JP2007295855A - 核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法と、当該サンプル核酸を用いた核酸修飾を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能な核酸解析方法を提供することである。更なる本発明の目的は、煩雑な作業を必要としないゲノムの特定部位を解析する方法を提供する。
【課題手段】 核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法であって;検出対象となる核酸を用意すること;用意された核酸を第1の核酸群と第2の核酸群の2群に分けること;第1の核酸群の核酸について脱修飾すること;第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライマーセットを用いて、増幅可能な条件下でランダム増幅を行うこと;第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物をゲノム解析のためのサンプル核酸として提供すること。
【選択図】図1
【課題手段】 核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法であって;検出対象となる核酸を用意すること;用意された核酸を第1の核酸群と第2の核酸群の2群に分けること;第1の核酸群の核酸について脱修飾すること;第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライマーセットを用いて、増幅可能な条件下でランダム増幅を行うこと;第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物をゲノム解析のためのサンプル核酸として提供すること。
【選択図】図1
Description
本発明は、ゲノム解析、特に、核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法と、当該サンプル核酸を用いた核酸修飾を検出する方法に関する。
ポストゲノムの時代になり、近年、後天的なDNA修飾による遺伝子発現抑制など、エピジェネティクス的な変異の形質発現への関与を研究する学問であるエピジェネティクスが注目を集めてきた。現在では、エピジェネティクス制御の中心は、DNAメチル化とヒストン修飾とされている。
癌抑制遺伝子がDNAのメチル化により転写抑制を受けることが発見されから、メチル化異常が癌細胞の大きな特徴の1であることも明らかとなってきた。例えば、メチル化は、真核生物の遺伝子のプロモーター領域にあるシトシンの5位がメチル化されることによって、その遺伝子の発現に影響を及ぼす。このような現象は主にCGペア(CG相補対との混同を避けるため以下「CpG」と記す)の配列に生じる。通常の正常な哺乳動物の細胞ではCpG含有量が少ない遺伝子領域のほとんどがメチル化されているが、GpG含量の多いCpGアイランドと呼ばれる配列は、メチル化されていない。
例えば、hMLH1、p16およびp15などの遺伝子は、プロモーター領域がメチル化された遺伝子としてよく解析例が報告されている。従来ではシトシンのメチル化解析は、主にメチル化感受性制限酵素による切断や、ゲノムDNAのシーケンシングで解析されている。しかしながら、この2つの方法には限界がある。制限酵素を使用した方法では、制限酵素の認識配列のメチル化部位のみ検出可能である。また、シーケンシングによる方法では、煩雑であることや、網羅的解析、混合系での検出が難しいなど問題点が存在する。
また、従来、サザンブロット(非特許文献1)、RLGS(Restriction landmark genome scanning)(特許文献1)、および質量分析(非特許文献2)などもメチル化の解析に利用されている。これらの場合、何れの方法も多量のゲノムを必要とし、また、何れも操作が煩雑で多くの工程を必要とする。また、シークエンサー反応には高価な機器が必要である。
バイサルファイトPCR(Bisulfite-PCR、非特許文献3)は、メチル化されたシトシンの存在が必須であり、またバイサルフェイト化後にPCRが必要である。更に、そのPCR産物を解析するために、電気泳動や遺伝子解析などのシークエンス反応などの煩雑な工程を必要とする。従って、この方法でも高価な機器が必要である。
ギタン(Gitan)らは、サンプルをバイサルファイト処理し、それにより得られた標識化PCR産物についてマイクロアレイによりメチル化を検出する方法を示している(非特許文献4)。この方法は、バイサルファイトPCRによって得られた産物の配列に相補的な捕獲プローブを設計し、アレイ化するところに特徴がある。ハタダら(Hatada)らは(非特許文献5)、サンプルを制限酵素で切断し、その後、切断部分にアダプターDNAを結合し、PCRを行って得られた標識化PCR産物についてマイクロアレイによりメチル化を検出する方法を示してる。この方法は、制限酵素切断後にPCRを行うためのアダプター配列を結合することが特徴であり、当該アダプター配列に相補的なプライマーを当該PCRにおいて用いる。上述した他の従来技術と同様に、この方法も煩雑な多くの工程を必要とし、且つシーケンサーを使用するためのPCRを行うことが必要である。また、従来、メチル化アダプター配列を付加せずにランダムプライマーで増幅させてなどもメチル化の解析に利用されている。これらの場合、何れの方法も多量のゲノムを必要とし、また、何れも操作が煩雑で多くの工程を必要とする。
