FR2920159A1 - Methode et reactifs pour la quantification, la comparaison et l'identification d'alleles sur support solide - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier des allèles dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet. L'invention est basée sur une méthode de détection spécifique de mésappariement entre des allèles au moyen de sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide. Plus particulièrement, la méthode concerne la détection sur biopuces de variations (à la hausse ou à la baisse) de la quantité d'un ou plusieurs allèles d'une séquence d'ADN comme par exemple une séquence microsatellitaire.

Description

METHODE ET REACTIFS POUR LA QUANTIFICATION, LA COMPARAISON ET

L'IDENTIFICATION D'ALLELES SUR SUPPORT SOLIDE

DOMAINE DE L'INVENTION

L'invention concerne une méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier des allèles dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet. L'invention est basée sur une méthode de détection spécifique des allèles au moyen de sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide. Plus particulièrement, la méthode concerne la détection sur biopuces de variations (à la hausse ou à la baisse) de la quantité d'un ou plusieurs allèles d'une séquence d'ADN comme par exemple une séquence microsatellitaire.

ETAT DE L'ART Un déséquilibre allélique peut correspondre à une perte ou un gain d'une base, d'un fragment ou de la totalité d'un gène, ou même d'un fragment d'un chromosome, intervenant sur un nombre discret de cellules isolées. Ces altérations peuvent se produire sur un exemplaire d'un chromosome ou sur les deux. La perte ou le gain de ces fragments d'ADN peut être analysé à travers la quantification de marqueurs moléculaires comme des mutations ponctuelles ou encore des séquences microsatellites.

Les données concernant la séquence, le nombre de répétitions, et les fréquences des allèles sont disponibles dans les bases de données pour des milliers d'allèles et de nombreux organismes. La possibilité d'accès à une large sélection de marqueurs aussi informatifs a fait de l'analyse des microsatellites un outil largement répandu pour les études de liaison et d'association, l'identification d'organisme, et le diagnostic de pathologies.

Les marqueurs microsatellites sont par exemple très employés dans la recherche en cancérologie pour détecter des événements de délétion et de duplication de fragments de gènes en relation avec la survenue d'un processus de cancérisation, notamment dans la détection d'un cancer de la vessie (voir par exemple Schneider et al. ; Cancer Research 60, 4617-4622, 15 août 2000 ; Evaluation of Microsatellite Analysis in Urine Sediment for Diagnosis of Bladder Cancer ). Les marqueurs satellites peuvent également être utilisés dans le cadre de l'exploration du cancer du sein (voir par exemple Buerger et al. ; J. Clin. Pathol. 2001; 54; 836-840; Genetic characterisation of invasive breast cancer: comparison of CGH and PCR based multiplex microsatellite analysis ).

Des demandes de brevets décrivent notamment des combinaisons d'allèles dont les déséquilibres sont utiles pour diagnostiquer l'apparition de cancers, souvent à des stades assez précoces. Voir par exemple WO 2002/022879, WO 2002/086448, US 20030113758, WO 2003/000890 et WO 2000/024933.

Outre les marqueurs microsatellites, d'autres variations de une à quelques bases dans une séquence d'ADN ou d'ARN peuvent être utilisées pour analyser des déséquilibres alléliques. Ces mutations peuvent parfois être présentes de façon discrète, et localisées dans un groupe de cellules, et parfois sur un seul des chromosomes présents dans ces cellules. De tels exemples sont trouvés dans le cas du cancer du colon (voir par exemple Woodford-Richens et al. PNAS 98 (17): 9719. (2001) SMAD4 mutations in colorectal cancer probably occur before chromosomal instability, but after divergence of the microsatellite instability pathway ; Mutter et al., J Clin Pathol: Mol Pathol 1999;52:257-262, K-ras mutations appear in the premalignant phase of both microsatellite stable and unstable endometrial carcinogenesis ).

Un autre domaine dans lequel la quantification du nombre d'allèles peut être utile concerne l'analyse du caractère homozygote ou hétérozygote d'une ou plusieurs variations génétiques dans un échantillon d'acides nucléiques. Cette analyse peut être appliquée dans le cadre de tests rapides de sélections de caractères génétiques utilisables, par exemple, dans la recherche de caractéristiques génétiques d'intérêt dans la descendance d'un organisme. Des exemples de tests de sélection de caractères génétiques sont trouvés dans la littérature, pour des applications en sélection végétale ou animale. Une méthode bien connue de l'homme de l'art est appelée TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes). Cette méthode utilise une technique de détection de mutations ponctuelles basée sur l'analyse d'hétéroduplexes formés entre une molécule d'ADN à analyser et une molécule d'ADN de référence. Les technologies utilisées fréquemment pour l'analyse de ces hétéroduplexes sont la dHPLC (McCallum et Al. (2000), Plant Physiol. Jun;123(2):439-42.), Targeting induced local lesions in genomes (TILLING) for plant functional genomics ) et l'analyse par électrophorèse capillaire, en utilisant une endonuclease qui reconnaît les mésappariements de l'ADN (Colbert T, et Al. (2001), Plant Physiol. Jun;126(2):480-4. High-throughput screening for induced point mutations ).

La comparaison de marqueurs génétiques avec ceux d'un individu ou organisme de référence est également utile pour l'identification d'individus ou d'organismes. Une application de cette technique concerne la caractérisation d'individus en police scientifique ou dans le domaine de la recherche de paternité, ou de parentèle. De nombreux exemples d'utilisation de microsatellites sont décrits dans la littérature comme par exemple : Walsh et al., Forensic Sci Int., (2007) May 24;168(2-3):e47-50.

Epub 2007 Mar 6., Autosomal microsatellite allele frequencies for a nationwide dataset from the Australian Caucasian sub-population ; Kashyap et al., BMC Genet., 17 mai 2006, 7:28, Genetic structure of Indian populations based on fifteen autosomal microsatellite loci , Ruitberg et Al. , Nucleic Acid Research 2001, V29, Nol, pages 320-322, STRBase : a short tandem repeat DNA database for human identity testing community.

Les techniques d'analyse de l'ADN comme le séquençage ou le polymorphisme de conformation des simples brins (single strand conformation polymorphism ou SSCP) sont bien connues de l'homme de l'art, et peuvent être utilisées pour la détermination de la présence d'un déséquilibre allélique dans un échantillon d'ADN (voir par exemple Kemp et al., Cancer Research, 65 (24): 11361. (2005) CDC4 Mutations Occur in a Subset of Colorectal Cancers but Are Not Predicted to Cause Loss of Function and Are Not Associated with Chromosomal Instability ).

Dans le cas de séquences microsatellites, une fois ces séquences identifiées à proximité d'un gène d'intérêt, des amorces de PCR (séquences uniques au niveau génomique) flanquant ces microsatellites sont utilisées pour amplifier le fragment contenant ces séquences microsatellites. Les produits de PCR obtenus à partir de ces amorces contiennent les séquences microsatellites qui peuvent être analysées de plusieurs façons.

Une méthode largement répandue consiste à faire migrer par électrophorèse les fragments d'ADN amplifiés (amplicons) sur des gels d'agarose, à séparer les différents allèles microsatellitaires d'après leur taille, et à les repérer sur le gel via un marquage fluorescent de l'ADN double brin en utilisant par exemple le bromure d'éthidium. Cette méthode présente l'avantage d'un coût de réalisation modeste et nécessite peu d'investissement en équipements. La limitation est la faible résolution de ces gels (capacité de différencier des séquences microsatellitaires différentes de quelques bases), la difficulté de quantifier chaque microsatellite, ainsi que le temps de travail assez important nécessaire pour la mise en oeuvre de cette méthode. Une évolution de cette méthode, l'électrophorèse capillaire, a permis un certain degré d'automatisation et de multiplexage (analyse en parallèle d'un nombre important d'amplicons de microsatellites) de l'analyse des séquences microsatellitaires, associé à une détermination de la quantité relative de chaque séquence microsatellite. Un exemple d'un tel système d'analyse est le séquenceur d'ADN ABI3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Cet appareil comprend 48 capillaires qui permettent d'analyser en parallèle 48 échantillons pouvant contenir chacun plusieurs séquences microsatellites. Cependant une limitation importante des équipements d'électrophorèse capillaire est leur complexité qui rend difficile leur utilisation dans un cadre diagnostique. Le coût de ces équipements de séquençage et celui associé aux différentes étapes de marquage et de purification des amplicons avant analyse constituent également un frein au développement de cette technique. Enfin, dans le cas où la taille des microsatellites analysés est voisine ou identique, l'identification des allèles devient un problème délicat, voire impossible à résoudre. Ces trois limitations font qu'il est difficile d'envisager l'utilisation de séquenceurs dans un cadre de diagnostic in vitro où il est indispensable d'avoir i) un protocole simple et normalisé, et ii) une interprétation automatisée et sans ambiguïté.

Les biopuces sont aujourd'hui de plus en plus utilisées dans les applications de diagnostic moléculaire, comme par exemple l'identification des mutations du cytochrome P450 (www.roche-diagnostics.com Roche Ag), le diagnostic viral, par exemple le diagnostic d'une infection par le virus HPV (www.gbo.com Greiner Bio-One Gmbh), ou l'analyse de mutations ou de délétions au niveau génomique (www.asperbio.com/ Asperbiotech). Ces dispositifs présentent de grands avantages, notamment par rapport au nombre élevé de marqueurs analysable en parallèle à partir d'un échantillon unique et la relative simplicité de mise en oeuvre des analyses basées sur les biopuces, associés à une possibilité croissante d'intégrer les biopuces dans des dispositifs automatisés de très faible taille (laboratoire sur puce : lab on a chip). Par ailleurs, l'évolution récente de l'industrie des biopuces vers des procédés de fabrication (spotting) plus fiables et compatibles avec la production de kit de diagnostic in vitro rend accessible cet outil aux laboratoires de diagnostic.

Le choix de marqueurs pour le diagnostic moléculaire réalisé sur biopuces est déterminé sur la base de : i) l'identification de séquences d'ARNm comme par exemple le kit de diagnostic in vitro de l'HPV (Greiner Bio-One, GmbH, D-72636 Frickenhausen) qui permet la différentiation de 50 génotypes différents du virus de l'HPV, en utilisant des sondes comprenant une cinquantaine de nucléotides, chacune complémentaire d'une séquence spécifique d'un variant de l'HPV ; ii) l'analyse de mutations ponctuelles (SNPs) ou de faible taille comme des délétions ou insertions de quelques nucléotides, comme décrit par Le Calvez et al. (2005), Clin Chem 51: 1284-1287, Arrayed primer extension resequencing of mutations in the TP53 tumor suppressor gene: comparison with denaturing HPLC and direct sequencing . Dans ce cas, les sondes utilisées sur la biopuce sont généralement de faible taille et présentent des propriétés supplémentaires permettant d'améliorer leurs propriétés de discrimination des variants (voir par exemple WO 2004/083225) ; iii) l'analyse du nombre de copie d'un fragment d'ADN de taille variable, voir d'un fragment de chromosome dans son intégralité. Les technologies utilisées dans ce cas (hybridation génomique comparative : comparative genomic hybridization ou CGH) font généralement appel a des fragments d'ADN de grande taille (de quelques centaines à quelques milliers de bases) et de séquences chevauchantes qui sont déposées sur les supports des biopuces. Cette technologie d'analyse permet la quantification des déséquilibres d'allèles sur de grands fragments, mais ne possède pas une résolution suffisante pour analyser des événements de perte ou de gains d'allèles de faible taille (voir par exemple H Buerger et al., J Clin Pathol 2001; 54:836-840, Genetic characterisation of invasive breast cancer: a comparison of CGH and PCR based multiplex microsatellite analysis ). De plus, la fabrication des biopuces destinées à la CGH met en oeuvre des étapes de production d'ADN longues et d'utilisation délicate.

