WO2007034118A1 - Procede de detection, dans un echantillon biologique de mycobacteries, et en particulier de mycobacteries caracteristiques de la tuberculose - Google Patents

Procede de detection, dans un echantillon biologique de mycobacteries, et en particulier de mycobacteries caracteristiques de la tuberculose Download PDF

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WO2007034118A1
WO2007034118A1 PCT/FR2006/050916 FR2006050916W WO2007034118A1 WO 2007034118 A1 WO2007034118 A1 WO 2007034118A1 FR 2006050916 W FR2006050916 W FR 2006050916W WO 2007034118 A1 WO2007034118 A1 WO 2007034118A1
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seq
fluorochrome
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Monique Chomarat
Franck Breysse
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Hospices Civils De Lyon
Universite Claude Bernard Lyon I
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method of detection in a biological sample, mycobacteria in particular, those responsible for tuberculosis.
  • Tuberculosis remains one of the major public health problems in the world. In France, it is a disease that remains relevant with, among migrant people, an incidence 13 times higher than the rest of the population and which has increased by 8% each year since 1997. The multi-resistance mainly affects migrants (82% ), but although limited (1.4%), it has almost doubled in two years.
  • Mycobacterium tuberculosis complex comprises 5 species of mycobacteria, namely M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti and M. canettii.
  • the genus Mycobacterium comprises more than 100 species.
  • AZA acid-fast bacilli
  • Nucleic acid amplification assays are increasingly used in diagnostic tests.
  • the polymerase chain reaction (PCR) detection of species-specific DNA or of the genus mycobacteria is therefore a very promising approach.
  • the basic principle of any molecular diagnostic test is to hybridize a bacterial-specific nucleic acid sequence that one wishes to detect, to a complementary sequence called a probe, and then to perform a detection of the disease. 'hybrid.
  • PCR is usually performed on a DNA template previously extracted from the biological sample. Relatively simple procedures, well known to those skilled in the art, make it possible to extract nucleic acids from clinical specimens. Nevertheless, the extracted nucleic acids may contain impurities that inhibit nucleic acid amplification assays. Negative results, then, do not necessarily indicate the absence of the desired nucleic acid. Due to this possibility of false negative reactions, the use of nucleic acid amplification tests has been questioned.
  • PCR has made recent progress, with the development of real-time PCR that has significantly simplified and accelerated PCR.
  • the LightCycler® system marketed by Roche Diagnostics, combines PCR with real-time detection.
  • Hybridization products using two fluorogenic hybridization probes that use the principle of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and which allows to obtain much faster results.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • This system has been used successfully for the rapid detection or identification of various microorganisms (viruses, parasites, fungi and bacteria). It has also been shown that real-time PCR with fluorogenic probes is useful for the detection of mycobacteria, including the M.
  • the new detection method according to the invention must also be easy to use, and be at least as fast as current techniques that are time consuming and reagents.
  • the main subject of the present invention is a method for detecting the possible presence of bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample, which uses the real-time PCR technique and which comprises the following steps: ) amplification of the DNA of the biological sample, with: a pair of primers in which each of the primers comprises from 18 to 22 nucleotides, and
  • either one of the primers has at least 90%, preferentially at least 95% and preferably 100% sequence identity with the sequence SEQ ID N 0 I: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT and the other primer has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 2: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OR either one of the primers has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 13: 5'-GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT and the other primer has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No.
  • the method according to the invention makes it possible to detect the presence of bacteria belonging to Mtbc.
  • the detection method according to the invention also makes it possible to detect the other species of the genus Mycobacterium.
  • a second pair of FRET probes of the Mycobacterium genus consisting of:
  • an anchoring probe which corresponds to an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 5: 5 ' -AGG ACC GTA GAA GAA GAT CGG, and which is preferably labeled at 3 'by a fluorochrome donor, and
  • hybridization probe which corresponds to an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 6: 5 ' -GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, and which is preferably labeled in 5 ', by a fluorochrome acceptor.
  • the method according to the invention uses an internal control (IC).
  • IC internal control
  • the DNA of the biological sample is also placed in the presence of a CI on the one hand and a third pair of specific FRET probes on the other hand , advantageously constituted:
  • an anchoring probe which corresponds to an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 7: 5 ' -AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, and which is preferably labeled in 3 ', by a fluorochrome donor, and
  • hybridization probe which corresponds to an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides and which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 8: 5 -CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, and which is preferably labeled in 5 ', by an acceptor fluorochrome.
  • the identification of the species present is then carried out by sequencing using a sequencing primer which comprises from 18 to 28 nucleotides and which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A.
  • the invention also relates to a diagnostic kit for the in vitro detection of mycobacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in a biological sample comprising:
  • each of the primers comprises from 18 to 22 nucleotides
  • either one of the primers has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 1: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT and the other primer has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 2: S'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OR
  • one of the primers has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 13: 5'-GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT and the other primer has at least 90%, preferentially at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 14: 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT,
  • the reagents necessary to allow the amplification of a nucleic acid fragment having a specific zone of the Mycobacterium genus and possibly a specific zone of the Mycobacterium tuberculosis complex by means of the said primers,
  • An oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which presents at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3 -5GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA , preferably 3 'coupled to a donor fluorochrome, advantageously fluorescein, and An oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which presents at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4 -5GGA CGG GGA GAA GGT , preferably 5 'coupled to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red640.
  • the diagnostic kit also comprises a pair of specific FRET probes of the genus Mycobacterium consisting of:
  • an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with SEQ ID NO: 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, preferably coupled at 3 'to a donor fluorochrome, advantageously fluorescein and
  • an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with SEQ ID NO: 6'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, preferably coupled in 5 'to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red670.
  • the diagnostic kit also comprises an internal control (CI) and a pair of FRET probes specific to the IC.
  • the internal control is a double-stranded nucleotide sequence of sequences: SEQ ID No. 10:
  • an oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with SEQ ID NO: 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, preferably coupled in 3 'to a fluorochrome donor, advantageously fluorescein,
  • oligonucleotide of 18 to 22 nucleotides which has at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with SEQ ID No. 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, preferably 5 'coupled to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red705.
  • the subject of the present invention is also oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of similarity with one of the following sequences:
  • SEQ ID NO: 3 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA
  • SEQ ID NO: 4 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT
  • SEQ ID NO: 6 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT
  • SEQ ID NO: 7 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G
  • SEQ ID NO: 8'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C particularly suitable for use as hybridization probes.
  • the subject of the invention is also the following oligonucleotides labeled with a fluorochrome:
  • oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 3: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, and which are preferably coupled in 3 'to a donor fluorochrome, advantageously fluorescein;
  • oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID No. 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, and which are preferably coupled in 5 'to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red640;
  • oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, and which are preferably coupled 3 'to a donor fluorochrome, preferably fluorescein;
  • oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 6: 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, and which are preferably 5 'coupled to an acceptor fluorochrome, preferably LC Red670;
  • oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7: 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, and which are preferably 3 'coupled to a donor fluorochrome, preferably fluorescein, and
  • the oligonucleotides of 18 to 22 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 8: 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, and which are preferably coupled in 5 'to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red705.
  • the subject of the invention is also the oligonucleotides of 18 to 28 nucleotides which have at least 90%, preferably at least 95% and advantageously 100% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 9: 5'-CGC CAA AGG
  • These oligonucleotides are particularly suitable for the sequencing of the amplification products obtained in the context of the invention, which correspond to the DNA of a species belonging to the genus Mycobacterium.
  • nucleic acid will be used interchangeably in the present description to denote a precise sequence of nucleotides, modified or otherwise, which may corresponding to double-stranded DNA, single-stranded DNA or RNA or the transcripts of said DNAs. Preferably, and unless otherwise stated, these terms will preferably refer to single-stranded DNA.
  • the percentage of sequence identity is, in the sense of the invention, determined by the nucleic sequence comparison techniques, performed after alignment. It can be determined on part of the sequence or on the entire sequence.
  • Sequence alignments are performed, for example, with the SeaView software (Galtier et al., Comput Biosci., 12, 543-548, 1996) which utilizes the Clustal_w alignment program developed by Thompson et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673-4680, 1994). After alignment, the percentage of sequence identity is then calculated between the two aligned fragments of the same length, by counting manually or with commercial software, the number of identical bases and dividing it by the length of the fragment. x 100 on which the comparison was made.
  • probes or primers which have at least 90%, preferably at least 95% and preferably 100% of similarity with the probes and primers of SEQ ID NO. 1 to 9 and SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14.
  • the percentage of similarity accounts for the similarity over the total length of the two sequences compared.
