FR2659086A1 - Fragments nucleotidiques caracteristiques de fragments d'adn de mycobacteries. leur utilisation comme amorce pour la detection d'une infection due a des mycobacteries. - Google Patents
Fragments nucleotidiques caracteristiques de fragments d'adn de mycobacteries. leur utilisation comme amorce pour la detection d'une infection due a des mycobacteries. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne des fragments nucléotidiques caractéristiques de l'ADN de mycobactéries du groupe de la tuberculose, caractérisés en ce qu'ils répondent à l'un des enchaînements suivants: (CF DESSIN DANS BOPI) L'invention se rapporte également à l'utilisation de ces fragments nucléotidiques, dans les tests de diagnostic pour la détection de mycobactéries.
Description
FRAGMENTS NUCLEOTIDIQUES CARACTERISTIQUES DE FRAGMENTS
D'ADN DE MYCOBACTERIES. LEUR UTILISATION CONNE AMORCES
POUR LA DETECTION D'UNE INFECTION DUE À DES
MYCOBACTERIES
La présente demande concerne des fragments nucléotidiques caractéristiques de fragments d'ADN de mycobactéries et leur utilisation comme amorces pour la détection d'une infection due à des mycobactéries.
D'ADN DE MYCOBACTERIES. LEUR UTILISATION CONNE AMORCES
POUR LA DETECTION D'UNE INFECTION DUE À DES
MYCOBACTERIES
La présente demande concerne des fragments nucléotidiques caractéristiques de fragments d'ADN de mycobactéries et leur utilisation comme amorces pour la détection d'une infection due à des mycobactéries.
Les mycobactéries comptent environ 54 espèces différentes parmi lesquelles 10 environ sont pathogènes ou opportunistes pour l'homme ou l'animal.
Ces bactéries interviennent dans des pathologies telles que la tuberculose ou encore dans des infections liées au SIDA.
De nombreux problèmes sont posés en ce qui concerne le diagnostic d'infections dues à ces mycobactéries.
En particulier, certaines difficultés résultent du fait que les quantités d'ADN de mycobactéries accessibles pour la détection d'une infection sont souvent très faibles. De plus, les moyens habituellement mis en oeuvre nécessitent des étapes de culture et sont par conséquent souvent très longs pour obtenir le résultat du diagnostic.
Des travaux antérieurs sur les mycobactéries ont conduit à constater qu'elles comportent un gène commun codant pour une protéine de 65 kD décrite dans Molec.
Microbiol., (1989), 3, 843-849.
Des moyens de diagnostic visant à détecter cet antigène de 65 kD et par conséquent la présence de mycobactéries le contenant ont été proposés: ces moyens font appel à des fragments nucléotidiques désignés par TB1 et TB2, utilisables comme amorces d'amplification J appliqués dans des techniques d'amplification d'acide nucléique, ces fragments correspondant aux séquences suivantes
TB1 : 5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC 3'
TB2 : 5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT 3'
Dans la présente invention, les inventeurs se sont intéressés plus particulièrement à Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) responsable de la tuberculose, ainsi qu'aux bactéries appartenant au groupe de celles ae la tuberculose et qui comprennent
M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti.
TB1 : 5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC 3'
TB2 : 5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT 3'
Dans la présente invention, les inventeurs se sont intéressés plus particulièrement à Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) responsable de la tuberculose, ainsi qu'aux bactéries appartenant au groupe de celles ae la tuberculose et qui comprennent
M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti.
En particulier, la présente invention a pour objet la mise au point de moyens pour le diagnostic d'infections dues à des bactéries du genre
Mycobacterium, plus rapides, plus spécifiques et plus efficaces que les moyens disponibles jusqu'à présent.
Mycobacterium, plus rapides, plus spécifiques et plus efficaces que les moyens disponibles jusqu'à présent.
Dans ce but, les inventeurs se sont intéressés à une séquence de mycobactéries en particulier présente chez les mycobactéries du groupe dela tuberculose.
Cette séquence peut apparaître sous forme d'une séquence nucléotidique répétée dans le génome de mycobactéries, du groupe du bacille de la tuberculose, ladite séquence hybridant, notamment très fortement avec M. tuberculosis.
Cette séquence de mycobactéries s'est avérée particulièrement intéressante pour les inventeurs, dans le cadre de la recherche des fragments nucléotidiques pouvant présenter des propriétés intéressantes dans le cadre de nouveaux réactifs pour le diagnostic d'infections dues à ces mycobactéries.
Cette séquence répond à l'enchaînement nucléotidique suivant
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAAGCATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTCA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTCCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 200 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCCATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCG
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTCGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 640 acacagctga CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTG GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCGATGCAG CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAG
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAG
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGG CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
A partir de cette séquence nucléotidique, on a déjà décrit des oligonucléotides susceptibles d'être utilisés soit comme sondes d'hybridation pour détecter la présence d'ADN de mycobactéries, soit comme amorces permettant la synthèse amplifiée de fragments d'ADN présents dans un échantillon biologique et susceptibles de révéler une infection due à une mycobactérie.
