FR2811321A1 - Amplificateur d'une region ribonucleique cible d'un arn ribosomal 16s ou adn pour un tel arn d'une espece eubacterienne et detection de telles especes - Google Patents

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Corinne Jay
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

La présente invention concerne des amorces eubactériennes, des amplicons eubactériens, sensiblement différents les uns des autres obtenus par l'amplification réalisée avec les amorces eubactériennes au niveau d'un échantillon biologique à tester, un procédé pour amplifier une région ribonucléique cible d'un ARN ribosomal 16S d'une espèce eubactérienne, une méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans un échantillon biologique et des sondes de détection.Elle consiste en une paire d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier l'ARN ribosomal 16S ou l'ADN ribosomal codant pour l'ARN ribosomal 16S des espèces eubactériennes, qui consiste en :- une première amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1, et- une seconde amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 4,dans lesquelles la première amorce peut s'hybrider à une région d'une première séquence nucléotidique d'une espèce eubactérienne et la seconde amorce peut s'hybrider à une région d'une seconde séquence nucléotidique de cette même espèce eubactérienne, la première et la seconde séquences nucléotidiques, après avoir subi une extension, étant complémentaires.L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

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DESCRIPTION
La présente invention concerne des amorces eubactériennes, des amplicons eubactériens, sensiblement différents les uns des autres obtenus par l'amplification réalisée avec les amorces eubactériennes au niveau d'un échantillon biologique à tester, un procédé pour amplifier une région ribonucléique cible d'un ARN ribosomal 16S d'une espèce eubactérienne ou d'un ADN codant pour un tel ARN, une méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans un échantillon biologique, un kit de détection et des sondes de détection.
Ceci peut permettre l'identification d'espèces présentes dans l'échantillon à tester définies ci-dessus, par exemple en utilisant des puces à oligonucléotides, également appelée biopuce, comportant tout ou partie des sondes de capture en relation avec les amplicons eubactériens obtenus. Une telle invention est particulièrement intéressante dans le domaine de l'identification de micro-organismes présents dans le sang ou le sérum de patients, correspondant à des cas de septicémie.
La détection rapide dans le sang de la présence de bactéries pathogènes, causant une septicémie, est de la plus grande importance. L 'état de la technique est constitué de diagnostics qui utilise les techniques tout à fait classiques de la bactériologie. Ces techniques sont les suivantes. Tout d'abord, on incube un échantillon de sang dans un milieu de culture, puis on laisse le ou les bactérie(s) et/ou champignon(s) éventuellement présents croître, jusqu'à ce qu'une biomasse détectable par l '#il soit présente, et enfin on isole tout ou partie de cette biomasse sur un milieu solide pour effectuer des tests biochimiques et de susceptibilité.
Une telle technique est relativement lente, au minimum trois jours, ce qui permet pendant ce temps aux micro-organismes, présents dans le sang, de se développer. Les médecins ont alors tendance à prescrire des antibiotiques puissants pour essayer d'enrayer la maladie, mais le plus souvent l'antibiotique n'a pas d'effet sur le ou les micro-organismes à combattre. Ceci est particulièrement gênant car des résistances à ces antibiotiques peuvent apparaître, du fait de contacts inappropriés avec des microorganismes pathogènes pouvant être résistants.
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Il y a donc une réelle nécessité d'avoir ce diagnostic plus rapidement, il est alors plus aisé de choisir l'antibiotique réellement efficace face aux micro-organismes présents dans le sang du patient, tout en diminuant la pression de sélection de la résistance aux antibiotiques, et enfin, en contrôlant mieux les dépenses médicamenteuses hospitalières.
D'autres documents décrivent des méthodes qui permettent de répondre à ces problèmes en diminuant les délais de diagnostic, puisque limités à quelques heures.
Ces méthodes sont basées sur les analyses génétiques. Par exemple, il est possible d'extraire une cible d'identification à base d'ARN ribosomal, mais pas exclusivement, d'amplifier une région polymorphique en utilisant unjeu d'amorces eubactériennes, et de déterminer la séquence correspondant à la région amplifiée.
La détermination de la .séquence peut faire intervenir deux techniques différentes. La première technique consiste à utiliser tout d'abord la technique enzymatique de Sanger suivie par une électrophorèse sur gel.
Toutefois, il n'est pas possible avec cette technique de faire de distinction entre les différentes espèces qui peuvent être présentes dans l'échantillon biologique à tester.
Pour arriver à ce résultat, il convient donc d'effectuer des tests complémentaires qui sont réalisées par l'intermédiaire des techniques plus conventionnelles, qui sont lentes.
Figure img00020001
La deuxième technique utilise un panel de sondes olrgonucléotidiques spécifiques qui permettent d'identifier l'identité des amplicons. Ainsi le brevet US-A- 5,635,348 propose une méthode pour déterminer la présence d'un polynucléotide de bactéries à Gram négatifdans un échantillon suspecté d'en contenir, dans lequel ledit polynucléotide bactérien comprend une région cible choisie. Cette méthode comprend les étapes suivantes : (a) amplification de la région cible, si celle-ci est présente, jusqu'à un niveau détectable, (b) incubation de la région cible amplifiée, si celle-ci a été amplifiée, par l'intermédiaire d'une sonde polynucléotidique consistant en une séquence nucléique sélectionnée dans le groupe suivant :
Figure img00020002

