisation exhaustive, très précise et très fiable de l'ensemble des codons mutés des gènes gyrA, gyrB, parc et perE des entérobactéries. Ainsi, il n'existe, à l'heure actuelle, aucune méthode rapide et fiable permettant de caractériser de manière spécifique et exhaustive les mutations, dans les gènes gyrA, gyrB, parc et perE des entérobactéries, qui sont à l'origine des résistances des entérobactéries aux quinolones. L'invention offre la possibilité de pallier les divers inconvénients de l'état de la technique en proposant une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques des gènes gyrA, gyrB, parc et perE responsables de la résistance des entérobactéries aux quinolones, dans laquelle, après une amplification d'une ou plusieurs portions de ces gènes avec au moins un couple d'amorces forward et reverse pouvant être dégénérées, on réalise une réaction de pyroséquençage en - 6 - utilisant une pluralité d'amorces de pyroséquençage, dénommées ci après « sondes » ou « sondes dégénérées » pour des raisons de compréhension, lesdites sondes étant spécifiques des codons susceptibles de subir des substitutions et donc d'être mutés.

A cet effet, la présente invention concerne une méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, parC et parE codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle : - on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie ; - on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; - on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaine (PCR), pour obtenir au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; - on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification des gènes gyrA, gyrB, perC et perE obtenus lors de l'étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier le pyroséquençage. Selon d'autres caractéristiques particulières de la présente méthode : - avantageusement, au moins l'une des amorces de chaque couple d'amorces, utilisée pour la réaction de polymérisation en chaine, est une amorce dégénérée comportant au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite amorce ; -7- - préférentiellement la (ou les) sonde (s) dégénérée(s), utilisée(s) pour initier le pyroséquençage, comporte(nt) au moins un nucléotide dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite sonde ; - de façon intéressante, l'une des amorces, de chacun des couples d'amorces, est biotinylée ; - de préférence, l'on effectue au moins deux réactions de polymérisation en chaine (PCR) indépendantes pour amplifier plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE en utilisant deux couples d'amorces différents ; - avantageusement, les gènes gyrA, gyrB, perC et perE sont amplifiés à partir d'au moins un genre d'entérobactérie à Gram négatif choisi parmi le groupe consistant en Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia ; Selon un mode de réalisation particulier, l'on effectue au 20 moins six PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrA, notées PCR1gyrA à PCR6 gyrA, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorces tel que défini plus loin dans la description. De préférence, l'un des couples d'amorces permet 25 l'amplification d'au moins une portion de gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella et Serratia. Les réactions de pyroséquençage de gyrA sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les 30 séquences seront décrites ci après. Selon un exemple de réalisation intéressant, l'on effectue au moins deux PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrB, notées PCR1gyrB et PCR2gyrB, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorces tel que défini plus 35 loin dans la description. - 8 - Préférentiellement, l'un de ces couples d'amorces permet l'amplification d'au moins une portion de gyrB chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella.

Les réactions de pyroséquençage de gyrB sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci après. De façon avantageuse, l'on effectue au moins trois PCR indépendantes pour amplifier le gène perC, notées PCR1parC à 10 PCR3parC, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorces tel que défini plus loin dans la description. Préférentiellement, l'un de ces couples d'amorces permet l'amplification d'au moins une portion de perC chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et 15 Morganella. Les réactions de pyroséquençage de perC sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les séquences seront décrites ci après. En ce qui concerne l'amplification du gène perE, l'on 20 effectue préférentiellement au moins quatre PCR indépendantes, notées PCRlperE à PCR4perE chacune desdites PCR étant effectuées à partir d'un couple d'amorce, l'ensemble des couples d'amorces seront définis ci après. Selon un exemple intéressant, l'un de ces couples est 25 destiné à permettre l'amplification d'au moins une portion de perE chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella. Les réactions de pyroséquençage de perE sont ensuite avantageusement initiées à partir de sondes dégénérées dont les 30 séquences seront décrites ci après. La présente invention est également relative à une amorce oligonucléotidique pour l'amplification de l'un des gènes gyrA, gyrB, perC et perE. L'invention est encore relative à une sonde 35 oligonucléotidique dégénérée pour le pyroséquençage de l'un des gènes gyrA, gyrB, perC et perE. - 9 - La présente invention comporte de nombreux avantages. D'une part, elle permet de déterminer extrêmement rapidement, et de manière exhaustive, les mutations présentes au niveau des gènes d'intérêt et qui conduisent à l'augmentation de la résistance 5 des micro-organismes, notamment des entérobactéries, aux antibiotiques de la famille des quinolones. A titre indicatif, la présente méthode permet de caractériser ces mutations en moins de 5h après extraction de l'ADN bactérien de l'échantillon à tester. De plus, l'utilisation d'amorces, dont certaines 10 peuvent contenir des nucléotides dégénérés, et de sondes dégénérées, respectivement pour la réaction de PCR et pour la réaction de pyroséquençage, permet de cibler plusieurs genres bactériens susceptibles d'être retrouvés dans les organismes infectés. 15 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre des modes de réalisation non limitatifs de l'invention, en référence aux figures annexées dans lesquelles : la figure 1 est une illustration schématique de 20 différentes réactions de polymérisation en chaîne (PCR) pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène gyrA, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes 25 dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ; la figure 2 est une illustration schématique des différentes réactions de PCR effectuées pour amplifier différents fragments du gène gyrB, 30 précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ; la figure 3 est une illustration schématique de 35 différentes réactions de PCR pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène parc, - 10 - précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage ; la figure 4 est une illustration schématique de différentes réactions de PCR pouvant être effectuées pour amplifier différents fragments du gène parE, précisant, pour chaque réaction de PCR, le couple d'amorces utilisé et illustrant également le positionnement des sondes dégénérées utilisées pour la réaction de pyroséquençage. Dans la suite de la description, on entend par les termes « amorce » ou « primer », une courte séquence oligonucléotidique simple brin comportant entre 10 et 40 nucléotides, usuellement 15 obtenue par la mise en oeuvre d'une méthode de synthèse chimique, mais pas obligatoirement. Les amorces sont complémentaires à une séquence d'acide nucléique à amplifier et sont donc aptes à s'hybrider à cette séquence pour servir de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette séquence. On utilise 20 une amorce « forward » (également appelée amorce gauche ou amorce sens) et une amorce « reverse » (également appelée amorce droite ou amorce antisens), chacune étant complémentaire de l'extrémité de l'un des brins pour permettre la synthèse et l'amplification de la séquence nucléotidique entre chacune de 25 ces extrémités et obtenir un produit d'amplification. On entend par « couple d'amorces spécifique » d'un gène un couple comportant une amorce forward et une amorce reverse, chacune étant apte à s'hybrider à une séquence dudit gène, l'amorce forward étant complémentaire de l'un des brins de l'ADN 30 tandis que l'amorce reverse est complémentaire à l'autre brin, de sorte à permettre l'initiation de la réaction d'amplification de ce gène ou d'une portion de ce gène. On entend par les termes « amorce dégénérée » ou « primer dégénéré » un mélange d'amorces (ou de primers) de séquence 35 similaire mais présentant des variations de nucléotides au niveau d'une ou de plusieurs positions. Les nucléotides dégénérés peuvent être situés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de l'amorce. On entend par le terme « sonde » ou « sonde oligonucléotidique », une courte séquence oligonucléotidique, comportant entre 5 et 30 nucléotides, et apte à s'hybrider à un produit d'amplification pour initier la réaction de pyroséquençage. On entend par le terme « sonde dégénérée » ou « sonde oligonucléotidique dégénérée », dans la suite de la description, 10 un mélange de sondes de séquence similaire mais présentant des variations de nucléotides au niveau d'une ou de plusieurs positions. Les nucléotides dégénérés peuvent être positionnés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de la sonde. 15 Les amorces et les sondes utilisées dans la présente méthode ont été élaborées en se basant sur les séquences nucléotidiques disponibles dans la base de données Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) ainsi que dans la littérature. Elles sont listées dans le listage de séquences ci 20 après. On entend par « quinolones » une famille d'antibiotiques à large spectre efficaces dans le traitement de nombreuses infections, notamment celles qui sont dues à des bactéries Gram négatif. Le terme « quinolones » inclut les quinolones de 25 première, deuxième, troisième et quatrième générations, ainsi que les fluoroquinolones. La présente invention est relative à une méthode destinée à permettre une caractérisation rapide, fiable et exhaustive, des mutations des gènes gyrA, gyrB, perC et perE. 30 Les gènes gyrA et gyrB codent chacun deux sous unités de l'ADN gyrase bactérienne, respectivement appelées sous unité A et sous unité B. Cette gyrase appartient aux topoisomérases de classe II et est impliquée dans les mécanismes de réplication et de transcription de l'ADN bactérien. 35 Les gènes perC et perE codent la topoisomérase IV, celle- ci appartenant également aux topoisomérases de classe II. - 12 - Des mutations au niveau de ces gènes entrainent une augmentation de la résistance aux quinolones chez certaines bactéries, en particulier chez les entérobactéries, dont les infections sont traitées par cette famille d'antibiotique.