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAAGCATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTCA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTCCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 200 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCCATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCG
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTCGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 640 acacagctga CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTG GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCGATGCAG CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAG
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAG
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGG CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
A partir de cette séquence nucléotidique, on a déjà décrit des oligonucléotides susceptibles d'être utilisés soit comme sondes d'hybridation pour détecter la présence d'ADN de mycobactéries, soit comme amorces permettant la synthèse amplifiée de fragments d'ADN présents dans un échantillon biologique et susceptibles de révéler une infection due à une mycobactérie.
Ces fragments sont d'une part, un oligonucléotide désigné par ISTB1 et qui correspond à la séquence nucléotidique suivante 5' ATGTCAGGTGGTTCATCGAG 3', et d'autre part, un oligonucléotidde désigné par
ISTB2, correspondant à la séquence nucléotidique suivante 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3'
Les inventeurs de la présente demande, ont ont maintenant sélectionné d'autres fragments nucléotidiques intéressants, différents des fragments
ISTB1 et ISTB2 précédents. Ces nouveaux fragments nucléotidiques peuvent présenter un intérêt tout à fait remarquable, pour la mise au point de moyens de diagnostic permettant la détection de certaines mycobactéries et plus particulièrement des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose (M. tuberculosis).
ISTB2, correspondant à la séquence nucléotidique suivante 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3'
Les inventeurs de la présente demande, ont ont maintenant sélectionné d'autres fragments nucléotidiques intéressants, différents des fragments
ISTB1 et ISTB2 précédents. Ces nouveaux fragments nucléotidiques peuvent présenter un intérêt tout à fait remarquable, pour la mise au point de moyens de diagnostic permettant la détection de certaines mycobactéries et plus particulièrement des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose (M. tuberculosis).
Certains des fragments de l'invention peuvent s'avérer particulièrement avantageux à cause de leur spécificité très précise vis-à-vis des mycobactéries du groupe M. tuberculosis.
L'invention concerne à cet égard des fragments nucléotidiques particuliers, spécifiques de la séquence d'ADN de mycobactérie décrite ci-dessus ou d'une séquence nucléotodique ayant une homologie d'au moins 85 % avec cette séquence, elle-même présente de façon sélective chez certaines mycobactéries, ces fragments étant susceptibles d'être utilises pour la préparation d'un réactif de diagnostic.
L'invention concerne également un kit pour le diagnostic d'une infection due à une mycobactérie, et en particulier à une mycobactérie du groupe de la tuberculose, ainsi qu'un procédé pour réaliser ce diagnostic in vitro.
L'invention se rapporte également à des sondes susceptibles d'être mises en oeuvre pour la détection de la présence d'acide nucléique caractéristique de mycobactéries, de préférence pour le diagnostic de la présence de bactéries du groupe des mycobactéries de la tuberculose dans un échantillon biologique.
Les fragments nucléotidiques selon l'invention, caractéristiques de 1'ADN de mycobactéries, sont des fragments spécifiques de la séquence d'ADN de mycobactéries précédemment identifiée, et sont caractérisés en ce qu'ils répondent à l'un des enchaînements nucléotidiques suivants
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 5'
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3'
L'invention vise aussi des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotide(s) dans une proportion d'environ 15% par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de mycobactéries, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés.
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 5'
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3'
L'invention vise aussi des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotide(s) dans une proportion d'environ 15% par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de mycobactéries, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés.
Certains de ces fragments ont l'avantage tout à fait remarquable de pouvoir être utilisés en tant qu'amorces permettant l'amplification de fragments d'ADN de la séquence identifiée dans les pages précédentes, des mycobactéries notamment du groue-du bacille de la tuberculose.
Ces amorces pour l'amplification de fragments d'ADN de mycobactéries, notamment pour l'amplification de fragments de la séquence précédemment décrite de Mvcobactérium tuberculosis, sont caractérisés en ce qu'elles correspondent à des fragments nucléotidiques définis ci-dessus, choisis parmi le groupe suivant ou parmi les fragments nucléotidiques complémentaires des suivants, ou encore des fragments modifiés mais néanmoins fonctionnels s'agissant de leur capacité d'hybridation avec ledit fragment d'ADN de mycobactéries en vue de son amplification
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
De façon tout à fait avantageuse, et dans le cadre de leur application à l'amplification de fragments d'ADN, ces amorces sont prises en combinaison deux à deux, de façon à hybrider dans des conditions déterminées avec les extrémités 5' et 3' respectives du fragment choisi d'ADN à amplifier.
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
De façon tout à fait avantageuse, et dans le cadre de leur application à l'amplification de fragments d'ADN, ces amorces sont prises en combinaison deux à deux, de façon à hybrider dans des conditions déterminées avec les extrémités 5' et 3' respectives du fragment choisi d'ADN à amplifier.
Différentes combinaisons de ces armoces permettent d'amplifier des fragments d'ADN de taille inférieure à 350 paires de bases, en particulier inférieure à 300 paires de base. Ceci est particulièrement intéressant puisque 1 'amplification est d'autant meilleure que le fragment amplifié est plus court.