. 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3', et sa séquence complémentaire, et . S'-GACGTAAGGGCCATGAGGACITGACGTC-3 ; et sa séquence complémentaire,
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sous des conditions qui permettent l 'hybridation de la sonde à la région cible amplifiée, et (c) détection des hybrides formés entre la région cible amplifiée, s'il y en a une, et la sonde polynucléotidique.
Pourtant, cette technique n'a jamais été associée avec des amorces eubactériennes encadrant une zone polymorphique adaptée à ce type de technique.
Pourtant les avantages sont importants, et particulièrement adaptés à l'étude des septicémies, où la présence de plus d'une espèce de micro-organisme dans le sang est peu probable, mais où le nombre d'espèce de micro-organisme susceptible d'être présent dans ledit sang est important Le traitement de la septicémie nécessite bien entendu de bien définir dès le départ la nature du micro-organisme présent.
Même si de nombreuses amorces d'amplification enzymatique ciblant l'ADN ou l'ARN ribosomal 16S ont été décrites, cependant aucune d'entre elles ne combinent les caractéristiques suivantes, conformément à la présente invention : - spécificité eubactérienne la plus large possible, - sensibilité maximum (idéalement une copie), et - encadrant une zone polymorphique permettant l'identification d'un grand nombre d'espèces bactériennes.
A cet effet, la présente invention concerne une amorce oligonucléotidique pour amplifier l'ARN ribosomal 16S ou l'ADN ribosomal codant pour l'ARN ribosomal 16S, qui consiste en une séquence comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO . 1 et/ou SEQ ID NO : 4 et/ou SEQ ID NO :11 et/ou SEQ ID NO: 14, dans laquelle l'amorce peut s'hybrider à une région d'une séquence nucléotidique d'une espèce eubactérienne
Préférentiellement, l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 1 est constituée de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 4 est constituée de SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8, l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 11est constituée de SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO - 13, et l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO - 14 est constituée de SEQ ID NO . 15 ou SEQ ID NO - 16 ou SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 18.
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L'invention a également trait à un paire d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier l'ARN ribosomal 16S ou l'ADN ribosomal codant pour l'ARN ribosomal 16S des espèces eubactériennes, qui consiste en : - une première amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1, et - une seconde amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 4, dans lesquelles la première amorce peut s'hybrider à une région d'une première séquence nucléotidique d'une espèce eubactérienne et la seconde amorce peut s'hybrider à une région d'une seconde séquence nucléotidique de cette même espèce eubactérienne, la première et la seconde séquences nucléotidiques, après avoir subi une extension, étant complémentaires.
Dans ce dernier cas de la paire d'amorces, la première amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 1 est constituée de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, et la seconde amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 4 est constituée de SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8.
Dans tous les cas de figure, l'amorce consiste en une séquence comportant au moins 15 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11à 18.
L'amorce oligonucléotidique SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11 à 18 est associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase.
L'invention concerne également des amplicons obtenus par amplification avec une amorce ou l'une des paires d'amorces, décrite ci-dessus, qui est caractérisés par le fait qu'ils consistent en une séquence constituée de trois zones différentes : - deux zones génétiquement conservées situées à chaque extrémité de l'amplicon et permettant l'hybridation des amorces, et - une zone située, entre les deux zones précédentes, apparentée à la séquence SEQ ID NO : 10 et ayant un pouvoir résolutif du polymorphisme d'espèces par rapport à l'ensemble des amplicons des autres espèces bactériennes.
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Selon un mode de réalisation, la zone ayant un pouvoir résolutif a une homologie par rapport aux autres espèces bactériennes compris entre 28 et 68 %, préférentiellement entre 35 et 59%, et encore plus préférentiellement entre 50 et 59 %.
Les amplicons issus d'ARN et/ou d'ADN bactérien, correspondant à l'amplification d'une espèce bactérienne parmi un panel d'au moins 100, préférentiellement au moins 150 et encore plus préférentiellement au moins 200 espèces bactériennes potentiellement amplifiables, utilisant au plus 6, préférentiellement au plus 4 et encore plus préférentiellement au plus 2 amorces oligonucléotidiques, chaque amplicon consiste en une séquence constituée de trois zones différentes : deux zones génétiquement conservées situées à chaque extrémité de l'amplicon et permettant l'hybridation des amorces, et une zone située, entre les deux zones précédentes, ayant un pouvoir résolutif du polymorphisme d'espèces par rapport à l'ensemble des amplicons issus de l'amplification des autres espèces bactériennes et ayant les caractéristiques suivantes : - un taux d'homologie compris entre 28 et 68 %, préférentiellement entre 35 et
59 %, et encore plus préférentiellement entre 50 et 59 % par rapport à l'une quelconque des espèces choisies parmi le panel d'espèces bactériennes, et - une longueur inférieure à 1000 nucléotides préférentiellement inférieure à 500 nucléotides.
L'invention concerne encore un procédé pour amplifier une région ribonucléique cible d'un brin d'acide nucléique d'une espèce eubactérienne, caractérisé en ce qu'il comporte les différentes étapes suivantes : (a) hybridation, sur le brin d'acide nucléique concerné, d'une première amorce SEQ ID NO : 4 à 8, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, et (b) utilisation d'une enzyme à activité polymérase enzymatique pour étendre la première amorce afin d'obtenir un double brin d'acide nucléique.
Selon un mode de réalisation, le procédé consiste, sans les étapes (a) et (b) ou après les étapes (a) et (b), à effectuer ;
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(c) séparation d'un double brin pour obtenir deux simples brins complémentaires, (d) hybridation sur le premier brin d'une première amorce, SEQ ID NO : 4 à 8, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, hybridation sur le second brin complémentaire d'une seconde amorce SEQ ID NO: 1 à 3, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, (e) extension des première et seconde amorces afin d'obtenir deux brins d'ADN complémentaire, contenant éventuellement une séquence promotrice, et (f) répétition éventuelle des étapes (c) à (e) en fonction du nombre de brin d'acide nucléique contenant la région ribonucléique cible que l'on souhaite amplifier.
La séquence promotrice associée à la première amorce, SEQ ID NO : 4 à 8 ou 14 à 18, est par exemple constituée par la T7, SEQ ID NO : 9. La séquence promotrice associée à la seconde amorce, SEQ ID NO : 1 à 3 ou 11 à 13, est par exemple constituée par la T3, dont la séquence n'est pas jointe mais qui est bien connue de l'homme du métier.
Selon un autre mode particulier, on effectue une activité enzymatique de type transcriptionnelle, comme par exemple NASBA, TMA, 3SR, utilisant une activité DNA polymérase ADN et ARN dépendante, une activité RNA polymérase et une activité Rnase H.
Selon un autre mode de réalisation, le simple brin d'ARN obtenu dans l'étape (f) est utilisé comme matrice de synthèse du double brin d'ADN des étapes (a) à (e), afin d'établir une phase cyclique d'amplification.
Toujours selon un autre mode de réalisation, dans l'étape (b), une enzyme RNase H est utilisée pour séparer le simple brin d'ADN du double brin ARN-ADN.
La présente invention concerne encore une méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : # prélever d'un échantillon biologique contenant au moins un ARN ribosomal 16S ou un ADN, codant pour l'ARN ribosomal 16S, d'au moins une espèce eubactérienne,
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# amplifier l'ARN ou ADN ribosomal 16S eubactérien dans in vitro dans un mélange contenant au moins une activité polymérase enzymatique, et au moins deux amorces ayant des séquences sélectionnées parmi les SEQ ID NO : 1 à 8 et 11 à 18 pour obtenir des acides nucléiques eubactériens amplifiés, et # détecter les acides nucléiques eubactériens amplifiés par détection d'un marqueur associé auxdits acides nucléiques eubactériens amplifiés.
Selon un mode particulier, cette méthode comporte les étapes supplémentaires suivantes : # ajouter à l'échantillon biologique au moins un oligonucléotide de capture qui s'hybride spécifiquement aux acides nucléiques eubactériens amplifiés, et au moins un acide nucléique qui immobilise l'oligonucléotide de capture dans des conditions d'hybridation pour constituer un complexe d'hybridation, et # séparer le complexe d'hybridation par rapport aux autres constituants de l'échantillon biologique avant l'étape d'amplification.
Selon un mode particulier de réalisation, l'étape d'amplification amplifie l'ARN ou ADN 16S des espèces suivantes ; Abiotropha adjacens, Acinobacter baumanii, Aeromonas hydrophila, Atobobium parvulum, Bacillus acidocaldarius, Bacillus brevis, Bacillus caldovelox, Bacillus licheniformis, Bacillus piliformis, Bacillus schlegelii, Bacteroides fragilis" Brochothrix campestris, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli, Campylobacter coli, Campylobacter curvus, Campylobacter fétus fétus, Campylobacter sputorum, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Clostridium perfringens, Corynebacterium hoagii, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium xerosis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus faecahs, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Escherichia coli, Flavobacterium meningosepticum, Flavobacterium odoratum, Flavobacterium thalpophilum, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium nucleatum animalis, Fusobacterium nucleatum fusiforme, Fusobacterium nucleatum nucleatum, Fusobacterium nucleatum polymorphum, Haemophilus mfluenza, Haemophilus parahaemolyticus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus paraphrophilus, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella
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pneumoniae ozaenae, Klebsiella pneumoniae pneumoniae, Klebsiella pneumoniae rhinoscleromatis, Leuconostoc fallax, , Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Neisseria meningitidis, Pantoea agglomerans, Propionibacterium freundenreichii, Propionibacterium propionicus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas citronellolis, Salmonelle agona, Salmonella bareilly, Salmonella blockley, Salmonella bovis morbificans, Salmonella chingola, Salmonella enteritidis, Salmonella give, Salmonella matopeni, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhimurium, Salmonella weltevreden, Serratia marcescens, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Staphylococcus aerophilus, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis / xylosus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae str, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus vitulus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus acidominimus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolytiens, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus caprinus, Streptococcus cecorum, Streptococcus constellatus, Streptococcus criae, Streptococcus cricetus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus gordonii, Streptococcus hansenii, Streptrococcus hyointestinalis, Streptococcus intermedius, Streptococcus intestinalis, Streptococcus macacae, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Steptococcus mutans, Streptococcus parasanguis, Streptococcus parauberis, Streptococcus pleomorphus, Steptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus / uberis, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus saccharolyticus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis,
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Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus thoraltensis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Veillonella atypica, Veillonella vispar, Veillonella parvula, Xanthomonas maltophilia et Yersinia enterocolitica.
Selon un autre mode particulier de réalisation, l'étape de détection utilise au moins une sonde qui s'hybride spécifiquement sur les acides nucléiques eubactériens amplifiés.
Dans ce dernier cas, l'étape de détection utilise au moins une sonde marquée qui s'hybride spécifiquement sur les acides nucléiques eubactériens amplifiés.