Les entérobactéries (Enterobacteriaceae) constituent l'une des plus importantes familles de bactéries, et regroupent plus de 40 genres très ubiquitaires. Ainsi, les micro-organismes appartenant aux genres Escheri chia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Kiebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia sont des exemples d'entérobactéries d'intérêt clinique sur lesquelles la méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre pour déterminer la présence de mutations et caractériser ces dernières. En effet, ces micro-organismes sont fréquemment rencontrés en pathologie infectieuse humaine ou vétérinaire, et notamment dans les infections nosocomiales. A titre d'exemple, en France, approximativement 15% des souches appartenant à l'espèce Escherichia cou, isolées d'hémocultures, sont résistantes aux quinolones (données du European Antimicrobial Résistance Surveillance System : http://www.ecdc.europa.eu). Ce pourcentage monte à 25% aux Etats-Unis. En ce qui concerne l'Asie, la résistance des entérobactéries aux antibiotiques quinolones est quasiment endémique. En conséquence, il devient primordial de pouvoir détecter 25 le plus rapidement possible, et de manière fiable et exhaustive, les mutations notamment chromosomiques des gènes gyrA, gyrB, perC et perE responsables de l'acquisition de la résistance bactérienne aux quinolones. Cela permet, de manière particulièrement avantageuse, de pouvoir rapidement adapter le 30 traitement thérapeutique de sorte à soigner le patient de manière adéquate, en évitant de lui administrer un traitement inefficace et souvent lourd. La méthode selon l'invention présente également un intérêt en épidémiologie ou en recherche. En effet, cette méthode permet 35 une caractérisation exhaustive des mutations des gènes codant pour les topoisomérases des entérobactéries provenant de grandes - 13 - collections de souches, et ce de façon très rapide. L'invention présente ainsi également un intérêt particulier dans le cadre de l'étude de l'évolution de la résistance bactérienne aux antibiotiques.