特開2005−000167号公報
Pietrobono, R., et al., Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, No.14, p 3278-3285
Tamura, T., et al., Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25, No.20, p 4162-4164
Olek, A., et al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, No.24, p 5064-5066
Gitan R. S., et al., Methylation-Specific Oligonucleotide Microarray: A New Potential for High-Throughput Methlation Analysis, Genome Research, 2002, 12(1): 158-64
Hatada I., et al., "A mecroarray-based method for detedting methlated loci", J Hum Genet, 2002, 47: 448-451
そのような状況に鑑み、本発明の目的は、従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能な核酸解析方法を提供することである。更なる本発明の目的は、煩雑な作業を必要としないゲノムの特定部位を解析する方法を提供することである。
本発明者は鋭意研究の結果、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
(1) 核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法であって、
検出対象となる核酸を用意すること;
用意された核酸を第1の核酸群と第2の核酸群の2群に分けること;
第1の核酸群の核酸について脱修飾すること;
第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;
前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライマーセットを用いて、ランダム増幅を行うこと;
第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物をゲノム解析のためのサンプル核酸として提供すること:並びに
(2) 核酸修飾を解析する方法であって、請求項1により得られた第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較することにより、当該検出対象に関する核酸修飾の解析を行うこと:
である。
(1) 核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法であって、
検出対象となる核酸を用意すること;
用意された核酸を第1の核酸群と第2の核酸群の2群に分けること;
第1の核酸群の核酸について脱修飾すること;
第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;
前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライマーセットを用いて、ランダム増幅を行うこと;
第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物をゲノム解析のためのサンプル核酸として提供すること:並びに
(2) 核酸修飾を解析する方法であって、請求項1により得られた第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較することにより、当該検出対象に関する核酸修飾の解析を行うこと:
である。
本発明により、従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能な核酸解析方法が提供される。更に、本発明により、煩雑な作業を必要としないゲノムの特定部位を解析する方法、特に、修飾塩基を解析する方法が提供される。
本発明の1態様に従うと、ゲノムの特異的部位の検出方法であり、例えば、癌や加齢などに影響を及ぼす修飾塩基、特に後天的修飾を解析する方法するための方法が提供される。
ここで使用される「ゲノムの特定部位」の語は、ゲノムの特定部位における塩基のメチル化および/またはアセチル化などの修飾などを指示する。
ここで使用される「核酸」とは、ゲノムDNA、天然および/または合成DNA、cDNA、mRNA、全RNA、hnRNA、天然および/または合成RNAなどを含む全てのDNAおよびRNAを指示する。
(1)核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法
本発明の1態様に従うと、核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法が提供される。その態様の1例として核酸のメチル化を検出する方法が提供される。以下に、その1例を図1を用いて説明する。