Selon un mode de réalisation préféré de réalisation de l'invention, les amorces pour l'amplification de fragments d'ADN répondant aux définitions précédentes, sont encore caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les couples d'amorces suivants
ISTB2 et ISTB4 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB2 et ISTB5 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB2 et ISTB 7 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3 et 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
ISTB5 et ISTB6 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3' et 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB6 et ISTB7 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3' 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
Une paire d'amorces particulièrement avantageux pour réaliser l'amplification voulue est la paire d'amorces constituée par ISTB2 et ISTB7, compte tenu de sa spécificité pour les mycobactéries du groupe de la tuberculose.
ISTB2 et ISTB4 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB2 et ISTB5 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB2 et ISTB 7 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3 et 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
ISTB5 et ISTB6 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3' et 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB6 et ISTB7 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3' 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
Une paire d'amorces particulièrement avantageux pour réaliser l'amplification voulue est la paire d'amorces constituée par ISTB2 et ISTB7, compte tenu de sa spécificité pour les mycobactéries du groupe de la tuberculose.
Comme le montre la figure 1, les couples d'amorces précisés ci-dessus dirigent l'amplification de fragments ayant respectivement les longueurs suivantes
ISTB1 + ISTB3 dirigent l'amplification d'un fragment
de 260 pb,
ISTB2 + ISTB4 dirigent l'amplification d'un fragment
de 198 pb,
ISTB2 + ISTB5 dirigent l'amplification d'un fragment
de 248 pb,
ISTB5 + ISTB6 dirigent l'amplification d'un fragment
de 189 PB,
ISTB6 + ISTB7 dirigent l'amplification d'un fragment
de 260 pb.
ISTB1 + ISTB3 dirigent l'amplification d'un fragment
de 260 pb,
ISTB2 + ISTB4 dirigent l'amplification d'un fragment
de 198 pb,
ISTB2 + ISTB5 dirigent l'amplification d'un fragment
de 248 pb,
ISTB5 + ISTB6 dirigent l'amplification d'un fragment
de 189 PB,
ISTB6 + ISTB7 dirigent l'amplification d'un fragment
de 260 pb.
ISTB2 et ISTB7 dirigent l'amplification d'un fragment de 325 pb.
Les tests réalisés pour évaluer l'efficacité d'amplification obtenue à partir des couples (paires) d'amorces précédemment décrits, montrent que cette efficacité est tout à fait satisfaisante pour les cinq derniers couples d'amorces définis.
Ceci est d'autant plus vrai que les amplifications ont été réalisées sur des dilutions contenant lOng, lOOpg et lOOfg d'ADN purifiée de M.
tuberculosis, ce qui montre que l'amplification peut être réalisée à partir de quantités d'ADN extrêmement faibles.
Un autre avantage des amorces proposées dans la présente invention, réside dans la spécificité des différents couples proposés.
En particulier, certains couples d'amorces permettent de distinguer entre une infection due à des mycobactéries du groupe de la tuberculose ou une infection due à des bactéries atypiques. Ainsi un test mettant en oeuvre différents couples d'amorces a été réalisé sur 1'ADN purifié de 19 espèces mycobactériennes comprenant : M. t-uberculosis, M.
africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti (ces 5 espèces forment le groupe de la tuberculose), M.
gordonae, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum, M.
paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. simple, M.
szulqai, M. terrae, M. xenopi, M. asiaticum, M. avium,
M. chelonae, et M. flavescens.
M. chelonae, et M. flavescens.
Par exemple, le couple ISTB2/ISTB7, et le couple
ISTB1/ISTB2, détectent uniquement les mycobactéries du groupe de la tuberculose, et non les mycobactéries atypiques.
ISTB1/ISTB2, détectent uniquement les mycobactéries du groupe de la tuberculose, et non les mycobactéries atypiques.
L'invention vise aussi les amorces ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont marquées par un marqueur chimique, physique ou enzymatique et/ou en ce qu'elles sont fixées à un support solide,notamment un support particulaire ou membranaire par exempledes billes magnétiques.
L'invention concerne également des sondes pour la détection de fragments d'ADN amplifiés de mycobactéries, caractérisées en ce qu'il s'agit de fragments nucléotidiques spécifiques de la séquence décrite plus haut dont on cherche à détecter des fragments, choisis parmi les fragments nucléotidiques appartenant au groupe de ceux qui ont été présentés précédemment, capables d'hybrider avec ledit fragment d'ADN amplifié, lesdits fragments étant soit marqués à leur extrémité 5' et/ou 3' par une substance que l'on peut détecter, soit fixés à un support physique.
A titre de marqueurs, on peut citer les isotopes radioactifs, les enzymes ou marqueurs chimiques appropriés, des fluorochromes, des haptènes, des anticorps, des analogues de bases ou encore un marqueur physique.
La fixation à un support peut être faite sur un support solide particulaire ou membranaire, par exemple des billes magnétiques.
De tels fragments nucléotidiques, doivent être capables d'hybrider avec le fragment d'ADN amplifié, et lorsqu'ils sont marqués par une susbtance que l'on peut détecter, ils doivent permettre la mise en évidence de la présence d'une infection par les mycobactéries et en particulier celles du groupe de la tuberculose.
Des sondes particulièrement préférées pour la mise en oeuvre de l'invention sont choisies parmi les fragments nucléotidiques suivants
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3'
Les sondes IS-2 et IS-4 ont une taille de 30 bases et elles sont complémentaires des fragments amplifiés à l'aide des paires d'amorces ISTB2/ISTB4,
ISTB2/ISTB5, ISTB5/ISTB6, ISTB6/ISTB7 et ISTB2/ISTB7.