Pour en revenir à présent plus particulièrement aux différentes étapes mises en oeuvre dans la méthode selon l'invention, celles-ci sont les suivantes : dans un premier temps, il convient d'extraire l'ADN bactérien notamment contenu dans un échantillon ou provenant d'une colonie individuelle, par exemple cultivée sur gélose ; l'on met ensuite, en présence de l'ADN bactérien extrait, au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE, indépendamment les unes des autres on obtient alors au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; on effectue ensuite une réaction de pyroséquençage pour chacun des produits de PCR obtenus lors de l'étape d'amplification ; pour initier la réaction de pyroséquençage on utilise au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun des produits d'amplification. L'étape d'extraction de l'ADN bactérien, contenu dans un échantillon ou dans une colonie, peut être effectuée par tout moyen connu par l'homme du métier et apte à cet effet. Généralement, l'extraction de l'ADN bactérien comprend une étape au cours de laquelle les cellules bactériennes sont lysées, suivie d'une étape d'extraction à proprement dite, destinée à détruire la membrane et à dénaturer les protéines pour isoler et récupérer l'ADN. Les protéines sont ensuite généralement séparées de l'ADN par une extraction au phénol- chloroforme, par exemple. On obtient alors un précipité - 14 - contenant les protéines tandis que l'ADN reste en solution et peut être récupéré par décantation ou centrifugation, avant de subir une étape de précipitation par addition d'éthanol ou encore d'isopropanol. Après une nouvelle étape de centrifugation, qui permet de récupérer l'ADN, celui-ci est habituellement dissout dans un tampon adéquat pour la suite du procédé. Cependant, un tel mode d'extraction ne doit pas être compris comme étant limitatif, et l'ADN bactérien peut également 10 être extrait à l'aide de kits commerciaux adaptés ou de tout autre moyen prévu à cet effet. Les échantillons susceptibles d'être testés par la méthode selon l'invention sont, en particulier mais non limitativement, des échantillons biologiques provenant d'un individu ou d'un 15 organisme infecté, normalement stériles et localisés anatomiquement au foyer infectieux. L'ADN bactérien extrait est par la suite mis en présence d'au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE dont les mutations sont susceptibles de 20 conférer à la bactérie une résistance aux antibiotiques appartenant à la famille des quinolones. Cela signifie que l'ADN bactérien peut être mis en présence d'un ou de plusieurs couples d'amorces spécifiques pour chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE. 25 En prenant pour exemple le gène gyrA, il est ainsi possible d'utiliser un premier couple d'amorces permettant d'amplifier une première portion de ce gène, un deuxième couple d'amorces pour l'amplification d'une seconde portion de gyrA, etc. Il en est de même pour les gènes gyrB, perC et perE. 30 Plus particulièrement, chacun des couple d'amorces est mélangé à de l'ADN bactérien extrait lors de la première étape du procédé. Chacun des mélanges est réalisé à part des autres mélanges ; en d'autres termes, pour chaque couple d'amorces spécifique à l'un des gènes, un mélange comportant notamment ces 35 amorces et l'ADN bactérien est effectué. - 15 - Dans la suite de la méthode selon l'invention, l'on réalise l'amplification d'au moins une portion de chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE en mettant en oeuvre une réaction de PCR. Comme évoqué plus haut, il est possible d'amplifier indépendamment plusieurs portions d'un gène donné en utilisant deux, ou plus de deux, couples d'amorces différents et spécifiques de ce gène, comme illustré sur les figures annexées. Il est également envisageable d'amplifier indépendamment l'intégralité d'un gène et éventuellement une ou plusieurs portions de ce même gène. Un tel mode de réalisation permet notamment d'obtenir la séquence complète du gène et de comparer celle-ci aux résultats obtenus par la méthode proposée. Suite à la mise en oeuvre de la réaction de PCR sur les mélanges comportant l'ADN bactérien et les couples d'amorces, on obtient au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE à tester. Ce produit d'amplification correspond généralement à une portion seulement de ce gène, en fonction du couple d'amorces utilisé. A titre d'exemple, si l'on se réfère à la figure 1, illustrant le gène gyrA et un mode de réalisation de la méthode selon l'invention pouvant être appliqué à ce gène, on remarque qu'il est possible de réaliser 6 PCR en utilisant différents couples d'amorces. Chacune de ces PCR va permettre de caractériser 25 ultérieurement, par la réaction de pyroséquençage, un ou plusieurs codons particuliers du gène gyrA susceptible de porter des mutations conférant, à la bactérie, la résistance aux quinolones. Il est également illustré, sur cette figure 1, la 30 possibilité d'amplifier au moins une portion du gène gyrA des bactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella et Serratia, noté gyrA PPMS sur cette figure, en utilisant un couple d'amorces ad hoc. Ce point particulier sera évoqué plus en détail dans la suite de la description. 35 Selon un exemple de réalisation intéressant de la méthode selon l'invention, au moins l'une des amorces, du couple - 16 - d'amorces, utilisée pour initier la réaction de PCR est une amorce dégénérée, présentant au moins un nucléotide dégénéré, et de préférence plusieurs nucléotides dégénérés, c'est-à-dire variables.

Une telle caractéristique permet une amplification PCR des gènes d'intérêt gyrA, gyrB, perC et perE, ou de portions de ceux-ci, chez différents genres bactériens, entre lesquels il peut exister des différences au niveau de ces gènes. Plus particulièrement, la méthode selon l'invention se 10 propose de caractériser les mutations de ces gènes chez des entérobactéries d'intérêt clinique susceptibles d'être responsables d'infections. Plus préférentiellement, les entérobactéries d'intérêt clinique qui sont visées par la méthode selon l'invention 15 appartiennent aux genres Escherichia, Shigella, Citrobacter, Kiebsiella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia. Ainsi, avantageusement, l'utilisation de certaines amorces dégénérées permet l'amplification des gènes, ou portion de gènes, chez l'ensemble de ces entérobactéries. 20 Selon un exemple de réalisation particulier, la présente méthode permet de caractériser les mutations des gènes codant les topoisomérases chez au moins une espèce choisie dans le groupe comportant Escheri chia cou, Kiebsiella pneumoniae, Kiebsiella oxytoca, Shigella spp., Citrobacter spp., Salmonella 25 spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Serratia spp. A titre indicatif, certaines portions de gènes sont conservées entre ces différents genre ou espèces d'entérobactéries expliquant que toutes les amorces ne sont pas 30 dégénérées. Selon un mode de réalisation particulier, l'une des amorces, de chacun des couples d'amorces utilisés pour initier la réaction de PCR, est biotinylée. L'amorce forward ou l'amorce reverse peut être biotinylée, selon le positionnement de la 35 sonde de pyroséquençage sur le produit d'amplification ad hoc. - 17 - La biotinylation d'une séquence nucléotidique consiste à lier, à cette séquence, une molécule de biotine, cette dernière présentant une affinité extrêmement importante pour la streptavidine ou l'avidine. Ainsi, la biotinylation de l'une des amorces utilisée dans la réaction de PCR permet la fixation d'un des brins du produit d'amplification, par exemple à des billes sur lesquelles est notamment liée de la streptavidine, ledit brin servant alors de matrice pour la réaction de pyroséquençage.