本発明の1態様に従うと、核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法が提供される。その態様の1例として核酸のメチル化を検出する方法が提供される。以下に、その1例を図1を用いて説明する。
本発明に従う検出対象核酸1を用意する。これを2群に分ける。一方を、脱メチル化核酸2にするために脱メチル化を行う(図1(A))。従って、検出対象核酸1はメチル化されていないヌクレオチド3と4を含み、更に、メチル化されたヌクレオチド5および6を含む。これに対して、脱メチル化核酸2は、そこに非メチル化ヌクレオチド7〜10を含む。
このような2群の核酸に対して、それぞれにバイサルファイト修飾を行う。図1(1B)および図1(1C)のように、バイサルファイト修飾によって、そこに存在するシトシンをウラシルに変換する(図1(1C))。しかしながら、メチル化されたシトシンは変換されずにそのままの状態が維持される。
更に、これらの2群の核酸をそれぞれにランダム増幅を行う。
本発明の態様に従う「ランダム増幅」とは、例えば、「NNNNNNNN」という塩基配列で示され、Nは任意の何れかの塩基であってよく、その塩基長は、例えば約5個から10個、例えば約8〜9個であるランダム且つ包括的に増幅を行うことが可能なプライマーセットを使用し、増幅可能な条件下で行う増幅のことをいう。本発明で好ましく使用されるランダム増幅の例は、φ29DNAポリメラーゼを用いた増幅およびエクソクレノーフラグメントを利用した増幅である。
このようにランダム増幅を行うことにより、従来よりも少量の試料から容易に核酸修飾解析を都合よく行うために使用可能なサンプル核酸が提供される。
更なる本発明の態様に従うと、当該サンプル核酸は、検出を有利に行うために何れかの識別可能な標識物質をコントロール核酸または何れかのサンプル核酸に付与することが可能である。そのような標的物質は、これらに限定するものではないが、例えば、色素、例えば、FITCなど、蛍光色素、例えば、Cy3、Alexa Fluorなど、抗原抗体反応により標識可能な物質、例えばデゴキシゲニンなどを含む。
また、当該修飾に関する解析を行う場合には、コントロールとして当該修飾を含まない核酸を用いる必要がある。本発明の態様に従うと、検出対象となる核酸を2群に分け、一方の群の当該修飾を脱修飾し、コントロールとして使用することが可能である。このような脱修飾に適切な脱修飾剤は、例えば、酵素、例えば、Phi29 DNA polymerase、細胞株を脱メチル化剤 5-aza-2'-deoxycytidineでの処理などであるが、これに限定されるものではない。
或いは、本発明の更なる態様においては、当該コントロールとして、予め目的とする部位、例えば、特定部位に問題となる修飾が存在しないことが明らかとなっている核酸群を使用してもよい。
このようにして製造されたサンプル核酸は、都合よく、核酸修飾解析に用いることが可能である。
また、このような核酸を製造するためのキットも本発明の更なる態様である。例えば、そのようなキッドは、脱修飾するための酵素、バイサルファイト修飾を行うための試薬、例えば、重亜硫酸ナトリウム(即ち、sodium bisulfite)など、必要なpHを維持するための緩衝剤、良好な反応を得るための補酵素など、更に、反応容器などを含めばよい。
また、本発明の態様に従うキッドには、コントロール核酸が含まれてもよい。
このような本発明の態様により、都合よく、核酸修飾を解析するためのサンプル核酸が容易に且つ多量に提供することが可能になる。
(2)核酸修飾を検出する方法
上述のサンプル核酸の製造方法と同時、順次、または別の時期に、核酸修飾を検出方法を行うことが可能である。そのような方法も本発明の範囲内である。
上述のサンプル核酸の製造方法と同時、順次、または別の時期に、核酸修飾を検出方法を行うことが可能である。そのような方法も本発明の範囲内である。
まず、上述の(1)のサンプル核酸の製造方法により製造されたコントロールを準備する。上述したようにコントロール核酸は、検出の対象となる核酸を脱メチル化して得てもよく、予め目的とする部位、例えば、特定部位に問題となる修飾が存在しないことが明らかとなっている核酸群をコントロール核酸としてもよい。
上述の(1)に記載の通り、コントロール核酸とサンプル核酸を準備する。次に、これを、バイサルファイト修飾によって、そこに存在するシトシンをウラシルに変換する(図1(1C))。その結果、メチル化されたシトシンは変換されずにそのままの状態が維持される。
次に、得られたサンプル核酸毎に別々にランダム増幅を行う。例えば、クレノウフラグメントによって核酸を増幅そればよい。被検サンプルの増幅には、基質である核酸のモノマーの何れかに1種類に識別可能な第1の標識物質を付与した基質を存在させ、増幅可能な条件下で核酸の増幅を行う。同様に、コントロールについても、基質である核酸のモノマーの何れかに1種類に識別可能な第2の標識物質を付与した基質を存在させ、増幅可能な条件下で核酸の増幅を行う。ここで、第1の標識物質と第2の標識物質は、互いに識別可能である(図1(C))。図中、例として、第1の標識物質は赤色蛍光を生じる蛍光色素、第2の標識物質は緑色蛍光を生じる蛍光色素を使用した例を記した。
次に等量で、増幅標識化被検サンプルと、増幅標識化被検コントロールとを混合し、固定化されたプライマーに対して競合的にハイブリダイズさせる。その後、ハイブリダイズしてないサンプル核酸を除去した後、当該標識物質を検出する。このとき、標識物質が蛍光物質であれば、検出の結果、当該核酸がメチル化していれば、被検サンプルに付された第1の標識物質由来の蛍光が検出のための信号として検出され、メチル化していなければ、第1の標識物質と第2の標識物質由来の中間の蛍光が検出のための信号として検出される。例えば、メチル化していれば赤色の蛍光が観察され、メチル化していなければ中間の黄色蛍光が検出される。