  • the percentage of similarity of two sequences (a sequence of a length of x bases and a sequence of a length of y bases) is calculated, after alignment of the two compared sequences, by counting manually or with the aid of software commercial the number of identical bases (number equal to z) and dividing it by the sum of the base numbers of the 2 fragments (x + y) minus the number of identical bases (z) and times 100.
  • probes or primers which correspond to the probes or primers of SEQ ID No. 1 to 9 or SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14, or which do not differ from each other, will preferably be used. the latter only by one or two bases.
  • the real-time PCR reaction is performed on the DNA of a biological sample.
  • This DNA can be either directly extracted from the biological sample, or it is the RNA of the biological sample that can be extracted and transformed into DNA by a reverse transcription enzyme. DNA or RNA extraction techniques are well known to those skilled in the art.
  • biological sample is meant a sample containing biological material.
  • This sample may come from a biological sample taken from a living being (human patient, animal, plant), a bacterial culture or a sample taken from the soil, water ...
  • all types of clinical samples or biological cultures that may contain bacterial populations such as cells, tissues, biological secretions or body fluids can be used in the method that is the subject of the invention.
  • the biological samples according to the invention are advantageously derived from broncho-pulmonary samples of patients.
  • the detection method according to the invention is therefore an in vitro diagnostic method.
  • the present invention uses the real-time PCR technique, which can be implemented in particular on the LightCycler® 2.0 device, marketed by Roche Diagnostics. Any other apparatus for real-time PCR can of course be used. Real-time PCR makes it possible in one experiment to perform both gene amplification and detection, which results in considerable time savings.
  • Each gene amplification of the target DNA comprises its hybridization with a pair of FRET probes and a pair of primers and its extension with a DNA polymerase. More specifically, each real-time PCR cycle comprises the following successive steps:
  • a denaturation step during which the double-stranded DNA contained in the reaction mixture is heated to cause the separation of the 2 DNA strands.
  • the target DNA, the primers and the probes are then single stranded.
  • the fluorochrome donor is excited, in the case of fluorescein by a blue light at 470nm, and emits a green light at 530 nm in the case of fluorescein.
  • a hybridization step carried out at a lower temperature during which the PCR primers as well as the hybridization probes hybridize to their complementary regions.
  • the donor fluorochrome then comes close to the acceptor fluorochrome and the energy emitted by the donor fluorochrome excites the fluorochrome receptor which then emits in the red light, in particular at 610, 640, 670, 705 nm, depending on the selected fluorochrome. The red light emitted is then measured.
  • an extension step in which, after hybridization on the target regions, the target DNA is amplified from the primers by a DNA polymerase.
  • the amount of target DNA has doubled and once the elongation approaches the end, the DNA is double stranded.
  • the hybridization probes have been moved from their target area,
  • At least 30, preferably at least 45 PCR cycles are performed to obtain a satisfactory fluorescence measurement.
  • an anchoring probe carrying a fluorochrome or fluorophore donor (for example, fluorescein), preferably in position 3 ', that is to say photon emitter; this probe will hybridize to an area of the target nucleic acid sequence whose presence is to be detected, and a hybridization probe which hybridizes with the target nucleic acid sequence, the presence of which is to be detected, which is very close, most often separated from one or two pairs of nucleotides, from the zone to which the anchor probe; this hybridization probe is carrier, preferably in the 5 'position, of another fluorochrome, named acceptor or "quencher” (for example, rhodamine derivatives such as LC Red640, LC Red670, LC Red705, marketed by Roche Diagnostics or cyanine derivatives such as Cy5, Cy5.5 marketed by Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) which will capture the photons of the donor fluorochrome and re-emit them at another wavelength.
  • LC Red-640 florophore presents, for example, the formula:
  • the coupling with the oligonucleotide is via the / V-succinimide function.
  • the use of a pair of FRET probes makes it possible to carry out a melting curve after progressive heating, up to a temperature of 80-90 ° C. for example, of the amplification products obtained at the end of the PCR.
  • the double strands of the amplification products and, in particular, those carrying labeled probes dissociate. Fluorescence decreases until complete disappearance. The fluorescence thus measured, during this progressive heating, will produce a curve whose device calculates the first derivative to have a curve in "bell".
  • This curve makes it possible to define a Tm (melting temperature of the amplification product) which is a characteristic of the amplification product obtained under the experimental conditions.
  • the method according to the invention in the case of a positive detection of fluorescence corresponding to a hybridization of specific probes of the genus Mycobacterium or Mtbc, will advantageously comprise a step of determining the melting curve of the amplification product and a determination of the melting temperature of the amplification product obtained.
  • the following FREET probes are advantageously used for the detection of the Mtbc complex.
  • nucleotide sequence of sequence SEQ ID No. 3 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, preferably coupled in 3 'to a donor fluorochrome, advantageously fluorescein,
  • hybridization probe nucleotide sequence of SEQ ID No. 4: 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, preferably coupled in 5 'to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red640.
  • the following FRET probes are advantageously used for the detection of the genus Mycobacterium:
  • nucleotide sequence of SEQ ID No. 5 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, preferably coupled 3 'to a donor fluorochrome, advantageously fluorescein,
  • hybridization probe nucleotide sequence of SEQ ID No. 6: 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, preferably coupled in 5 'to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red670.
  • an internal control is used to verify the amplification.
  • the IC is a target, other than the specific target DNA of the species that one wishes to detect.
  • positive detection of the IC hybridization product demonstrates that the amplification reaction has indeed taken place, and then validates a negative response.
  • a negative response is a lack of fluorescence detection at the wavelength where the fluorochrome acceptor of the pair of corresponding probes would have emitted if said pair of probes had hybridized on a target DNA.
  • a positive response is a fluorescence detection at this same wavelength.
  • This IC makes it possible to check if the detection is negative, by absence of target DNA or by inhibition of the amplification.
  • the construction of this synthetic CI can be carried out with, on the one hand, regions identical to the primers used for the amplification of the specific fragments of the species whose presence is to be detected, and, on the other hand, a binding region for a couple of FRET probes that differentiates the IC from the amplified target nucleic acid. That is, the binding region is chosen such that it does not hybridize with specific Mtbc and Mycobacterium probes.
  • a hybrid DNA segment composed of a 216 bp phage lambda DNA fragment (position 13551 to 13766) flanked at both ends by two short Mtbc (20 bp) sequences corresponding to the primers or their reverse sequences is advantageously chosen as an internal control.
  • a double-stranded IC will be used, of sequences: SEQ ID N 0 IO:
  • This IC is used with the primers of SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2, or primers having the% identity or similarity desired.
  • the internal control may be an expression vector such as a plasmid containing the sequences of the primers necessary for the amplification of Mtbc, as well as a nucleotide zone which does not correspond to an area of the DNA of the mycobacteria and for which a FRET probe has been built. Insertion in a plasmid, advantageously with Escherichia coli, makes it possible to improve its conservation.
  • this IC will have the sequence SEQ ID No. 15:
  • this IC will have the sequence SEQ ID No. 16:
  • a limited number of CI molecules is added to each DNA sample extracted and co-amplified with the target nucleic acid.
  • an oligonucleotide of nucleotide sequence of SEQ ID No. 8 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, preferably 5 'coupled to an acceptor fluorochrome, advantageously LC Red705.
  • the different hybridization probes are, labeled with different acceptor fluorochromes, to be able to distinguish during detection the different hybridization complexes possibly obtained.
  • the different pairs of probes are added to the reaction mixture containing the extracted bacterial DNA. , before performing the amplification.
  • three pairs of FRET probes are used simultaneously: a couple of probes for a complex Mtbc, a pair of probes for the genus Mycobacterium and a pair of probes for the CL.
  • the PCR is advantageously of the "touchdown" type, that is to say that in the first cycles of PCR, the hybridization is carried out at a high and therefore specific hybridization temperature. After a number of cycles, the hybridization temperature is lowered to the optimum primer annealing temperature for a sufficient number of cycles to obtain sufficient amplified DNA. In the context of the invention, in the first cycles of PCR (for example in the first 16 cycles), the hybridization temperature decreases, preferably from 68 ° C. to 60 ° C., the optimum temperature for the following cycles.
  • the method according to the invention comprises a sequencing step which makes it possible to identify the bacterial species, in particular the atypical mycobacteria, or the species not cultivable M. leprae. Sequencing is preferably carried out with the nucleotide primer of SEQ ID NO: 9'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A.
  • primers and probes according to the invention can be prepared according to conventional chemical synthesis techniques.
  • the method according to the invention in its most complete variant, therefore allows the amplification of all mycobacteria with: 1. a specific detection of Mtbc, with a first pair of FRET probes;
  • the sensitivity obtained for the detection of Mtbc from the analysis of 158 clinical samples was 93.1% with a specificity of 92.2%.