Toujours selon un mode particulier de réalisation, l'étape d'amplification utilise une combinaison d'au moins deux amorces, une première amorce sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 3 et une seconde amorce sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO : 4 à 8.
La présente invention concerne aussi un kit de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce eubactérienne présente dans un échantillon biologique, qui comprend une paire d'amorces dans laquelle : - une première amorce comporte au moins 10, préférentiellement au moins 15 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 3, et - une seconde amorce comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 4 à 8.
Selon un mode particulier de réalisation, la première amorce est associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le kit comporte au moins une sonde oligonucléotidique, spécifique de la séquence amplifiée, qui consiste en une séquence comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15, et préférentiellement au moins 20 nucléotides successifs.
La présente invention concerne enfin une sonde de détection qui consiste en une séquence comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15, nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11à 18, dans laquelle la sonde
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s'hybride à une région spécifique d'une séquence nucléotidique d'une seule espèce eubactérienne.
La technique de détection de bactéries dans le sang, telle que décrite dans la présente invention, trouve son application principale dans le domaine de la biologie moléculaire. Néanmoins, les mêmes principes sont applicables pour la multidétection dans le cadre par exemple de dosages immunologiques.
Dans le cadre des techniques de biologie moléculaire, le procédé peut comprendre, outre l'étape finale de détection qui est nécessaire pour mettre en évidence la présence ou l'absence des bactéries recherchées : une étape de lyse et/ou une étape de purification et/ou une étape d'amplification enzymatique.
Par étape de lyse, on entend une étape capable de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des bactéries (des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la demanderesse : # PCT/FROO/00832, déposée sous priorité du 1er avril 1999, sur la lyse par sonication, # WO-A-00/05338, déposée sous priorité du 23 juillet 1998, sur la lyse mixte magnétique et mécanique, # WO-A-99/53304, déposée sous priorité du 10 avril 1998, sur la lyse électrique, à noter que ce document décrit également un procédé de séparation, et # WO-A-99/15621, déposée sous priorité du 23 septembre 1997, sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium, voir à ce sujet le brevet US-A-5,234,809.
Par étape de purification, on entend la séparation entre les acides nucléiques des bactéries et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des
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particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou par covalence, voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338, et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la demanderesse sous les références suivantes : # WO-A-97/45202 sous priorité française du 24 mai 1996, et # WO-A-99/35500 sous priorité française du 6 janvier 1998.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100 C et de préférence entre 20 et 60 C. Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques.
Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne (kits Qiagen par exemple), soit sous forme de particules inertes (cf. Boom R et al. 1990, J. Clin. Microbiol. 28 (3) 495-503) ou magnétiques (Merck : MagPrep (marque déposéer) Silica, Promega : (marque déposéer) Paramagnetic particles).
D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne (kits Qiagen par exemple) ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose, cf. Levison PR et al. J. Chromatography 1998,337-344). Une autre méthode très pertinente pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind).
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Par amplification enzymatique on entend un processus générant de manière exponentielle une séquence particulière d'acides nucléiques à l'aide d'amorces complémentaires de la matrice à amplifier par l'action d'au moins une enzyme. Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, il existe entre autres les techniques suivantes : # PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-
4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse
Transcription-PCR), notamment dans un format en une étape tel que décrit dans le brevet EP-A-0.569.272, # LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-
A-0.201.184, # RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, # 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-
90/06995, # NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet
WO-A-91/02818, et # TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.
On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique
L'étape de détection peut être soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques, voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 45 (4), pp. 453-458,1999 ou Keller G. H et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, pp. 173-249), ou la demande de brevet EPOO/400449 5 déposée par la demanderesse sous priorité du 24 février 1999.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, une méthode d'hybridation à l'aide de sondes spécifiques est mise en #uvre pour l'étape de détection. Ce mode d'exécution particulier consiste à mettre en contact les acides nucléiques (ou amplicons) des micro-organismes à détecter avec une sonde de capture fixée sur un support solide, et capable de s'hybrider spécifiquement avec lesdits acides nucléiques ; à révéler,
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selon les méthodes connues, la présence éventuelle des acides nucléiques fixés au support solide notamment par l'intermédiaire d'au moins une sonde de capture.
Par "marqueur", on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la P-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I.
Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléoside triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA.
Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812.
Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande WO-A-99/65926 de la demanderesse, sous priorité du 17 juin 1998. Elle concerne plus particulièrement des produits de marquage et de coupure des amplicons, lesdits amplicons ayant ainsi une taille adéquate pour leur hybridation ultérieure sur des oligonucléotides de capture. Ces oligonucléotides de capture peuvent être fixés sur un support solide.
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Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO-A-95/08000 et dans ce cas, la réaction préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire.
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse, ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides, tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une biopuce.
Par biopuce ou puce biologique ou puce à ADN , on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées.
A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p40-44,1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, p1-10, 1997 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1 (3), p183-200, 1996 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p541-546, 1998 ou dans les brevets US-A-4,981,783 (Augenlicht), US-A-5,700,637 (Southem), US-A-5,445,934 (Fodor), US-A-5,744,305 (Fodor), US-A-5,807,522 (Brown).
La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les acides nucléiques et de permettre un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Un avantage des biopuces réside dans le fait qu'elles simplifient l'utilisation de nombreuses sondes de capture permettant ainsi la détection multiple de micro-organismes tout en tenant compte du polymorphisme desdits micro-organismes à détecter.
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Etape 1 : de la région à amplifier :
Cette région a été choisie car après calcul, elle présente une longueur minimuale pour une résolution élevée des séquences en relation avec un maximum d'espèces bactériennes d'intérêt clinique. Cette région amplifiée se situe dans la portion polymorphique 340-800 de l'ARN 16S.
Etape 2 : Choix des amorces :
Après la sélection d'une région à amplifier se situant dans la portion polymorphique 340-800 de l'ARN 16S, six amorces ont été conçues : # deux amorces dites amont sont issues de la séquence de base SEQ ID NO : 1 définie pour la position de ces amorces amont, de références SEQ ID NO : 2 (S4) et SEQ ID NO : 3 (Al. 1), et # quatre amorces dites aval sont issues de la séquence de base SEQ ID NO : 4, de références SEQ ID NO : 5 (S9), SEQ ID NO : 6 (A2. 2), SEQ ID NO : 7 (A2.1) et
SEQ ID NO : 8 (E2.20).
Par acide nucléique cible, il faut comprendre tout ou partie d'un acide nucléique comportant une zone intermédiaire dite de détection, qui est spécifique de l'espèce à détecter, et deux zones permettant directement (amorce amont) ou indirectement (amorce aval) l'hybridation des amorces, ces deux zones encadrant la zone de détection.
Par amorce amont, il faut entendre une amorce qui peut s'hybrider directement sur l'acide nucléique cible à amplifier, en position amont par rapport à la zone de détection, c'est-à-dire à l'extrémité 5' de cette zone, et ainsi générer l'acide nucléique complémentaire dudit acide nucléique cible. Par amorce aval, il faut comprendre une amorce qui peut s'hybrider indirectement sur l'acide nucléique cible à amplifier, en position aval par rapport à la zone de détection, c'est-à-dire à l'extrémité 3' de cette zone, et ainsi générer l'acide nucléique complémentaire dudit acide nucléique cible.
Par hybridisation indirecte, il faut entendre que l'amorce aval en fait s'hybride sur acide nucléique complémentaire. En d'autres termes, l'amorce aval peut s'hybrider directement sur l'acide nucléique complémentaire, en position amont par rapport à la
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zone de détection, c'est-à-dire à l'extrémité 5' de cette zone, et ainsi générer l'acide nucléique cible.
Il y a donc huit combinaisons de jeux d'amorces, l'une aval l'autre amont, à tester en spécificité et en sensibilité.
Pour information, lorsque l'on utilise des techniques d'amplification transcriptionnelle, telles que le NASBA ou la TMA, l'homme du métier peut choisir préférentiellement des amorces aval comportant en leur extrémité 5', la séquence du promoteur T7, SEQ ID NO : 9, qui est une séquence de trente nucléotides bien connue, pour la transcription d'ARN, qui peuvent s'hybrider ultérieurement sur la puce à ADN, au même titre que les amplicons issus d'une amplification simple par PCR. Il est également possible de fonctionner en PCR afin d'amplifier la séquence cible, cette amplification étant réaliser en présence de la séquence du promoteur T7 accolé à l'amorce aval et/ou amont, pour ensuite ajouter l'enzyme T7 polymérase et ainsi obtenir des amplicons ARN
Cette dernière technique est particulièrement intéressante par la demanderesse puisque celle-ci a déposée un demande de brevet WO-A-99/65926 permettant de cliver et de marquer les fragments d'ARN. Il existe d'autres techniques pour effectuer ce clivage-marquage tant sur des ADN que sur des ARN, pourtant cette technique est intéressante par la taille des fragments d'oligonucléotides générés qui sont parfaitement adaptés à une hybridation sur une puce à ADN.
Enfin, il est également possible d'utiliser en lieu et place des amorces eubactériennes précédemment citées, c'est-à-dire les séquences SEQ ID NO :1 à 8, les amorces complémentaires bien connues de l'homme du métier et qui correspondent aux séquences SEQ ID NO : 11à 18.
La sélection du meilleur jeu d'amorces parmi les huit disponibles a comporté deux étapes : - la recherche expérimentale de la température d'hybridation optimale, et - le recherche du meilleur jeu d'amorces d'après la spécificité, la reproductibilité et la sensibilité de détection.
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Etape 3 : Recherche expérimentale de la température d'hybridation optimale :
Les points de fusion des amorces, c'est-à-dire quand 50% des amorces sont déshybridées, ainsi que la température optimale d'hybridation pour la PCR ont été évalués à l'aide du logiciel OLIGO. La séquence du promoteur T7 n'a pas été prise en compte pour le calcul des points de fusion. Les points de fusion des amorces, ainsi que la température optimale d'hybridation théorique pour les huit (8) combinaisons sont obtenus dans les conditions suivantes : # températures d'hybridation testées pour les huit (8) combinaisons : 45,50, 55,60 et
65 C, # souches testées : E. coli (ATCC 11775T) N API 73 08 009 et S. aureus (ATCC
12600) N API 87 12 082, # lysats réalisés comme suit : - réalisation d'un inoculum del McF en H20 osmosée, - lyse mécanique par bille de verre vortexée sur 600 l pendant 2 minutes (mn), et - aliquotage en tube Eppendorf par 1501 et conservation à -20 C.
# réaction de PCR dans les conditions suivantes :
Figure img00170001