Pour en revenir à présent à la réaction de pyroséquençage, qui constitue la dernière étape de la méthode selon l'invention, celle-ci est effectuée sur chacun des produits d'amplification obtenus lors de l'étape d'amplification par PCR. Plus précisément, pour initier cette réaction de pyroséquençage, on utilise au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification en fonction du codon à caractériser. Il est ainsi envisageable d'utiliser plusieurs sondes dégénérées spécifiques pour un produit d'amplification, comme cela est illustré notamment sur la figure 1 ci-jointe. Il est également possible d'utiliser au moins une sonde dégénérée et une sonde de séquence constante pour pyroséquencer un produit d'amplification. Dans le cas où plusieurs sondes sont utilisées, on effectue une réaction de pyroséquençage à partir de chacune de 25 ces sondes. On entend par « sonde dégénérée spécifique » d'un produit d'amplification une sonde apte à s'hybrider au niveau de l'un des brins dudit produit d'amplification pour initier la réaction de pyroséquençage. 30 De façon particulièrement avantageuse, la sonde dégénérée, utilisée pour initier la réaction de pyroséquençage, présente au moins un nucléotide dégénéré, et de préférence plusieurs nucléotides dégénérés, ces derniers pouvant être situés à n'importe quelle position de la séquence nucléotidique de la 35 sonde dégénérée. - 18 - Le pyroséquençage permet un séquençage rapide d'une séquence, avec une lecture directe des résultats. Plus précisément, le principe du pyroséquençage repose sur un ajout des nucléotides A, T, G, et C les uns après les autres ; lorsque le nucléotide ajouté est complémentaire au nucléotide de la molécule d'ADN à séquencer, il est incorporé dans le brin qui est en cours de synthèse, et il se produit une libération d'une molécule de pyrophosphate qui va être transformée, par une ATP phosphorylase, en ATP (adénosine tri-phosphate). Une enzyme, la luciférase, catalyse la réaction de couplage de cet ATP à une molécule de luciférine, entrainant la production d'oxyluciférine et d'un signal lumineux, dû à l'émission de photons. Ce signal est alors détecté par un capteur qui va le convertir en un pic représenté au niveau d'un pyrogramme, la hauteur dudit pic étant fonction de l'intensité du signal capté. La séquence est ainsi déduite des pics obtenus lors de l'incorporation des nucléotides et de la hauteur de ces pics. Dans un exemple de réalisation de la méthode selon l'invention, le pyroséquenceur PSQ96MA (Qiagen) a été utilisé, 20 et les recommandations du fabricant pour la mise en oeuvre du pyroséquençage ont été suivies. L'utilisation de sondes dégénérées pour initier la réaction de pyroséquençage est particulièrement avantageuse. D'une part, chacune des sondes est élaborée pour permettre le 25 séquençage d'un ou plusieurs codons susceptibles d'être mutés et donc de conférer la résistance aux quinolones. C'est pourquoi, dans certains cas, l'on utilise plusieurs sondes dégénérées pour pyroséquencer un produit d'amplification, lesdites sondes se positionnant, par complémentarité, à différents endroits sur 30 ledit produit d'amplification. Ainsi, l'ensemble des codons de la région QRDR, potentiellement mutés ou non, peut-être caractérisé. Il est possible de caractériser les seuls codons, décrits comme majoritairement incriminés dans la résistance aux quinolones (désignés par le terme « hot spots ») ou toute la 35 région QRDR par utilisation d'une ou plusieurs sondes. - 19 - D'autre part, l'utilisation de sondes dégénérées facilite l'hybridation de la sonde à des produits d'amplification de gènes gyrA, gyrB, perC et perE appartenant à différents micro- organismes, en particulier à différentes espèces d'entérobactéries d'intérêt clinique, qui ont déjà été mentionnées ci-dessus dans la description. En effet, les gènes codant les topoisomérases bactériennes peuvent présenter des variations entre les différentes espèces d'entérobactéries, mais la méthode selon l'invention permet avantageusement le 10 pyroséquençage de ces gènes pour plusieurs espèces d'entérobactéries, sans avoir recours à autant de sondes que d'espèces ou genres d'entérobactéries pour lesquels la caractérisation des mutations QRDR est effectuée. Ainsi, quelle que soit l'espèce d'entérobactérie, telle 15 que définie ci-dessus, contenue dans l'échantillon biologique ou constituant la colonie à tester, la méthode selon l'invention permettra d'amplifier les gènes d'intérêt chez l'ensemble de ces bactéries et de séquencer l'ensemble de ces gènes, par pyroséquençage afin de déterminer la présence d'une résistance 20 aux quinolones et de caractériser la ou les mutations responsables de cette ré sistance. Préférentiellement , pour obtenir des résultats optimaux pour la caractérisation des mutations du gène gyrA, on réalise au moins six réactions de PCR, notées PCR1gyrA à PCR6gyrA, 25 indépendantes les unes des autres, à partir des six couples d'amorces suivants : - PCR1gyrA et PCR2gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 ; - PCR3gyrA et PCR4gyrA avec les amorces présentant les 30 SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8 ; - PCR5gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:13 et SEQ ID NO:14 ; - PCR6gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:16 et SEQ ID NO:17. - 20 - A titre de remarque, pour chacun des couples d'amorces mentionnés ci-dessus, et dans le reste de la description, la première correspond à l'amorce forward (ou sens) et la seconde correspond à l'amorce reverse (antisens).

En particulier, les amorces présentant les SEQ ID NO:16 et SEQ ID NO:17 permettent préférentiellement l'amplification d'au moins une portion du gène gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, M'organelle et Serratia, comme illustré plus en détail sur la figure 1.

En effet, ces quatre genres d'entérobactéries portent des gènes gyrA dont les séquences nucléotidiques sont susceptibles d'être différentes de celles des gènes gyrA des autres espèces d'entérobactéries listées ci-dessus. En ce qui concerne les réactions de PCR effectuées indépendamment mais avec des couples d'amorces identiques, notamment les PCR1gyrA et PCR2gyrA, il est envisageable que, pour la PCR1gyrA, l'amorce reverse de SEQ ID NO:2 soit biotinylée tandis que, pour la PCR2gyrA, c'est l'amorce forward de SEQ ID NO:1 qui le soit.

Ces réactions de PCR, indépendantes et avec des couples d'amorces identiques, permettent d'obtenir avantageusement des produits d'amplifications de séquences identiques qui seront ensuite mis en présence de sonde différentes pour la réaction de pyroséquençage.

Ainsi, de façon préférentielle, suite aux réactions de PCR en présence des amorces telles que définies plus haut, et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification obtenus pour le gène gyrA : - le produit d'amplification de la PCR1gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4 ; - le produit d'amplification de la PCR2gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6 ; - 21 - - le produit d'amplification de la PCR3gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 et SEQ ID NO:11; - le produit d'amplification de la PCR4gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:12 ; - le produit d'amplification de la PCR5gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:15 ; - le produit d'amplification de la PCR6gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:18. La caractérisation des mutations sur le gène gyrA, dont le positionnement des amorces pour les réactions de PCR, et le positionnement des sondes pour le pyroséquençage, est illustrée sur la figure 1 qui est décrite plus en détail dans l'exemple 1 15 ci-dessous. De façon toute particulièrement avantageuse, pour obtenir des résultats optimaux pour la caractérisation des mutations du gène gyrB, on réalise au moins deux réactions de PCR, notées PCR1gyrB et PCR2gyrB, indépendantes les unes des autres, à 20 partir des deux couples d'amorces suivants : - PCR1gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO:19 et SEQ ID NO:20 ; - PCR2gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO:28 et SEQ ID NO:29. 25 Plus avantageusement encore, les amorces présentant les SEQ ID NO:28 et SEQ ID NO:29 permettent spécifiquement l'amplification d'au moins une portion de gyrB chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella. 30 Préférentiellement, suite aux réactions de PCR, et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification obtenus pour le gène gyrB : - le produit d'amplification de la PCR1gyrB est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe 35 comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:21, SEQ - 22 - ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:27 ; - le produit d'amplification de la PCR2gyrB est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:30.