  • the total duration of the analysis with the method according to the invention may be 3 hours, including 1 hour for extraction, while conventional PCR techniques require on average 8 hours.
  • the real-time techniques previously used do not allow the simultaneous detection of internal control, Mycobacteria and Mtbc.
  • L 1 DNA bacterial reference strains is extracted using a solution of achromopeptidase to 5 U / ml (15 min at 55 ° C). After a brief centrifugation, the crude lysate is used as a template for the determination of specificity.
  • a serial dilution of 10 9 bacteria per ml is carried out. Dilutions are extracted with the High Pure PCR Template Preparation Kit reagent (Roche Diagnostics Meylan France) as well as all samples. To increase the sensitivity, 400 .mu.l of sample are extracted, according to the manufacturer's instructions, except for the elution of DNA which is carried out with 50 .mu.l of elution buffer instead of 200 .mu.l.
  • a 439-bp fragment is amplified using primers TbI1 of SEQ ID No. 1 and Tbl2 of SEQ ID No. 2.
  • Probes were designed by comparing the hsp65 sequences of different previously published mycobacteria.
  • the following FRET probes are used for the detection of the Mtbc complex: 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA fluorescein (SEQ ID NO: 3 fluorescein) as anchoring probe and: LC Red640-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT-phosphate (LC Red640-SEQ ID No. 4) as a hybridization probe.
  • FRET probes are used for the detection of the genus Mycobacterium: 5'-AGG ACC GA CGA GAA GAT CGG-Fluorescein (SEQ ID No. 5 fluorescein) as an anchoring probe and: LC Red670-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT-phosphate (LC Red670-SEQ ID No. 6) as a hybridization probe.
  • a sequence is constructed by inserting a DNA sequence of the IC into a DNA plasmid.
  • a hybrid DNA segment consisting of a 216 bp phage lambda DNA fragment (position 13551 to 13766) flanked at both ends by two short Mtbc (20 bp) sequences corresponding to the primers is selected as a control. internal.
  • Hybrid primers CIBK1 and CIBK2 are synthesized with hsp65 primers previously described by Telenti et al. 1993, supra.
  • CIBK2 (antisense): SEQ ID NO: 12: CTTGTCGAACCGCATACCCTAGAAAACGGGCGTAAACCTT
  • Bold indicates external hsp65 gene primers and normal characters indicate primers for lambda phage DNA.
  • L 1 hybrid DNA is amplified from CIBKl and CIBK2 primers with I 1 lambda phage DNA as a template (Roche Diagnostics), DNA polymerase (pureTaq Ready to Go PCR -Amersham Biosciences) with the aid of a conventional thermocycler (95 ° C, 2 min, then 35 cycles with 94 ° C 30 s, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min then 72 ° C 10 min to ensure a complete reaction).
  • the amplified products (5 .mu.l) are subjected to agarose gel electrophoresis (E-Gel® 1.2% agarose gels, Invitrogen Life Technologies) and then visualized under UV light to control the amplification of DNA.
  • E-Gel® 1.2% agarose gels Invitrogen Life Technologies
  • the resulting hybrid fragment (300 bp) consists of a double-stranded phage lambda pf sequence (216 bp) flanked at both ends by two short Mtbc sequences (20 bp).
  • SEQ ID N 0 IO (direction):
  • the border sequences are complementary to primers TbI1 and Tbl2 and are targets for these primers.
  • I 1 lambda-DNA hybrid MTBC phage is then cloned into a plasmid ⁇ 'Escherichia coli (TOPO ® plasmid pCR®2.1- 3.9 kb; TOPO TA cloning kit, Invitrogen Life Technologies, Cergy 95613 Pontoise) according to the manufacturer's instructions.
  • TOPO ® plasmid pCR®2.1- 3.9 kb; TOPO TA cloning kit Invitrogen Life Technologies, Cergy 95613 Pontoise
  • E. coli is seeded on selective media containing ampicillin and X-GaI (LB IPTG Agar Amp / X-Gal E.coli FastMedia TM MBI Fermentas) and incubated 18 hours at 35 ° C.
  • the plasmids containing the insertion segment are purified with the Wizard®Plus miniprep kit (Promega Charbonippos-les-Bains - France) and linearized with the XbaI enzyme (Promega). The enzyme is denatured at 94 ° C for 10 min.
  • the insertion segment is purified with the Wizard®Plus miniprep kit (Promega).
  • the products (5 ⁇ l) are subjected to agarose gel electrophoresis (E-Gel® 1.2% agarose gels, Invitrogen Life Technologies). The gel is visualized under UV light.
  • the optimum concentration of the plasmid is determined by dilution of 10 "1-10" 10 so as to minimize competition between the specific target DNA MTBC complex and I 1 CI target DNA during amplification.
  • the amplification program is the same as for Mycobacterium tuberculosis complex.
  • Probes are designed by comparison with a previously described sequence of lambda phage.
  • the following FRET probes are used for the detection of IC: 5'-AGTACGCCCCACGCTGACGG-fluorescein (SEQ ID NO: 7 fluorescein), as anchor probe and LC Red705-CTAACCTGTACGGTATGGTCAC-phosphate (LC Red705-SEQ ID NO. 8) as a hybridization probe.
  • the reaction mixture (LC FastStart DNA Master Hybridization Probes (Roche Biochemicals) containing Taq FastStart polymerase, the reaction buffer, deoxynucleoside triphosphates is supplemented with MgCl 2 so as to obtain 2.5 mM final. final concentration of 0.53 ⁇ M and the three pairs of DNA probes at 0.2 ⁇ M each and the CI at 3 to 6 copies, the reaction mixture is introduced into a reaction vessel located above a glass capillary (20 ⁇ l) After adding the DNA matrix, the glass capillaries are filled by a brief centrifugation to move the liquid to the bottom of the capillary.
  • the amplification program begins with a denaturation step of 10 min at 95 ° C, followed by 55 cycles of PCR with 1 denaturation cycle (15 s at 95 ° C), a hybridization "touchdown" (30 s at a temperature ranging from 68 ° C. to 60 ° C., no 0.5 ° C. / cycle) and extension (30 sec at 72 ° C.).
  • the temperature transition rate is 20 ° C / s for denaturation and hybridization and 2 ° C / s for extension.
  • the amplification program is followed by cooling for 30 seconds at 40 ° C.
  • Version 4 of the LightCycler software adjusts the gain in each channel. A color compensation test is conducted and the color compensation data is recorded in the LightCycler software.
  • Each LightCycler assay includes a negative control in which the matrix is replaced with distilled water to control cross-contamination and a positive control containing DNA at 10 6 CFU / ml.
  • PCR assays are conducted on serial dilutions of suspensions of Mycobacterium tuberculosis H37rv (from 10 8 to 10 CFU / ml) and with a negative sputum to which are added the same dilutions. Extraction is performed with the High Pure PCR Template Preparation Kit Template Preparation Kit (Roche Diagnostics).
  • the detection limit is 5 x 10 3 CFU / ml. All amplifications were performed with the IC.
  • the PCR assay is evaluated with different mycobacteria and with other bacteria (Table 1).
  • Table 1 List of bacterial species tested for specificity
  • the amplification product is heated at 45 ° C. and then at 75 ° C. at a rate of 0.1 ° C./s with continuous measurement of the fluorescence and its melting curve. is determined by the software by calculating the first derivative of the curve obtained by heating the amplified DNA.
  • the curves shown FIGURE IA and IB (corresponding respectively to the melting curve and the first derivative of the melting curve) are then obtained.
  • the melting temperature Tm of the amplification product thus calculated is 59.3 ° C.
  • the Tm of Mtbc is 64 ° C. ⁇ 20 ° C. and the Tm of the other species of mycobacteria are between 49 and 58 ° C. at ⁇ 2 ° C.
  • the amplicons are purified with the Exosapt-IT enzyme (Amersham, Les Ulis, France) and sequenced in one direction using the sequence primer SEQ ID No. 9: 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A (1 ⁇ M) using the Beckman Coulter Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
  • the reaction uses the following program on the LightCycler: 5 cycles amplification at 95 ° C for 3 s, hybridization of the primer at 50 0 C for 4 s and extension at 60 0 C for 30 s.
  • the amplified and labeled products are purified with the Qiagen DyeEx 2.0 Spin Kit Kit (QIAgen,) before being passed through the columns of a CEQ 2000 XL sequencer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). The resulting sequence is then compared to a database, which allows the identification of the detected Mycobacterium.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend une étape d'amplification avec un couple d'amorces de PCR et un couple de sondes FRET issus du gène hsp 65 et la détection de la fluorescence émise.