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3'
Les sondes IS-2 et IS-4 ont une taille de 30 bases et elles sont complémentaires des fragments amplifiés à l'aide des paires d'amorces ISTB2/ISTB4,
ISTB2/ISTB5, ISTB5/ISTB6, ISTB6/ISTB7 et ISTB2/ISTB7.
La sonde IS-6 est également complémentaire du fragment amplifié àl'aide de la paire d'amorces
ISTB2/ISTB4.
ISTB2/ISTB4.
Ces sondes permettent avantageusement la détection de tous les membres du groupe des mycobactéries de la tuberculose. Elles présentent également l'avantage pour les quatre dernières paires d'amorces citées, de pouvoir être utilisées simultanément, l'une servant de sonde de capture, et l'autre de sonde de marquage.
Elles permettent donc la réalisation d'une détection directe sur un échantillon biologique en milieu liquide.
Lorsque les sondes sont utilisées comme sondes de marquage, le marqueur peut être choisi parmi le groupe comprenant les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes ou les marqueurs chimiques ou chimioluminescents appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le brevet français 2 518 755 ou dans la demande de brevet européen 158758, ou encore des marqueurs physiques.
Des marqueurs préférés sont par exemple le phosphore radioactif (32p) incorporé à l'extrémité 5'.
Lorsque les sondes sont utilisées pour la capture, elles sont avantageusement fixées sur un support solide tel que décrit plus haut.
Entre également dans le cadre de l'invention, un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par des mycobactéries, dans un échantillon biologique déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une paire d'amorces nucléotidiques correspondant aux définitions données ci-dessus, capable d'hybrider aux extrémités 5' et 3' d'un fragment d'ADN spécifique de mycobactéries, - des réactifs nécessaires à l'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon traité, - des réactifs pour effectuer la polymérisation dudit fragment drADN, à partir des amorces nucléotidiques, notamment des enzymes de polymérisation, en quantité suffisante pour réaliser l'amplification du fragment d-'ADN que l'on souhaite amplifier, - au moins un fragment nucléotidique pouvant être utilisé comme sonde et capable d'hybrider dans des conditions déterminées avec le fragment d'ADN amplifié, - un contrôle interne de la réaction d'amplification par exemple constitué par un fragment d'ADN éventuellement porté par un plasmide, ledit fragment pouvant aisément être détecté par hybridation, par exemple en ce qu'il contient un gène de résistance à un antibiotique, ledit fragment étant en outre muni à ces deux extrémités d'au moins une amorce d'amplification, ces amorces étant de préférence choisies parmi les amorces de l'invention, - une sonde capable d'hybrider avec le fragment d'ADN contenu dans le contrôle interne, - le cas échéant, une réverse transcriptase pour obtenir de l'ADNc à partir de 1'ARN éventuellement présent dans l'échantillon testé, - le cas échéant, des moyens pour révéler l'hybridation.
A titre d'échantillon biologique, on peut utiliser tout échantillon de fluide biologique ou de tissu biologique comme par exemple le sang, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, le liquide pleural, l'urine, les crachats, les échantillons obtenus par tubage, aspiration bronchique, ponction ou biopsie du foie, biopsie ganglionnaire etc...
Le kit de diagnostic selon l'invention a pour avantage de pouvoir être utilisé directement surdes échantillons cliniques et permet d'obtenir des résultats en un temps très rapide.
La présence d'un contrôle interne ajouté l'échantillon permet de détecter la présence de "faux négatifs" parmi les échantillons. En effet, lorsque la sonde spécifique du contrôle interne ne détecte pas un produit d'amplification, on est vraisemblablement en présence d'un échantillon contenant un inhibiteur de la Tag polymérase, inhibiteur qui gène l'amplification d'ADN ou d'ADNc de mycobactéries. Dans ce cas, différentes dilutions de l'échantillon testé peuvent permettre de mettre en évidence la présence d'acide nucléique de mycobactéries.
Lorsque le témoin interne présente une réaction positive, une réaction négative au niveau de l'échantillon testé permet de déduire qu'il y a bien absence de mycobactéries.
On note que les amorces incorporées au contrôle interne, ne sont pas nécessairement celles de l'invention. Cependant, le choix d'autres amorces peut entraîner une diminution de sensibilité
Selon un mode de réalisation préféré du kit de diagnostic de l'invention, les amorces utilisées sont
ISTB2 et ISTB7 et la sonde de détection du produit éventuel d'amplification est IS-2 éventuellement combinée avec IS-6.
Selon un mode de réalisation préféré du kit de diagnostic de l'invention, les amorces utilisées sont
ISTB2 et ISTB7 et la sonde de détection du produit éventuel d'amplification est IS-2 éventuellement combinée avec IS-6.
On peut aussi avantageusement utiliser plusieurs sondes de détection et, notamment ajouter IS-6 à IS-2.