L'un des modes de réalisation de la méthode selon l'invention sur le gène gyrB est illustré sur la figure 2 ci jointe. La position des amorces au niveau du gène, ainsi que celle des sondes et chacune des séquences, sont visibles sur cette figure.

Les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer ultérieurement le brin d'ADN servant de matrice pour le pyroséquençage. En ce qui concerne à présent le gène perC, l'on effectue au moins trois réactions de PCR, notées PCR1parC à PCR3parC, indépendantes les unes des autres, à partir des trois couples d'amorces suivants, et ce dans l'optique de déterminer les mutations de ce gène : - PCR1parC et PCR2perC avec les amorces présentant les SEQ ID NO:31 et SEQ ID NO:32 ; - PCR3parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO:44 et SEQ ID NO:45. Les amorces présentant les SEQ ID NO:44 et SEQ ID NO:45 permettent de façon intéressante d'amplifier spécifiquement au 25 moins une portion de perC chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella. Préférentiellement, suite aux réactions de PCR et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification obtenus pour le gène perC : 30 - le produit d'amplification de la PCR1parC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 et SEQ ID NO:40 ; - 23 - - le produit d'amplification de la PCR2perC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 et SEQ ID NO:43 ; - le produit d'amplification de la PCR3parC est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:46. L'un des modes de réalisation de la présente méthode, mise en oeuvre sur le gène perC, est illustré sur la figure 3 ci jointe. La position des amorces au niveau de ce gène, ainsi que celle des sondes et chacune des séquences, sont visibles sur cette figure. De même que pour les autres figures, les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer le brin d'ADN servant de matrice pour le pyroséquençage.

Enfin, selon un mode de réalisation préférentiel, et pour caractériser au mieux les mutations du gène perE, on réalise au moins quatre réactions de PCR, notées PCR1parE à PCR4perE, indépendantes les unes des autres, à partir des quatre couples d'amorces suivants : - PCR1parE et PCR2perE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:47 et SEQ ID NO:48 ; - PCR3parE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:64 et SEQ ID NO:65 ; - PCR4perE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:71 et SEQ ID NO:72. Plus préférentiellement, les amorces présentant les SEQ ID NO:71 et SEQ ID NO:72 permettent spécifiquement l'amplification d'au moins une portion de perE chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia, Morganella.

Préférentiellement, suite aux réactions de PCR et dans l'optique d'initier les réactions de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification obtenus pour le gène perE : - le produit d'amplification de la PCR1parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:49, SEQ -24- ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54 ; - le produit d'amplification de la PCR2parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62 et SEQ ID NO:63 ; - le produit d'amplification de la PCR3parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 et SEQ ID NO:70 ; - le produit d'amplification de la PCR4parE est hybridé avec au moins une sonde dégénérée apte à permettre l'initiation de pyroséquençage dudit produit d'amplification. Un mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, mise en oeuvre sur le gène perE, est illustré sur 20 la figure 4 ci jointe. La position des différentes amorces au niveau de ce gène perE, pour les réactions de PCR 1, 2 et 3 ainsi que la position de certaines sondes et chacune des séquences, sont visibles sur cette figure. La réaction de PCR 4 n'est pas illustrée sur cette figure. 25 De même que pour les figures illustrant les réactions effectuées sur les trois autres gènes, les amorces qui se terminent par le suffixe « biot » sont celles qui sont avantageusement biotinylées pour fixer le brin d'ADN du gène amplifié servant de matrice pour le pyroséquençage. 30 Le fait d'amplifier chacun des gènes gyrA, gyrB, parc et perE en utilisant une pluralité de couples d'amorces différents, spécifiques à chacun de ces gènes, et pouvant comporter des oligonucléotides dégénérés le cas échéant, permet d'obtenir plusieurs produits d'amplification pour chaque gène, chacun de 35 ces produits correspondant à au moins une partie du gène d'intérêt à amplifier. -25- Chacun de ces produits d'amplification est ensuite hybridé avec au moins une sonde dégénérée, voire une pluralité de sondes dont l'une au moins est dégénérée, de sorte à initier le pyroséquençage de chaque produit d'amplification. Chaque sonde 5 est élaborée de telle manière qu'elle va permettre, en association avec le couple d'amorces spécifique, la caractérisation d'un codon particulier de l'un des gènes d'intérêt, ledit codon étant susceptible de porter une mutation qu'il convient de caractériser par la mise en oeuvre de la 10 méthode selon l'invention. Il découle de cette méthode la possibilité de caractériser, d'un point de vue moléculaire, et de façon toute à fait exhaustive, l'ensemble des points de mutations retrouvés au niveau de chaque portion QRDR des gènes gyrA, gyrB, perC et 15 perE. L'utilisation de sondes dégénérées, et éventuellement d'amorces dégénérées, facilite la caractérisation simultanée des mutations de ces gènes chez plusieurs genres d'entérobactéries d'intérêt clinique, c'est-à-dire susceptibles d'être retrouvés 20 dans des organismes infectés. La présente invention propose une méthode rapide, les résultats étant obtenus usuellement moins de 5h après l'étape d'extraction de l'ADN bactérien, ce qui permet de s'assurer de la présence éventuelle d'un germe résistant aux quinolones et 25 d'adapter rapidement le traitement, de sorte à éviter d'administrer des antibiotiques inefficaces. Exemple 1 : Amplification du gène gyrA - conditions de PCR et de pyroséquençage à partir d'au moins une sonde 30 dégénérée La figure 1 ci jointe, illustrant l'amplification du gène gyrA par la méthode selon l'invention, représente ce gène ainsi que les différents couples d'amorces pouvant être utilisés pour 35 l'amplification de plusieurs portions de ce gène et leur positionnement au niveau de celui-ci, ainsi que le -26- positionnement des différentes sondes dégénérées qui sont utilisées pour initier la réaction de pyroséquençage. En haut de la figure 1 est représenté le gène gyrA avec l'ensemble des points de mutation identifiés, correspondant aux 5 codons susceptibles de comporter des mutations. Les réactions de PCR, numérotées de PCR1 à PCR5, permettent l'amplification de différentes portions du gène gyrA, pour la caractérisation de points de mutations précis : - la PCR1 (PCR1gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:1 10 (notée également gyrA-110-F) et SEQ ID NO:2 (notée gyrA-290-R-biot), cette dernière étant avantageusement biotinylée, permet plus préférentiellement la caractérisation des codons 51 et 81 à 87 du gène gyrA en utilisant les sondes 15 dégénérées de SEQ ID NO:3 (notée 51-So) et de SEQ ID NO:4 (notée 81-87So4) pour initier la réaction de pyroséquençage. De façon avantageuse, la sonde de SEQ ID NO:4 facilite la caractérisation des mutations présentes au niveau des codons 81 à 87 chez les 20 entérobactéries appartenant au genre Klebsiella, notamment K. pmeumoniae et K. oxytoca ; - la PCR2 (PCR2gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:1 (notée gyrA-110-F biot) , cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO:2 (notée 25 gyrA-290-R) permet plus préférentiellement la caractérisation des codons 67 à 73 et 81 à 93 du gène gyrA en utilisant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:5 (notée 67-73-So) et SEQ ID NO:6 (notée 81-87- So3) pour initier la réaction de pyroséquençage ; 30 - la PCR3 (PCR3gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:7 (notée gyrA-290-F-biot), cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO:8 (notée gyrA-536-R) permet plus préférentiellement la caractérisation des codons 98 à 119 et 131 à 139 du 35 gène gyrA en utilisant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:9 (notée 98-So2) et SEQ ID NO:10 (notée 119-So) -27- et SEQ ID NO:11 (notée 131-139-So2) pour initier la réaction de pyroséquençage ; - la PCR4 (PCR4gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:7 (notée gyrA-290-F) et SEQ ID NO:8 (notée gyrA-536-R- biot), cette dernière étant avantageusement biotinylée, permet plus préférentiellement la caractérisation du codon 106 du gène gyrA en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO:12 (notée 106-So) pour initier la réaction de pyroséquençage ; - la PCR5 (PCR5gyrA) avec les amorces de SEQ ID NO:13 (notée gyrA-536-F-biot), cette dernière étant avantageusement biotinylée, et SEQ ID NO:14 (notée gyrA-661-R) permet plus préférentiellement la caractérisation du codon 196 du gène gyrA en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO:15 (notée 196-So2) pour initier la réaction de pyroséquençage. En bas de la figure 1, est représenté le gène gyrA avec l'ensemble des points de mutations identifiés pour les micro- organismes appartenant aux espèces d'entérobactéries suivantes : Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp. et Serratia spp. (PPMS). La PCR numérotée 6 permet avantageusement l'amplification de la portion assurant la caractérisation des mutations des codons 81 à 87 du gène gyrA chez ces entérobactéries.