A l'exception de la CGH, aucune application sur biopuces n'est décrite à ce jour permettant la quantification des déséquilibres alléliques de microsatellites sur un support solide comme une biopuce ou une plaque de microtitration. Ceci est dû à la difficulté d'identifier de façon spécifique, par hybridation, une séquence microsatellite composée principalement de bases G et T répétées un grand nombre de fois. Cette difficulté provient de la forte affinité des enchaînements de bases GT lors de l'hybridation avec leur séquences complémentaires (les sondes des biopuces) qui conduit à une mauvaise spécificité d'hybridation. (voir par exemple Chalaya et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 16 e130. Improving specificity of DNA hybridization-based Methods ).

La présente invention a pour but de fournir une solution à ces problèmes rencontrés dans l'art antérieur.

RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne une méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier les allèles d'un ou plusieurs polymorphismes dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet, ladite méthode comprenant : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser à partir de l'échantillon à tester, et le marquage des amplicons ainsi produits à une extrémité d'un seul des deux brins aboutissant ainsi à la production - soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 5' et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; - soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 3' et présente une extrémité 5'-OH, et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons obtenus à l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des produits de l'étape (3) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes comprenant une sonde pour chaque polymorphisme analysé complémentaire d'une partie du premier brin marqué de l'amplicon correspondant au polymorphisme particulier analysé ; (5) la détermination du signal émis par les brins marqués hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (6) la comparaison du signal déterminé à l'étape (5) au signal d'un échantillon référence, permettant ainsi l'identification, l'analyse et/ou la quantification des allèles d'un ou plusieurs polymorphismes.

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle l'amplification de l'étape (1) est réalisée par amplification isothermale ou par PCR. En particulier, la PCR peut être réalisée avec une paire d'amorces dont l'une des deux seulement est marquée en 5', l'autre portant une extrémité phosphorylée en 5'.

De préférence, l'amorce marquée est marquée par une molécule fluorescente, de préférence par le Cy3 ou le Cy5.

L'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les hétéroduplexes formés sont éliminés à l'étape (3) par l'action d'une endonucléase reconnaissant spécifiquement les mésappariements, suivie de l'action d'une exonucléase spécifique de l'ADN phosphorylé en 5'. De préférence, l'endonucléase est choisie dans le groupe constitué des endonucléases CEL1, Endo-1, BFN1, résolvases. Nuclease s1 et la nucléase du haricot mungo, et l'exonucléase est l'exonucléase du bactériophage lambda.

L'invention concerne en outre une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle l'étape (3) est réalisée par l'action d'un traitement physique ou chimique, ou combinant un traitement chimique et physique, de préférence par l'adjonction de [Rh(bpy)2(chrysi)]3+, ou d'un traitement combinant l'utilisation de KMnO4, de chlorure de tétraméthylamonium et de pipéridine.

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les hétéroduplexes formés sont éliminés par séparation physique des homoduplexes des hétéroduplexes.

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le support solide est une surface solide comme une surface de plastique, une lame de verre, de dioxyde de silicium, un puit de microplaque, ou un support fractionné comme des microbilles, des microbilles magnétiques ou des microbilles fluorescentes, des supports poreux ou possédant une surface non plane, des supports conducteurs de courant et des supports comme la nitrocellulose ou le nylon, de préférence une surface de plastique, une lame de verre ou de dioxyde de silicium.

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle la sonde oligonucléotidique possède une identité de séquence complète ou partielle avec la séquence de l'amorce non marquée.

L'invention concerne en outre une méthode telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la sonde oligonucléotidique est complémentaire d'une partie du brin marqué située entre l'extrémité non marquée et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2).

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'une pluralité de sondes est utilisée, chaque sonde étant complémentaire d'un polymorphisme unique présent dans les échantillons à analyser, et lesdites sondes étant immobilisées dans une position connue sur une surface solide.

L'invention concerne également une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les polymorphismes testés correspondent à des séquences microsatellites, des mutations, ponctuelles ou non, des variants d'épissage, des délétions, des insertions ou des amplifications.

L'invention concerne en outre une méthode telle que définie ci-dessus, pour déterminer le caractère homozygote ou hétérozygote d'un polymorphisme compris dans un échantillon d'acides nucléiques d'un sujet, dans laquelle à l'étape (6), le signal est comparé au signal d'un échantillon de référence qui est identique à l'échantillon testé mais uniquement soumis à la l'étape (1), de préférence avec un marqueur différent, et à la digestion du brin non marqué par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5' phosphate.

L'invention concerne en particulier une méthode telle que définie ci-dessus, 30 comprenant : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme à partir de l'échantillon à tester, ladite amplification étant réalisée sous la forme de deux amplifications indépendantes, une première amplification permettant d'obtenir des amplicons (a) et une deuxième amplification permettant d'obtenir des amplicons (b), et le marquage des amplicons (a) et (b) à l'extrémité 5' d'un premier brin étant réalisé avec un marqueur différent pour les amplicons (a) et (b), le deuxième brin étant phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) de l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la digestion des amplicons (b) de l'étape (1) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (5) l'hybridation des produits de l'étape (3) et des produits de l'étape (4) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination du signal émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (7) la comparaison des signaux issus des deux marqueurs.

L'invention concerne également une méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence, ladite méthode 25 comprenant : la détermination du caractère homozygote ou hétérozygote pour un ou plusieurs polymorphismes dans l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence selon l'un des modes de réalisation décrit ci-dessus ; et la comparaison du caractère homozygote ou hétérozygote pour le ou les 30 polymorphismes testés dans les deux échantillons, l'identité du caractère homozygote ou hétérozygote permettant de déduire l'identité entre l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence.

L'invention concerne également une méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence, comprenant : (1) deux réactions d'amplification indépendantes d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser et pour l'échantillon à identifier et l'échantillon référence d'un sujet dont l'identité est connue ou non, et le marquage des amplicons issus des deux réactions d'amplification par des marqueurs différents à une extrémité 5' d'un premier brin, le deuxième brin étant phosphorylé en 5', les amplicons marqués avec un premier marqueur étant appelés amplicons (a) et les amplicons marqués avec un deuxième marqueur étant appelés amplicons (b) ; (2) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) ; (3) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) dans les amplicons (a) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes des amplicons (a) et (b) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon référence avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (5) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon à identifier avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination des signaux émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques pour l'échantillon de référence et l'échantillon à identifier ; et (7) la comparaison des signaux, l'identité des signaux émis par les deux marqueurs pour l'échantillon de référence et l'échantillon à identifier indiquant l'identité des deux échantillons.

L'invention concerne également une biopuce sur laquelle sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques telles que définies dans la méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier les allèles d'un ou plusieurs polymorphismes dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet ci-dessus, lesdites sondes étant de préférence complémentaires d'une partie du brin marqué située entre l'extrémité non marquée et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2).

Les domaines d'application de la présente invention concernent la détermination de déséquilibres alléliques dans la recherche et le diagnostic in vitro en cancérologie, la détermination rapide du caractère homozygote ou hétérozygote d'un échantillon d'acide nucléique, utile notamment pour la détermination de fonds génétiques, c'est-à-dire l'analyse en parallèle du caractère homozygote ou hétérozygote de multiples marqueurs, comme par exemple des séquences microsatellites ou des mutations dans un échantillon d'ADN, applicable par exemple à l'analyse de banques de clones, et la sélection d'organismes présentant des caractères d'intérêt. Enfin, un autre domaine particulier de l'invention concerne l'identification d'individus ou d'organismes à travers la comparaison de leurs marqueurs génétiques avec ceux d'un individu ou organisme de référence, utile par exemple pour l'analyse de paternité, l'indentification de personnes, et le diagnostic in vitro.

DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 illustre les étapes de l'analyse de déséquilibres alléliques selon l'invention. La figure 2 représente un exemple de séquence d'amplicon d'un allèle pour les microsatellites D9S162 (SEQ ID NO :16) et PMP22 (SEQ ID NO :17). Légende :30 - en gras et italique : séquence et position de l'amorce sens modifiée à son extrémité 5' par un phosphate (SEQ ID NO :1 pour D9S162 ; SEQ ID NO :3 pour PMP22) ; - en gras : séquence et position de l'amorce antisens, marquée à la cyanine 5 à son extrémité 5' (SEQ ID NO :3 pour D9S162 ; SEQ ID NO :5 pour PMP22) ; -encadré : position et séquence de la sonde utilisée pour analyser le microsatellite D9S162 (SEQ ID NO :11) ou PMP22 (SEQ ID NO :12).

La figure 3 montre un exemple d'amplicons des allèles 1 (SEQ ID NO :16) et 2 (SEQ ID NO :18) du microsatellite D9S162 susceptible d'être obtenus par amplification avec les amorce sens et antisens représentées dans la figure 2. Légende : en gras, séquence répétée en tandem, de taille variable entre l'allèle 1 et l'allèle 2.

Figure 4 : exemple d'un hétéroduplexe comprenant un mésappariement entre les amplicons des deux allèles 1 et 2 du microsatellite D9S162. Légende : en italique, séquence d'ADN provenant de l'allèle 1 du microsatellite D9S162. Pleine, séquence d'ADN provenant de l'allèle 2 du microsatellite D9S162. En italique et en gras, séquence complémentaire de la sonde utilisée pour l'analyse du microsatellite D9S162.

Figure 5 : exemples du produit de digestion (SEQ ID NO :19) obtenu après action de l'endonucléase Endo-1 et de l'exonucléase lambda sur l'hétéroduplexe comprenant un mésappariement de la figure 4.

Figure 6 : exemple de capture du produit de digestion du microsatellite D9S162 représenté sur la figure 5 sur un support solide comprenant la sonde identifiée dans la figure 2 par un cadre.

La figure 7 montre la répartition des allèles du microsatellite D9S162 obtenue par électrophorèse capillaire sur le système d'analyse Agilent Bioanalyser 2100. La figure 8 illustre un exemple de détermination du caractère homozygote ou hétérozygote d'un polymorphisme présent dans un échantillon d'ADN.30 La figure 9 décrit un exemple de détermination de déséquilibres alléliques pour quatre polymorphismes différents présents dans un échantillon urinaire, et la comparaison de leur intensité relative de capture sur une biopuce. ND : échantillon non digéré avec Endo-1. endo : échantillon digéré avec Endo-1.