L'invention se rapporte aussi à un procédé pour le diagnostic in vitro d'une infection par des mycobactéries, dans un échantillon biologique déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) mise en contact de l'acide nucléique des mycobactéries éventuellement présent, de l'échantillon biologique testé, dans des conditions permettant l'accessibilité sous forme d'ADN simple brin, avec-au moins un couple d'amorces nucléotidiqes selon l'invention, lesdites amorces pouvant hybrider avec l'acide nucléique de mycobactéries s'il est présent, et initier la synthèse du produit d'élongation desdites amorces, chaque brin de fragment d'ADN de mycobactéries servant de matrice lorsqu'il est apparié avec les amorces; b) séparation des brins d'ADN synthétisés, de leur matrice; c) répétition de la synthèse de produit d'élongation, à partir de chaque brin d'ADN présent à l'issue de l'étape b) et susceptible d'hybrider avec les amorces, jusqu'à l'obtention d'une amplification de l'ADN recherché, suffisante pour être détectée, d) mise en contact du produit de l'étape c) avec une sonde nucléotidique dans des conditions permettant de détecter la présence du fragment d'ADN amplifié recherché; e) détection des produits de l'hybridation éventuellement formés.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé pour le diagnostic in vitro ci-dessus défini, la mise en contact de l'échantillon testé est précédée d'une étape de traitement de l'échantillon de façon à en extraire l'acide nucléique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé comporte une étape préalable à la mise en contact avec les amorces consistant en un traitement de l'acide nucléique de l'échantillon avec une réverse transcriptase, pour obtenir la synthèse d'ADNc à partir de l'ARN éventuellement présent dans l'échantillon testé.
Les techniques d'amplifications utilisables comportent par exemple, la technique PCR (Polymérase
Chain Reaction) décrite dans les demandes de brevet européen de CETUS (n 200 363, 201 184, et 229 701), ou encore la technique de "Qp replicase" décrite dans
Biotechnology (vol. 6, octobre 1988).
Chain Reaction) décrite dans les demandes de brevet européen de CETUS (n 200 363, 201 184, et 229 701), ou encore la technique de "Qp replicase" décrite dans
Biotechnology (vol. 6, octobre 1988).
L'invention vise aussi la production des fragments de nucléotides selon l'invention, qu'ils soient issus de la séquence IS6110 telle que purifiée à partir des mycobactéries de la tuberculose, ou qu'ils soient synthétisés par voie chimique.
A titre d'exemple, on peut citer pour la synthèse de tels fragments d'acides nucléiques, la méthode au phosphotriester, telle que décrite par NARANG, S.A. et al dans Meth. of Enzymol., 68, 90 (1979). Une autre méthode adaptée pour la préparation de fragments de nucléotides est la méthode au phosphodiester telle que décrite par BROWN, E.L. et al, dans Meth. Enzymol., 68, 109 (1979).
Cette préparation peut également être effectuée par un processus automatisé, par exemple faisant intervenir les diethylphosphoramidites en tant que constituants de départ, et dans ce cas, la synthèse peut être réalisée suivant la description de BEAUCAGE et al, Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859-1862.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent
La fiqure 1 représente la situation des différentes amorces et sondes dans la séquence IS6110.
La fiqure 1 représente la situation des différentes amorces et sondes dans la séquence IS6110.
La figure 2a représente la spécificité d'amplification du couple ISTB2/ISTB7 : 1'ARN purifié de 19 especes mycobactériennes a été amplifié à 11 aide de deux couples d'amorces - le couple TB1/TB2 permettant l'amplification d'un fragment (383 pb) du gène codant pour la protéine de 65 kD des mycobactéries, - le couple ISTB2/ISTB7;
les mycobactéries du groupe de la tuberuclose présentent une amplification positive avec les deux couples alors que les mycobactéries atypiques ne sont détectées que par le couple TB1/TB2.
les mycobactéries du groupe de la tuberuclose présentent une amplification positive avec les deux couples alors que les mycobactéries atypiques ne sont détectées que par le couple TB1/TB2.
La figure 2b. représente l'hybridation de la sonde IS-2 sur le fragment amplifié à partir de
ISTB2/ISTB7.
ISTB2/ISTB7.
La figure 3 représente la sensibilité de la détection par amplificaiton à l'aide du couple
ISTB2/ISTB7 et l'hybridation avec la sonde IS-2.
ISTB2/ISTB7 et l'hybridation avec la sonde IS-2.
On peut détecter jusqu'à 100 fg d'ADN de M.
tuberculosis, ce qui correspond à environ 3 bactéries.
La figure 4 représente la détection de
M.tuberculosis dans les échantillons cliniques
1. tubage (positif en culture),
2. aspiration bronchique (positif à l'examen microscopique et en culture),
3. tubage (positif à l'examen microscopique et en culture),
4. tubage (négatif en culture),
5. liquide céphalorachidien (positif en culture),
6. tubage (positif en culture).
M.tuberculosis dans les échantillons cliniques
1. tubage (positif en culture),
2. aspiration bronchique (positif à l'examen microscopique et en culture),
3. tubage (positif à l'examen microscopique et en culture),
4. tubage (négatif en culture),
5. liquide céphalorachidien (positif en culture),
6. tubage (positif en culture).
Exemple 1
Test de la détection de B.tuberculosis dans les échantillons cliniques.
Test de la détection de B.tuberculosis dans les échantillons cliniques.