Plus particulièrement, la PCR6 (PCR6gyrA) est initiée à partir des amorces de SEQ ID NO:16 (notée gyrA-175-F) et SEQ ID NO:17 (notée gyrA-332-R-biot), cette dernière étant avantageusement biotinylée, et la réaction de pyroséquençage est initiée en utilisant la sonde dégénérée de SEQ ID NO:18 (notée 30 81-87-PPS-So). Comme indiqué dans leur dénomination sur la figure 1, certaines amorces utilisées dans la réaction de PCR sont biotinylées (biot.). Comme déjà évoqué plus haut dans la description, la biotinylation de l'une des amorces permet de 35 récupérer aisément un brin du produit d'amplification, grâce à l'affinité de la biotine avec l'avidine ou la streptavidine. Le -28- brin d'ADN amplifié ainsi récupéré sert de matrice pour la réaction de pyroséquençage ultérieure. Il est à noter que les séquences des amorces forward et reverse utilisées dans la réaction de PCR 1 présentent des 5 séquences nucléotidiques identiques à celles des amorces forward et reverse utilisées dans la réaction de PCR 2. Cependant, dans la réaction de PCR 1, l'amorce reverse de SEQ ID NO:2 est biotinylée tandis que pour la PCR 2, c'est l'amorce forward de SEQ ID NO:1 qui est biotinylée. Il en est de même pour d'autres 10 amorces utilisées dans l'amplification du gène gyrA. Cela permet avantageusement de pouvoir récupérer l'un ou l'autre brin du produit d'amplification résultant de la réaction de PCR pour la réaction ultérieure de pyroséquençage. Ainsi, l'on peut amplifier, par la méthode selon 15 l'invention, deux fois la même portion de l'un des gènes et récupérer un des brins d'ADN sur un produit d'amplification et le second brin d'ADN sur le second produit d'amplification, chacun de ces brins étant ensuite pyroséquencé en utilisant avantageusement des sondes différentes pour initier la réaction.