Description

PROCEDE DE DETECTION, DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE DE MYCOBACTERIES, ET EN PARTICULIER DE MYCOBACTERIES CARACTERISTIQUES DE LA TUBERCULOSE
La présente invention est relative à une méthode de détection dans un échantillon biologique, des mycobactéries en particulier, celles responsables de la tuberculose.
La tuberculose demeure l'un des problèmes majeurs de santé publique dans le monde. En France, c'est une maladie qui reste d'actualité avec, chez les personnes migrantes, une incidence 13 fois supérieure au reste de la population et qui augmente de 8% chaque année depuis 1997. La multirésistance touche surtout les migrants (82%), mais bien que limitée (1,4%), elle a presque doublé en deux ans.
Il est très difficile de combattre la tuberculose, ainsi que les autres infections dues aux mycobactéries. Il existe donc un besoin de méthodes rapides, spécifiques et sensibles permettant de diagnostiquer ces infections. En particulier, la détection rapide et exacte du complexe Mycobacterium tuberculosis (Mtbc) est essentielle pour le traitement précoce et la réduction de la transmission. Le complexe Mycobacterium tuberculosis (Mtbc) comprend 5 espèces de mycobactéries, à savoir M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti et M. canettii. Le genre Mycobacterium comprend, quant à lui, plus de 100 espèces.
La détection de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) dans des frottis préparés à partir de prélèvements biologiques a été la base de l'identification rapide d'individus potentiellement porteurs de la tuberculose. Néanmoins, le frottis manque de spécificité et de sensibilité. C'est pourquoi la mise en culture demeure indispensable. Cependant, l'obtention d'une croissance bactérienne peut demander plusieurs semaines.
Les essais d'amplification d'acide nucléique sont de plus en plus utilisés dans les tests de diagnostic. La détection par PCR (de l'anglais « polymerase chain reaction ») d'ADN spécifique d'espèces ou du genre mycobactéries constitue donc une approche très prometteuse. Le principe de base d'un essai diagnostique moléculaire quelconque est d'effectuer une hybridation d'une séquence d'acide nucléique spécifique à la bactérie que l'on souhaite détecter, à une séquence complémentaire nommée sonde, puis de réaliser une détection de l'hybride.
Les tests mettant en oeuvre la PCR pour la détection de MtIx. sont proches de la sensibilité et de la spécificité de la culture, mais présentent l'avantage d'être plus rapides. En raison de sa capacité à amplifier spécifiquement des quantités infimes d'acides nucléiques, la PCR a été appliquée avec un grand succès dans des diagnostics cliniques.
La PCR est généralement réalisée sur une matrice d'ADN préalablement extraite de l'échantillon biologique. Des procédures relativement simples, bien connues de l'homme de l'art, permettent d'extraire des acides nucléiques à partir de spécimens cliniques. Néanmoins, les acides nucléiques extraits peuvent contenir des impuretés qui inhibent les essais d'amplification d'acide nucléique. Des résultats négatifs n'indiquent, alors, pas nécessairement l'absence de l'acide nucléique recherché. En raison de cette possibilité de réactions faussement négatives, l'utilisation de tests d'amplification d'acide nucléique a été remise en question.
Par ailleurs, la PCR a connu des progrès récents, avec le développement de la PCR en temps réel qui a simplifié et accéléré considérablement la PCR. Pour plus de précisions sur cette technique, on pourra se référer à Reviews in Biology and Biotechnology, 2(23), 2002, 2- 11. Le système LightCycler®, commercialisé par Roche Diagnostics, combine la PCR avec la détection en temps réel des produits d'hybridation à l'aide de deux sondes d'hybridation fluorogènes qui utilisent le principe de transfert d'énergie de résonance par fluorescence (FRET) et qui permet d'obtenir des résultats beaucoup plus rapides. Ce système a été utilisé avec succès pour la détection ou l'identification rapide de différents micro-organismes (virus, parasites, champignons et bactéries). Il a été également démontré que la PCR en temps réel avec des sondes fluorogènes est utile pour la détection de mycobactéries, comprenant le complexe M. tuberculosis. Les travaux utilisant la technique de PCR en temps réel amplifient, soit le gène 16S (Shrestha N. K. et al., J. Clin. Microbiol. 2003; 41:5121-6, Lachnick J. et al., J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3364-73, Burggraf S. et al., J. Clin. Microbiol. 2005; 43:1564-9), soit TITS (Kraus G. et al., Molecular and Cellular probes. 2001; 15: 375-83, Bruijnesteijn van Coppenraet E. S. et al., J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 2644-50), soit l'IS 6110 (Cleary T. J. et al., J. Clin. Microbiol. 2003; 41:4783-6, Lemaitre N. et al., J. Clin. Microbiol. 2004; 42:4307-9). Pour l'instant, les travaux basés sur le gène hsp 65, ont permis soit d'identifier les mycobactéries par séquençage, mais sans utilisation de la technique PCR en temps réel (Ringuet H. et al., J. Clin. Microbiol. 1999; 37:852-7), soit seulement de différencier les souches de M. abscessusόe M. chelonae (Sedlacek L. étal., J. Clin. Microbiol. 2004; 42:3284-7).
Dans ce contexte, un des objectifs de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode de détection du complexe M. tuberculosis qui présente une sensibilité améliorée par rapport aux techniques PCR existantes (104- 105 CFlVmI).
La nouvelle méthode de détection selon l'invention se doit également d'être d'un emploi aisé, et d'être au moins aussi rapide que les techniques actuelles qui sont consommatrices de temps et de réactifs.
Dans ce contexte, la présente invention a pour objet principal un procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend les étapes suivantes : (i) amplification de l'ADN de l'échantillon biologique, avec : un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, et :
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N0I : 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°2 : 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OU - soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°13 : 5'- GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°14 : 5'- CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT, et avec un couple de sondes FRET du Mtbc constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur et
(ii) détection de la fluorescence émise pour en déduire la présence éventuelle de bactéries que l'on cherche à détecter.
Le procédé selon l'invention permet de détecter la présence des bactéries appartenant à Mtbc.
Selon une première variante préférée, le procédé de détection selon l'invention permet également de détecter les autres espèces du genre Mycobacterium. Dans ce cas, lors de l'étape (i), on utilise un deuxième couple de sondes FRET du genre Mycobacterium constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
Selon une autre variante préférée, le procédé selon l'invention utilise un contrôle interne (CI). Dans ce cas, lors de l'étape (i), l'ADN de l'échantillon biologique est également mis en présence d'un CI d'une part et d'un troisième couple de sondes FRET spécifique du CI d'autre part, avantageusement constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
Selon une autre variante préférée, lorsqu'une fluorescence résultant de l'hybridation des sondes du genre Mycobacterium, est détectée, ce qui signifie qu'une espèce de mycobactéries est détectée dans l'échantillon, alors qu'aucune fluorescence résultant de l'hybridation des sondes spécifiques de Mtbc, n'est détectée, l'identification de l'espèce présente est alors réalisée par séquençage grâce à une amorce de séquençage qui comprend de 18 à 28 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A.
L'invention a également pour objet les différentes variantes du procédé telles que définies aux revendications 2 à 15.
L'invention concerne également une trousse de diagnostic pour la détection in vitro de mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant :
- un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, et :
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°l : 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°2 : S'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OU
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°13 : 5'-GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°14 : 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT,
- les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification d'un fragment d'acides nucléiques présentant une zone spécifique du genre Mycobacterium et éventuellement une zone spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis h l'aide des dites amorces,
- un couple de sondes FRET spécifique de M&c constitué :
• d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et • d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.
Selon une variante préférée, la trousse de diagnostic comprend également un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué :
- d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine et
- d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.
Selon une autre variante préférée, la trousse de diagnostic comprend également un contrôle interne (CI) et un couple de sondes FRET spécifique du CI. De façon préférée, le contrôle interne est une séquence nucléotidique double brin de séquences : SEQ ID N°10 :
5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG
CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG
GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT
CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG
TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' et le couple de sondes FRET spécifiques du CI est constitué :
- d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine,
- et d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.
La présente invention a également pour objet les oligonudéotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec l'une des séquences suivantes:
SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G et SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, particulièrement adaptés pour servir de sondes d'hybridation.
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet les oligonudéotides marqués avec un fluorochrome suivants :
- les oligonudéotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine ;
- les oligonudéotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640 ;
- les oligonudéotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670 ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.
L'invention a également pour objet les oligonucléotides de 18 à 28 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A. Ces oligonucléotides sont particulièrement adaptés au séquençage des produits d'amplification obtenus dans le cadre de l'invention, qui correspondent à l'ADN d'une espèce appartenant au genre Mycobacterium.
L'invention va maintenant être décrite en détails.