La figure 10 donne les séquences des amplicons des marqueurs D9S171 (SEQ ID NO :20), ACTPB2 (SEQ ID NO :21) et D16S476 (SEQ ID NO :22), ainsi que la séquence des amorces utilisées pour leur amplification (SEQ ID NO :5 à SEQ ID NO :10), et les sondes immobilisées utilisées pour la détection (SEQ ID NO :13 à SEQ ID NO :15).

Les figures 11 a-d illustrent la méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence.

La figure 11 a comprend un tableau listant la nomenclature adoptée pour l'étude de cinq polymorphismes différents à partir d'un échantillon à tester et un échantillon référence. La figure 11 b illustre le résultat de l'étape (1) comprenant deux amplifications indépendantes et le marquagedes amplicons correspondant au polymorphisme 1 pour l'échantillon et la référence. La figure 11 b illustre également l'étape (2) de dénaturation et hybridation des amplicons la), dans cet exemple, l'échantillon à identifier est hétérozygote pour le polymorphisme 1, et l'échantillon référence est hétérozygote pour le polymorphisme 1. La figure 11c illustre l'étape (3) d'élimination des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) de la méthode. Dans le mode particulier de réalisation représenté, les hétéroduplexes sont éliminés par digestion avec l'enzyme Endo-1, puis soumis à une digestion par l'exonucléase lambda. Après digestion par l'exonucléase lambda, 4 fragments peuvent être présents dans le milieu réactionnel correspondant à l'amplicons la) de l'échantillon à identifier (fragments F1 à F4). A partir des échantillons 1 b), seuls deux fragments différents sont présents dans le milieu réactionnel, correspondant aux brins marqués (fragments F3 et F4). Les amplicons la) des deux sources (échantillons à identifier et référence) sont ensuite réunis aux amplicons 1 b) correspondant. La figure 11d représente une biopuce sur laquelle sont immobilisées des sondes spécifiques des polymorphismes étudiés, dans une position définie et connue. La comparaison des signaux issus des échantillons à identifier et référence permettront de déterminer si l'échantillon à identifier correspond à l'échantillon de référence. Seuls les fragments F3 et F4 possèdent une partie complémentaire des sondes de la biopuce et donneront un signal lors de leur hybridation sur la biopuce (étapes (4) et (5) de la méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon décrite ci-dessous). La proportion non digérée des fragments F3 et F4 dans l'échantillon, après les deux étapes de digestion de cet exemple, est de 50% pour l'échantillon à identifier (hétérozygote pour l'allèle 1) et de 100% pour la référence (homozygote pour l'allèle 1). Pour les amplicons 1 b) aucune digestion n'ayant été effectuée, la proportion des fragments F3 et F4 est de 100% DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions Dans le texte qui suit, le terme échantillon référence ou échantillon de référence désigne un échantillon d'acides nucléiques, de préférence une solution d'ADN, possédant une composition stable en allèles et dont les proportions de ces allèles sont connues. Par exemple, une source référence d'acides nucléiques peut correspondre, dans le cadre du diagnostic d'un cancer, à l'ADN qui a été extrait des cellules mononucléaires du sang, ou de tout tissu ou fluide biologique non tumoral.

Le terme échantillon à tester désigne un échantillon d'acides nucléiques, de préférence une solution d'ADN, de manière encore plus préférée de l'ADN génomique extrait de cellules, de fluides ou de tissus biologiques tumoraux, ou supposés tumoraux, provenant d'une source unique. De manière générale, l'échantillon à tester comprend des acides nucléiques, comme par exemple une solution d'ADNc ou de l'ADN génomique dérivé d'un échantillon biologique devant être analysé, selon les modes de réalisations, pour sa composition relative en allèles, son hétérozygotie, ou encore pour son identité en le comparant à un échantillon référence connu. Par source unique , on entend indiquer que l'échantillon tel que défini ci avant ne correspond pas à un mélange d'acides nucléiques provenant de sources différentes. Ainsi, au sens de l'invention, un échantillon à tester correspond à un échantillon d'ADN provenant d'un seul sujet ou patient.

Le terme contrôle désigne un échantillon d'acides nucléiques, synthétiques ou naturels, comprenant deux allèles stables et connus, de proportions fixes (par exemple de proportion=l, pour un échantillon hétérozygote d'un organisme diploïde, ou par exemple 10 pour un échantillon possédant 10 fois plus d'un allèle par rapport au second), un des allèles différant de l'autre d'au minimum un nucléotide. Un échantillon contrôle peut servir à confectionner une gamme d'étalonnage interne composée de plusieurs étalons ayant des proportions différentes d'allèles, et qui est utile pour contrôler la bonne réalisation du test. Par exemple, un contrôle peut correspondre à une source d'ADN hétérozygote pour une mutation comme par exemple le contrôle : ref # NA 11284, (ccr.coriell.org/Sections/Collections/CDC/Coriell Oeil Repository) qui présente deux allèles différant de 3 bases au niveau du codon 508 présent dans l'exon 10 du gène CFTR.

Le terme déséquilibre allélique désigne une situation où une partie (allèle) d'un gène est perdue ou amplifiée. Dans le cas de la perte d'un allèle dans un locus spécifique, on parle de perte d'hétérozygotie si l'individu était à l'origine hétérozygote pour cet allèle. Cette perte d'un allèle peut être causée par une délétion ou la perte d'un chromosome sur deux, produisant alors une hémizygosité. Cette perte d'hétérozygotie est détectée lorsqu'un marqueur hétérozygote devient monomorphique. Quand ce phénomène se produit dans le locus d'un gène suppresseur de tumeur dont l'un des allèles est déjà non fonctionnel, il peut initier une transformation néoplasique.30 Un polymorphisme ou variant polymorphique correspond à une région particulière d'acide nucléique qui peut avoir différentes formes, ces différentes formes correspondant à des allèles.

Méthodes selon l'invention Un premier aspect de la présente invention concerne une méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier les allèles d'un ou plusieurs polymorphismes dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet, ladite méthode comprenant : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser à partir de l'échantillon à tester, et le marquage des amplicons ainsi produits à une extrémité d'un seul des deux brins aboutissant ainsi à la production soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 5' et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 3' et présente une extrémité 5'-OH, et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons obtenus à l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des produits de l'étape (3) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes comprenant une sonde pour chaque polymorphisme analysé complémentaire d'une partie du premier brin marqué de l'amplicon correspondant au polymorphisme particulier analysé, ladite partie étant située entre l'extrémité non marquée et la zone de mésappariement des hétéroduplexes de l'étape (2) ; (5) la détermination du signal émis par les brins marqués hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (6) la comparaison du signal déterminé à l'étape (5) au signal d'un échantillon référence, permettant ainsi l'identification, l'analyse et/ou la quantification des allèles d'un ou plusieurs polymorphismes.

L'invention est basée sur la détection spécifique des allèles au moyen de sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide. L'approche utilisée dans la présente invention consiste à amplifier spécifiquement les séquences d'intérêt d'un échantillon sous la forme d'amplicons double brins marqués, à dénaturer puis réhybrider ces amplicons double brins et enfin à éliminer les duplexes comprenant une région mésappariée qui auraient pu se former au cours de l'étape de réhybridation. Les sondes oligonucléotidiques immobilisées sont choisies de manière à ne retenir que les brins marqués qui faisaient partie d'un homoduplexe sans mésappariement après l'étape de dénaturation/réhybridation.

La méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier les allèles selon l'invention va maintenant être détaillée dans ses différents aspects.

La méthode selon l'invention décrite ci-dessus permet l'étude de variations génomiques polymorphiques. Par exemple, la méthode selon l'invention peut permettre l'identification de déséquilibres alléliques sur la base de l'étude de séquences microsatellitaires, que l'on peut trouver dans des bases de données publiques (www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/; et www.cephb.fr/cephdb/). Les microsatellites, connus aussi sous le nom de petites répétitions en tandem (short tandem repeats ou STRs), sont des loci d'ADN polymorphiques qui contiennent des séquences répétées de 2-10 nucléotides. Le nombre de répétitions pour un locus donné peut varier, produisant des allèles de taille différente. Le polymorphisme de ces marqueurs permet de visualiser 2 allèles différents (hétérozygotie) dans un génome diploïde. La comparaison du signal de ces deux allèles dans les génomes constitutionnel (référence) et tumoral (échantillon à tester) peut permettre de détecter des déséquilibres alléliques, témoins d'un remaniement tumoral. Ce déséquilibre allélique peut être une "perte d'allèle" ou un "gain d'allèle" selon que la séquence considérée est gagnée ou perdue.

Tous les autres marqueurs polymorphiques existant peuvent également être utilisés comme source de variations utilisable dans l'invention. Par exemple, les polymorphismes de polynucléotide unique (single nucleotide polymorphism ou SNPs), qui sont des variations ponctuelles d'une base accessibles par exemple dans la base de donnée publique dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), ou des mutations ponctuelles ou de plusieurs nucléotides, comprenant par exemple des délétions, des amplifications, des substitutions, des inversions ou des duplications, peuvent servir de base à l'identification, la comparaison et/ou la quantification d'allèles dans un échantillon d'acide nucléique selon l'invention.

Dans la méthode définie ci-dessus, les polymorphismes testés peuvent ainsi correspondent à des séquences microsatellites, des mutations, ponctuelles ou non, des variants d'épissage, des délétions, des insertions ou des amplifications.

La méthode peut permettre d'identifier, d'analyser et/ou de quantifier les allèles de plusieurs polymorphismes simultanément, par exemple d'au moins 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50 ou 100 polymorphismes, notamment de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50 ou 100 polymorphismes.

L'étape (1) de la méthode définie ci-dessus comprend l'amplification double brin d'une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques comprenant les allèles des polymorphismes testés, à partir de l'échantillon d'un sujet, et le marquage des amplicons ainsi produits à une extrémité d'un seul brin. La méthode peut comprendre en outre la même amplification dans l'échantillon de référence.

L'échantillon à tester par la méthode selon l'invention provient d'un sujet unique.

Le sujet peut être tout organisme, de préférence au moins diploïde, par exemple une plante, un animal, de préférence un mammifère, en particulier un humain. La méthode selon l'invention peut comprendre une étape de prélèvement de l'échantillon à partir du sujet. Cependant, il s'agit d'une méthode in vitro réalisée sur la base d'un échantillon d'acide nucléique préparé au préalable.

Les molécules d'acides nucléiques servant de matrice pour l'amplification réalisée à l'étape (1) de la méthode selon l'invention peuvent correspondre à tout type de molécules d'acides nucléiques, en particulier des molécules d'ARN (par exemple ARN messagers (ARNm), ARN ribosomaux (ARNr), ARNc (c'est à dire des molécules d'ARN préparées par transcription inverse in vitro à partir de molécules d'ADN complémentaire), etc.) ou des molécules d'ADN (ADN génomique, ADNc et fragments de ces molécules incluant des oligonucléotides, ESTs, STSs, séquences microsatellites, etc).