本発明により使用される制限酵素は、それ自体公知の何れの制限酵素でよく、検出しようとするゲノムなどの核酸の配列を考慮して、また、検出しようとする修飾に対する感受性のある酵素を任意に選択してよい。本態様におけるメチル化の検出においては、メチル化感受性のある酵素が好ましい。例えば、アセチル化を検出する場合には、アセチル化感受性のある酵素が好ましい。
本発明に従う方法により使用される核酸は、ゲノムDNA、天然および/または合成DNA、cDNA、mRNA、全RNA、hnRNA、天然および/または合成RNAなどを含む全てのDNAおよびRNAなど何れか核酸でもよいが、ゲノムDNAを用いて、当該DNAについてのメチル化修飾を検出することが好ましい。
本発明に従う方法において使用される増幅用の酵素は、核酸合成酵素であればよく、それ自身公知の何れの酵素であるDNAポリメラーゼ、特に、エクソクレノウフラグメントなどが好ましく使用される。
また、本発明に従う方法では、何れの操作の段階においても商業的に入手可能な何れのキットなどを使用することも可能である。
本発明に従う標識物質は、それ自身公知の何れの識別可能な標識物質を使用してもよいが、好ましくは蛍光物質を使用してよい。好ましい蛍光物質の例は、Cy-dye、Alexa Fluor
およびFITCなどであり、第1の標識物質と第2の標識物質の選択は、互いに識別可能であればどのような組み合わせであってもよい。第1の標識物質および第2の標識物質の何れの物質を、コントロール核酸と被検核酸(ここでは「サンプル核酸」とも記す)の何れに対して使用してもよい。また、コントロール核酸と被検核酸の何れか1方のみに標識を付してもよい。
およびFITCなどであり、第1の標識物質と第2の標識物質の選択は、互いに識別可能であればどのような組み合わせであってもよい。第1の標識物質および第2の標識物質の何れの物質を、コントロール核酸と被検核酸(ここでは「サンプル核酸」とも記す)の何れに対して使用してもよい。また、コントロール核酸と被検核酸の何れか1方のみに標識を付してもよい。
本発明に従う方法におけるコントロールのための脱メチル化の手段は、それ自身公知の何れの脱メチル化手段を使用してよい。例えば、酵素、脱メチル化剤、例えば、5-aza-2'-deoxycytidineなどを使用してよいが、好ましくは、酵素が使用される。好ましい酵素の例は、Phi酵素、例えば、Phi29 (φ29) DNAポリメラーゼなどである。メチル化以外の修飾を検出する場合には、目的とする修飾に適切な手段により脱修飾を行えばよく、そのような手段は公知の手段を利用可能である。
本発明に従う方法における「増幅可能な条件下」とは、増幅しようとする核酸が増幅することが可能な条件であればよく、使用する酵素に応じた至適温度、基質、プライマーおよび緩衝剤などの存在するそれ自身当業者に公知の環境であればよい。
本発明に従う方法において、基質となるモノマーは、当該核酸がDNAである場合、それ自身公知の通常のdNTP混合物を使用すればよく、そのうちの1種類に対して標識物質を付与すればよい。第1の標識物質と第2の標識物質で標識されるモノマーは同じ種類のモノマーであっても、異なる種類のモノマーであってもよいが、同じ種類のモノマーであることが望ましい。
本発明に従う方法における増幅のために使用されるプライマーは、任意に選択した、または任意に無作為に選択した配列を有する任意の長さを有するプライマーでよい。好ましいプライマーは、互いに異なる任意の配列を有する5塩基から15塩基、好ましくは5塩基から10塩基、より好ましくは5塩基から8塩基であればよい。また、使用するプライマーの種類は少なくとも1種類であればよく、好ましくは1種類であってもよい。
検出には、オリゴヌクレオチドプローブを固定化したそれ自身公知の何れかの核酸マイクロアレイ(以下、「核酸アレイ」とも記す)を使用してもよい。以下の実施例では、簡易な手法によって作製したDNAマイクロアレイ(以下、「DNAアレイ」とも記す)を使用する例を示すが、それに限定するものではない。
また、必ずしもDNAアレイなどの核酸アレイを使用しなくてもよい。例えば、それ自身公知の何れかの電気泳動に供してもよく、またはそれ自身公知のその他のプローブを介した反応を利用して検出してもよい。
本発明に従う方法によると、サザンブロットなどの従来の方法では多量に必要とされた試料を少量に抑えて解析を実行することが可能である。
本発明に従う方法によると、被検核酸を制限酵素切断した後に迅速で簡便なサンプル調製で従来よりも簡便にメチル化を検出することが可能である。
本発明に従う方法は、アダプターの付加を必要としないので切断部の状態を増幅する簡便な手法である。また、エクソクレノウフラグメント(exo-Klenow fragment)を用いるので、複雑な温度管理の必要がなく一定温度で増幅することが可能であり、操作が簡便である。それに比べて、従来のPCRを利用する方法では、特異的な配列、即ち、アダプターの付加が必要であり、温度を上下に変化する工程が必要であり、且つサーマルサイクラーが必要である。従って、煩雑な操作が必要であり、且つ高価な装置が必要である。
本発明の方法に従うと種々の長さの標識化断片が被検サンプルより得ることが可能である。