Les termes « acide nucléique », « séquence nucléique », « séquence d'acide nucléique », « séquence nucléotidique », « oligonucléotide » seront employés indifféremment dans la présente description, pour désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, qui peut correspondre aussi bien à un ADN double brin, qu'à un ADN ou ARN simple brin ou aux produits de transcription desdits ADNs. De préférence, et sauf mention contraire, ces termes désigneront de préférence un ADN simple brin. Le pourcentage d'identité de séquences, est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences nucléiques, réalisées après alignement. Il peut être déterminé sur une partie de la séquence ou sur la séquence entière. Les alignements de séquences sont réalisés, par exemple, avec le logiciel SeaView (Galtier et al. Comput. Applic. Biosci., 12, 543-548, 1996) qui utilise le programme d'alignement Clustal_w, développé par Thompson et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673- 4680, 1994). Après alignement, le pourcentage d'identité de séquence est alors calculé entre les deux fragments alignés de même longueur, en comptant manuellement ou à l'aide d'un logiciel commercial, le nombre de bases identiques et en le divisant par la longueur du fragment x 100 sur lequel la comparaison a été réalisée.
De façon avantageuse, dans le cadre de l'invention, on utilisera de préférence des sondes ou amorces qui présentent au moins 90%, de préférence au moins 95% et préférentiel lement 100% de similitude avec les sondes et amorces de SEQ ID N°l à 9 et SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14. Le pourcentage de similitude rend compte de la similitude sur la longueur totale des deux séquences comparées. Le pourcentage de similitude de deux séquences (une séquence d'une longueur de x bases et une séquence d'une longueur de y bases) est calculé, après alignement des deux séquences comparées, en comptant manuellement ou à l'aide d'un logiciel commercial le nombre de bases identiques (nombre égal à z) et en le divisant par la somme des nombres de bases des 2 fragments (x+y) moins le nombre de bases identiques (z) et fois 100.
Cela donne la formule suivante : % de similitude = z/(x+y-z).
Par conséquent, seules deux séquences strictement identiques peuvent présenter 100% de similitude.
Dans le cadre de l'invention, on utilisera, de préférence, des sondes ou amorces qui correspondent aux sondes ou amorces de SEQ ID N°l à 9 ou SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14, ou qui ne diffèrent de ces dernières que par une ou deux bases. La réaction de PCR en temps réel est réalisée sur l'ADN d'un échantillon biologique. Cet ADN peut être soit directement extrait de l'échantillon biologique, soit c'est l'ARN de l'échantillon biologique qui peut être extrait et transformé en ADN par une enzyme de transcription inverse. Les techniques d'extraction d'ADN ou d'ARN sont bien connues de l'homme du métier.
Par échantillon biologique, on entend un échantillon contenant de la matière biologique. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement biologique effectué chez un être vivant (patient humain, animal, végétal), d'une culture bactérienne ou d'un prélèvement effectué dans le sol, des eaux... En particulier, tous les types de prélèvements cliniques ou cultures biologiques pouvant contenir des populations bactériennes comme des cellules, des tissus, des sécrétions biologiques ou des liquides biologiques sont utilisables dans le procédé objet de l'invention. Les échantillons biologiques selon l'invention sont avantageusement issus de prélèvements broncho-pulmonaires de patients. Le procédé de détection selon l'invention, est donc un procédé de diagnostic in vitro.
La présente invention utilise la technique de PCR en temps réel, qui peut notamment être mise en œuvre sur l'appareil LightCycler® 2.0, commercialisé par Roche Diagnostics. Tout autre appareil permettant de réaliser une PCR en temps réel peut bien entendu être utilisé. La PCR en temps réel permet en une seule expérience, de réaliser à la fois l'amplification génique et la détection, ce qui entraîne un gain de temps considérable.
Chaque amplification génique de l'ADN cible comprend son hybridation avec un couple de sondes FRET et un couple d'amorces et son extension avec une ADN polymérase. Plus précisément, chaque cycle de PCR en temps réel comprend les étapes successives suivantes :
- une étape de dénaturation, durant laquelle l'ADN double brin contenu dans le mélange réactionnel est chauffé pour provoquer la séparation des 2 brins d'ADN. L'ADN cible, les amorces et les sondes sont alors simple brin. Le fluorochrome donneur est excité, dans le cas de la fluorescéine par une lumière bleue à 470nm, et émet une lumière verte à 530 nm dans le cas de la fluorescéine.
- une étape d'hybridation réalisée à une température plus basse pendant laquelle, les amorces de la PCR ainsi que les sondes d'hybridation s'hybrident à leurs régions complémentaires. Le fluorochrome donneur vient alors à proximité du fluorochrome accepteur et l'énergie émise par le fluorochrome donneur excite le fluorochrome récepteur qui émet alors dans la lumière rouge, notamment à 610, 640, 670, 705 nm, en fonction du fluorochrome sélectionné. La lumière rouge émise est alors mesurée.
- une étape d'extension, dans laquelle, après l'hybridation sur les régions cibles, l'ADN cible est amplifié à partir des amorces par une ADN polymérase. A la fin du cycle, la quantité d'ADN cible a doublé et une fois que l'élongation approche de la fin, l'ADN est double brin. Les sondes d'hybridation ont été déplacées de leur zone cible,
- une étape de détection de la fluorescence émise.
En général, au moins 30, de préférence au moins 45 cycles de PCR sont réalisés pour obtenir une mesure de fluorescence satisfaisante.
Dans le cadre de l'invention, c'est une partie du gène hsp65 (Telenti et al., J. Clin. Microbiol. 1993, 31:175-8) qui a été choisi pour être amplifié. L'amplification d'une partie du gène f?sp65, comportant une partie spécifique du genre Mycobacterium qui inclut une sous-partie spécifique de Mtbc, est réalisée, de préférence, à partir du couple d'amorces suivant : SEQ ID N°l : 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et SEQ ID N°2 : 5'-
CTTGTCGAACCGCATACCCT.
La détection par sondes FRET est réalisée en utilisant deux sondes marquées par deux fluorochromes différents :
- une sonde d'ancrage, porteuse d'un fluorochrome ou fluorophore donneur (par exemple, la fluorescéine), de préférence en position 3', c'est-à-dire émetteur de photons ; cette sonde va venir s'hybrider sur une zone de la séquence d'acides nucléiques cible dont on cherche à détecter la présence, et une sonde d'hybridation qui s'hybride avec la séquence d'acides nucléiques cible, dont on cherche à détecter la présence, qui est très proche, le plus souvent séparée de une ou deux paires de nucléotides, de la zone sur laquelle se lie la sonde d'ancrage ; cette sonde d'hybridation est porteuse, de préférence en position 5', d'un autre fluorochrome, nommé accepteur ou « quencher » (par exemple, des dérivés de rhodamine tels que LC Red640, LC Red670, LC Red705, commercialisés par Roche Diagnostics ou des dérivés de cyanine tels que Cy5, Cy5.5 commercialisés par Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) qui va capter les photons du fluorochrome donneur et les réémettre à une autre longueur d'onde. Concernant les fluorochromes donneurs et accepteurs pouvant être utilisés, on pourra, par exemple, se référer à la demande de brevet US2004/0076979 décrivant de tels fluorophores. Le florophore LC Red-640 présente, par exemple, la formule :
Figure imgf000014_0001
le couplage avec l'oligonudéotide se faisant par l'intermédiaire de la fonction /V-succinimide.
L'utilisation d'un couple de sondes FRET permet de réaliser une courbe de fusion après chauffage progressif, jusqu'à une température de 80-900C par exemple, des produits d'amplification obtenus en fin de PCR. Les doubles brins des produits d'amplifications et, notamment ceux porteurs des sondes marquées se dissocient. La fluorescence diminue jusqu'à disparition totale. La fluorescence ainsi mesurée, pendant ce chauffage progressif, va produire une courbe dont l'appareil calcule la dérivée première pour avoir une courbe en « cloche ». Cette courbe permet de définir un Tm (température de fusion du produit d'amplification) qui est une caractéristique du produit d'amplification obtenu dans les conditions expérimentales. Le procédé selon l'invention, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacteήum ou Mtbc, comportera avantageusement une étape de détermination de la courbe de fusion du produit d'amplification et une détermination de la température de fusion du produit d'amplification obtenu. Les sondes FREET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du complexe Mtbc.
- en tant que sonde d'ancrage : séquence nucléotidique de séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplée de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine,
- en tant que sonde d'hybridation : séquence nucléotidique de SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplée de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.
Lorsque le procédé selon l'invention permet également la détection d'espèces du genre Mycobacterium, autres que Mtbc, les sondes FRET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du genre Mycobacterium :
- en tant que sonde d'ancrage : séquence nucléotidique de SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, couplée de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine,
- en tant que sonde d'hybridation : séquence nucléotidique de SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, couplée de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.