Des échantillons cliniques d'origines variées ont été traités suivant les conditions décrites par ABN et al., (THE LANCET, (1989), ii:1069-1071). Une fraction de la préparation d'ADN obtenue a été amplifiée à l'aide des amorces TB1/TB2 spécifique de l'antigène 65 kD et des amorces ISTB5/ISTB6 spécifiques de la séquence IS6110. La détection a été réalisée par hybridation avec la sonde IS-4. Les résultats obtenus concordent avec les données cliniques - et microbiologiques, ainsi qu'avec les résultats obtenus après hybridation avec une sonde spécifique du gène 65 kD de M. tuberculosis.
Conditions expérimentales a) Amplifications
Les réactions d'amplifications sont réalisées d'après la méthode de Saiki et al. (SCIENCE, (1988), 239:787-491) en utilisant le mélange réactionnel suivant
- 50 mM KC1
- 10 mM Tris-HCl pH 8.3
- 1,5 mM MgCl2
- 125 M désoxyribunucléotides
- 12,5 pmoles oligonucléotides amorces
- 50 ng ADN.
Les réactions d'amplifications sont réalisées d'après la méthode de Saiki et al. (SCIENCE, (1988), 239:787-491) en utilisant le mélange réactionnel suivant
- 50 mM KC1
- 10 mM Tris-HCl pH 8.3
- 1,5 mM MgCl2
- 125 M désoxyribunucléotides
- 12,5 pmoles oligonucléotides amorces
- 50 ng ADN.
dans un volume final de 100 Al.
Les cycles de températures utilisées sont les suivants
3 mn à 95 C,
2 mn à 95"C,
2 mn à 60"C, et
2 mn à 72 C pendant 40 cycles, suivis de 5 mn à 72"C.
3 mn à 95 C,
2 mn à 95"C,
2 mn à 60"C, et
2 mn à 72 C pendant 40 cycles, suivis de 5 mn à 72"C.
b) Marquage de sondes
Les sondes ont été marquées par incorporation d'un phosphore radioactif (32p) à leur extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase : 25 p moles d'olignonucléotide sonde ont été incubées en présence de Tris-HCl pH 7,5 (50 mM), MgC12 (10 mM), dithiotritol (5 mM) ; 2,5 p1 de (c32p) - ATP (activité spécifique > 3000 Ci/mmole) et 2 unités de polynucléotide kinase.
Les sondes ont été marquées par incorporation d'un phosphore radioactif (32p) à leur extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase : 25 p moles d'olignonucléotide sonde ont été incubées en présence de Tris-HCl pH 7,5 (50 mM), MgC12 (10 mM), dithiotritol (5 mM) ; 2,5 p1 de (c32p) - ATP (activité spécifique > 3000 Ci/mmole) et 2 unités de polynucléotide kinase.
c) Hybridations
Les échantillons amplifiés ont été déposés sur un gel d'agarose et transférés sur une membrane de nylon suivant les techniques classiques (Maniatis). Les hybridations ont été réalisées à l'aide du tampon d'Hybridation rapide Amersham comme suit : préhybridation 15 mn à 65 C, hybridation 2 heures à 65 en présence de 106 cpm de sonde, lavages 2 fois 10 mn en 2 SSC/O,1 % SDS à 20 C et 1 fois 15 mn en 1 SSC/0,1 % SDS à 65"C.
Les échantillons amplifiés ont été déposés sur un gel d'agarose et transférés sur une membrane de nylon suivant les techniques classiques (Maniatis). Les hybridations ont été réalisées à l'aide du tampon d'Hybridation rapide Amersham comme suit : préhybridation 15 mn à 65 C, hybridation 2 heures à 65 en présence de 106 cpm de sonde, lavages 2 fois 10 mn en 2 SSC/O,1 % SDS à 20 C et 1 fois 15 mn en 1 SSC/0,1 % SDS à 65"C.
d) Préparation d'ADN de mycobactéries
Un ml de culture a été centrifugé 5 mn à 15000 tr/mn, le culot resuspendu dans 200 1 d'eau stérile et soumis à un traitement aux ultra-sons dans un bain sonicant pendant 10 mn. La préparation obtenue a été extraite deux fois par un mélange phénol/chloroforme puis précipitée à l'éthanol. Les culots d'ADN obtenus ont été resuspendus dans 50 1 d'eau stérile.
Un ml de culture a été centrifugé 5 mn à 15000 tr/mn, le culot resuspendu dans 200 1 d'eau stérile et soumis à un traitement aux ultra-sons dans un bain sonicant pendant 10 mn. La préparation obtenue a été extraite deux fois par un mélange phénol/chloroforme puis précipitée à l'éthanol. Les culots d'ADN obtenus ont été resuspendus dans 50 1 d'eau stérile.
e) Traitement des échantillons
Les échantillons ne sont pas décontaminés avant le traitement. Une aliquote de 200 p1 est placée dans une tube Eppendorf, centrifugée et le culot est resuspendu dans 200 ssl de solution de lyse (Na OH O 1
N, NaCl 2 M, SDS 0,5 %). Après 15 mn d'incubation à 95"C, on procède à deux extraction phénol/chloroforme et une précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN est resuspendu dans 50 iil d'eau stérile. Le volume utilisé pour l'amplification est de 5 pl.