本発明に従う方法によると、メチル化検出などの修飾検出の感度が向上される。従って、腫瘍抑制因子遺伝子の機能解析や、関与するゲノムにおける特定部位核酸のメチル化を簡便に早く検出することが可能になる。それにより、早期腫瘍発見に寄与することが可能である。
また、増幅断片の長さが多様であるので、高次構造によるプライマーへの結合障害のない短いものだけを選択して使用することも可能である。また、選択しなくとも、プライマーに結合する増幅断片が検出可能に反応することが可能である。
例えば、任意に短い増幅断片を回収する、或いは場合によって長い増幅断片を回収するためには、それ自身公知の遠心手段、遠心濾過、クロマトグラフィーおよびゲル濾過などの手段を使用することが可能である。例えば、Millipore(登録商標)の遠心用フィルターユニットなどのPCR精製カラムやQIAgenから入手可能なDNAクリーンアップ手段やなど、商業的に入手可能な何れの手段を使用してもよい。
以上、核酸の修飾を検出する態様の1例を、メチル化を例に説明した。同様に、アセチル化などの他の修飾についても、上述の本発明の方法に従って検出を達成することが可能である。
本発明の更なる態様に従うと、上述の(1)に記載の方法を用いて癌化や老化に深く関与するメチル化を検出することが可能である。
[例]
1.核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造
(1)サンプルの調製
本例においては、種々の癌に関与しているとされている後天的修飾のうち、メチル化についての情報を得るために都合よく使用されるゲノム解析のためのサンプル核酸を製造した。
1.核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造
(1)サンプルの調製
本例においては、種々の癌に関与しているとされている後天的修飾のうち、メチル化についての情報を得るために都合よく使用されるゲノム解析のためのサンプル核酸を製造した。
まず、種々の癌細胞由来のゲノム、即ち、MCF7(American Type Culture Collection社(以下、「ATCC社」と記す)から入手、以後「ゲノムサンプル1」と記す)、Hela(ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル2」と記す)およびA431(ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル3」と記す)のゲノムを被検サンプルを用意した。
具体的には、ゲノム解析のためのサンプル核酸を製造するために、それ自身公知の界面活性剤を使用してゲノムを得た。
これら各々を2群に分け、そのうちの1群はコントロールサンプルとして使用するための脱メチル化サンプルとした。得られたサンプルは、それぞれ、脱メチルゲノムサンプル1、脱メチル化ゲノムサンプル2、脱メチル化ゲノムサンプル3とした。
(2)ゲノム解析のためのサンプル核酸の製造
[例1]
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
[例1]
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該6種類の被検サンプル、即ち、ゲノムサンプル1、2および3、並びに脱メチル化サンプル1、2および3を、それぞれ別の0.2MのNaOHの49μLの入った試験チューブに1μgずつ入れ、100mMのヒドロキノンの30μLを添加し、これらに濃度3.6Mのsodium bisulfiteの520μL(シグマ-アルドリッチ社から入手)を添加し、65℃で1時間処理してゲノムを化学修飾した。その後、修飾された核酸を精製した。当該過程は、キットを用いた(Bisulfast:東洋紡社製)。当該キットは、シトシンが非メチル化の場合には、当該制限部位はウラシルに変換され、当該制限部位がメチル化されている場合には、変換されなかった。
次に、6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該6種類の被検サンプル、即ち、ゲノムサンプル1、2および3、並びに脱メチル化サンプル1、2および3を、それぞれ別の試験チューブに各々のサンプル核酸毎に試験チューブに20u/μLを1μLずつ添加し、核酸のモノマーであるdNTP混合物を添加し、37℃で2時間インキュベーションした。エクソクレノウフラグメント(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)を20u/μLずづ添加し、核酸のモノマーであるdNTP混合物を添加して37℃で2時間インキュベートした。エクソクレノウフラグメントは、4種類の塩基から作成可能な全ての9塩基長のプライマーセット、即ち、49種類のプライマーセットを予め用意し、それらのプライマーを一緒に使用した。蛍光標識は1種類のモノマーに付与した。ここで、アミノアリル化ウラシル(dUTP)を取り込ませ、そのアミノアリル基を介して蛍光標識した。
以上のような方法によって製造されたゲノム解析のためのサンプル核酸は、更に、コントロール用および/または被検用のサンプル核酸に検出可能な標識を与えることによって、それぞれを認識可能に標識されたコントロール用および/または被検用の断片を得ることが可能である。認識可能に標識されることにより、目的とするゲノムのメチル化の検出に好ましく使用することが可能であった。