20 Un tel mode de réalisation est également visible sur la figure 1, pour les PCR1 et 2 d'une part et pour les PCR 3 et 4 d'autre part. La composition des mélanges ainsi que les conditions de températures pour les différentes réactions de PCR sont 25 détaillées dans les tableaux ci-après. PCR 1 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR1 du gène gyrA est détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette réaction 30 de PCR sont les amorces de SEQ ID NO:1 (notée gyrA-110F dans le tableau) et SEQ ID NO:2 (notée gyrA-290Rbiot) -29- Volume pour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (Cone. Initiale) (Conc Finale) Tampon 10 X 5 1 X I 25 50 75 LINTP, 25 niNI 0.5 0.25 niNI ' ' - 5 7.5 NIgC1, 25 niNI 0.5 2 niNI''' 1 2.5 5 7.5 (i^r \-110F 25 i_i Ni 0.5 1 il Ni ' 2.5 5 7.5 G^ r \-290Rbiol 25 0M 0.5 1 !..[NI 1 2.5 5 7.5 7-anoI^nicrasc 5 U/0 0.5 2.5 tl , 2.5 5 7.5 HO .34.5 15(1 1S2.5 ; 562,5 ADN 5 VolumefinM: -1() I 225 450 675 LoReixtrtir 45p1 pe tube Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn 35 cydes : dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale : 72°C 5 mn PCR 2 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR2 du gène gyrA est détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette réaction de PCR sont les amorces de SEQ ID NO:1 (notée gyrA-110Fbiot) et 10 SEQ ID NO:2 (notée gyrA-290R) Volurneour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (Cone. Initiale) (Cone. Finale) Ltmpon I) X 5 1 X 2O _.,,,, ) 75 ,IN IV, 25 inN1 (1.5 ().115HIM , ,_ 7.5 NLCL l',IIIM p.:, 21111W -,:=, 5 7.5 Gm-A-HHH,ipL 5pM , 1pM P) 11u .1,p (1\ rA-29HR 25 p NI 1 1 i\1 6 7,5 15 215 Tagpolmik'r:_t,' 5 l lip 1 O.5 2.5, t I , , .,, 5 7.5 II:0 .--4.5 1:10 1S2'5 7 562.5 AD1\I 5 Vol ume final : f,o I so 25 451) 675 4Répertir 45p1 par tube Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn 35 cycles: dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale : 72°C 5 mn 15 - 30 - PCR 3 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR3 du gène gyrA est détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO:7 (notée gyrA-290Fbiot) et SEQ ID NO:8 (notée gyrA-536R). Volume pour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (CricAnitial (con, m. FamiNm mx 5 IN 20 -,5 50 75 ,IN IV,,, 25 IHNI 0.5 0./5 IHNI 5 7.5 NhICL 25 m:\.1 0.5, 2 inNI"' , 2.5 5 7.5 ( 6 r.A-2)01-Nim 25 p N1 1 1 p N1 4 IH If, (ivr:-\-2,6R 2:-', p:\il I 1 p N.1 4 1u h Tagoolmnene,e 5 11/p1 u.5 2.5, t I 110 34.5 150 182.5 375 562'5 .ADN 5 Vol ume fi nal : 5o i 12 450 675 LoRépetir 451.4l par tube Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn 35 cydes: dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale : 72°C 5 mn PCR 4 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR4 du gène gyrA est détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette PCR sont 15 les amorces de SEQ ID NO:7 (notée gyrA-290F) et SEQ ID NO:8 (notée gyrA-536Rbiot). Volume pour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (Cone. Initiale) (Cone. Finale) Tampon 10 X 5 1 X 2)) 25 50 75 cINTP 25 mN1 0.-, (1.25 mN1 ' ' s 5 7.5 Nt,.2C1, 25 niN1 0.5 2 nAl:: ' -, - 5 7.5 ( L \ -2`)OF 25 ilN1 I I 4 IO 15 2 I Gyr. \ -536Rbiol I 4 10 15 Tacipol^mcm5c 5 U/il I 0.5 ,.5 1,1 2 --2:-, S-, 7.5 H=0 .34.5 1-k) 177.5 365, 547.5 .NDN 5 VOI ume final : 5o 1SO / 450 675 Lolclepartir 45p! par tube Les conditions de températures pour les différentes phases 20 de la réaction de PCR sont précisées ci après :10 -31- dénaturation initiale : 94°C 3 mn 35 cydes: dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn donekmfinMe: 72°C 5 mn PCR 5 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR5 du gène gyrA est 5 détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO:13 (notée gyrA-536Fbiot) et SEQ ID NO:14 (notée gyrA-661R). Volume pour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (Cone. Initiale) (Conc. Finale) Tampon 10 X 5 I X 20 -'` :-)0 75 LINTP, 25 niN1 0.5 0.25 niN1 , 25 5 7.5 MgCI, 25 riLM 0.5 2 m\1: ' -) - 5 7.5 G\I-.\-5.36FIli 25 i.[N1 1 1 i.[N1 4 5 10 15 25 !..[ NI I 1 0 NI 4 7) I 0 15 Tanol^mcrasc 5 U/0 0.5 2.5 u ' 2.5 5 7.5 HM .34.5 1:-)0 1.S2,5 3 562.5 ADN D VdumefinM: 7)0 225 450 675 LoRéixtrtir 45p1 pe tube Les conditions de températures pour les différentes phases 10 de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale : 94°C 3 mn 35 cydes: dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale : 72°C 5 mn PCR 6 pour amplification gyrA La composition du mélange pour la PCR6 du gène gyrA est 15 détaillée ci-dessous. Les amorces utilisées pour cette PCR sont les amorces de SEQ ID NO:16 (notée GyrA-PPS 175F) et SEQ ID NO:17 (notée GyrA-PPS 332 Rbiot). -32- Volume pour :1 tube 4 tubes 5 tubes 10 tubes 15 tubes (Cone Initiale) (Cenc Finale) Tampon H) N :, IN iINTP, 25 IHNI 0.5 0.25 IHNI ' 2.:, IVIrLI. ."--, tnN1 (1.5 2 niNI' G \ r. \ -PPS I 75F 25 p NI I 1pM --, W 15 G -, 121-12PS 332 Rbiot 25 p NI ] 1pM 4 --, IO 15 Taqpol^Im2rJ,,2 _ l !_il 0 .-, 2. 2 2.5 ' Il TO 34.5 150 1152.5 475 5615 ADN 5 Vd ume fi nal : 50 1 SO 44,, 450 6 LoRépartir 45p1 par tube Les conditions de températures pour les différentes phases de la réaction de PCR sont précisées ci après : dénaturation initiale: 94°C 3 mn 35 cydes: dénaturation 94°C 0,30 mn hybridation 61°C 0,30 mn élongation 72°C 0,30 mn élongation finale: 72°C 5 mn Pyroséquençage des produits d'amplification obtenus pour le gène gyrA En ce qui concerne la réaction de pyroséquençage, celle-ci 10 a été réalisée grâce à un séquenceur PSQ96MA (Qiagen) et selon les indications du fabricant, en adaptant cependant les quantités de sondes en fonctions des cibles. Ainsi, ces quantités ont été multipliées par 2 par rapport aux recommandations du fabricant à l'exception de la sonde de SEQ ID 15 NO:5 (notée 67-73-So) pour laquelle les concentrations ont été multipliées par 4 par rapport aux recommandations du fabricant. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés et décrits précédemment qui peuvent présenter des variantes et modifications sans pour autant sortir du cadre de 20 l'invention.