Les échantillons ne sont pas décontaminés avant le traitement. Une aliquote de 200 p1 est placée dans une tube Eppendorf, centrifugée et le culot est resuspendu dans 200 ssl de solution de lyse (Na OH O 1
N, NaCl 2 M, SDS 0,5 %). Après 15 mn d'incubation à 95"C, on procède à deux extraction phénol/chloroforme et une précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN est resuspendu dans 50 iil d'eau stérile. Le volume utilisé pour l'amplification est de 5 pl.
Ce procédé de diagnostic peut être appliqué à des quantités d'ADN faibles, et il s'avère donc intéressant pour la réalisation de diagnostic précoce et rapide.
f) evaluation sur échantillons cliniques (tableau I)
41 échantillons cliniques ont été analysés à l'aide des amorces ISTB2/ISTB7 et de la sonde IS-2.
41 échantillons cliniques ont été analysés à l'aide des amorces ISTB2/ISTB7 et de la sonde IS-2.
Les mêmes échantillons ont été testés en parallèle par les techniques classiques (examen direct et culture) - 16 échantillons positifs en culture ont été trouvés positifs par amplification, - 18 échantillons négatifs en culture ont été trouvés négatifs par amplification, - 1 échantillon faiblement positif en culture a été trouvé négatif par amplification ; nous avons montré, à l'aide d'un contrôle interne d'amplification (amplification simultanée d'un plasmide ajouté au mélange d'amplification), que ce échantillon contient des inhibiteurs de la réaction d'amplification.
Contrairement aux résultats obtenus par d'autres échantillons qui contenaient également des inhibiteurs, des dilutions successives de cet échantillon sont demeurées négatives, - 6 échantillons négatifs en culture ont été trouvés positifs par amplification. Ces résultats ne correspondent pas à des faux positifs car les échantillons provenaient de patients ayant effectivement une tuberculose, le diagnostic ayant été fait sur l'existence d'autres prélèvements positifs en culture ou sur des analyses histobiologiques. Ces résultats montrent la bonne sensibilité du test décrit dans la présente demande, par rapport aux techniques classiques.
TABLEAU I
Comparaison des résultats d'amplification d'ADN avec
les données des procédures standard.
Comparaison des résultats d'amplification d'ADN avec
les données des procédures standard.
Résultats Résultats
PCR des
procédures
standard
Examen direct Examen direct Examen direct
positif négatif négatif
culture posi- Culture posi- Culture néga
tive tive tive
Positif pour M.tuberculosis :
Sérum 1 0 0
Expectoration 2 0 0
Tubage 10 1 0
Liquide céphalorachidien 0 2 0
Cysiotomie o 0 3
Liquide pleural 0 0 2 biopsie du foie 0 0 1
Négatif pour
M. tuberculosis
Tubage 0 1 15
Liquide céphalorachidien 0 0 2
Biopsie ganglionaire 0 0 1
Examen direct : Examen microscopique après coloration de Ziehl-Neelssen
Culture : culture sur milieu solide de Loenenstein
Jensen.
PCR des
procédures
standard
Examen direct Examen direct Examen direct
positif négatif négatif
culture posi- Culture posi- Culture néga
tive tive tive
Positif pour M.tuberculosis :
Sérum 1 0 0
Expectoration 2 0 0
Tubage 10 1 0
Liquide céphalorachidien 0 2 0
Cysiotomie o 0 3
Liquide pleural 0 0 2 biopsie du foie 0 0 1
Négatif pour
M. tuberculosis
Tubage 0 1 15
Liquide céphalorachidien 0 0 2
Biopsie ganglionaire 0 0 1
Examen direct : Examen microscopique après coloration de Ziehl-Neelssen
Culture : culture sur milieu solide de Loenenstein
Jensen.
Claims (12)
1. Fragments nucléotidiques caractéristiques de la séquence d'ADN de mycobactéries du genre mycobactérienne , caractérisés en ce qu'ils répondent à l'un des enchaînements nucléotidiques suivants
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3' ou en ce qu'il s'agit des fragments complémentaires des précédents ou de fragments modifiés par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotide(s) dans une proportion d'environ 15% par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou par modification de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de mycobactéries, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés.
2. Amorces pour l'amplification de fragments d'ADN de mycobactéries, notamment pour l'amplification de fragments d'une séquence de Mycobacterium tuberculosis, caractérisées en ce qu'elles correspondent à des fragments nucléotidiques selon la revendication 1, choisis parmi les suivants ou parmi leurs fragments nucléotidiques complémentaires, ou encore à des fragments modifiés, mais néanmoins fonctionnels, s'agissant de leur capacité d'hybridation avec ledit fragment d'ADN de mycobactérie en vue de son amplification
ISTB3 : 5' TTCGCAATTCTCGTTGTCCC 3'
ISTB4 : 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB5 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB6 : 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB7 : 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
3.Amorces pour l'amplification de fragments d'ADN de mycobactéries, selon la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont prises en combinaison deux à deux, de façon à hybrider dans des conditions déterminées avec les extrémités 5' et 3' respectives du fragment choisi d'ADN à amplifier, notamment en ce qu'il s'agit des couples suivants
ISTB2 et ISTB4 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' TCGACCTACTACGACCACAT 3'
ISTB2 et ISTB5 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3'
ISTB5 et ISTB6 5' GTCGAGTCGATCTGCACACA 3' et 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3'
ISTB6 et ISTB7 5' GTTCACGGTTAGCCACACTT 3' et 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
4.Amorces pour l'amplification de fragments d'ADN selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisées en ce qu'elles correspondent au couple d'amorces suivant
ISTB2 et ISTB7 5' ACAGGCCGAGTTTGGTCATC 3' et 5' CAGCACGCTAATTAACCCGG 3'
5. Amorces selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisées en ce qu'elles sont marquées par un marqueur chimique, physique ou enzymatique et/ou en ce qu'elles sont fixées à un support solide, notamment un support particulaire ou membranaire, par exemple des billes magnétiques.