- Tampon...............1X, - MgCh......................l,5 mM, - dNTP.......................200 M, - Amorces ................... 0,3 M, - Taq.........................0,015 U/ l, - H20 QSP.................50 l, et - Cible.........................2 l de lysat.
# cycles PCR : - 2 mn à 95 C, - 1 mn à 95 C, - 1 mn à 55 C, - 1 mn à 72 C , - répétition 30 fois des trois dernières conditions, et
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Figure img00180001
<tb>
<tb> - <SEP> 10 <SEP> mn <SEP> à <SEP> 72 C. <SEP>
<tb>
Combinaisons <SEP> des <SEP> amorces
<tb> T C <SEP> Souches <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP>
<tb> ~~~~~ <SEP> ~~~~~~
<tb> 45 <SEP> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
Figure img00180002

r S. aureu.s'...+.... + + ..+....+.. +
Figure img00180003
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> @
<tb> S. <SEP> aureus
<tb> 55 <SEP> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
Figure img00180004

r S'.. aureus .
Figure img00180005
<tb>
<tb>
60 <SEP> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
Figure img00180006

1........................................................................
Figure img00180007
<tb>
<tb>
S. <SEP> aureus <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb> 65 <SEP> E. <SEP> cob <SEP> (+) <SEP> - <SEP> + <SEP> (+) <SEP> + <SEP> +
<tb>
Figure img00180008

r' " ..... """ ........0..'" .........................................................,.................... "'" ..... i \S.mtreus 11 (+) - - I (+) - - -
Figure img00180009
<tb>
<tb>
<tb>
Tableau 1 Température d'hybridation optimale des amorces
Les résultats indiqués dans le tableau 1 ci-dessus sont exprimés en + pour les bons résultats, en (+) pour les résultats moyens et en - pour les résultats inexploitables, ceci est également vrai pour le tableau 2 ci-après. De plus, les paires d'amorces sont les suivantes - combinaison 1 pour SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5, - combinaison 2 pour SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO : 6, - combinaison 3 pour SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 8, - combinaison 4 pour SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO 7, - combinaison 5 pour SEQ ID NO - 3 et SEQ ID NO . 5, - combinaison 6 pour SEQ ID NO . 3 et SEQ ID NO 6, - combinaison 7 pour SEQ ID NO , 3 et SEQ ID NO 8, et - combinaison 8 pour SEQ ID NO - 3 et SEQ ID NO : 7.
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Ces combinaisons sont également utilisées dans le tableau 2 ci-après.
Pour les huit (8) combinaisons, la température de 55 C donne de très bons résultats et est donc retenue.
Etape 4 : Définition du meilleur jeu d'amorces d'après les critères de spécificité :
Il s'agit de vérifier que l'amplification est spécifique des bactéries et effective pour l'ensemble des souches testées, échantillonage représentatif de la diversité bactérienne médicale.
L'étude de spécificité est réalisée en deux étapes : # essai de sélection dit screening des huit (8) jeux d'amorces, et # étude complémentaire d'espèces bactériennes médicales.
Le but de cet essai de sélection est de vérifier la spécificité des huit (8) jeux d'amorces vis-à-vis des espèces bactériennes. Dix (10) espèces bactériennes, les plus fréquemment isolées dans les hémocultures positives, 1 espèce de bactérie anaérobie et 5 espèces de levures, comme contrôle négatif, ont été testées.
Il s'agit des espèces suivantes : # pour les espèces bactériennes aérobies : E. coli (N ATCC 11775T et N API 73 08
009), S. aureus (N ATCC 12600 et N API 87 12 082), S. pneumoniae (N ATCC
14990 et N API 87 10 057), K pneumoniae (N ATCC 7465T et N API 78 04
060), S. epidermidis (N ATCC 13883T et N API 73 08 012), E. cloacae (N
ATCC 13047T et N API 73 08 013), S. agalactiae (N ATCC 13813T et N API 77 01 031), P. mirabilis (N ATCC 29906T et N API 92 11049), E. faecalis (N
ATCC 19433 et N API 76 Il007) et P. aeruginosa (N ATCC 10145 et N API 73 09 001 ), # pour l'espèce bactérienne anaérobie : B. fragilis (N ATCC 25285 et N API 95 04
033) # pour les levures : C. albicans (N ATCC 18804et N API 85 04 277), C. tropicalis (N ATCC 7349 et N API 75 10 043), C. glabrata (N ATCC 2001T et N API
85 10 012), C. krusei (N ATCC 6258et N API 74 09 013) et C. parapsilosis (N
ATCC 22019et N API 74 09 007)
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Ces souches ont été amplifiées comme décrit précédemment.
Figure img00200001
<tb>
<tb>
Combinaisons <SEP> des <SEP> amorces
<tb> Espèces <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E. <SEP> cloacae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E. <SEP> faecalis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> B. <SEP> fragilis <SEP> +... <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> C. <SEP> albicans
<tb> C. <SEP> tropicahs
<tb> C.glabrata
<tb> C. <SEP> krusei
<tb> C. <SEP> parapsilosis
<tb>
Tableau 2 : des combinaisons d'amorces avec les espèces bactériennes les plus répandues et des levures
Les huit (8) combinaisons sont 100% spécifiques (aucun faux +), mais seules deux d'entre elles rendent des résultats positifs pour les 11espèces bactériennes, il s'agit de la combinaison 1 SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 (S4/ S9) et de la combinaison 5: SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 5 (A1.1 / S9).
Afin de confirmer la spécificité de ces deux (2) jeux d'amorces, dix (10) autres espèces bactériennes ont été testées. Ces dix (10) espèces ont été choisies d'après les
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fréquences d'isolement et en fonction des espèces non encore testées. Il s'agit de C. freundri (N ATCC 8090T et N API 73 08 010), S. sanguis (N ATCC 10556T et N
API 77 09 011), C. perfringens (N ATCC 13124 et N API 78 Il 155), H. influenzae (N ATCC 33391 et N API 85 01 113), C. coli (NI' ATCC 33559T et N API 87 02 074), S. hominis (N ATCC 27844T et N API 87 07 021), S. marcescens (N ATCC
Figure img00210001

13880T et N API 89 03 014), S. maltophrlia (N ATCC 13637T et N API 92 11 069), E. enteritidis (N ATCC 13076T et N API 94 06 001) et A. baumanii N ATCC 19606 et N API 92 12 046).
Ces souches ont été amplifiées comme décrit précédemment.
Figure img00210002
<tb>
<tb>
Combinaisons <SEP> des <SEP> amorces
<tb> Espèces <SEP> Combinaison <SEP> 1 <SEP> Combinaison <SEP> 5
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> sanguis <SEP> + <SEP> +
<tb> C. <SEP> perfringens <SEP> + <SEP> +
<tb> H. <SEP> influenzae <SEP> + <SEP> +
<tb> C. <SEP> coli <SEP> (+)
<tb> S. <SEP> hominis <SEP> +
<tb> C. <SEP> jeikeium <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> marcescens <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> maltophilia <SEP> + <SEP> (+)
<tb> S. <SEP> enteritidis <SEP> + <SEP> +
<tb> A. <SEP> baumannit <SEP> + <SEP> +
<tb>
Tableau 3 : Spécificité des combinaisons d'amorces sélectionnées avec d'autre espèces bactériennes
Avec la combinaison 1, il n'y a qu'une souche négative à savoir : C. coli, alors qu'avec la combinaison 5, aucune souche est négative. Ainsi la spécificité est légèrement
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meilleure avec SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 5, car aucune espèce bactérienne n'est trouvée négative sur les vingt-deux (22) testées Etape 5 : Etude de reproductibilité :
Afin de vérifier la "robustesse" des deux jeux d'amorces correspondant à la combinaison 1, c'est-à-dire SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 (S4/ S9) et de la combinaison 5, à savoir SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 5 (A1.1 / S9), une étude de reproductibilité sur six manipulations différentes avec les 11 espèces bactériennes précédemment utilisées (10 espèces + 1 espèce d'anaérobie) ayant servi à l'étude de spécificité (voir tableau 2).
Ces souches ont été amplifiées comme décrit précédemment. Les colonnes 1 à 6 des tableaux 4 et 5 correspondent à six (6) manipulations différentes.
Figure img00220001
<tb>
<tb>
Combinaison <SEP> 1
<tb> Espèces <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> coli
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E. <SEP> cloacae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E. <SEP> faecalis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> agalactrae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> B. <SEP> fragilis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Tableau 4 : Répétabilité de la combinaison 1 pour différentes espèces bactériennes
Il n'y a qu'un résultat négatif sur six (6) résultats obtenus pour K pneumoniae.
<Desc/Clms Page number 23>
Figure img00230001
<tb>
<tb>
Combinaison <SEP> 5
<tb> Espèces <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> E. <SEP> coli <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Figure img00230002