Claims (20)

1. REVENDICATIONS1. Méthode pour la caractérisation des mutations chromosomiques de chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE 5 codant les topoisomérases bactériennes, ces mutations pouvant être responsables de la résistance des bactéries aux quinolones, dans laquelle : - on extrait l'ADN bactérien d'un échantillon ou d'une colonie ; 10 - on met en présence l'ADN bactérien extrait lors de l'étape précédente avec au moins un couple d'amorces spécifique à chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; - on amplifie une ou plusieurs portions de chacun des 15 gènes gyrA, gyrB, perC et perE, indépendamment les unes des autres, par une réaction de polymérisation en chaine (PCR), pour obtenir au moins un produit d'amplification pour chacun des gènes gyrA, gyrB, perC et perE ; 20 - on réalise une réaction de pyroséquençage de chacun des produits d'amplification des gènes gyrA, gyrB, perC et perE obtenus lors de l'étape précédente en utilisant au moins une sonde dégénérée spécifique à chacun desdits produits d'amplification pour initier 25 le pyroséquençage.
2. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une des amorces de chaque couple d'amorces, utilisée pour la réaction de polymérisation en chaine, est une amorce dégénérée comportant au moins un nucléotide dégénéré pouvant 30 être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite amorce.
3. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la sonde dégénérée, utilisée pour initier le pyroséquençage, comporte au moins un nucléotide-34- dégénéré pouvant être positionné indifféremment sur la séquence nucléotidique de ladite sonde.
4. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'une des amorces, de chacun 5 des couples d'amorces, est biotinylée.
5. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins deux réactions de polymérisation en chaine (PCR) indépendantes pour amplifier plusieurs portions de chacun des gènes gyrA, gyrB, 10 parC et parE en utilisant deux couples d'amorces différents.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les gènes gyrA, gyrB, parC et parE sont amplifiés à partir d'au moins un genre d'entérobactérie à Gram négatif choisi parmi le groupe 15 consistant en Escheri chia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Kiebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Morganella et Serratia.
7. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins six 20 PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrA, notées PCR1gyrA à PCR6 gyrA, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorces, défini comme suit : - PCR1gyrA et PCR2gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 ; 25 - PCR3gyrA et PCR4gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8 ; - PCR5gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:13 et SEQ ID NO:14 ; - PCR6gyrA avec les amorces présentant les SEQ ID NO:16 30 et SEQ ID NO:17.
8. 8. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO:16 et SEQ ID NO:17 permettent l'amplification d'au moins une portion de gyrA chez les entérobactéries appartenant aux genres 35 Proteus, Providencia, Morganella et Serratia.- 35 -
9. 9. Méthode selon la revendication 7 ou la revendication 8 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage : - le produit d'amplification de la PCR1gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4 ; - le produit d'amplification de la PCR2gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6 ; - le produit d'amplification de la PCR3gyrA est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 et SEQ ID NO:11; - le produit d'amplification de la PCR4gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:12 ; - le produit d'amplification de la PCR5gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:15; - le produit d'amplification de la PCR6gyrA est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:18.
10. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins deux PCR indépendantes pour amplifier le gène gyrB, notées PCR1gyrB et PCR2gyrB, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorces, défini comme suit : - PCR1gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO:19 et SEQ ID NO:20 ; - PCR2gyrB avec les amorces présentant les SEQ ID NO:28 et SEQ ID NO:29.
11. 11.Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO:28 et SEQ ID NO:29 permettent l'amplification d'au moins une portion de gyrB- 36 - chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella.
12. 12. Méthode selon la revendication 10 ou la revendication 11 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de 5 pyroséquençage : - le produit d'amplification de la PCR1gyrB est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, 10 SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:27 ; - le produit d'amplification de la PCR2gyrB est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:30.
13. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins trois 15 PCR indépendantes pour amplifier le gène perC, notées PCR1parC à PCR3parC, chacune desdites PCR étant effectuée à partir d'un couple d'amorce, défini comme suit : - PCR1parC et PCR2perC avec les amorces présentant les SEQ ID NO:31 et SEQ ID NO:32 ; 20 - PCR3parC avec les amorces présentant les SEQ ID NO:44 et SEQ ID NO:45.
14. 14. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO:44 et SEQ ID NO:45 permettent l'amplification d'au moins une 25 portion de perC chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella.
15. 15. Méthode selon la revendication 13 ou la revendication 14 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage, 30 - le produit d'amplification de la PCR1parC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 et SEQ ID NO:40 ;- 37 - - le produit d'amplification de la PCR2perC est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 et SEQ ID NO:43 ; - le produit d'amplification de la PCR3parC est hybridé avec au moins une sonde dégénérée de SEQ ID NO:46.
16. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on effectue au moins quatre PCR indépendantes, notées PCR1parE à PCR4parE pour amplifier le 10 gène parE, chacune desdites PCR étant effectuées à partir d'un couple d'amorce, défini comme suit : - PCR1parE et PCR2parE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:47 et SEQ ID NO:48 ; - PCR3parE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:64 15 et SEQ ID NO:65 ; - PCR4perE avec les amorces présentant les SEQ ID NO:71 et SEQ ID NO:72.
17. 17.Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que les amorces présentant les SEQ ID NO:71 et SEQ ID 20 NO:72 permettent l'amplification d'au moins une portion de parE chez les entérobactéries appartenant aux genres Proteus, Providencia et Morganella.
18. 18.Méthode selon la revendication 16 ou 17 caractérisée en ce que, pour initier la réaction de pyroséquençage : 25 - le produit d'amplification de la PCR1parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54 ; 30 - le produit d'amplification de la PCR2perE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62 et SEQ ID 35 NO:63 ;- 38 - - le produit d'amplification de la PCR3parE est hybridé avec au moins une sonde choisie dans le groupe comportant les sondes dégénérées de SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 et SEQ ID NO:70 ; - le produit d'amplification de la PCR4parE est hybridé avec au moins une sonde dégénérée apte à permettre l'initiation du pyroséquençage dudit produit d'amplification.
19. 19. Amorce oligonucléotidique pour l'amplification de l'un des gènes gyrA, gyrB, perC et perE, ladite amorce étant choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:71 et SEQ ID NO:72.
20. 20. Sonde oligonucléotidique dégénérée pour le pyroséquençage de l'un des gènes gyrA, gyrB, perC et perE, ladite sonde étant choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID NO:3 à 6, SEQ ID NO:9 à 12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 à 27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33 à 43, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:49 à 63 et SEQ ID NO:66 à 70.