[例2]
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該6種類の被検サンプル、即ち、ゲノムサンプル1、2および3、並びに脱メチル化サンプル1、2および3を、それぞれ別の0.2MのNaOHの49μLを含む試験チューブに1μgずつ入れ、これらに100mMのヒドロキノンの30μLを添加し、これらに濃度の3.6MのSodium bisulfiteの520μL(シグマ-アルドリッチ社から入手)を添加し、65℃で1時間処理してゲノムを化学修飾した。その後、修飾された核酸を精製した。当該過程は、キットを用いた(Bisulfast:東洋紡社性)。当該キットは、シトシンが非メチル化の場合には、当該制限部位はウラシルに変換され、当該制限部位がメチル化されている場合には、変換されなかった。
次に、6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該脱メチル化は、3種類のゲノムサンプル1〜3をそれぞれにφ29酵素(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)でメチル基を外した。具体的には、各ゲノムサンプルの0.1mgを20u/1μLの濃度のφ29DNAポリメラーゼ(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)を1μLと30℃で16時間処理することによりメチル基を外した。
他方、脱メチルを行わない解析用のサンプルは、それぞれゲノムサンプル1、ゲノムサンプル2およびゲノムサンプル3とした。
ここで、φ29DNAポリメラーゼでの増幅時に、核酸のモノマーであるdNTP混合物を混合するが、そのうちのdTTPは蛍光標識物質を与えたものも総dTTPの半分量だけ存在し、蛍光標識を行った。
ル基を介して蛍光標識した。
以上のような方法によって製造されたゲノム解析のためのサンプル核酸は、更に、コントロール用および/または被検用のサンプル核酸に検出可能な標識を与えることによって、それぞれを認識可能に標識されたコントロール用および/または被検用の断片を得ることが可能である。認識可能に標識されることにより、目的とするゲノムのメチル化の検出に好ましく使用することが可能であった。
[例3]
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
上記(1)で用意された6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該6種類の被検サンプル、即ち、ゲノムサンプル1、2および3、並びに脱メチル化サンプル1、2および3を、それぞれ別の0.2MのNaOHを49μL含む試験チューブに1μgずつ入れ、これらに100mMのヒドロキノンの30μLを添加し、これらに濃度の3.6MのSodium bisulfiteの520μL(シグマ-アルドリッチ社から入手)を添加し、65℃で1時間処理してゲノムを化学修飾した。その後、修飾された核酸を精製した。当該過程は、キットを用いた(Bisulfast:東洋紡社性)。当該キットは、シトシンが非メチル化の場合には、当該制限部位はウラシルに変換され、当該制限部位がメチル化されている場合には、変換されなかった。
次に、6種類のサンプルをゲノム解析のためのサンプル核酸にするために、以下のような処置をした。
当該脱メチル化は、3種類のゲノムサンプル1〜3をそれぞれにφ29酵素(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)でメチル基を外した。具体的には、各ゲノムサンプルの0.1mgを20u/1μLの濃度のφ29DNAポリメラーゼ(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)を1μLと30℃で16時間処理することによりメチル基を外した。
他方、脱メチルを行わない解析用のサンプルは、それぞれゲノムサンプル1、ゲノムサンプル2およびゲノムサンプル3とした。
上述のように処理した当該6種類のサンプル毎に、各チューブに分注した。それぞれに、エクソクレノウフラグメント(アマシャム・バイオサイエンス社から入手)を20u/μLを1μLずつ添加し、核酸のモノマーであるdNTP混合物を添加して37℃で2時間インキュベーションした。エクソクレノウフラグメントは4種類の塩基から作成可能な全ての9塩基長のプライマーセット、即ち、49週類のプライマーセットを予め用意し、それらのプライマーを一緒に使用した。蛍光標識は1種類のモノマーに付与した。ここでは、アミノアリル化(dUTP)を取り込ませ、そのアミノアリル基を介して蛍光標識した。
ル基を介して蛍光標識した。
以上のような方法によって製造されたゲノム解析のためのサンプル核酸は、更に、コントロール用および/または被検用のサンプル核酸に検出可能な標識を与えることによって、それぞれを認識可能に標識されたコントロール用および/または被検用の断片を得ることが可能である。認識可能に標識されることにより、目的とするゲノムのメチル化の検出に好ましく使用することが可能であった。
2.後天的修飾を検出する方法
(1)サンプル核酸の調製
使用するサンプル核酸は、上記[例3]の方法に得た。得たゲノム解析のためのサンプル核酸の蛍光標識は、実際は、インビトロジェン社のBio Prime(登録商標)プライスアレイCGH(domparative Genomic Hydridization)ジェノミックラベリングシステム(インビトロジェン社から入手)を使用し、提供元の使用説明書に従って、ワンステップで各サンプルの蛍光標識を行った。