Les molécules d'acides nucléiques analysées par la méthode selon l'invention peuvent être de toute origine. Par exemple, l'analyse peut porter sur des molécules naturelles d'acides nucléiques, comme des molécules d'ADN génomique ou extra génomique isolées d'un organisme, ou des molécules d'ARN, comme des molécules d'ARN messager isolées d'un organisme. De façon alternative, ces molécules d'acides nucléiques peuvent être synthétisées, a l'aide d'enzymes in vivo ou in vitro, comme des molécules d'ADNc, des molécules polynucléotidiques synthétisées par PCR, des molécules d'ARN synthétisées par transcription inverse in vitro, etc.

Les acides nucléiques compris dans les échantillons à amplifier peuvent être amplifié par tout moyen connu par l'homme du métier. En particulier, l'homme du métier peut notamment envisager l'amplification d'une source d'ADN par PCR ou amplification isothermale.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'amplification est réalisée par PCR. L'homme de l'art peut identifier les amorces de PCR utiles pour la réalisation de la méthode selon l'invention par tout moyen, et notamment en utilisant des logiciels de modélisation d'amorces, comme Primer 3 (biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi), à partir de la séquence connue de la région à amplifier. Dans le cas de microsatellites, les séquences des amorces utiles pour l'amplification par PCR peuvent également être trouvées dans des bases de 5 données publiques comme par exemple : www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/str fact.htm, ou www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/primerl.htm.

dbsnp (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) est également une base de 10 données utile pour obtenir la séquence des amorces de PCR de certaines variations polymorphiques comme les SNP.

Dans un autre mode particulier de réalisation, un protocole ou un kit d'amplification isothermale est utilisé pour amplifier l'ADN dans l'étape (1) de la 15 méthode selon l'invention. L'amplification isothermale peut être utile si les échantillons analysés contiennent très peu de matériel amplifiable. Cette méthode d'amplification est bien connue de l'homme de l'art pour amplifier de façon uniforme l'ensemble de l'ADN d'un génome en utilisant un mélange d'amorces aléatoires de 6 nucléotides et la polymérase du bactériophage PHI29. Alan et al. (Molecular Human 20 Reproduction Vol.10 (2004), 10, pp. 767-772), notamment, décrivent une application de cette technique dans le domaine du diagnostic in vitro. Les réactifs nécessaires à ce type d'amplification sont disponibles sous forme de kits complets comme, par exemple, le kit GE Healthcare Life sciences, GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit.

25 Les amplicons produits peuvent être de l'ADN ou de l'ARN. Cependant, dans un mode de réalisation préféré, les amplicons sont de l'ADN.

Le marquage des amplicons peut être réalisé simultanément à l'étape d'amplification, notamment lorsqu'une PCR est utilisée. De manière alternative, et 30 notamment lorsqu'une amplification isothermale est mise en oeuvre, une étape supplémentaire de marquage des amplicons peut être réalisée, par exemple par PCR en utilisant deux amorces spécifiques, dont l'une est fluorescente.

Les amplicons obtenus dans l'étape (1) de la méthode selon l'invention doivent être marqués de façon à pouvoir être détectés. Le marqueur de détection peut être un marqueur fluorescent, fonctionnant par exemple par incorporation d'analogues de nucléotides portant un marqueur fluorescent.

Les molécules fluorescentes utilisables dans la présente invention incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, le rouge texas, la 5' carboxy-fluoresceine ( FAM ), la 2',7'-dimethoxy-4',5'-dichloro-6- carboxy-fluoresceine ( JOE ), la N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxy-rhodamine ( TAMRA ), la 6'carboxy-X-rhodamine ( ROX ), HEX, TET, IRD40, et IRD41. D'autres molécules fluorescentes additionnelles adaptées et utilisables dans le cadre de la présente invention incluent en outre : les cyanines (incluant notamment la Cy3, Cy3.5, et Cy5), les molécules BODIPY (incluant notamment BODIPY-FL, BODIPY- TM, BODIPY-630/650 et BODIPY-650/670), et les molécules fluorescentes de la série ALEXA (incluant notamment ALEXA-488, ALEXA-532, ALEXA-546, ALEXA-568, et ALEXA-594), ainsi que toute autre molécule fluorescente connue de l'homme de l'art.

D'autres marqueurs peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. On peut notamment citer la biotine, l'imminobiotine, des antigènes, des co-facteurs, du dinitrophenol, de l'acide lipoique, des composés oléfiniques, des polypeptides détectables, des molécules riches en électrons, des enzymes capables de générer un signal détectable en agissant en présence d'un substrat, et des isotopes radioactifs. Des isotopes radioactifs préférés incluent notamment 32P, 35S, 14C, 15N et 1251. Les amplicons peuvent être marqués soit en 5' du brin marqué soit en 3' du brin marqué. De préférence, tous les amplicons des polymorphismes à étudier à partir d'un échantillon sont marqués de manière exclusive en 5' ou en 3'.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les échantillons d'acides nucléiques sont amplifiés par PCR en utilisant un couple d'amorces oligonucléotidiques. Avantageusement, l'une des deux amorces est modifiée à son extrémité 5' avec une molécule fluorescente, de préférence par le Cy3 ou le Cy5, et l'autre amorce présente une extrémité 5'-phosphate.

Dans un mode particulier de réalisation, l'amplification et le marquage réalisés à l'étape (1) de la méthode définie ci-dessus sont réalisés de manière simultanée dans une étape de PCR telle que décrite ci-dessus.

Dans un autre mode particulier de réalisation, l'amplification et le marquage réalisés à l'étape (1) de la méthode définie ci-dessus sont réalisés par amplification isothermale d'un échantillon test et d'un échantillon référence,par exemple avec le kit isoAMP II THDA kit de Biohelix (BioHelix, 32 Tozer Road Beverly, MA 01915).

L'étape (2) de la méthode selon l'invention comprend la dénaturation et l'hybridation des amplicons marqués obtenus à l'étape (1). Par l'expression hybridation des amplicons marqués , on entend la dissociation des amplicons double brin produits à l'étape (1), puis la formation de duplexes d'acides nucléiques double-brin à partir des molécules d'acides nucléiques simples brins ainsi formées. Si l'échantillon à tester comprend des allèles différents d'un même locus analysé, le résultat d'une telle hybridation conduit à la formation d'homoduplexes et d'hétéroduplexes comprenant une région mésappariée. L'expression duplexe ne comprenant pas de région mésappariée , ou homoduplexe , est utilisée pour désigner une molécule d'acide nucléique double brin dont les deux brins sont complémentaires sur toute leur longueur.

L'expression hétéroduplexe comprenant une région mésappariée est utilisée pour désigner une molécule d'acide nucléique double brin dont les deux brins sont complémentaires sur une partie seulement de leur longueur. De préférence, la ou les régions non appariées correspondent à une ou des région(s) du duplexe éloignée(s) des extrémités de l'hétéroduplexe ainsi formé. En d'autres termes, les hétéroduplexes comprenant une région mésappariées formés dans la méthode selon l'invention comprennent de préférence des extrémités double-brin. Pour illustrer cette notion, la figure 4 montre un exemple d'hétéroduplexe comprenant une région mésappariée formé entre deux allèles d'un microsatellite possédant un nombre de répétitions différent. Les duplexes comprenant une région mésappariée ont dans leur structure un certain nombre de bases non appariées, schématisé par une boucle dans la figure 4. Dans cet exemple, le nombre de répétitions entre les deux allèles du microsatellite analysé varie de 25 répétitions GT pour l'allèle 1 et 28 répétitions GT pour l'allèle 2. La zone de mésappariement du duplexe comprenant une région mésapparié est donc de 6 bases dans la figure 4. Lors de cette étape de formation d'hétéroduplexes comprenant une région mésappariée, seule une fraction des brins d'acide nucléique en solution sont combinés pour donner des duplexes comprenant une région mésappariée, alors que les autres fragments sont réassociés de façon parfaite pour donner des homoduplexes. La proportion d'hétéroduplexes comprenant une région mésappariée et d'homoduplexes formés à l'issue de l'étape (2) de la méthode décrite ci-dessus est statistiquement de 50% si deux allèles sont présents dans les même proportions. La figure 1 montre les proportions de chacune des espèces obtenues lors de l'amplification d'un échantillon contenant deux allèles présents dans les mêmes proportions.

L'étape (3) de la méthode selon l'invention, a tout d'abord pour résultat l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2). Par élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée, on entend aussi bien l'hydrolyse sélective de tels hétéroduplexes par rapport à des homoduplexes que la séparation physique des homoduplexes des hétéroduplexes.

L'élimination par hydrolyse sélective peut être réalisée au moyen de plusieurs procédés, notamment physico-chimiques ou enzymatiques. Dans un mode particulier de réalisation, l'étape (3) comprend l'utilisation d'une ou plusieurs enzymes pour cliver sélectivement les hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés au cours de l'étape (2).30 En particulier, on peut utiliser certaines endonucléases reconnaissant spécifiquement les mésappariements. Parmi celles-ci, on peut notamment citer la nucléase du haricot mungo, la nucléase S1, l'enzyme CEL1, ZEN-1, BFN-1 ou Endo- 1, de préférence CEL1 ou Endo-1, et de façon encore plus préférée Endo-1. De préférence, les endonucléases utilisées génèrent un clivage double brin et des extrémités 5' phosphorylées après clivage.

Ces endonucléases se fixent sur l'ADN double brin et le clive à la position du ou des mésappariements. Ce clivage génère deux fragments d'ADN double brin lorsqu'un seul mésappariement est présent dans l'hétéroduplexe comprenant une région mésappariée. Lorsqu'on utilise les enzymes CEL1, ZEN-1, BFN-1 ou Endo-1, les deux fragments d'ADN double brins obtenus après digestion possèdent une extrémité 5' phosphorylée, éventuellement disponible pour la digestion avec une exonucléase spécifique d'une extrémité 5' phosphorylée, notamment l'exonucléase lambda.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le clivage des hétéroduplexes est obtenu par digestion enzymatique utilisant un mélange des enzymes mutH, MutS et MutL.

L'étape d'élimination enzymatique peut également comprendre une deuxième digestion en complément de la digestion par une endonucléase spécifique des mésappariement telle que décrite ci-dessus.

Ainsi, par exemple, une deuxième digestion peut mettre en oeuvre une exonucléase digérant sélectivement les brins d'ADN dont l'extrémité 5' présente un groupement phosphate, ou extrémité 5'-phosphate, et transformant ainsi les fragments d'ADN double brins en ADN simple brins. Ces groupements phosphates sont présents à la fois par la coupure des duplexes par l'endonucléase utilisée précédemment et parce que l'amorce non marquée utilisée dans les étapes d'amplification préliminaires est une amorce comprenant une extrémité 5'-phosphate.

En conséquence, à la fois les extrémités 5'-phosphate générées par l'hydrolyse des hétéroduplexes par l'endonucléase spécifique des mésappariements et celles situées sur le brin non marqué sont des substrats exploitables pour cette exonucléase. Ainsi, l'élimination sélective des hétéroduplexes et la digestion du deuxième brin des homoduplexes peuvent être réalisées simultanément lors de la digestion par cette exonucléase.

10 Dans un mode de réalisation particulier, l'exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate est une exonucléase lambda.