.6. Sondes pour la détection de fragments d'ADN amplifiés de mycobactéries, caractérisées en ce qu'il s'agit de fragments nucléotidiques spécifiques d'une séquence de mycobactérie selon la revendication 1, capables d'hybrider avec ledit fragment d'ADN amplifié, lesdits fragments étant soit marqués à leur extrémité 5' et/ou 3' par une substance que l'on peut détecter, par exemple par un isotope radioactif, une enzyme, un marqueur chimique ou chimioluminescent approprié, un fluorochrome, un haptène, ou un anticorps, des analogues de bases ou encore un marqueur physique, soit fixés à un support solide notamment un support particulaire ou membranaire, par exemple des billes magnétiques.
7. Sondes selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'il s'agit de l'un des fragments nucléotidiques suivants, ledit fragment étant marqué
IS-2 : 5' CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGG 3'
IS-4 : 5' TGTGCCGATCGCCCCATCGACCTACTACGA 3'
IS-6 : 5' GTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGAG 3'
8.Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par des mycobactéries, sur un échantillon biologique déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un couple d'amorces nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, capables d'hybrider aux extrémités 5' et en 3' d'un fragment d'ADN spécifique de mycobactéries, - des réactifs nécessaires à l'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon traité, - des réactifs pour effectuer la polymérisation dudit fragment d'ADN, à partir des amorces nucléotidiques, notamment des enzymes de polymérisation, en quantité suffisante pour réaliser l'amplification du fragment d'ADN que l'on souhaite amplifier, - au moins un fragment nucléotidique pouvant être utilisé comme sonde et capable d'hybrider dans des conditions déterminées avec le fragment d'ADN amplifié, - un contrôle interne de la réaction d'amplification par exemple constitué par un fragment d'ADN éventuellement porté par un plasmide, ledit fragment pouvant être aisément détecté, par exemple en ce qu'il contient un gène de résistance à un antibiotique, ledit fragment étant en outre muni à ses deux extrémités, d'au moins une amorce d'amplification, de préférence choisie parmi les amorces de l'invention, - une sonde capable d'hybrider avec le fragment d'ADN contenu dans le contrôle interne, - le cas échéant, une réverse-transcriptase pour obtenir de l'ADNc à partir d'ARN éventuellement présent dans l'échantillon testé, - le cas échéant de moyens pour révéler l'hybridation.
9. Kit pour le diagnostic in vitro selon la revendication 8, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont ISTB2 et ISTB7 et en ce qu'on utilise au moins une sonde de détection constituée par le fragment nucléotidique IS-2 marqué, éventuellement complétée par la sonde constituée par le fragment nucléotidique IS-6 marqué.
10. Procédé pour le diagnostic in vitro d'une infection par des mycobactéries, sur un échantillon biologique déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) mise en contact de l'acide nucléique des mycobactéries éventuellement présent dans l'échantillon biologique testé, si nécessaire dans des conditions permettant l'accessibilité sous forme d'ADN simple brin avec au moins un couple d'amorces nucléotidiques selon 1 l'une quelconque des revendications 2 à 4, lesdites amorces pouvant hybrider avec l'acide nucléique de mycobactéries s'il est présent, et initier la synthèse du produit d'élongation desdites amorces, chaque brin de fragment d'ADN de mycobactéries servant de matrice lorsqu'il est apparié avec les amorces; b) séparation des brins d'ADN synthétisés, de leur matrice; c) répétition de la synthèse de produit d'élongation, à partir de chaque brin dlADN présent à l'issue de l'étape b) et susceptible d'hybrider avec les amorces, jusqu'à l'obtention d'une amplification de l'ADN recherché, suffisante pour être détectée, d) mise en contact du produit de l'étape c) avec une sonde nucléotidique dans des conditions permettant de détecter la présence du fragment d'ADN amplifié recherché; e) détection des produits de l'hybridation éventuellement formés.
11. Procédé pour le diagnostic in vitro selon la revendication 10, caractérisé en ce que la mise en contact de l'échantillon testé est précédée d'une étape de traitement de l'échantillon de façon à en extraire l'acide nucléique.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 12, caractérisé en ce que préalablement à la mise en contact avec les amorces, on traite l'acide nucléique de l'échantillon avec une réverse transcriptase, pour obtenir la synthèse d'ADNc à partir de L'BARN éventuellement présent dans 1 'échantillon testé.
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