S. pneumo1llae + + + + (+) +
Figure img00230003
<tb>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E. <SEP> cloacae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E.faecalis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> B. <SEP> fragilis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Tableau 5 : de la combinaison 5 pour différentes espèces bactériennes
Il n'y a pas de résultat négatif.
Ainsi, l'étude de spécificité donne les résultats suivants .
# la combinaison 5 donne 100% de reproductibilité alors que la combinaison 1 donne
98,5 % de reproductibilité (65/66 réponses +), # l'ensemble des couples d'amorces est intéressant mais les combinaisons 1 et 5 et plus particulièrement la combinaison 5 ont prouvé qu'il s'agissait de jeux d'amorces eubactérien-spécifiques, et # la séquence SEQ ID NO : 3 est positionnée aux coordonnées 347-364 de la séquence
16S d'Escherichia coli (Genbank ECORRD-J01859), tandis que la partie spécifique de la séquence SEQ ID NO : 5 est positionnée aux coordonnées 786-802 de cette même séquence.
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Etape 6 : Définition du meilleur jeu d'amorces d'après les critères de sensibilité :
Cette étude a été entreprise afin de déterminer et comparer la sensibilité (nombre minimal de bactéries détectable par réaction PCR) des deux (2) jeux d'amorces sur deux (2) espèces bactériennes : E. coli et S. aureus. L'étude de sensibilité est réalisée en utilisant comme cible PCR des lysats bactériens bruts (non purifiés) testés à différentes concentrations.
Les souches utilisées sont E. coli (N ATCC 11775T et N API 73 08 009), S. aureus (N ATCC 12600 et N API 87 12 082) et des lysats.
Les lysats ont les caractéristiques suivantes 0,5 McF en H2O# (108 bactéries par millilitre (bact. /ml) théorique et confirmé par un dénombrement. On effectue des dilutions en cascade au 1/10, afin d'obtenir les concentrations suivantes e: 106, 105, 104, 103, 102, 10 et 1 bact./ml.
On effectue une lyse d'un échantillon biologique de 300 l par bille subissant un vortex pendant une durée de 2 mn Puis, les lysats sont conservés à -20 C.
La réaction de PCR s'effectue dans les mêmes conditions que précédemment, mais avec 10 l de cible pour 90ulde volume réactionnel.
# réaction PCR : - Tampon Gibco, -MgCl2 1,5 mM, - dNTP 200 M, - Amorces 0,3 M, - Taq 0,015 U/ l Gibco, - H2O QSP 50 l, et - Cible 10 l de lysat.
# cycles PCR - 2 mn à 95 C, - 1 mn à 95 C, - 1 mn à 55 C, - 1 mn à 72 C, - répétition 30 fois des trois dernières conditions, et - 10 mn à 72 C.
<Desc/Clms Page number 25>
La sensibilité est donc étudiée sur la gamme : 104 - 103 - 102 - 10 - 1 - 0,1 -0,01 CFU par réaction PCR. L'enzyme utilisée est la Taq polymérase : GIBCO et AmpliTaq Gold de Perkin-Elmer.
La détection du produit PCR par coloration au bromure d'éthidium.
Dans ces conditions, les résultats obtenus pour les deux (2) jeux d'amorces, la sensibilité sur gel (dernière bande PCR visible) est de 1 à 10 cellules d'E. coli par réaction PCR. Avec S. aureus, la sensibilité est identique.
Etape 7 : Amplicons obtenus :
La fréquence d'isolement de micro-organismes en hémoculture est la suivante selon différentes analyses françaises (A et B) et américaine (C). L'analyse A est une étude multicentrique réalisée par la demanderesse en juillet 1996 sur six hôpitaux français équipés d'un appareil d'hémoculture VITAL. L'analyse B est également une étude multicentrique réalisée par la demanderesse auprès de cinquante-neuf hôpitaux français (septembre à décembre 1991). Ces études sont disponibles auprès de la demanderesse. Enfin, l'analyse C est une étude d'hémoculture américaine de Frank R.
Cockerill et al. Analysis of 281,797 Consécutive Blood Cultures Performed over an Eight-Year Period : Trends in Microorganisms Isolated and the Value of Anaerobic Culture of Blood. Clinical Infectious Diseases 1997 ; 24 : 403-18.
Le tableau 6 récapitule ci-dessous l'essentiel des résultats.
Figure img00250001
<tb>
<tb>
Etude <SEP> A <SEP> Etude <SEP> B <SEP> Etude <SEP> C
<tb> Espèces <SEP> Nombre <SEP> Fréquence <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Fréquence <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Fréquence
<tb> Espèces <SEP> de <SEP> souches <SEP> (en <SEP> %) <SEP> souches <SEP> (en <SEP> %) <SEP> souches <SEP> (en <SEP> %)
<tb>
Figure img00250002

1 Escherichia coli 547 31,71 924 28,75 2522 12,33
Figure img00250003
<tb>
<tb> 2 <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 321 <SEP> 18,61 <SEP> 509 <SEP> 15,84 <SEP> 3518 <SEP> 17,2 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Streptococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 139 <SEP> 8,06 <SEP> 201 <SEP> 6,25 <SEP> 658 <SEP> 3,22
<tb> 4 <SEP> Staphylococcus <SEP> epidermidis <SEP> 105 <SEP> 6,09 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Figure img00250004

5 Klebsiellaptieumoniae 48 2,78 139 4,32 724 3,54
Figure img00250005
<tb>
<tb> 6 <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 42 <SEP> 2,43 <SEP> 103 <SEP> 3,2 <SEP> 1204 <SEP> 5,89
<tb>
Figure img00250006

7 ~nteroccusfaecalis 41 2,38 0 971 4,75
<Desc/Clms Page number 26>
Figure img00260001

8 I nterobactercloacae 38 2,2 51 1,59 556 2,72 9 Proteusmrrabrlrs 32 1,86 104 3,24 233 1,14
Figure img00260002
<tb>
<tb> 10 <SEP> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> 29 <SEP> 1,68 <SEP> 62 <SEP> 1,93 <SEP> 187 <SEP> 0,91
<tb> 11 <SEP> Staphyloccus <SEP> hominis <SEP> 23 <SEP> 1,33 <SEP> 0
<tb>
Figure img00260003

12 acterordes fragrlrs 20 1,16 54 1,68 449 2,19 13 KlebSlella oxytoca 20 1,16 25 0,78 286 1,4
Figure img00260004
<tb>
<tb> 14 <SEP> Serratiamarcescens <SEP> 16 <SEP> 0,93 <SEP> 36 <SEP> 1,12 <SEP> 456 <SEP> 2,23
<tb> 15 <SEP> Campylobacter <SEP> jejum <SEP> 14 <SEP> 0,81 <SEP> 0
<tb>
Figure img00260005

16 Streptococcusîanguis 13 0,75 0 17 Crtrobacterfreundtt 12 0,7 12 0,37 120 0,59
Figure img00260006
<tb>
<tb> 18 <SEP> Salmonella <SEP> entérinais <SEP> 12 <SEP> 0,7 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 19 <SEP> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 12 <SEP> 0,7 <SEP> 6 <SEP> 0,19 <SEP> 0
<tb>
Figure img00260007

20 tenotrophomonas 11 0,64 116 0,57
Figure img00260008
<tb>
<tb> maltophilia <SEP> bovis--j,64-
<tb> 21 <SEP> Streptococcus <SEP> bovis <SEP> 11 <SEP> 0,64 <SEP> 0
<tb> 22 <SEP> Staphylococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 9 <SEP> 0,52 <SEP> 0
<tb> 23 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10 <SEP> 0,58 <SEP> 0 <SEP> 117 <SEP> 0,57
<tb> 24 <SEP> Acmetobacter <SEP> lwoffi <SEP> 8 <SEP> 0,46 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Figure img00260009

