JP2004267201A - Rna配列の増幅のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の、目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を生成する方法は、以下の工程:(a)標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを、RNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程;(b)工程(b)の複合体中のRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程;(c)第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程;(d)第1および第2のプライマー伸長産物の複合体における複合プライマーから、RNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程;(e)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程、を包含する。
【選択図】 なし
Description
本出願は、2001年3月9日に出願された米国仮特許出願番号60/274,550号の優先権を主張し、これは、その全体が参考として援用される。
本発明は、ポリヌクレオチド増幅の分野に関する。より詳細には、本発明は、RNA/DNA複合プライマー、そして必要に応じて、転写を用いる、目的のRNA配列を増幅する(すなわち、複数コピーを作製する)ための方法、組成物およびキットを提供する。
リボ核酸(RNA)を増幅するための能力は、生物学的プロセスを解明するための試みの重要な局面である。現在まで、RNA(一般的には、mRNA)増幅は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)方法およびその変異を使用して、最も一般的に行われる。これらの方法は、RNAに相補的な一本鎖DNA(cDNA)を形成するための逆転写酵素によるRNAの複製に基づき、これは、続いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により、二本鎖DNAの複製コピーを産生する。これらの方法は最も一般的に使用されるが、これらは、以下のいくつかの有意な欠点を有する:a)反応が熱サイクルを必要とする;b)産物が二本鎖であり、従って、これらの産物をプローブに対する結合にアクセス可能にしない;c)反応物が増幅前の産物で汚染される傾向があり、従って、反応混合物の厳密な封じ込めが必要である;そして、d)これらの方法の指数関数的な増幅性質が、産物のプールを産生する傾向を与え、これは、異なる配列の増幅の不等な有効性(unequal efficiency)、およびインプット標的RNAの連続した複製ではなく増幅産物の複製に基づく指数関数的な増幅性質に起因して、インプット全RNAサンプル中の種々のRNA配列の提示を正確にもたらさない。
(a)標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを、RNA依存性DNAポリメラーゼで伸長し、それにより、第1のプライマー伸長産物と標的RNAとを含む複合体が生成される、工程であって、第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、工程;
(b)工程(b)の複合体中のRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程;
(c)第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長し、それにより、第2のプライマー伸長産物が生成されて、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体を形成する工程;
(d)第1および第2のプライマー伸長産物の複合体における複合プライマーから、RNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程であって、その結果、複合プライマーが第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、複合プライマーがRNA部分と3’DNA部分とを包含する、工程;
(e)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程、
を包含し、これにより、第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれにより目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が生成される。
(a)RNA依存性DNAポリメラーゼで標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを伸長し、それにより、第1のプライマー伸長産物と標的RNAとを包含する複合体が生成される、工程であって、第1のプライマーが、RNA部分と3’DNA部分とを包含する複合プライマーである、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;
(c)第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程であって、それにより、第2のプライマー伸長産物が生成されて、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体が形成される、工程;
(d)第1および第2のプライマー伸長産物の複合体中の複合プライマーからRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程であって、その結果、複合プライマーが第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、ここで、この複合プライマーが、RNA部分と3’DNA部分とを含む、工程;
(e)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程であって、それにより、第1のプライマー伸長産物が置換される、工程;
(f)置換された第1のプライマー伸長産物を、プロポロモーターと、置換された第1のプライマー伸長産物にRNAポリメラーゼによる転写が生じる条件下でハイブリダイズし得る領域と、を含むポリヌクレオチドに、置換された第1のプライマー伸長産物に相補的な配列を含むRNA転写物が生成されるようにハイブリダイズさせる工程、
を包含し、それにより、多数のコピーの目的のRNA配列が生成される。
(a)上記工程(c)の第1および第2のプライマー伸長産物の複合体;
(b)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし得る複合プライマーであって、ここで、複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、プライマー;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼ;ならびに
(d)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素;
を含み、ここで、インキュベーションは、そのRNAが切断され、かつ複合プライマーが複合体中の第2のプライマー伸長産物に結合し、そして伸長される場合に、上記工程(c)の複合体へのプライマーハイブリダイゼーション、上記工程(c)の複合体のRNA切断、および上記工程(c)の複合体からの第1のプライマー伸長産物の置換を可能にする条件下であり、それによって、目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される。
(a)第1の複合体であって、ここで、第1の複合体は、上記工程(c)の第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体である、第1の複合体;
(b)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である複合プライマーであって、ここで、この複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、複合プライマー;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼ;