Selon une variante préférée de l'invention, on utilise un contrôle interne (CI) pour vérifier l'amplification. Le CI est une cible, autre que l'ADN cible spécifique de l'espèce que l'on souhaite détecter. Aussi, une détection positive du produit d'hybridation du CI démontre que la réaction d'amplification a bien eu lieu, et valide alors une réponse négative. On qualifie de réponse négative, une absence de détection de fluorescence à la longueur d'onde où le fluorochrome accepteur du couple de sondes correspondant aurait émis, si le dit couple de sondes s'était hybride sur un ADN cible. De même, on qualifie de réponse positive, une détection de fluorescence à cette même longueur d'onde.
Ce CI permet de vérifier si la détection est négative, par absence d'ADN cible ou par inhibition de l'amplification. La construction de ce CI synthétique peut être réalisée avec, d'une part des régions identiques aux amorces utilisées pour l'amplification des fragments spécifiques des espèces dont on souhaite détecter la présence et, d'autre part, une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui différencie le CI de l'acide nucléique cible amplifié. C'est-à-dire que la région de liaison est choisie de manière telle qu'elle ne s'hybride pas avec les sondes spécifiques de Mtbc et de Mycobacterium. Un segment d'ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) flanquée à ses deux extrémités par deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces ou à leurs séquences inverses est avantageusement choisi en tant que témoin interne.
En particulier, on utilisera un CI double brin, de séquences : SEQ ID N0IO :
5'-ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGMGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TMGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3'
Ce CI est utilisé avec les amorces de SEQ ID N°l et SEQ ID N°2, ou des amorces présentant le % d'identité ou de similitude souhaité.
Le contrôle interne peut être un vecteur d'expression tel qu'un plasmide contenant les séquences des amorces nécessaires à l'amplification de Mtbc, ainsi qu'une zone nucléotidique qui ne correspond pas à une zone de l'ADN des mycobactéries et pour laquelle une sonde FRET a été construite. L'insertion dans un plasmide, avantageusement à' Escherichia coli, permet d'améliorer sa conservation.
Il est également possible d'utiliser un CI correspondant à un oligonucléotide synthétique qui pourra directement être additionné au mélange réactionnel :
- dans le cas où l'on utilise les amorces de SEQ ID N°l et SEQ ID N°2, ou des amorces présentant le % d'identité ou de similitude souhaité, ce CI aura la séquence SEQ ID N° 15 :
ACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAGGCACC AGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGATGGCG GAAGATATGCAGAGTCTTGGTCAGGGTATGCGGTTCGACAAG
- dans le cas où l'on utilise les amorces de SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14, ou des amorces présentant le % d'identité ou de similitude souhaité, ce CI aura la séquence SEQ ID N° 16 :
GATCACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAG GCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGA TGGCGGAAGATATGCAGAGTCTTGGTCACCGAGGGTATGCGGTTCGACAAG
Un nombre limité de molécules de CI, avantageusement de l'ordre de 3 à 6 copies, est ajouté à chaque échantillon d'ADN extrait et co-amplifié avec l'acide nucléique cible.
Les sondes FRET suivantes sont, avantageusement, utilisées pour la détection du CI :
- en tant que sonde d'ancrage, un oligonucléotide de séquence nucléotidique de SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, couplé de préférence en 3', à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine,
- en tant que sonde d'hybridation, un oligonucléotide de séquence nucléotidique de SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.
Quand différents couples de sondes sont utilisés (par exemple un pour Mtbc complexe et un pour le genre Mycobacterium et/ou un pour le CI), les différentes sondes d'hybridation sont, marquées avec des fluorochromes accepteurs différents, pour pouvoir distinguer lors de la détection les différents complexes d'hybridation éventuellement obtenus. Dans le cas où l'on souhaite détecter plusieurs fragments spécifiques amplifiés (par exemple un fragment spécifique de Mtbc complexe, fragment spécifique de Mycobacterium, fragment spécifique du CI), les différents couples de sondes sont ajoutés au mélange réactionnel contenant l'ADN bactérien extrait, avant de réaliser l'amplification.
Dans la variante préférée de l'invention, trois couples de sondes FRET, décrites ci-dessus sont utilisés simultanément : un couple de sondes pour Mtbc complexe, un couple de sondes pour le genre Mycobacterium et un couple de sondes pour le CL
La PCR est avantageusement de type « touchdown », c'est-à-dire que dans les premiers cycles de PCR, l'hybridation est réalisée à une température d'hybridation élevée et donc spécifique. Après un certain nombre de cycles, la température d'hybridation est abaissée jusqu'à la température optimale d'hybridation des amorces, pendant un nombre de cycles suffisant pour obtenir suffisamment d'ADN amplifié. Dans le cadre de l'invention, dans les premiers cycles de PCR (par exemple dans les 16 premiers cycles), la température d'hybridation diminue, de préférence, de 68°C à 600C, température optimale pour les cycles suivants.
De façon avantageuse, lorsque la détection montre la présence de mycobactéries qui ne correspondent pas à Mtbc, le procédé selon l'invention, comprend une étape de séquençage qui permet d'identifier l'espèce bactérienne, notamment les mycobactéries atypiques, ou l'espèce non cultivable M. leprae. Le séquençage est, de préférence, réalisé, avec l'amorce nucléotidique de SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A.
Bien entendu, les amorces et sondes selon l'invention peuvent être préparées selon des techniques de synthèse chimique classique.
Le procédé selon l'invention, dans sa variante la plus complète, permet donc l'amplification de toutes les mycobactéries avec : 1. une détection spécifique du Mtbc, avec un premier couple de sondes FRET ;
2. une détection spécifique du genre Mycobacterium, avec un deuxième couple de sondes FRET ;
3. une fiabilité des résultats de détection obtenus par utilisation d'un contrôle interne qui permet de s'assurer de la réelle négativité des résultats ;
4. l'identification des Mycobactéries autres que celles de Mtbc qui est réalisée par séquençage du produit d'amplification, directement à partir de l'ADN du capillaire du LightCycler.
Les résultats obtenus à partir de suspensions bactériennes et à partir de crachats enrichis en bactéries, montrent que la sensibilité de la méthode selon l'invention, est d'environ 5 x 103 CFU/ml, soit 2xlO3 CFU par prise d'essai de 400 μl.
Les sondes pour la détection de Mtbc ont été testées et ont abouti à un résultat :
1. positif chez tous les membres de Mycobacterium tuberculosis complex,
2. négatif pour 83 Mycobactéries atypiques des 100 espèces décrites, ainsi que pour 16 espèces de Corynebacterium, 4 espèces de Nocardia et 2 espèces de Propionibacterium (acnés et granulosum).
La sensibilité obtenue, pour la détection de Mtbc, à partir de l'analyse de 158 échantillons cliniques était de 93,1% avec une spécificité de 92,2%.
La durée totale de l'analyse avec la méthode selon l'invention peut être de 3 heures, dont 1 heure pour l'extraction, alors que les techniques classiques de PCR nécessitent en moyenne 8 heures. Par ailleurs, les techniques en temps réel, précédemment utilisées, ne permettent pas la détection simultanée du contrôle interne, des Mycobactéries et de Mtbc.
La description qui va suivre, en référence aux FIGURES IA et IB annexées, est relative à la mise en œuvre du procédé selon l'invention avec une PCR multiplexe réalisée sur un appareil LightCycler® 2.0, commercialisé par la société Roche Diagnostics (Meylan - France) permet d'illustrer l'invention, mais n'a aucun caractère limitatif.
Souches
La plupart des souches bactériennes proviennent de la collection CIP (Collection Institut Pasteur de Paris), à l'exception de Mycobacterium leprae identifiée par séquençage direct du gène hsp65 à partir de deux échantillons humains positifs.
Extract/on
L1ADN bactérien de souches de référence est extrait en utilisant une solution d'achromopeptidase à 5 U/ml (15 min à 55°C). Après une brève centrifugation, le lysat brut est utilisé en tant que matrice pour la détermination de la spécificité.
Pour la détermination de la sensibilité, une dilution en série de 109 bactéries par ml est effectuée. Les dilutions sont extraites avec le réactif High Pure PCR Template Préparation kit (Roche Diagnostics Meylan France) ainsi que tous les échantillons. Pour augmenter la sensibilité, 400 μl d'échantillon sont extraits, conformément aux instructions du fabricant, sauf pour l'élution d'ADN qui est effectuée avec 50 μl de tampon d'élution au lieu de 200 μl.
Détection de bactéries appartenant au complexe Mvcobacterium tuberculosis et au genre Mvcobacterium
Amorces et sondes de PCR
Pour l'amplification du gène hspβS, un fragment de 439 pb est amplifié en utilisant des amorces TbIl de SEQ ID N°l et Tbl2 de SEQ ID N°2.