25 Corvnebactenumjeikeium 8 0,46 0 49 0,24
Figure img00260010
<tb>
<tb> 26 <SEP> Staphylococcus <SEP> coagulase <SEP> (-) <SEP> 8 <SEP> 0,46 <SEP> 288 <SEP> 8,96 <SEP> 1831 <SEP> 8,95
<tb> 27 <SEP> Streptococcus <SEP> groupe <SEP> G <SEP> 8 <SEP> 0,46 <SEP> 0 <SEP> 82 <SEP> 0,4
<tb> 28 <SEP> Proteus <SEP> vulgans <SEP> 7 <SEP> 0,41 <SEP> 15 <SEP> 0,47 <SEP> 0
<tb> 29 <SEP> Streptococcus <SEP> groupe <SEP> C <SEP> 7 <SEP> 0,41 <SEP> 0
<tb> 30 <SEP> Streptococcus <SEP> equisimilis <SEP> 7 <SEP> 0,41 <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> Streptococcus <SEP> oralis <SEP> 7 <SEP> 0,41 <SEP> 0
<tb> 32 <SEP> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 6 <SEP> 0,35 <SEP> 0 <SEP> 254 <SEP> 1,24
<tb> 33 <SEP> Enterococcusfaecium <SEP> 6 <SEP> 0,35 <SEP> 0 <SEP> 125 <SEP> 0,61
<tb>
Figure img00260011

34 Enterobacter aerogenes 6 0,35 5 0,16 265 1,3
Figure img00260012
<tb>
<tb> 35 <SEP> Streptococcus <SEP> salivarius <SEP> 5 <SEP> 0,29 <SEP> 0
<tb> 36 <SEP> Listena <SEP> monocytogenes <SEP> 4 <SEP> 0,23 <SEP> 12 <SEP> 0,37 <SEP> 45 <SEP> 0,22
<tb> 37 <SEP> Neissena <SEP> meningititis <SEP> 4 <SEP> 0,23 <SEP> 0
<tb> 38 <SEP> Streptococcus <SEP> cams <SEP> 4 <SEP> 0,23 <SEP> 0
<tb> 39 <SEP> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> 4 <SEP> 0,23 <SEP> 50 <SEP> 1,56 <SEP> 158 <SEP> 0,77
<tb>
Figure img00260013

40 cinetobacter baumaml 3 0,17 0 41 Candida parapsilosis 3 0,17 0 359 1,75 42 Clostndrum perfnngens 3 0,17 30 0,93 59 0,29
<Desc/Clms Page number 27>
Figure img00270001
<tb>
<tb> 43 <SEP> Enterobacter <SEP> amnigenus <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 44 <SEP> Enterococcus <SEP> gallinarum <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 45 <SEP> Fusobacterium <SEP> mortiferum <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Figure img00270002

46 1organellamorganii 3 0,17 31 0,96 93 0,45
Figure img00270003
<tb>
<tb> 47 <SEP> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 48 <SEP> Salmonella <SEP> virchow <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 49 <SEP> Staphylococcus <SEP> sp. <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> Streptococcus <SEP> groupe <SEP> F <SEP> 3 <SEP> 0,17 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 51 <SEP> Alcaligenes <SEP> xylosoxidans <SEP> spp <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> xylosoxidans
<tb> 52 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 15 <SEP> 0,47 <SEP> 1983 <SEP> 9,69
<tb> 53 <SEP> Capnocytophaga <SEP> sp <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 54 <SEP> Corynebacterium <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 7 <SEP> 0,22 <SEP> 0
<tb> 55 <SEP> Enterobacter <SEP> agglomérons <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 6 <SEP> 0,19 <SEP> 0
<tb> 56 <SEP> Enterococcus <SEP> sp. <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 57 <SEP> Fusobactenum <SEP> nucleatum <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 36 <SEP> 0,18
<tb>
Figure img00270004

58 Fusobacterium.sp 2 0,12 14 0,44 7 0,03
Figure img00270005
<tb>
<tb> 59 <SEP> Haemophilus <SEP> para <SEP> influenzae <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 60 <SEP> Neisseria <SEP> mentungititis <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 8 <SEP> 0,25 <SEP> 0
<tb> 61 <SEP> Providencia <SEP> stuartii <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 62 <SEP> Pseudomonas <SEP> stutzen <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 63 <SEP> Staphylococcus <SEP> capitis <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 64 <SEP> Streptococcus <SEP> anginosus <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 65 <SEP> Streptococcusavium <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 66 <SEP> Streptococcus <SEP> constellatus <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 67 <SEP> Streptococcus <SEP> mitis <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 68 <SEP> Streptococcussp <SEP> 2 <SEP> 0,12 <SEP> 98 <SEP> 3,05 <SEP> 146 <SEP> 0,71
<tb> 69 <SEP> Actinobacillus <SEP> actinomycetem <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> comita
<tb> 70 <SEP> Alcaligenes <SEP> xylosoxidans <SEP> spp <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> denitrificans
<tb> 71 <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 72 <SEP> Bacillus <SEP> sp <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 73 <SEP> Bifidobacterium <SEP> adolescentis <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 74 <SEP> Brucella <SEP> melitensis <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 75 <SEP> Campylobacter <SEP> coli <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 28>
Figure img00280001
<tb>
<tb> 76 <SEP> Citrobacter <SEP> diversus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 44 <SEP> 0,22
<tb> 77 <SEP> Clostridium <SEP> septicum <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 34 <SEP> 0,17
<tb> 78 <SEP> Comamonas <SEP> testosterom <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 79 <SEP> Corynebactenum <SEP> ANF <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 80 <SEP> Flavobacterium <SEP> sp <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 81 <SEP> Gemella <SEP> haemolysans <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 82 <SEP> Leclercia <SEP> adecarboxylata <SEP> 1 <SEP> 0,06
<tb> 83 <SEP> Micrococcus <SEP> roseus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 84 <SEP> Moraxella <SEP> osloensis <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 85 <SEP> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 86 <SEP> Peptostreptococcus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 87 <SEP> Staphylococcus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> saprophyhticus
<tb> 88 <SEP> Staphylococcus <SEP> simulons <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 89 <SEP> Staphylococcus <SEP> warnen <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 90 <SEP> Salmonella <SEP> 0,06 <SEP> 42 <SEP> 1,31
<tb> 91 <SEP> Salmonella <SEP> groupe <SEP> C <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 92 <SEP> Salmonella <SEP> heldelberg <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 93 <SEP> Sporobolomycetes <SEP> spp <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 94 <SEP> Stomatococcus <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> mucliagenosus
<tb> 95 <SEP> Streptococcus <SEP> alpha <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> hémolytique
<tb> 96 <SEP> Streptococcus <SEP> groupe <SEP> D <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 130 <SEP> 4,04
<tb> 97 <SEP> Streptococcus <SEP> durans <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 98 <SEP> Streptococcus <SEP> vestibularis <SEP> 1 <SEP> 0,06 <SEP> 0
<tb> 99 <SEP> Candida <SEP> glabrata <SEP> 0,06 <SEP> 0 <SEP> 376 <SEP> 1,84
<tb>
Figure img00280002

100 Yersinia enterocohtica 1 0,06 5 0,16 0
Figure img00280003
<tb>
<tb> 101 <SEP> Clostridium <SEP> groupe <SEP> A <SEP> 0 <SEP> 29 <SEP> 0,9
<tb>
Figure img00280004

102 cinetobactersp. 0 41 1,28 198 0,97
Figure img00280005
<tb>
<tb> 103 <SEP> Bacteroides <SEP> autres <SEP> que <SEP> 0 <SEP> 41 <SEP> 1,28 <SEP> 49 <SEP> 0,24
<tb> fragilis
<tb> 104 <SEP> Candida <SEP> autres <SEP> qu'albicans <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 0,34
<tb> 105 <SEP> Propionibacterium <SEP> sp. <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0,31
<tb> 106 <SEP> Haemophilus <SEP> autres <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 0,28 <SEP> 0
<tb> qu'influenzae
<tb> 107 <SEP> Campylobacte <SEP> sp <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 0,25 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 29>
Figure img00290001
<tb>
<tb> 108 <SEP> Pasteurella <SEP> sp. <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0,19 <SEP> 0
<tb> 109 <SEP> Flavobactenum <SEP> sp <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 0,16 <SEP> 0
<tb>
Figure img00290002

110 u.sobactenum groupe G 0 12 0,37 0
Figure img00290003
<tb>
<tb> 111 <SEP> Clostndium <SEP> autres <SEP> que <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0,31 <SEP> 0
<tb> perfringens
<tb>
Figure img00290004