(d)RNAポリメラーゼ;
(e)プロプロモーターおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド;ならびに
(f)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素;
を含み、ここで、このインキュベーションが、そのRNAが切断され、かつ複合プライマーが第1の複合体中の第2のプライマー伸長産物に結合した場合、第1の複合体へのプライマーハイブリダイゼーション、第1の複合体のRNA切断、第1の複合体からの第1のプライマー伸長産物の置換、置換されたプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む第2の複合体を形成する、置換された第1のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ならびに第2の複合体からのRNA転写を可能にする条件下であり、それによって、多数のコピーの目的のRNA配列が作製される。
(a)反応混合物をインキュベートする工程であって、この反応混合物が、以下:
(i)標的RNA;
(ii)標的RNAにハイブリダイズ可能である第1のプライマーであって、ここで、この第1のプライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、第1のプライマー;
(iii)RNA依存性DNAポリメラーゼ;ならびに
(iv)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素
を含み;ここで、このインキュベーションが、プライマーハイブリダイゼーション、第1のプライマー伸長産物および標的RNAを含む複合体の形成、ならびに第1のプライマー伸長産物および標的RNAを含む複合体中のRNAの切断を可能にする条件下である、工程;
(b)反応混合物をインキュベートする工程であって、この反応混合物は、以下:
(i)第1のプライマー伸長産物;
(ii)DNA依存性DNAポリメラーゼ;および
(iii)必要に応じて、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素
を含み;ここで、このインキュベーションが、第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む複合体の形成、ならびに必要に応じて、第1のプライマー伸長産物および標的RNAを含む複合体中のRNAの切断を可能にする条件下である、工程;
(c)反応混合物をインキュベートする工程であって、この反応混合物は、以下:
(i)第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む複合体;
(ii)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素;
(iii)複合プライマーであって、この複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、複合プライマー;
(iv)第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む切断された複合体;ならびに
(v)DNA依存性DNAポリメラーゼ
を含み、ここで、このインキュベーションは、第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む複合体中のRNAの切断、複合プライマーハイブリダイゼーション、ならびに第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む複合体からの第1のプライマー伸長産物の置換を可能にする条件下であり;それによって、目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される、工程、
を包含する。
(a)複合プライマーが第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズするように、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体からRNAを切断する工程であって、ここで、複合プライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含み、ここで、第1のプライマー伸長産物が、RNA依存性DNAポリメラーゼを用いた、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーの伸長によって産生され、ここで、第1のプライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、工程;
(b)第2のプライマー伸長産物に複合プライマーをハイブリダイズさせ、そしてDNA依存性DNAポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長させる工程であって、それによって第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれによって、目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される、工程
を包含する。
(i)第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体であって、この第1のプライマー伸長産物は、RNA依存性DNAポリメラーゼを用いた、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーの伸長によって産生され、ここで、第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーであり、この第2のプライマー伸長産物は、第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーの伸長によって作製され、ここで、第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体由来のRNAは、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて切断される、複合体;ならびに
(ii)複合プライマーであって、この複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含み、ここで、この複合プライマーは、第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、ここで、この複合プライマーは、第1のプライマーと同じであっても異なっていてもよい、複合プライマー;
を含み、
それによって、第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれによって、目的のRNA配列に相補的な複数コピーのポリヌクレオチド配列が作製される。
(a)プライマー伸長がdNTPアナログの取り込みの際に終了するように、dNTPおよびdNTPアナログの混合物の存在下で、上記方法のいずれかによって、目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)配列を決定するために、増幅産物を分析する工程、
を包含する。
(a)転写がrNTPアナログの取り込みの際に終了するように、rNTPおよびrNTPアナログの混合物の存在下で、上記方法のいずれかによって、目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)配列を決定するために、増幅産物を分析する工程、
を包含する。
(a)上記方法のいずれかによって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)一本鎖コンホメーションについて増幅産物を分析する工程であって、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合のコンホメーションにおける差異が、標的ポリヌクレオチドにおける変異を示す、工程、
を包含する。
(i)目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程であって、この増幅する工程が、上記工程(d)の複合体にハイブリダイズした複合プライマーを伸長する工程を包含し、この複合プライマーのRNA部分の配列が既知である、工程;および