Des sondes ont été conçues par comparaison des séquences hsp65 de différentes mycobactéries précédemment publiées. Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du complexe Mtbc : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA-fluorescéine (SEQ ID N°3- fluorescéine) en tant que sonde d'ancrage et : LC Red640-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT- phosphate (LC Red640-SEQ ID N°4) en tant que sonde d'hybridation.
Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du genre Mycobacterium : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG -fluorescéine (SEQ ID N°5- fluorescéine) en tant que sonde d'ancrage et : LC Red670-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT -phosphate (LC Red670-SEQ ID N°6) en tant que sonde d'hybridation.
Construction du CI
Une séquence est construite en insérant une séquence d'ADN du CI dans un plasmide d'ADN.
Un segment d'ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) flanquée à ses deux extrémités de deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces est choisi en tant que contrôle interne.
Des amorces hybrides CIBKl et CIBK2 sont synthétisées avec des amorces de hsp65 précédemment décrites par Telenti étal. 1993, supra.
CIBKl (sens) :
SEQ ID N0Il : ACCAACGATGGTGTGTCCATGCACAGAACGAAAAAGGTGAGC et
CIBK2 (antisens) : SEQ ID N°12 : CTTGTCGAACCGCATACCCTAGAAAACGGGCGTAAACCTT
Les caractères gras indiquent les amorces de gène hsp65 externes et les caractères normaux indiquent les amorces pour l'ADN du phage lambda.
L1ADN hybride est amplifié à partir des amorces CIBKl et CIBK2 avec I1ADN de phage lambda en tant que matrice (Roche Diagnostics), de l'ADN polymérase (pureTaq Ready to Go PCR -Amersham Biosciences) à l'aide d'un thermocycleur conventionnel (95°C, 2 min, puis 35 cycles avec 94°C 30 s, 600C 1 min, 72°C 1 min puis 72°C 10 min pour assurer une réaction complète).
Les produits amplifiés (5 μl) sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (gels E-Gel® Agarose 1,2 %, Invitrogen Life Technologies) puis visualisés sous lumière UV pour contrôler l'amplification d'ADN.
Le fragment hybride résultant (300 pb) consiste en une séquence double brin de phage lambda pf (216 pb) flanquée aux deux extrémités par deux séquences courtes de Mtbc (20 pb). SEQ ID N0IO (sens) :
5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG
CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG
GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT
CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG
TAAGGTTTACGCCCGTπTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3'
Les séquences de bordure (en gras) sont complémentaires des amorces TbIl et Tbl2 et sont des cibles pour ces amorces.
Afin d'améliorer sa conservation, I1ADN hybride phage lambda-Mtbc est ensuite clone dans un plasmide ύ'Escherichia coli (plasmide pCR®2.1- TOPO® 3,9 kb ; kit de clonage TOPO TA, Invitrogen Life Technologies, 95613 Cergy Pontoise) conformément aux instructions du fabricant. Après une croissance exponentielle, E co// est ensemencé sur des milieux sélectifs contenant de l'ampicilline et X-GaI (LB Agar Amp IPTG/X-Gal E. coli FastMedia™ MBI Fermentas) et incubées 18 heures à 35°C.
Environ dix colonies blanches contenant le segment d'insertion sont cultivées pendant 6 heures dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (LB Liquid Amp E. coli FastMedia™ MBI Fermentas).
Les plasmides contenant le segment d'insertion sont purifiés avec le kit miniprep Wizard®Plus (Promega Charbonnières-les-Bains - France) et linéarisés avec l'enzyme Xbal (Promega). L'enzyme est dénaturée à 94°C pendant 10 min. Le segment d'insertion est purifié avec le kit miniprep Wizard®Plus (Promega). Les produits (5 μl) sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (gels E-Gel® Agarose 1,2 %, Invitrogen Life Technologies). Le gel est visualisé sous lumière UV.
La concentration optimale du plasmide est déterminée par dilution de 10"1 à 10"10, afin de réduire au minimum la compétition entre l'ADN cible spécifique de Mtbc complexe et I1ADN cible du CI durant l'amplification.
Le programme d'amplification est le même que pour Mycobacterium tuberculosis complexe.
Des sondes sont conçues par comparaison à une séquence précédemment décrite de phage lambda. Les sondes FRET suivantes sont utilisées pour la détection du CI : 5'- AGTACGCCCCACGCTGACGG-fluorescéine (SEQ ID N°7- fluorescéine), en tant que sonde d'ancrage et LC Red705-CTAACCTGTACGGTATGGTCAC-phosphate (LC Red705-SEQ ID N°8) en tant que sonde d'hybridation.
Protocole LightCycler
Le mélange réactionnel (LC FastStart DNA Master Hybridisation Probes (Roche Biochemicals) contenant la polymérase Taq FastStart, le tampon de réaction, des désoxynucléosides triphosphates est complété avec MgCI2 de façon à obtenir 2,5mM en final. Après avoir ajouté les amorces à une concentration finale de 0,53 μM et les trois couples de sondes d'ADN à 0,2 μM chacune et le CI à raison de 3 à 6 copies, le mélange réactionnel est introduit dans une cuve de réaction située au-dessus d'un capillaire en verre (20 μl). Après l'ajout de la matrice d'ADN, les capillaires en verre sont remplis par une brève centrifugation pour déplacer le liquide au fond du capillaire.
Le programme d'amplification commence par une étape de dénaturation de 10 min à 95°C, suivie par 55 cycles de PCR avec 1 cycle de dénaturation (15 s à 95°C), une hybridation "touchdown" (30 s à une température allant de 68°C à 600C, pas de 0,5°C/cycle) et extension (30 s à 72°C). La vitesse de transition de température est de 20°C/s pour la dénaturation et l'hybridation et de 2°C/s pour l'extension. Le programme d'amplification est suivi par un refroidissement de 30 s à 400C.
La version 4 du logiciel du LightCycler ajuste le gain dans chaque canal. Un essai de compensation de couleur est conduit et les données de compensation de couleur sont enregistrées dans le logiciel du LightCycler.
Chaque essai du LightCycler comprend un témoin négatif dans lequel la matrice est remplacée par de l'eau distillée pour contrôler la contamination croisée et par un témoin positif contenant l'ADN à 106 CFU/ml. Résultats
Sensibilité et spécificité de la détection de Mtbc
Afin de déterminer la limite inférieure de détection, des essais PCR sont conduits sur des dilutions en série de suspensions de Mycobacterium tuberculosis H37rv (de 108 à 10 UFC/ml) et avec un crachat négatif auquel sont ajoutées les mêmes dilutions. L'extraction est effectuée avec le kit de préparation de matrice High Pure PCR Template préparation kit (Roche Diagnostics).
Dans les deux cas, la limite de détection est de 5 x 103 CFU/ml. Toutes les amplifications ont été effectuées avec le CI.
L'essai PCR est évalué avec différentes mycobactéries et avec d'autres bactéries (Tableau 1).
Tableau 1 : Liste des espèces bactériennes testées pour la spécificité
Figure imgf000024_0001
Tableau 1 (suite 1)
Figure imgf000025_0001
Tableau 1 (suite 2)
Figure imgf000026_0001
A la fin du Protocole Light cycler, le produit d'amplification est chauffé 30 s à 45°C puis jusqu'à 75°C à raison de 0,l°C/s avec mesure en continu de la fluorescence et sa courbe de fusion est déterminée grâce au logiciel par calcul de la dérivée première de la courbe obtenue par chauffage de l'ADN amplifié. Les courbes présentées FIGURE IA et IB (correspondant respectivement à la courbe de fusion et à la dérivé première de la courbe de fusion) sont alors obtenues. La température de fusion Tm du produit d'amplification, ainsi calculée est de 59,30C. Le Tm de Mtbc est de 640C ± 20C et les Tm des autres espèces de mycobactéries se situant entre 49 et 58°C à ± 2°C.
L'ADN amplifié du tube correspondant à ces courbes a été séquence grâce au protocole suivant :
Les amplicons sont purifiés avec l'enzyme Exosapt-IT (Amersham, Les Ulis, France) et séquences dans un seul sens à l'aide de l'amorce de séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A (lμM) en utilisant le kit de séquençage Beckman Coulter Dye Terminator Cycle (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La réaction utilise le programme suivant sur le LightCycler : 5 cycles amplification à 95°C pendant 3 s, hybridation de l'amorce à 500C pendant 4 s et extension à 600C pendant 30 s. Les produits amplifiés et marqués sont purifiés avec le kit DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen (QIAgen,) avant d'être passés dans les colonnes d'un séquenceur CEQ 2000 XL (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La séquence obtenue est ensuite comparée à une base de données, ce qui permet l'identification de la Mycobactérie détectée.