Dans un mode particulier de réalisation, la combinaison des deux types de digestion décrits ci-dessus est tout particulièrement adaptée au marquage à 15 l'extrémité 5'. Elle permet de produire des fragments d'ADN simple brin marqués avec une molécule fluorescente dont une fraction seulement peut être capturée par les sondes oligonucléotidiques immobilisées de la quatrième étape. Ces fragments capturables correspondent aux molécules qui n'ont pas été digérées.

20 Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, l'étape (3) est réalisée par action d'une endonucléase reconnaissant spécifiquement les mésappariements dans un ADN double brin, suivi d'une digestion par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate qui permet d'éliminer les brins phosphorylés en 5' produits par la digestion par l'endonucléase reconnaissant 25 spécifiquement les mésappariements et le brin non marqué qui comprend une extrémité 5'-phosphate.

Dans un autre mode particulier de réalisation, l'étape (3) est réalisée par traitement chimique comprenant l'adjonction de [Rh(bpy)2(chrysi)]3+ ou d'un traitement 30 combinant l'utilisation de KMnO4, de chlorure de tetramethylamonium et de pipéridine.5 Dans un mode de réalisation particulier reposant sur une séparation physique, deux méthodes d'électrophorèse capillaire alternatives, appelées respectivement constant denaturant capillary electrophoresis (CDCE) et denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE), peuvent être utilisées pour séparer physiquement les homoduplexes des hétéroduplexes, de façon à ne conserver que les fragments homoduplexes pour l'analyse de l'étape (4).

Dans un autre mode de réalisation particulier reposant sur une séparation physique, l'élimination des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée est réalisée par rétention de ces derniers sur une colonne de chromatographie d'affinité, obtenue en couplant la proteine MutS avec une résine adéquate comme par exemple dans Brock et Al. Nucleic acid research, 2005, V33, No.6, e55. Dans ce mode de réalisation, les homoduplexes ne sont pas retenus sur la colonne d'affinité, et sont collectés et utilisés pour l'analyse de l'étape (4).

L'étape (4) de la méthode définie ci-dessus comprend la mise en contact et l'hybridation des produits de l'étape (3) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes comprenant une sonde pour chaque polymorphisme analysé complémentaire d'une partie du premier brin marqué de l'amplicon correspondant au polymorphisme particulier analysé. Ainsi, le support solide comprend au moins une sonde immobilisée correspondant à chaque polymorphisme étudié.

Les sondes oligonucléotidiques utilisées dans l'étape (4) sont donc conçues pour s'hybrider sélectivement à une partie du brin marqué des amplicons. Pour rappel, l'étape d'amplification décrite ci-dessus comprend, ou est suivie, d'une étape de marquage à une extrémité d'un brin desdits amplicons. Les sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide sont complémentaires de régions spécifiques des brins marqués.

Avantageusement, dans un mode préféré de réalisation, lorsque l'étape (3) d'élimination est réalisée par digestion des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée, les sondes oligonucléotidiques sont spécifiques des extrémités non marquées du brin portant le marquage, entre l'extrémité nonmarquée et le point de clivage correspondant à la région potentielle de mésappariement des duplexes formés à l'étape (2). Dans un mode de réalisation préféré, le marquage étant réalisé en 5' de l'un des brins des amplicons, la sonde nucléotidique immobilisée est spécifique de l'extrémité 3' de ces brins marqués, entre l'extrémité 3' et la région de mésappariement. En particulier, la sonde peut être spécifique de l'extrémité 3' du brin marqué.

Dans un mode particulier de réalisation, lorsque l'étape d'élimination des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée est réalisée par séparation physique, comme cela est décrit ci-dessus, la sonde oligonucléotidique est complémentaire d'une région quelconque du brin marqué.

De façon préférée, les sondes oligonucléotidiques immobilisées ont une séquence correspondant à une séquence utilisable comme amorce de PCR. De manière encore plus préférée, les sondes oligonucléotidiques ont la même séquence que les amorces utilisées dans l'étape d'amplification pour générer le brin non marqué des produits d'amplification. Alternativement, les sondes oligonucléotidiques peuvent avoir une séquence qui chevauche celle des amorces utilisées dans l'étape d'amplification pour générer le brin non marqué des produits d'amplification.

La figure 6 donne un exemple de produit résultant des étapes (1) à (3) du microsatellite D9S162, hybridé sur une biopuce portant une sonde complémentaire du brin marqué. Les sondes de l'invention sont préférentiellement des sondes oligonucléotidiques d'ADN, d'ARN de LNA, ou de PNA possédant de 10 à 70 nucléotides, partiellement ou totalement complémentaires de la zone d'hybridation du produit de PCR. Ces sondes peuvent être organisées en épingle à cheveux ou non, et peuvent inclure une ou plusieurs modifications chimiques comme, de façon préférée, une extrémité aminée, ou biotinylée.

Les sondes adéquates peuvent être conçues en utilisant par exemple des logiciels de dessins de sondes comme Primer 3 (biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi), La détection des brins marqués est réalisée sur un support solide, de préférence sur des biopuces à sondes. Une biopuce est un ensemble organisé de sites de liaisons adressables en terme de position sur un support, par exemple un substrat solide où des sondes oligonucleotidiques sont immobilisées à la surface du substrat à une position définie et connue. L'invention concerne donc également une biopuce sur laquelle sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus.

De préférence, les substrats utilisés dans cette invention sont notamment des lames de verre, des billes de silice, d'agarose, des billes magnétiques, des plaques de microtitrations, ou des supports cellulosiques. Ces substrats peuvent être modifiés ou fonctionnalisés par silanisation ou toute autre modification chimique connue de l'homme de l'art permettant de créer des groupements chimiques adéquats pour l'immobilisation covalente des sondes. Ces groupements peuvent être notamment des amines primaires, des thiols, des carboxyls ou des aldéhydes. D'autres surfaces utiles pour l'immobilisation peuvent être notamment du dioxyde de silicium, des polymères plastiques comme le polystyrène, ou des supports conducteurs de courant comme des surfaces métalliques ou du carbone vitreux. Le support peut être poreux ou non poreux.

Les méthodes d'attachement des sondes sont bien connues de l'homme de l'art (voir par exemple Sambrook et al., eds., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Vols. 1-3, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Dans un mode particulier de réalisation, le support solide correspond à une lame de verre sur laquelle sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques spécifiques d'allèles dont les proportions sont connues pour être déséquilibrées dans une pathologie, normalement dans un cancer. Il s'agit notamment d'allèles dont les déséquilibres alléliques peuvent permettre la détection ou l'analyse d'un cancer de la vessie ou du sein.

L'étape (5) comprend la détermination du signal émis par les brins marqués hybridés sur les sondes oligonucléotidiques immobilisées sur le support solide. Cette détermination dépend du marqueur utilisé pour marqué les amplicons à l'étape (1) de la méthode de l'invention et fait partie des connaissances générales de l'homme du métier.

Dans l'étape (6), le signal issu d'un échantillon de référence peut être le signal issu de l'échantillon du sujet et n'ayant pas subit l'étape d'élimination sélective des hétéroduplexes de l'étape (3). Il peut également s'agir du signal d'un échantillon de référence possédant une composition stable et connue en allèles du polymorphisme étudié. L'échantillon de référence peut correspondre à un échantillon provenant de cellules saines ou de cellules caractéristiques d'une pathologie. Dans un mode de réalisation, l'échantillon de référence est soumis aux étapes (1) à (4). Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon n'est pas soumis à l'étape d'élimination sélective des hétéroduplexes de l'étape (3). Les amplicons générés à partir de l'échantillon de référence peuvent être marqués par le même marqueur que les amplicons générés à partir de l'échantillon étudié ou par un marqueur différent.

La méthode selon la présente invention peut être utile pour détecter des déséquilibres alléliques, pour déterminer le caractère homozygote ou hétérozygote et pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acide nucléique à un échantillon de référence.

La combinaison des étapes de la méthode selon l'invention permet de différencier les échantillons références des échantillons possédant un déséquilibre dans la proportion de leurs allèles. En effet, pour un organisme diploïde, dans le cas d'un échantillon ayant deux allèles présent dans les même proportions (par exemple dans le cas de la référence), la dénaturation puis la renaturation lente d'un mélange contenant par exemple deux allèles d'un même microsatellite (par exemple un allèle de taille courte et un allèle de taille longue) conduit statistiquement à la formation de 50 % de duplexes comprenant une région mésappariée, correspondant à l'hybridation d'un brin amplifié correspondant à un allèle long avec un brin amplifié correspondant à un allèle court, 25 % d'homoduplexes d'allèles courts (duplexes parfaitement complémentaires de produits d'amplification correspondant à un allèle court) et 25 % d'homoduplexes d'allèles longs. Cette répartition n'est respectée que si les 2 allèles sont en proportions équivalentes dans le mélange. Dans le cas d'un échantillon dans lequel l'un des 2 allèles d'une séquence microsatellite est amplifié ou perdu (cas par exemple de certains échantillons issus de cellules cancéreuses), il se forme moins de duplexes comprenant une région mésappariée. Ces duplexes comprenant une région mésappariée n'étant pas détectables dans l'étape (4), la diminution du signal par rapport à un même échantillon n'ayant pas subi l'élimination des hétéroduplexes, pour un échantillon déséquilibré au niveau du nombre de ses allèles sera moindre que pour l'échantillon de référence, par exemple un échantillon de référence qui a une proportion de 50% de duplexes comprenant une région mésappariée formés et conduit a une diminution de 50% de son signal après traitement à l'étape (3).

Dans un échantillon diploïde homogène, et pour une variation polymorphique donnée, la fréquence d'un allèle est obtenue selon les calculs suivants: Fréquence de l'allèle de type 1, Al= NA1/ NA1+NA2, Fréquence de l'allèle de type 2, A2 = NA2/ NA1+NA2, avec NA1= nombre d'allèles de type 1, et NA2= nombre d'allèles de type 2 . Au cours de la réaction d'hybridation de l'étape (2) de la présente invention, il y a formation d'hétéroduplexes selon les proportions suivantes : fréquence des hétéroduplexes : Fh = 2xA1xA2.

Le signal obtenu par capture des brins marqués restant, après réalisation des étapes (1) à (5) de la méthode selon l'invention est directement proportionnel à la quantité d'allèles non digérés restant en solution, c'est à dire formant des homoduplexes. L'ensemble des hétéroduplexes étant éliminés à l'étape (3) de l'invention, le signal obtenu est proportionnel à : S= a [FH-Fh], où S= signal de capture sur la biopuce a est une variable caractérisant l'environnement des réactions d'hybridation et de capture sur la biopuce. FH= fréquence des homoduplexes avant retape (2), Fh= Fréquence des hétéroduplexes (éliminés au cours de l'étape (3))

La fréquence des homoduplexes avant digestion est la suivante: FH = Al2+ A22+ 2x A1xA2.

D'où S = a [Al2+ A22].

Dans le cas de la comparaison des signaux provenant de deux échantillons traités selon la méthode selon l'invention, par exemple le signal d'un échantillon à tester (Se) et d'un échantillon référence (Sr), vis-à-vis des mêmes allèles: Se= a [A1e2+ A2e2], et Sr = a [A1r2+ A2,2].