112 rucella sp 0 5 0,16 0
Figure img00290005
<tb>
<tb> 113 <SEP> Levures <SEP> autres <SEP> que <SEP> Candida <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 0,12 <SEP> 0
<tb> 114 <SEP> Streptocoques <SEP> vindans <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 573 <SEP> 2,8
<tb> 115 <SEP> Nutrinionnaly <SEP> variant <SEP> Strepto <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 77 <SEP> 0,38
<tb>
Figure img00290006

116 OtherGmm(+) bacilli than 0 0 472 2,31
Figure img00290007
<tb>
<tb> Listena <SEP> and <SEP> Coryne
<tb> 117 <SEP> Other <SEP> Enterobactenaceae <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 154 <SEP> 0,75
<tb> 118 <SEP> Other <SEP> Gram(-) <SEP> bacillt <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 55 <SEP> 0,27
<tb> (HACEK <SEP> group)
<tb> 119 <SEP> Other <SEP> Gram(-) <SEP> bacilli <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 77 <SEP> 0,38
<tb> 120 <SEP> Prevotella <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 0,14
<tb> 121 <SEP> Fusobactenum <SEP> necrophorum <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 0,08
<tb> 122 <SEP> Clostridium <SEP> ramosus <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 29 <SEP> 0,14
<tb> 123 <SEP> Clostndium <SEP> clostndioforme <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0,05
<tb> 124 <SEP> Autres <SEP> Clostndium <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 93 <SEP> 0,45
<tb> 125 <SEP> Eubacterium <SEP> spectes <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 0,16
<tb> 126 <SEP> Actinomyces <SEP> spectes <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 0,04
<tb> 127 <SEP> Peptostreptococcus <SEP> species <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40 <SEP> 0,2
<tb> 128 <SEP> Veillonella <SEP> species <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 22 <SEP> 0,11
<tb> 129 <SEP> Autres <SEP> anaerobies <SEP> 0 <SEP> 41 <SEP> 1,28 <SEP> 7 <SEP> 0,03
<tb> 130 <SEP> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 123 <SEP> 0,6
<tb> 131 <SEP> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 181 <SEP> 0,88
<tb> 132 <SEP> Autres <SEP> levures <SEP> et <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 148 <SEP> 0,72 <SEP>
<tb> champignons
<tb> Total <SEP> 1725 <SEP> 100 <SEP> 3214 <SEP> 100 <SEP> 20456 <SEP> 100
<tb>
* Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corodens et Kingella kingae.
Tableau 6 : Fréquence d'isolement de micro-organismes en hémoculture
<Desc/Clms Page number 30>
Si l'on compare chaque amplicon un à un pour chaque espèce précédemment étudié, cet amplicon a une homologie qui est au minimum comprise entre 28 et 68 %, préférentiellement entre 35 et 59 %, et encore plus préférentiellement entre 50 et 59 % par rapport à l'une quelconque des espèces choisies parmi le panel d'espèces bactériennes.
Le tableau 7 ci-après récapitule les résultats obtenus en fonction du taux d'homologie et du nombre d'espèces.
Figure img00300001
<tb>
<tb>
Pourcentage <SEP> Nombre <SEP> d'espèces <SEP> ayant <SEP> Pourcentage <SEP> d'espèce <SEP> ayant
<tb> d'homologie <SEP> cette <SEP> homologie <SEP> cette <SEP> homologie
<tb> Moins <SEP> de <SEP> 30 <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 0,3 <SEP>
<tb> De <SEP> 30 <SEP> à <SEP> 34 <SEP> % <SEP> 2 <SEP> 0,7
<tb> De <SEP> 35 <SEP> à <SEP> 39 <SEP> % <SEP> 5 <SEP> 1,7 <SEP>
<tb> De <SEP> 40 <SEP> à <SEP> 44 <SEP> % <SEP> 7 <SEP> 2,4 <SEP>
<tb> De <SEP> 45 <SEP> à <SEP> 49 <SEP> % <SEP> 22 <SEP> 7,5
<tb> De <SEP> 50 <SEP> à <SEP> 54 <SEP> 191 <SEP> 65,2
<tb> De <SEP> 55 <SEP> à <SEP> 59 <SEP> % <SEP> 61 <SEP> 20,8
<tb> Plus <SEP> de <SEP> 59 <SEP> % <SEP> 4 <SEP> 1,4 <SEP>
<tb> Total <SEP> 293 <SEP> 100,0 <SEP>
<tb>
Tableau 7 : Résultats obtenus en fonction du taux d'homologie et du nombre d'espèces
Un exemple d'amplicon est décrit en relation avec la séquence SEQ ID NO : 10, qui correspond à une séquence d'acides nucléiques de 441 nucléotides amplifiée par l'intermédiaire d'une amorce amont 5' et d'une amorce aval 3' à partir de l'espèce bactérienne Escherichia coli.
A noter que sur la liste de séquences jointes à propos des SEQ ID NO : 1 à 8 et 11 à 18, les amorces étant eubactériennes peuvent être extraites de toutes les autres
<Desc/Clms Page number 31>
espèces décrites dans cette demande de brevet. A contrario, la SEQ ID NO : 10 est spécifique d'Escherichia coli
Enfin les séquences SEQ ID NO : 1 à 8 et 11 à 18 peuvent également être utilisées, comme cela est bien connu de l'homme du métier, en tant que sondes de détection de bactéries.
<Desc/Clms Page number 32>
LISTE DE SEQUENCES <110> BIOMERIEUX <120> Amplification d'une région ribonucléique cible d'un ARN ribosomal 16S ou ADN codant pour un tel ARN d'une espèce eubactérienne et détection de telles espèces <130> PUCE SBF <140> <141> <160> 18 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 1 tacgggaggc agcagtgggg aat 23 <210> <211> 15 <212> ADN <213> Escherichia coh <400> 2 tacgggaggc agcag 15 <210> 3 <211> 18 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 3 gaggcagcag tggggaat 18 <210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 4 ctaccagggt atctaatctt gtttgctccc cacgcttt 38 <210> 5
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<211> 17 <212> ADN <213> Eschenchia coli <400> 5 ctaccagggt atctaat 17 <210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 6 ctaatcttgt ttgctccc 18 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 7 gtttgctccc cacgcttt 18 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Eschenchia coli <400> 8 tctaatcttg tttgctcccc 20 <210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Promoteur T7 <400> 9 taatagactc actataggga ggaggatta 29 <210> 10 <211> 441 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 10 gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt 60 gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggg agtaaagtta 120 atacctttgc tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc 180 cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg 240
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cggtttgtta agtcagatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tctgatactg 300 gcaagcttga gtctcgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag 360 atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg ctcaggtgcg 420 aaagcgtggg gagcaaacag g 441 <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 11 attccccact gctgcctccc gta 23 <210> 12 <211> 15 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 12 ctgctgcctc ccgta 15 <210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Eschenchia coli <400> 13 attccccact gctgcctc 18 <210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 14 aaagcgtggg gagcaaacaa gattagatac cctggtag 38 <210> 15 <211> 17 <212> ADN <213> Eschericlua coli <400> 15 attagatacc ctggtag 17 <210> 16 <211> 18 <212> ADN
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<213> Escherichia coli <400> 16 gggagcaaac aagattag 18 <210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 17 aaagcgtggg gagcaaac 18 <210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 18 ggggagcaaa caagattaga 20

Claims (23)