La séquence obtenue après séquençage, correspondant à la courbe de fusion de la FIGURE IA, correspond à l'ADN de Mycobacterium leprae (Souche Réf : AL 583918).

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de détection de l'éventuelle présence de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, qui utilise la technique de PCR en temps réel et qui comprend les étapes suivantes :
(i) amplification de l'ADN de l'échantillon biologique, avec un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, et :
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°l : 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°2 : 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OU
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°13 : 5'- GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°14 : 5'- CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT, et avec un couple de sondes FRET spécifique de Mtbc constitué : d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur et
(ii) détection de la fluorescence émise pour en déduire la présence éventuelle de bactéries que l'on cherche à détecter.
2 - Procédé de détection selon la revendication 1 caractérisé en ce que le couple d'amorces comprend :
- soit une amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°l : S'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et une amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°2 : S'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OU
- soit une amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°13 : S'-GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT et une amorce présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°14 : 5'- CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT, et le couple de sondes FRET spécifique de Mtbc est constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'- CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
3 - Procédé de détection selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il permet également de détecter la présence d'un membre du genre Mycobacterium, autres que Mtbc, dans lequel, à l'étape (i), l'échantillon biologique est également mis en contact avec un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
4 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 3, en ce que le couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium est constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
5 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape (i) est réalisée en présence d'un contrôle interne (CI) et d'un couple de sondes FRET spécifique du CL
6 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique de Mtbc est :
- une sonde d'ancrage de séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA couplée en 3' à une fluorescéine - une sonde d'hybridation de séquence SEQ ID N°4 : CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT couplée en 5' à LC Red640.
7 - Procédé de détection, selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium est :
- une sonde d'ancrage de séquence SEQ ID N° N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG couplée en 3' à une fluorescéine
- une sonde d'hybridation de séquence SEQ ID N°6 : GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT couplée en 5' à LC Red670.
8 - Procédé de détection, selon la revendication 5, caractérisé en ce que le CI comprend des régions capables de s'hybrider avec les amorces et une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui s'hybride ni avec les sondes spécifiques de Mtbc, ni avec celles spécifiques du genre Mycobacterium.
9 - Procédé de détection, selon la revendication 8, caractérisé en ce que le CI comprend un ADN hybride composé d'un fragment d'ADN du phage lambda de 216 pb (position 13551 à 13766) couplée à ses deux extrémités à deux séquences courtes de Mtbc (20 pb) correspondant aux amorces de PCR utilisées ou à leurs séquences inverses.
10 - Procédé de détection, selon la revendication 8, caractérisé en ce que le CI est une séquence nucléotidique double brin de séquences : SEQ ID N0IO :
5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTTTTGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' ou un oligonudéotide synthétique de séquence SEQ ID N° 15 :
ACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAGGCACC AGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGATGGCG GAAGATATGCAGAGTCTTGGTCAGGGTATGCGGTTCGACAAG ou SEQ ID N0 16 :
GATCACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAG GCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGA TGGCGGAAGATATGCAGAGTCTTGGTCACCGAGGGTATGCGGTTCGACAAG
11 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 5 ou 8 à 10, caractérisé en ce que le couple de sondes FRET spécifique du CI est constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
12 - Procédé de détection, selon la revendication 11 caractérisé en ce que, le couple de sondes FRET spécifique du CI est constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marqué de préférence en 3', par un fluorochrome donneur et
- d'une sonde d'hybridation qui correspond à un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marqué de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur.
13 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacterium et d'une détection négative de fluorescence correspondant à une absence d'hybridation des sondes spécifiques Mtbc, le mélange d'amplification obtenu est séquence avec une amorce de séquençage qui comprend de 18 à 28 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A, pour identifier spécifiquement la séquence du membre du genre Mycobacterium présent.
14 - Procédé de détection, selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'amorce de séquençage comprend de 18 à 28 nucléotides et présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A.
15 - Procédé de détection, selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que, dans le cas d'une détection positive de fluorescence correspondant à une hybridation des sondes spécifiques du genre Mycobacterium et, éventuellement des sondes spécifiques Mtbc, il comprend une étape de détermination de la courbe de fusion du produit d'amplification obtenu et une détermination de la température de fusion du produit d'amplification.
16 - Trousse de diagnostic pour la détection in vitro de mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant :
- un couple d'amorces dans lequel chacune des amorces comprend de 18 à 22 nucléotides, et :
- soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°l : S'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°2 : 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT, OU - soit une des amorces présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°13 : S'-GATCACCAACGATGGTGTGTCCAT et l'autre amorce présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°14 : 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCTCGGT,
- les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification d'un fragment d'acides nucléiques présentant une zone spécifique du genre Mycobactehum et éventuellement une zone spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis à l'aide des dites amorces,
- un couple de sondes FRET spécifique de Mtbc constitué :
• d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et
• d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640.
17 - Trousse de diagnostic selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend également un couple de sondes FRET spécifique du genre Mycobacterium constitué :
• d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, couplé de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine et • d'un oligonucléotide de 18 à 22 nucléotides qui présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, couplé de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670.
18 - Trousse de diagnostic selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comprend également un contrôle interne (CI) et un couple de sondes FRET spécifique du CI.
19 - Trousse de diagnostic selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que le CI comprend des régions capables de s'hybrider avec les amorces de PCR et une région de liaison pour un couple de sondes FRET qui ne s'hybride ni avec les sondes spécifiques de Mtbc, ni avec celles spécifiques du genre Mycobacterium et correspond, de préférence, à une séquence nucléotidique double brin de séquences : SEQ ID N0IO : 5' ACCAACGATGGTGTGTCCATGCAGAACGAAAAAGGTGAGCCGGTCACCTGG
CAGGGGCGACAGTATCAGCCGTATCCCATTCAGGGGAGCGGTΠTGAACTGAATG GCAAAGGCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTTCTAACCTGTACGGTATGGT CACCGGGATGGCGGAAGATATGCAGAGTCTGGTCGGCGGAACGGTGGTCCGGCG TAAGGTTTACGCCCGTTTTCTAGGGTATGCGGTTCGACAAG-3' ou à un oligonucléotide synthétique de séquence SEQ ID N° 15 :
ACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAGGCACC AGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGATGGCG GAAGATATGCAGAGTCTTGGTCAGGGTATGCGGTTCGACAAG ou SEQ ID N° 16 :
GATCACCAACGATGGTGTGTCCATGGGAGCGGTTTTGAACTGAATGGCAAAG
GCACCAGTACGCGCCCCACGCTGACGGTTCTAACCTGTACGGTATGGTCACGGGA
TGGCGGAAGATATGCAGAGTCTTGGTCACCGAGGGTATGCGGTTCGACAAG
20 - Trousse de diagnostic selon la revendication 19, caractérisée en ce que le couple de sondes FRET spécifique du CI est constitué :
- d'une sonde d'ancrage qui comprend de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui est marquée de préférence en 3', par un fluorochrome donneur, et - d'une sonde d'hybridation qui comprend de 18 à 22 nucléotides et qui présente au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui est marquée de préférence en 5', par un fluorochrome accepteur. 21 - Oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins
90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec l'une des séquences suivantes:
SEQ ID N°3 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, SEQ ID N°4 CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, SEQ ID N°5 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, SEQ ID N°6 GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, SEQ ID N°7 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G et SEQ ID N°8 CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C.
22 - Oligonucléotides selon la revendication 21 précédente marqués avec un fluorochrome.
23 - Oligonucléotides selon la revendication 22, choisis parmi :
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°3 : 5'-GCT CGG TCT CAA ACG CGG CA, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°4 : 5'-CGA AAA GGC CGT GGA GAA GGT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red640 ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiellement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°5 : 5'-AGG ACC GTA CGA GAA GAT CGG, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°6 : 5'-GCT GAG CTG GTC AAG GAG GT, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red670 ;
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°7 : 5'-AGT ACG CGC CCC ACG CTG ACG G, et qui sont couplés de préférence en 3' à un fluorochrome donneur, avantageusement la fluorescéine, et
- les oligonucléotides de 18 à 22 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°8 : 5'-CTA ACC TGT ACG GTA TGG TCA C, et qui sont couplés de préférence en 5' à un fluorochrome accepteur, avantageusement LC Red705.
24 - Oligonucléotides de 18 à 28 nucléotides qui présentent au moins 90%, préférentiel lement au moins 95% et avantageusement 100% de similitude avec la séquence SEQ ID N°9 : 5'-CGC CAA AGG AGA TCG AGC TGG AGG A, particulièrement adaptés au séquençage des produits d'amplification du genre Mycobacterium.
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