Soit Se/Sr le ratio de déséquilibre allélique obtenu par comparaison des deux échantillons, 25 Alors, Se/Sr=(Ale2+ A2e2)/(A1r2+ A2r2)

La comparaison des signaux peut donc être effectuée sur la base de cette formule.

Par exemple, dans le cas ou Sr est le signal obtenu pour un échantillon référence 30 diploïde possédant un allèle de type 1 sur un chromosome, et un allèle de type 2 sur un autre chromosome, alors Al = 0, 5 et A2 = 0,5. Dans ces conditions, Se/Sr= A1e2+ AZe2/ 0,520 A partir de cette formule de calcul du ratio de déséquilibre allélique, l'on voit que si l'échantillon à tester présente la même quantité d'allèles de type 1 et de type 2, alors, Se/Sr= 2 x A1e2/0,5.

Et si Ale= A2e= 0,5 ; (cas d'un échantillon diploïde présentant un allèle de type 1 sur un chromosome, et un allèle de type 2 sur un autre chromosome) alors, Se/Sr=l .

Les signaux obtenus dans ces conditions par la comparaison de l'échantillon avec la référence seront égaux.

Dans un deuxième exemple illustratif, une référence diploïde possédant un allèle de type 1 sur chromosome, et un allèle de type 2 par chromosome, et un échantillon présentant un déséquilibre allélique de la forme : Ale = 0,75, et A2e = 0,25, soit un déséquilibre allélique de 25%, sont comparés.

Le calcul du ratio de déséquilibre allélique, après les étapes 1 à 6 de l'invention donnera : Se/Sr= A1e2+ A2e2 / 0,5, ou Se/Sr=0,625/0,5=1,25, ce qui signifiera que le signal de l'échantillon sera 1,25 fois (25%) plus élevé que celui de la référence.

Un déséquilibre allélique est donc détecté lorsque le signal correspondant à l'échantillon testé est plus élevé que le signal de la référence.

La figure 1 schématise les différentes étapes d'un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la méthode pour identifier, comparer et/ou quantifier des alleles selon l'invention. Il est entendu que ce mode de réalisation n'est décrit que dans un but d'illustration de la présente invention et qu'il n'est pas destiné à en limiter la portée. 30 La figure 1 représente l'analyse d'un échantillon à tester, limitée à l'amplification d'une seule séquence d'intérêt, qui est présente sous la forme de deux allèles différents, un allèle court et un allèle long. L'étape (1) de la méthode définie ci-dessus est constituée d'une amplification double brin par PCR de la séquence d'intérêt et du marquage d'un seul des deux brins des amplicons (en utilisant une paire d'amorces de PCR avec une seule des deux amorces marquée). Ce marquage est représenté par un losange plein dans la figure 1, à l'extrémité 5' d'un seul des deux brins des amplicons long et court, et est par exemple constitué d'une molécule fluorescente. L'autre amorce utilisée pour l'amplification est modifiée par ajout à son extrémité 5' d'un phosphate.

A l'étape (2), les amplicons marqués subissent une étape de déshybridation, résultant en l'obtention d'une solution ne comprenant que des ADN simple brin, qui sont ensuite hybridés entre eux. Cette étape d'hybridation conduit à la formation de duplexes qui peuvent être soit des homoduplexes dans le cas d'une réassociation des brins correspondant au même allèle (brin d'amplification de l'allèle court associé au brin complémentaire correspondant à l'allèle court ; ou brin d'amplification de l'allèle long associé au brin complémentaire correspondant à l'allèle long) ou à des hétéroduplexes dans le cas d'une réassociation des brins correspondant à des allèles différents (un brin correspondant à l'amplification de l'allèle long s'associe au brin complémentaire correspondant à l'amplification de l'allèle court).

Tel que représentée dans la figure 1, pour un échantillon diploïde comportant un allèle court et un allèle long, l'étape (2) de la méthode définie ci-dessus conduit à la formation de 50 % d'hétéroduplexes, c'est à dire de duplexes comprenant une région mésappariée (allèle long - allèle court, le mésappariement étant représenté par une boucle sur l'un des deux brins) et 50 % d'homoduplexes, c'est à dire de duplexes parfaits, appariés sur toute leur longueur (25 % allèle long - allèle long et 25 % allèle court - allèle court).

L'étape (3) de la méthode définie ci-dessus comprend l'élimination spécifique des duplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2). Dans le cas particulier illustré sur la figure 1, cette élimination est réalisée par digestion enzymatique. Une première digestion par l'enzyme Endo-1 permet le clivage double brin des hétéroduplexes. Les homoduplexes ne sont pas digérés par Endo-1. Une deuxième digestion est ensuite réalisée avec l'exonucléase lambda, qui digère les fragments d'ADN simple brin à partie d'une extrémité 5'-phosphate.

Les produits de digestion sont ensuite mis en contact avec une sonde oligonucléotidique immobilisée complémentaire du brin marqué des amplicons de l'étape (1). La sonde immobilisée est conçue de telle manière qu'elle est complémentaire d'une partie particulière du brin marqué. Dans le mode de réalisation de la figure 1, une digestion par Endo-1 est réalisée. Après cette digestion, le brin marqué est séparé en deux fragments, un fragment comprenant le marqueur en 5' et un fragment ne comprenant pas ce marqueur. La sonde oligonucléotidique immobilisée est complémentaire du brin marqué, dans une partie située entre l'extremité 3' du brin marqué et la zone de présence du mésappariement. De la sorte, les seuls brins marqués qui se fixeront sur la sonde sont ceux qui n'auront pas été clivés au cours de l'étape (3), c'est à dire les brins marqués qui faisaient partie d'un duplexe parfait après l'étape (2).

Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon la présente invention, l'invention concerne une méthode pour déterminer le caractère homozygote ou hétérozygote d'un polymorphisme compris dans un échantillon d'acides nucléiques d'un sujet, dans laquelle à l'étape (6), le signal est comparé au signal d'un échantillon de référence qui est identique à l'échantillon testé mais uniquement soumis à la l'étape (1) avec un marqueur différent et à la digestion du brin non marqué par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5' phosphate. C'est-à-dire que cet échantillon n'est pas soumis à l'élimination sélective des hétéroduplexes.

Un marquage au cours d'une PCR avec une des deux amorces comprenant une extrémité 5' marquée est tout particulièrement adapté pour ce mode de réalisation.

Ainsi, la méthode pour déterminer le caractère homozygote ou hétérozygote d'un polymorphisme compris dans un échantillon d'acides nucléiques d'un sujet peut comprendre : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme à partir de l'échantillon à tester, ladite amplification étant réalisée sous la forme de deux amplifications indépendantes, une première amplification permettant d'obtenir des amplicons (a) et une deuxième amplification permettant d'obtenir des amplicons (b), et le marquage des amplicons (a) et (b) à l'extrémité 5' d'un premier brin étant réalisé avec un marqueur différent pour les amplicons (a) et (b), le deuxième brin étant phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) de l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la digestion des amplicons (b) de l'étape (1) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (5) l'hybridation des produits de l'étape (3) et des produits de l'étape (4) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination du signal émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (7) la comparaison des signaux issus des deux marqueurs.

Dans un mode de réalisation alternatif, les deux amplicons peuvent être marqués avec le même marqueur. Dans ce mode de réalisation, l'amplicon (a) est traité séparément de l'amplicon (b), l'amplicon (a) subissant l'élimination sélective des hétéroduplexes et l'amplicon (b) ne subissant pas cette étape. Dans cette variante, les hybridations de l'étape (5) sont réalisées sur deux zones différentes de la biopuce (appelées matrices, identiques par le type, la position, et la nature des sondes qui y sont immobilisées, mais spatialement isolées l'une de l'autre), ou deux biopuces identiques. Un contrôle peut également être inclus dans cette méthode pour calibrer les différences de signaux. Par exemple, on peut inclure un contrôle homozygote ou hétérozygote.

Le signal des amplicons (b) correspond au signal de l'échantillon de référence.

Dans ce cadre, une hétérozygotie sera détectée si le signal émis par le marqueur correspondant aux amplicons (a) est inférieur au signal émis par le marqueur correspondant aux amplicons (b). En effet, le signal détecté à partir du marqueur fixé aux amplicons (b) défini le signal maximum qu'il est possible de détecter, et correspond donc, par rapport à un échantillon qui aurait subit l'ensemble des étapes de la méthode de détermination du caractère hétérozygote ou homozygote, au signal obtenu dans le cas d'une perte d'hétérozygotie (aucun hétéroduplexe ne peut être formé dans ce cas puisque pour un même allèle, une seul forme existe dans l'échantillon). Si les signaux issus des marqueurs des amplicons (a) et (b) diffèrent significativement pour un polymorphisme donné (si par exemple le signal obtenu avec l'amplicon (a) est proche de 50% du signal de l'amplicon (b), pour un marqueur bi-allélique dans un individu diploïde), il peut être conclu que cet allèle est hétérozygote dans l'échantillon testé.

Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon la présente invention, l'invention concerne une méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence, ladite méthode comprenant : la détermination du caractère homozygote ou hétérozygote pour un ou plusieurs polymorphismes dans l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence et ; la comparaison du caractère homozygote ou hétérozygote pour le ou les polymorphismes testés dans les deux échantillons, l'identité du caractère homozygote ou hétérozygote des polymorphismes dans les deux échantillons permettant de déduire l'identité entre l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence.

Le nombre de polymorphismes testés sera choisi de manière à permettre une discrimination statistiquement significative d'un individu particulier.

Ainsi, la méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence peut par exemple comprendre : (1) deux réactions d'amplification indépendantes d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser et pour l'échantillon à identifier et l'échantillon référence d'un sujet dont l'identité est connue ou non, et le marquage des amplicons issus des deux réactions d'amplification par des marqueurs différents à une extrémité 5' d'un premier brin, le deuxième brin étant phosphorylé en 5', les amplicons marqués avec un premier marqueur étant appelés amplicons (a) et les amplicons marqués avec un deuxième marqueur étant appelés amplicons (b) ; (2) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) ; (3) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) dans les amplicons (a) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes des amplicons (a) et (b) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon référence avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (5) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon à identifier avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination des signaux émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques pour l'échantillon de référence et pour l'échantillon à identifier ; et (7) la comparaison des signaux, l'identité des signaux émis par les deux marqueurs pour l'échantillon de référence et l'échantillon à identifier indiquant l'identité des deux échantillons.

Dans un mode de réalisation particulier, les étapes (4) et (5) mettent en oeuvre deux supports solides distincts. Dans un mode de réalisation alternatif, les étapes (4) et (5) mettent en oeuvre un seul support sur lequel les sondes sont immobilisées au moins à deux endroits différents.

Dans un mode de réalisation différent, l'identification d'un échantillon peut être réalisé également en comparant le profil obtenu pour plusieurs polymorphismes de cet échantillon à ceux d'une base de donnée informatique contenant les profils d'autres échantillons. Dans ce cas, il n'y a pas lieu de réaliser l'amplification et l'analyse de l'échantillon référence. Pour ce mode de réalisation, l'échantillon à identifier peut également provenir d'un sujet connu, et l'analyse de son profil peut permettre de déterminer la présence de ce profil dans la base de donnée.