(1)サンプル核酸の調製
使用するサンプル核酸は、上記[例3]の方法に得た。得たゲノム解析のためのサンプル核酸の蛍光標識は、実際は、インビトロジェン社のBio Prime(登録商標)プライスアレイCGH(domparative Genomic Hydridization)ジェノミックラベリングシステム(インビトロジェン社から入手)を使用し、提供元の使用説明書に従って、ワンステップで各サンプルの蛍光標識を行った。
使用した標識物質は、コントロールである脱メチル化サンプル1、2および3には、緑色の蛍光を生ずるAlexaFlour555(インビトロジェン社製)を用い、被検サンプルであるゲノムサンプル1、2および3には、赤色の蛍光を生ずるAlexafLour645(インビトロジェン社製)を用いた。
(2)DNAアレイの作成
住友ベークライト社より入手可能な「誰でもDNAアレイ」を使用して提供元の使用説明書に従って所望のDNAアレイを作成した。具体的には、当該キットに具備されるプラスチック基板に、表1および表2に示した20種類のオリゴヌクレオチドプローブを1μLずつピペットマンで滴下した。
住友ベークライト社より入手可能な「誰でもDNAアレイ」を使用して提供元の使用説明書に従って所望のDNAアレイを作成した。具体的には、当該キットに具備されるプラスチック基板に、表1および表2に示した20種類のオリゴヌクレオチドプローブを1μLずつピペットマンで滴下した。
これを80℃で1時間維持し、UVランプ下で1分間UV照射して、当該オリゴヌクレオチドプローブをプラスチック基板に固定化した。これをDNAマイクロアレイとした。各スポットに固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの位置は、図3に示したとおりである。各升目に記載の番号は、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの配列を記す表1および表2の番号に対応する。このようなDNAアレイを3枚用意し、DNAアレイ1、DNAアレイ2およびDNAアレイ3とした。
(3)検出
上記(2)で作製されたDNAアレイを用いて検体のメチル化を検出した。(1)サンプル核酸の調製で調製した被検サンプルについて、同じ遺伝子毎に、例えば、ゲノムサンプル1と脱メチル化サンプル1を同量ずつ混合し、そこに6xSSPE、0.05%のTween20をハイブリダイゼーション緩衝液として70μL添加した。得られた混合物をサンプル1に由来する混合物を以下「混合物1」とサンプル2に由来する混合物を「混合物2」と、サンプル3に由来する混合物を以下「混合物3」と記す。
上記(2)で作製されたDNAアレイを用いて検体のメチル化を検出した。(1)サンプル核酸の調製で調製した被検サンプルについて、同じ遺伝子毎に、例えば、ゲノムサンプル1と脱メチル化サンプル1を同量ずつ混合し、そこに6xSSPE、0.05%のTween20をハイブリダイゼーション緩衝液として70μL添加した。得られた混合物をサンプル1に由来する混合物を以下「混合物1」とサンプル2に由来する混合物を「混合物2」と、サンプル3に由来する混合物を以下「混合物3」と記す。
次に、混合物1をDNAアレイ1に、混合物2をDNAアレイ2に、混合物3をDNAアレイ3に各スポット毎に70μLずつオリゴヌクレオチドプローブ固定化部位に滴下し、ハイブリダイゼーションチャンバーで温度を十分に保ったまま50℃で12時間ハイブリダイゼーションを行った。
その後、以下の4週類の洗浄液、第1の洗浄液:6xSSPE、0.05%のTween20、第2の洗浄液:3xSSPE、0.05%のTween20、第3の洗浄液:0.05SSPE、0.05のTween20、第4の洗浄液:2xPBS、それぞれに浸すことによって、各洗浄液について1回ずつ洗浄を行った。
洗浄後、蛍光スキャナーであるGenePix(登録商標)(AXON社製)を用いて検出を行った。その結果を図2および図3に示す。図2は、赤色で標識された標的サンプルである完全メチル化サンプル(CHEMICON社製、Cat.No.S7821、CpGENOME(登録商標)Universal Methylated DNA)と、緑色で標識されたコントロールサンプルであるφ29でメチル基を外したサンプルとでアッセイを行った結果を示す。中間色は黄色であり、ハイブリダイズした添加サンプルの量に応じて色調に強弱が生じる。図3は、図2の結果を導くために使用したDNAアレイにおける固定化されたプローブを示す模式図である。
1 標的サンプル
2 コントロールサンプル
3 非メチル化核酸
4 非メチル化核酸
5 メチル化核酸
6 メチル化核酸
7 非メチル化核酸
8 非メチル化核酸
9 非メチル化核酸
10 非メチル化核酸
2 コントロールサンプル
3 非メチル化核酸
4 非メチル化核酸
5 メチル化核酸
6 メチル化核酸
7 非メチル化核酸
8 非メチル化核酸
9 非メチル化核酸
10 非メチル化核酸
Claims (10)
- 核酸修飾解析のためのサンプル核酸を製造する方法であって、
検出対象となる核酸を用意すること;
用意された核酸を第1の核酸群と第2の核酸群の2群に分けること;
第1の核酸群の核酸について脱修飾すること;
第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;