REVENDICATIONS
1. Amorce oligonucléotidique pour amplifier l'ARN ribosomal 16S ou l'ADN ribosomal codant pour l'ARN ribosomal 16S, qui consiste en une séquence comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou SEQ ID NO . 4 et/ou SEQ ID NO . 11 et/ou SEQ ID NO : 14, dans laquelle l'amorce peut s'hybrider à une région d'une séquence nucléotidique d'une espèce eubactérienne.
2. Amorce, selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 1 est constituée de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, que l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO - 4 est constituée de SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, que l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 11 est constituée de SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13, et que l'amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 14 est constituée de SEQ ID NO : 15 ou SEQ ID NO - 16 ou SEQ ID NO . 17 ou SEQ ID NO : 18.
3. Paire d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier l'ARN ribosomal 16S ou l'ADN ribosomal codant pour l'ARN ribosomal 16S des espèces eubactériennes, qui consiste en : - une première amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1, et - une seconde amorce comportant au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 4, dans lesquelles la première amorce peut s'hybrider à une région d'une première séquence nucléotidique d'une espèce eubactérienne et la seconde amorce peut s'hybrider à une région d'une seconde séquence nucléotidique de cette même espèce eubactérienne, la première et la seconde séquences nucléotidiques, après avoir subi une extension, étant complémentaires.
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4. Paire d'amorces, selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la première amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 1 est constituée de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, et que la seconde amorce issue de la séquence SEQ ID NO : 4 est constituée de SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO :6 ou SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8.
5. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle consiste en une séquence comportant au moins 15nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11à 18.
6. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que l'amorce oligonucléotidique SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11à 18 est associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase.
7. Amplicons issus d'ARN et/ou d'ADN bactérien, correspondant à l'amplification d'une espèce bactérienne parmi un panel d'au moins 100, préférentiellement au moins 150 et encore plus préférentiellement au moins 200 espèces bactériennes potentiellement amplifiables, utilisant au plus 6, préférentiellement au plus 4 et encore plus préférentiellement au plus 2 amorces oligonucléotidiques, chaque amplicon consiste en une séquence constituée de trois zones différentes : # deux zones génétiquement conservées situées à chaque extrémité de l'amplicon et permettant l'hybridation des amorces, et # une zone située, entre les deux zones précédentes, ayant un pouvoir résolutif du polymorphisme d'espèces par rapport à l'ensemble des amplicons issus de l'amplification des autres espèces bactériennes et ayant les caractéristiques suivantes : - un taux d'homologie compris entre 28 et 68 %, préférentiellement entre 35 et
59 %, et encore plus préférentiellement entre 50 et 59 % par rapport à l'une quelconque des espèces choisies parmi le panel d'espèces bactériennes, et - une longueur inférieure à 1000 nucléotides préférentiellement inférieure à 500 nucléotides.
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8. Amplicons, selon la revendication 7, obtenus par amplification avec une amorce ou l'une des paires d'amorces, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui consistent en une séquence constituée de trois zones différentes : - deux zones génétiquement conservées situées à chaque extrémité de l'amplicon et permettant l'hybridation des amorces, et - une zone située, entre les deux zones précédentes, apparentée à la séquence SEQ ID NO . 10 et ayant un pouvoir résolutif du polymorphisme d'espèces par rapport à l'ensemble des amplicons des autres espèces bactériennes.
9. Amplicons, selon la revendication 8, caractérisés par le faitque la zone ayant un pouvoir résolutif a une homologie par rapport aux autres espèces bactériennes compris entre 28 et 68 %, préférentiellement entre 35 et 59%, et encore plus préférentiellement entre 50 et 59 %.
10. Procédé pour amplifier une région ribonucléique cible d'un brin d'acide nucléique d'une espèce eubactérienne, caractérisé en ce qu'il comporte les différentes étapes suivantes : (a) hybridation, sur le brin d'acide nucléique concerné, d'une première amorce SEQ ID NO - 4 à 8, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, et (b) utilisation d'une enzyme à activité polymérase enzymatique pour étendre la première amorce afin d'obtenir un double brin d'acide nucléique.
11. Procédé, selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste, sans les étapes (a) et (b) ou après les étapes (a) et (b), à effectuer (c) séparation d'un double brin pour obtenir deux simples brins complémentaires, (d) hybridation sur le premier brin d'une première amorce, SEQ ID NO : 4 à 8, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, hybridation sur le second brin complémentaire d'une seconde amorce
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SEQ ID NO : 1 à 3, éventuellement associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase, (e) extension des première et seconde amorces afin d'obtenir deux brins d'ADN complémentaire, contenant éventuellement une séquence promotrice, et (f) répétition éventuelle des étapes (c) à (e) en fonction du nombre de brin d'acide nucléique contenant la région ribonucléique cible que l'on souhaite amplifier.
12. Procédé, selon la revendication 11, caractérisé en ce que le simple brin d'ARN obtenu dans l'étape (f) est utilisé comme matrice de synthèse du double brin d'ADN des étapes (a) à (e), afin d'établir une phase cyclique d'amplification.
13. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que, dans l'étape (b), une enzyme ARNase H est utilisée pour séparer le simple brin d'ADN du double brin ARN-ADN.
14. Méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : # prélever d'un échantillon biologique contenant au moins un ARN ribosomal 16S ou un ADN, codant pour l'ARN ribosomal 16S, d'au moins une espèce eubactérienne, # amplifier l'ARN ou ADN ribosomal 16S eubactérien in vitro dans un mélange contenant au moins une enzyme ayant une activité polymérase, et au moins deux amorces ayant des séquences sélectionnées parmi les SEQ ID NO : 1 à 8 et 11à 18 pour obtenir des acides nucléiques eubactériens amplifiés, et # détecter les acides nucléiques eubactériens amplifiés par détection d'un marqueur associé auxdits acides nucléiques eubactériens amplifiés.
15. Méthode, selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes supplémentaires suivantes : * ajouter à l'échantillon biologique au moins un oligonucléotide de capture qui s'hybride spécifiquement aux acides nucléiques eubactériens amplifiés, et au moins un
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acide nucléique qui immobilise l'oligonucléotide de capture dans des conditions d'hybridation pour constituer un complexe d'hybridation, et séparer le complexe d'hybridation par rapport aux autres constituants de l'échantillon biologique avant l'étape d'amplification.
16. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que l'étape d'amplification amplifie l'ARN ou ADN 16S des espèces suivantes : Abiotropha adjacens, Acinobacter baumanii, Aeromonas hydrophila, Atobobium parvulum, Bacillus acidocaldarius, Bacillus brevis, Bacillus caldovelox, Bacillus licheniformis, Bacillus piliformis, Bacillus schlegelii, Bacteroides fragilis, Brochothrix campestris, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli, Campylobacter coli, Campylobacter curvus, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter sputorum, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Clostridium perfringens, Corynebacterium hoagii, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium xerosis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Escherichia coli, Flavobacterium meningosepticum, Flavobacterium odoratum, Flavobacterium thalpophilum, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium nucleatum animalis, Fusobacterium nucleatum fusiforme, Fusobacterium nucleatum nucleatum, Fusobacterium nucleatum polymorphum, Haemophilus influenza, Haemophilus parahaemolyticus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus paraphrophilus, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae ozaenae, Klebsiella
Figure img00400001
pneumoniae pneumoniae, Klebsiella pneumomae rhinoscleromatis, Leuconostoc fallax, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Neisseria meningitidis, Pantoea agglomerans, Propionibacterium freundenreichii, Propionibacterrum propionicus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas citronellolis, Salmonelle agona, Salmonella bareilly, Salmonella blockley, Salmonella bovis morbificans, Salmonella chingola, Salmonella enteritidis, Salmonella give, Salmonella matopeni, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhimurium, Salmonella weltevreden, Serratia marcescens, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Staphylococcus
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Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis / xylosus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae str, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulons, Staphylococcus vitulus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus acidominimus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolytiens, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus caprinus, Streptococcus cecorum, Streptococcus constellatus, Streptococcus criae, Streptococcus cricetus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus gordonii, Streptococcus hansenii, Streptrococcus hyointestinalis, Streptococcus intermedius, Streptococcus intestinalis, Streptococcus macacae, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Steptococcus mutans, Streptococcus parasanguis, Streptococcus parauberis, Streptococcus pleomorphus, Steptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus / uberrs, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus saccharolyticus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus thoraltensis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Veillonella atypica, Veillonella vispar, Veillonella parvula, Xanthomonas maltophilia et Yersinia enterocolitica.
aerophilus, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus,
17. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que l'étape de détection utilise au moins une sonde qui s'hybride spécifiquement sur les acides nucléiques eubactériens amplifiés.
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18. Méthode, selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'étape de détection utilise au moins une sonde marquée qui s'hybride spécifiquement sur les acides nucléiques eubactériens amplifiés.
19. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que l'étape d'amplification utilise une combinaison d'au moins deux amorces, une première amorce sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 3 et une seconde amorce sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO : 4 à 8.
20. Kit de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce eubactérienne présente dans un échantillon biologique, qui comprend une paire d'amorces dans laquelle : - une première amorce comporte au moins 10, préférentiellement au moins 15 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 3, et - une seconde amorce comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15 nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 4 à 8.
21. Kit, selon la revendication 20, caractérisé par le fait que la première amorce est associée à une séquence d'acides nucléiques promotrice pour la fixation d'une polymérase.
22. Kit, selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une sonde oligonucléotidique, spécifique de la séquence amplifiée, qui consiste en une séquence comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15, et préférentiellement au moins 20 nucléotides successifs.
23. Sonde de détection qui consiste en une séquence comportant au moins 10, préférentiellement au moins 15, nucléotides successifs pris dans la séquence SEQ ID NO : 1 à 8 ou 11 à 18, dans laquelle la sonde s'hybride à une région spécifique d'une séquence nucléotidique d'une seule espèce eubactérienne.
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