Les figures 11 a-d illustrent un mode particulier de réalisation de la méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence telle que décrite ci-dessus.

Selon un aspect supplémentaire, l'invention concerne un kit comprenant un support solide tel que décrit ci-dessus sur lequel sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques spécifiques d'allèles d'intérêt, comprenant également des réactifs permettant la réalisation des étapes des méthodes décrites ci-dessus.

Il peut s'agir d'un kit pour la détection d'une pathologie déterminée, par exemple un cancer, notamment un cancer de la vessie ou du sein, comprenant les éléments nécessaires à l'amplification des séquences d'allèle détectées sur le support solide. EXEMPLES

Les exemples qui suivent ne sont présentés que pour illustrer la présente 10 invention, et ne doivent pas être interprétés comme une limitation de l'invention aux seuls modes de réalisation indiqués. Les exemples présentés ci-dessous décrivent l'utilisation de biopuces à sondes pour la détection de déséquilibres d'allèles de microsatellites.

15 Amplification des séquences d'intérêt

La figure 2 montre un exemple d'amplicons d'allèles différents obtenus lors de l'amplification du microsatellite D9S162. Cette séquence comporte un allèle court et un allèle long, différant par le nombre de répétitions dans leur séquence. La figure 7 20 montre la répartition de ces allèles obtenue par électrophorèse capillaire sur le système d'analyse Agilent Bioanalyser 2100. Dans cet exemple, l'échantillon amplifié est marqué avec une molécule fluorescente de Cyanine 5 au cours d'une PCR, via l'incorporation d'une amorce antisens marquée à son extrémité 5', et une amorce sens non marquée, mais modifiée par un phosphate en 5' positionnée (fig 2). 25 Dans les exemples ci après, l'ensemble des PCRs est réalisé en suivant le protocole suivant :

100 ng d'ADN génomique issus d'échantillons d'ADN sanguins sont ajoutées à un 30 mélange composé de : H2O 22pI MixPCR 25 pl Amorce antisens à 20pM 1 pl Amorce sens à 20pM 1 pl5 Les séquences des amorces sont les suivantes : Amorce antisens D9S162 5'-[Cy5] AATTCCCACAACAAATCTCC-3' 20 bp marquée à la Cy5 (SEQ ID NO :1) Amorce sens D9S162 non 5'- [P] GCAATGACCAGTTAAGGTTC-3' 20 bp marquée, phosphorylee, en 5' (SEQ ID NO :2) Le mix de PCR contient 1,25 U de polymerase TaqGold, 300pM final de dNTPs dans le tampon de l'enzyme. 30 cycles de PCR sont réalisées dans un thermocycleur (95 C pendant 10 minutes, suivi de 30 cycles 94 C pendant 45 sec, 60 C pendant 60 sec, 65 C pendant 25 sec) 10 Formation des hétéroduplexes Dans les exemples suivants, les hétéroduplexes sont formés après l'étape de PCR en réalisant dans un thermocycleur une dénaturation des amplicons à 98 C pendant 5mn, puis en réassociant les brins d'ADN en appliquant une rampe de température 15 décroissante de 98 C à 4 C à une vitesse de 0,1 C /s.

Clivaqe des hétéroduplexes avec Endo-1 Dans les exemples suivant, l'enzyme Endo-1 (Ref E0515, Serial Genetics, 91000 Evry France) est diluée au 1/1000, puis la réaction est réalisée dans les conditions 20 suivantes : -Produit de PCR : 46pl - Tampon de réaction : 6pl - Eau : 2pl - Enzyme endo 1 : 6pl 25 Pour l'échantillon non digéré, l'enzyme est remplacée par de l'eau.

Le mélange est ensuite incubé pendant 40 min à 37 C, et la réaction est arrêtée en portant le mélange à 98 C pendant 5 min puis les brins sont renaturés. Elimination des produits de clivaqes avec l'exonucléase lambda 30 Dans les exemples suivants, cette réaction utilise l'exonucléase lambda (Ref MO2625: New England BioLabs.). Le mélange réactionnel contient : -Produit du clivage par Endo-1 : 58pl - Tampon de réaction : 10pI - Enzyme exonucléase lambda : 2pl Ce mélange est incubé 30 min à 37 C.

Conception de la biopuce La sonde complémentaire de l'extrémité 3' du brin antisens de l'amplicon D9S162 (voir fig. 2a : position et séquence de la sonde), et la sonde complémentaire de l'extrémité 3' du brin antisens de l'amplicon PMP22 (séquence représentée sur la figure 2, amplifiée dans les mêmes conditions que le microsatellite D9S162, avec les amorces sens et antisens de séquence SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4) sont déposées sur une lame codelink (GE healthcare) à une concentration de 50pM dans du tampon borate pH 8, à l'aide d'un spotter affymetrix 418, sous la forme de 3réplicats. Après incubation de la biopuce à 30 C pendant 45 minutes, celle-ci est ensuite inactivée avec 0,1% d'éthanolamine dans un tampon phosphate à pH 8, puis stockée après séchage dans un dessiccateur.

Capture des séquences a analyser sur la biopuce Chaque biopuce de sondes immobilisées est traitée avec 20pL de produit de PCR marquée à la Cy5 selon les conditions indiquées plus avant, dans du tampon SSC 6X. Après le dépôt d'une lamelle sur chaque lame, la solution de molécule cible est laissée à hybrider pendant 1 heure à température ambiante. Chaque biopuce est ensuite rincée pendant cinq minutes dans du SSC 4X, puis rincée pendant 2 minutes dans du SSC 0,1X. Chaque lame est ensuite analysée dans un scanner à biopuce (Axon Instruments, Inc., Union City, California, USA) en utilisant les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission du Cy5.

La figure 6 montre un exemple de capture d'un produit de digestion du microsatellite D9S162 sur un support solide comprenant des sondes oligonucléotidiques. Il s'agit d'une vue partielle de l'ADN double brin issu de la digestion de l'homoduplexe de l'allèle 1 (dont la séquence est représentée sur la figure 3) sur une biopuce comprenant une sonde immobilisée et complémentaire de l'amplicon D9S162. La sonde est fixée de façon covalente sur le support de biopuce, et hybridée avec le brin marqué à la Cy5 du produit de PCR 5 du microsatellite D9S162.

Hybridation des amplicons, élimination des hétéroduplexes et exemple de détermination de l'hétérozyqotie d'un échantillon pour plusieurs variations polymorphiques La figure 8 illustre les résultats obtenus après un cycle de formation d'hétéroduplexes du microsatellite D9S162, et de la séquence PMP22, amplifiés selon les conditions suivantes : deux échantillons d'ADN identiques sont amplifiés en utilisant pour DS9162 les amorces indiquées dans la figure 2 (en gras uniquement, l'amorce antisens SEQ ID NO :2 ; en gras et italique, l'amorce sens SEQ ID NO :1).

La séquence PMP22 est une séquence référence qui ne comporte aucune variation polymorphique. Cette séquence est amplifiée de la même façon que la séquence D9S162 dans deux réactions indépendantes utilisant deux échantillons d'ADN identiques, deux amorces anti-sens (séquence SEQ ID NO :4) marquées respectivement à la Cy5 et à la Cy3, ainsi qu'une amorce sens (séquence SEQ ID NO :3) non marquée, modifiée à son extrémité 5' par l'ajout d'un groupement phosphate.

Les échantillons marqués en Cy5, (fig. 8, Cy5) sont traités par digestions successives avec Endo-1 et l'exonucléase lambda, alors que celui marqué en Cy3, 25 n'est pas traité (fig. 8, Cy3).

L'ADN amplifié provient dans cet exemple d'un échantillon de sang d'un d'individu sain. La diminution du signal, après traitements successifs avec l'enzyme Endo-1 et exonucléase lambda est de 47% pour la séquence D9S162 et de 15% 30 pour PMP22. Ce pourcentage correspond à la proportion d'élimination des hétéroduplexes formés lors de l'étape d'hybridation. On peut en conclure que l'échantillon d'ADN utilisé est hétérozygote pour la variation D9S162.

Un autre exemple de la possibilité d'analyse simultanée de plusieurs marqueurs polymorphiques est donnée dans la figure 9 qui montre la détermination combinée de l'hétérozygotie de 4 séquences microsatellites, D9S162, D9S171, ACTBP2 et D16S476 amplifiées a partir de l'ADN du sang d'un patient, et analysée sur une biopuce portant 4 sondes complémentaires des brins marqués des amplicons (respectivement de séquences SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :15), en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus.

Analyse combinée du déséquilibre allélique de plusieurs marqueurs microsatellites Dans l'exemple suivant, l'invention s'appuie sur un modèle de diagnostic du cancer de la vessie décrit dans A.Schneider, et Al. ; 2000 ; Evaluation of microsatellite analysis in urine sediment for diagnosis of bladder cancer ; Cancer Research 60 : 4617-4622. Dans cet étude, les auteurs proposent une méthode de diagnostic du cancer de la vessie basée sur l'analyse combinée de 17 variants polymorphiques, dont les 4 séquences microsatellites suivantes : D9S162, D9S171, ACTBP2 et D16S476. Les travaux présentés dans cette étude montre qu'il est possible de diagnostiquer la présence d'un cancer de la vessie de façon assez précoce en comparant pour chaque séquence microsatellitaire identifiée les proportions des allèles présents dans l'ADN extrait du sang et l'ADN extrait de l'urine des patients. Dans ces conditions, l'ADN amplifié a partir du sang est utilisé comme référence c'est-à-dire comme source d'acide nucléique ne variant pas dans sa composition en allèles. L'utilisation de ces ADN du sang comme référence permet aux auteurs de mesurer pour chacun des échantillons d'ADN d'urine, et pour chaque microsatellite, un pourcentage de déséquilibre allélique qui correspond à la proportion d'allèles ayant disparu, témoin de la présence d'un processus néoplasique dans l'échantillon analysé.

Dans l'exemple présenté ici, l'analyse de la présence ou de l'absence de déséquilibres alléliques dans un échantillon d'ADN urinaire issu d'un patient présentant un cancer de la vessie est effectuée en utilisant les principes et méthodes de la présente invention.

Pour cela, les 4 microsatellites D9S162, D9S171, ACTBP2 et D16S476 sont amplifiés à partir d'un échantillon d'ADN du sang et d'un échantillon d'ADN urinaire d'un même patient.