前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライマーセットを用いて、増幅可能な条件下でランダム増幅を行うこと;
第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物をゲノム解析のためのサンプル核酸として提供すること。 - 核酸修飾を解析する方法であって、請求項1により得られた第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較することにより、当該検出対象に関する核酸修飾の解析を行うこと。
- 核酸修飾を解析する方法であって、
検出対象となる核酸の特定部分に修飾が存在しないことが予め明らかな第1の核酸群と、第2の核酸群としての検出対象となる核酸を用意すること;
第1の核酸群と第2の核酸群について、それぞれバイサルファイト修飾を行うこと;
前記バイサルファイト修飾により得られたそれぞれの群の核酸について、ランダムプライーセットを用いて、増幅可能な条件下でランダム増幅を行うこと;
第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較することにより、当該検出対象に関する核酸修飾の解析を行うこと。 - 前記ランダム増幅が、φ29DNAポリメラーゼによる増幅とエクソクレノーフラグメントを用いる増幅の何れかである請求項2または3の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較が、第1の核酸群および/または第2の核酸群の増幅時に、蛍光物質を付与し、得られる蛍光強度を比較することにより行われる請求項2または3の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1の核酸群からの増幅産物と第2の核酸群からの増幅産物とを比較が、第1の核酸群の増幅時に、第1の蛍光物質を付与し、および第2の核酸群の増幅時に、第2の蛍光物質を付与して、それらより得られる蛍光強度を比較することにより行われる請求項5に記載の方法。
- 前記核酸修飾が特定部位のメチル化である請求項2または3に記載の方法。
- 前記プライマーセットが48の種類のプライマーセットである請求項2から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光強度による比較することが、第1の核酸群を検出するためのプローブと第1の核酸群とのハイブリダイゼーションすること、第2の核酸群を検出するためのプローブと第2の核酸群とのハイブリダイゼーションすることにより行われること具備する請求項2から8の何れか1項に記載の方法。
- 前記プローブが核酸アレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブである請求項9に記載の方法。
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JP2006127074A JP2007295855A (ja) | 2006-04-28 | 2006-04-28 | 核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法と、当該サンプル核酸を用いた核酸修飾を検出する方法 |
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Cited By (1)
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WO2014136870A1 (ja) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | 国立大学法人熊本大学 | Rna修飾の簡易検出法、及び該検出法を用いた2型糖尿病の検査方法 |
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2006
- 2006-04-28 JP JP2006127074A patent/JP2007295855A/ja active Pending
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WO2014136870A1 (ja) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | 国立大学法人熊本大学 | Rna修飾の簡易検出法、及び該検出法を用いた2型糖尿病の検査方法 |
JPWO2014136870A1 (ja) * | 2013-03-08 | 2017-02-16 | 国立大学法人 熊本大学 | Rna修飾の簡易検出法、及び該検出法を用いた2型糖尿病の検査方法 |
US10526654B2 (en) | 2013-03-08 | 2020-01-07 | National University Corporation Kumamoto University | Simple detection method for RNA modification, and method for detecting type-II diabetes using said detection method |
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