Ces ADNs sont amplifiés indépendamment en utilisant deux jeux d'amorces comprenant une amorce sens commune non marquée et modifiée à son extrémité 5' par un groupement phosphate, et deux amorces anti-sens marqués à leur extremite 5' par un groupement Cyanine 3 pour l'amplification de l'ADN issu du sang, et Cyanine 5 pour l'amplification de l'ADN issu de l'urine. Pour chacun des amplicons, après formation de duplexes mésappariés, les amplicons marqués avec la Cyanine 3 et la Cyanine 5 sont séparés en deux tubes de même volume et de même contenu, appelés amplicons (a) et amplicons (b). Deux étapes de digestion, successivement avec l'enzyme Endo-1 et l'exonucléase lambda, sont réalisées avec les amplicons (a) dans les conditions expérimentales indiquées ci-avant. Les amplicons (b) ne sont digérés qu'avec l'exonucléase lambda. L'ensemble des produits de la digestion des amplicons (a) et les amplicons (b) digérés avec l'exonucléase lambda sont alors réunis dans un seul tube, et capturés sur une biopuce portant des sondes oligonucléotidiques complémentaires des extrémités 3' des brins marqués des amplicons. Les séquences des amplicons, des amorces utilisées pour leurs amplifications, ainsi que celles des sondes utilisées pour capturer les amplicons sont indiqués dans la figure 10.

L'analyse de la présence d'un déséquilibre allélique se fait alors en comparant les signaux Cy5 obtenus par rapport aux signaux Cy3, c'est-à-dire en comparant le niveau de digestion obtenu avec l'échantillon urinaire et l'échantillon de sang pour un microsatellite donné. Selon la méthode de calcul des déséquilibres alléliques indiquée ci avant, si une variation polymorphique est hétérozygote, et si l'échantillon d'acide nucléique qui la contient est diploïde, ce qui est le cas des échantillons d'ADN du sang, alors la diminution du signal doit être de 50%. Pour les échantillons urinaires, toute diminution du signal inférieure à 50% pour le même microsatellite indique la présence d'un déséquilibre allélique.

En appliquant cette méthode de calcul aux résultats présentés dans la figure 9, on peut établir le profil suivant concernant l'échantillon analysé. Variation %d'élimination % d'élimination Conclusion ADN du Sang ADN de l'urine D9S162 >50% >50% Pas de déséquilibre D9S171 >50% Significativement Déséquilibre <50% ACTBP2 >50% >50% Pas de déséquilibre Dl 6S476 >50% Significativement Déséquilibre <50% Dans cet exemple on prend en compte à la fois l'hétérozygotie de l'échantillon pour le marqueur microsatellite (comparaison de l'échantillon digéré avec celui non digéré), et la comparaison des signaux entre l'échantillon et la référence (sang et urine). 10 L'invention peut également être mise en oeuvre en ne prenant en compte que les signaux obtenus à partir de l'échantillon et de la référence (sang et urine). Pour cela, l'étape de séparation des échantillons en amplicons (a) et amplicons (b) est omise, et les digestions successives avec l'enzyme Endo-1 et l'exonucléase lambda 15 sont effectuées avec tous les amplicons.

Le calcul du rapport des signaux obtenus entre l'urine (Cy5) et le sang (Cy3) et indiqué ci-après. En effectuant ce calcul, toute variation polymorphique homozygote pour un organisme diploïde, ou toute variation polymorphique 20 hétérozygote conduisant à une diminution identique des signaux dans l'échantillon et la référence doit donner un rapport signal échantillon/signal référence=l. A l'opposé,5 si la quantité d'allèles dans l'échantillon est différente de la quantité d'allèle dans la référence, ce rapport doit être différent de 1. Variation Rapport signal urine/sang Conclusion D9S162 1 Pas de déséquilibre ou marqueur homozygote D9S171 >1 Déséquilibre ACTBP2 1 Pas de déséquilibre ou marqueur homozygote D16S476 >1 Déséquilibre REFERENCES CITEES

La citation des références ne doit pas être interprétée comme une reconnaissance du fait qu'elles appartiennent à l'état de l'art antérieur de la présente 10 invention.

De nombreuses modifications et variations de la présente invention peuvent être réalisées sans pour autant se distinguer de l'esprit et de la portée de l'invention comme pourra le constater l'homme du métier lui- même à la lecture de la description 15 de l'invention.5

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Méthode pour identifier, analyser et/ou quantifier les allèles d'un ou plusieurs polymorphismes dans un échantillon d'acide nucléique d'un sujet, ladite méthode comprenant : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser à partir de l'échantillon à tester, et le marquage des amplicons ainsi produits à une extrémité d'un seul des deux brins aboutissant ainsi à la production - soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 5' et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; - soit d'un amplicon double brin dont un premier brin est marqué à son extrémité 3' et présente une extrémité 5'-OH, et dont le deuxième brin est phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons obtenus à l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des produits de l'étape (3) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes comprenant une sonde pour chaque polymorphisme analysé complémentaire d'une partie du premier brin marqué de l'amplicon correspondant au polymorphisme particulier analysé ; (5) la détermination du signal émis par les brins marqués hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (6) la comparaison du signal déterminé à l'étape (5) au signal d'un échantillon référence, permettant ainsi l'identification, l'analyse et/ou la quantification des allèles d'un ou plusieurs polymorphismes.

2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'amplification de l'étape (1) est réalisée par amplification isothermale ou par PCR.

3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle la PCR est réalisée avec une paire d'amorces dont l'une des deux seulement est marquée en 5', l'autre portant une extrémité phosphorylée en 5'.

4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle l'amorce marquée est marquée par une molécule fluorescente, de préférence par le Cy3 ou le Cy5.

5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les 10 hétéroduplexes formés sont éliminés à l'étape (3) par l'action d'une endonucléase reconnaissant spécifiquement les mésappariements, suivie de l'action d'une exonucléase spécifique de l'ADN phosphorylé en 5'.

6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle l'endonucléase est choisie dans le 15 groupe constitué des endonucléases CEL1, Endo-1, BFN1, résolvases. Nuclease s1 et la nucléase du haricot mungo, et l'exonucléase est l'exonucléase du bactériophage lambda.

7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'étape 20 (3) est réalisée par l'action d'un traitement physique ou chimique, ou combinant un traitement chimique et physique, de préférence par l'adjonction de [Rh(bpy)2(chrysi)]3+, ou d'un traitement combinant l'utilisation de KMnO4, de chlorure de tétraméthylamonium et de pipéridine. 25

8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les hétéroduplexes formés sont éliminés par séparation physique des homoduplexes des hétéroduplexes.

9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que 30 le support solide est une surface solide comme une surface de plastique, une lame de verre, de dioxyde de silicium, un puit de microplaque, ou un support fractionné comme des microbilles, des microbilles magnétiques ou des microbilles5fluorescentes, des supports poreux ou possédant une surface non plane, des supports conducteurs de courant et des supports comme la nitrocellulose ou le nylon, de préférence une surface de plastique, une lame de verre ou de dioxyde de silicium.

10. Méthode d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle l'amplification est réalisée par PCR avec une paire d'amorces dont l'une des deux seulement est marquée en 5', l'autre portant une extrémité phosphorylée en 5', la sonde oligonucléotidique possèdant une identité de séquence complète ou partielle avec la séquence de l'amorce non marquée.

11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, caractérisée en ce que la sonde oligonucléotidique est complémentaire d'une partie du brin marqué située entre l'extrémité non marquée et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2).

12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'une pluralité de sondes est utilisée, chaque sonde étant complémentaire d'un polymorphisme unique présent dans les échantillons à analyser, et lesdites sondes étant immobilisées dans une position connue sur une surface solide.

13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle les polymorphismes testés correspondent à des séquences microsatellites, des mutations, ponctuelles ou non, des variants d'épissage, des délétions, des insertions ou des amplifications. 25

14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour déterminer le caractère homozygote ou hétérozygote d'un polymorphisme compris dans un échantillon d'acides nucléiques d'un sujet, dans laquelle à l'étape (6), le signal est comparé au signal d'un échantillon de référence qui est identique à l'échantillon testé 30 mais uniquement soumis à la l'étape (1) avec un marqueur différent et à la digestion du brin non marqué par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5' phosphate. 20

15. Méthode selon la revendication 14, comprenant : (1) l'amplification double brin d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme à partir de l'échantillon à tester, ladite amplification étant réalisée sous la forme de deux amplifications indépendantes, une première amplification permettant d'obtenir des amplicons (a) et une deuxième amplification permettant d'obtenir des amplicons (b), et le marquage des amplicons (a) et (b) à l'extrémité 5' d'un premier brin étant réalisé avec un marqueur différent pour les amplicons (a) et (b), le deuxième brin étant phosphorylé en 5' ; (2) la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) de l'étape (1) ; (3) l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la digestion des amplicons (b) de l'étape (1) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (5) l'hybridation des produits de l'étape (3) et des produits de l'étape (4) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination du signal émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques ; et (7) la comparaison des signaux issus des deux marqueurs.

16. Méthode pour déterminer l'identité d'un échantillon d'acides nucléiques à un échantillon référence, ladite méthode comprenant : la détermination du caractère homozygote ou hétérozygote pour un ou plusieurs polymorphismes dans l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence selon la méthode de l'une des revendications 14 et 15 ; et la comparaison du caractère homozygote ou hétérozygote pour le ou les polymorphismes testés dans les deux échantillons, l'identité du caractèrehomozygote ou hétérozygote permettant de déduire l'identité entre l'échantillon à identifier et l'échantillon de référence.

17. Méthode selon la revendication 16, comprenant : (1) deux réactions d'amplification indépendantes d'une séquence d'acide nucléique comprenant le polymorphisme pour chaque polymorphisme à analyser et pour l'échantillon à identifier et l'échantillon référence d'un sujet dont l'identité est connue ou non, et le marquage des amplicons issus des deux réactions d'amplification par des marqueurs différents à une extrémité 5' d'un premier brin, le deuxième brin étant phosphorylé en 5', les amplicons marqués avec un premier marqueur étant appelés amplicons (a) et les amplicons marqués avec un deuxième marqueur étant appelés amplicons (b) ; (2) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, la dénaturation et l'hybridation des amplicons (a) ; (3) séparément pour l'échantillon à identifier et pour l'échantillon référence, l'élimination sélective des hétéroduplexes comprenant une région mésappariée formés à l'étape (2) dans les amplicons (a) et la digestion du deuxième brin des homoduplexes des amplicons (a) et (b) par une exonucléase spécifique d'une extrémité 5'-phosphate ; (4) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon référence avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (5) la mise en contact et l'hybridation des amplicons (a) et (b) de l'échantillon à identifier avec des sondes oligonucleotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes étant complémentaires d'une partie du brin marqué située dans une région entre l'extrémité non marquée du brin et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2) ; (6) la détermination des signaux émis par les deux marqueurs attachés aux brins hybridés sur lesdites sondes oligonucléotidiques pour l'échantillon de référence et l'échantillon à identifier ; et(7) la comparaison des signaux, l'identité des signaux émis par les deux marqueurs pour l'échantillon de référence et l'échantillon à identifier indiquant l'identité des deux échantillons.

18. Biopuce comprenant des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, lesdites sondes comprenant une sonde pour chaque polymorphisme analysé complémentaire d'une partie du premier brin marqué de l'amplicon correspondant au polymorphisme particulier analysé à partir d'un échantillon d'acide nucléique d'un sujet traité selon les étapes (1) et (2) de la méthode selon la revendication 1.

19. Biopuce selon la revendication 18, dans laquelle les sondes oligonucléotidiques sont complémentaires d'une partie du brin marqué située entre l'extrémité non marquée et la zone de mésappariement des duplexes de l'étape (2).