(ii)存在する場合、工程(i)由来の増幅産物を、参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較する工程、
を包含し、
ここで、(1)複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な領域を含む参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較した場合に、テンプレート由来の検出可能に少ない増幅産物の生成は、第2のプライマー伸長産物が、複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な配列を含まず、そして複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な配列に関して配列改変体であることを示す;または
(2)複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な領域を含まない参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較した場合に、テンプレート由来の検出可能に多い増幅産物の生成は、第2のプライマー伸長産物が、複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な配列を含み、そして複合プライマーのRNA部分にハイブリダイズ可能な配列に関して配列改変体でないことを示す。
(a)上記方法のいずれかによって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)基材上に増幅産物を固定する工程、
を包含する。
(a)上記方法のいずれかによって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)DNA産物を分析する工程、
を包含する。
(a)上記方法のいずれかによって、標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)RNA産物を分析する方法。
(a)上記方法のいずれかを使用して、サンプル中の目的の少なくとも1つのRNA配列を増幅する工程;ならびに
(b)目的の各RNA配列の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで、各量がサンプル中の目的の各RNA配列の量を示し、これにより、サンプル中での遺伝子発現プロフィールが決定される、工程、
を包含する。
上記方法のいずれかを使用して、少なくとも1つの目的のRNA配列を増幅する工程、
を包含する。
(a)上記方法のいずれかを使用して、第1のRNA集団から少なくとも1つの目的のRNA配列の相補体の多数のDNAコピーを作製する工程;ならびに
(b)多数のコピーを第2のmRNA集団にハイブリダイズさせる工程であって、これにより、第2のmRNA集団の部分集団が、DNAコピーと複合体を形成する、工程、
を包含する。
(c)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;および
(d)上記第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅する工程であって、これにより、第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団に相補的な多数のコピーの一本鎖DNAが作製される、工程、
をさらに包含する。
(a)上記方法のいずれかを使用して、第1のRNA集団から1つ以上の目的のRNA配列の相補体の多数のポリヌクレオチドコピーを第2のmRNA集団にハイブリダイズする工程であって、これにより、第2のmRNA集団の部分集団が、ポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズして、複合体を形成する、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;ならびに
(c)第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅する工程であって、これにより、第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団に相補的な多数のコピーの一本鎖DNAが作製される、工程、
を包含する。
上記減算的ハイブリダイゼーションプローブを調製する工程、
を包含する。
(a)RNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを伸長させる工程であって、この第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーであり、これにより、第1のプライマー伸長産物および標的RNAを含む複合体が生成される、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させる工程であって、これにより、第2のプライマー伸長産物が形成され、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体を形成する、工程;
(d)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体中の複合プライマーからRNAを切断する工程を包含し;
これにより、3’一本鎖部分を含む第1および第2のプライマー伸長産物の複合体が生成され;
これにより、3’一本鎖部分が、複合プライマーのRNA部分に相補的である。
特許出願および刊行物を含む、本明細書中に列挙される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
本発明は、RNA増幅のための方法、組成物およびキット、ならびにこの増幅方法の適用を提供する。
本明細書中に記載される目的のRNA配列に相補的なポリヌクレオチド配列の複数コピーを産生する任意の方法からの、置換された第1のプライマー伸長産物を、ポリヌクレオチドと、置換された第1のプライマー伸長産物に相補的な配列を含むRNA転写物が産生されるように、転写がRNAポリメラーゼによって生じることが可能な条件下で、ハイブリダイズする工程であり、このポリヌクレオチドは、プロプロモーター(propromoter)および置換された第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な領域を含み、それによって、目的のRNA配列の複数コピーが産生される、工程。
(発明の概要およびその利点)
本発明は、RNA配列の増幅のための新規な方法、組成物およびキットを開示する。本発明は、単一のRNA種の等温増幅またはRNA種のプールを提供する。いくつかの方法は、目的のRNA配列に相補的な配列を含むDNAの複数のコピーの産生を提供する。他の方法は、目的のRNA配列の複数のコピーの産生を提供する。これらの方法は、例えば、cDNAライブラリーおよび差し引きハイブリダイゼーションプローブの産生に適切である。これらは、一本鎖DNA産物または一本鎖RNA産物を産生する。これらは、マイクロアレイ技術およびデイファレンシャルディスプレイのような電気泳動をベースとした技術による複合分析による発現プロファイリングを含む種々の使用に容易に適切である。この方法は、自動化し易く、そして熱サイクルを必要としない。
本発明の実行は、他に示さない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当業者の範囲内である。このような技術は、文献(例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第二版(Sambrookら、1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編、1984);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編、1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら、編、1987および定期的な更新);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」、(Mullisら、編、1994))中に完全に説明される。
本明細書中で使用される場合、「標的配列」、「標的核酸」または「標的RNA」は、増幅が所望される目的の配列を含むポリヌクレオチドである。この標的配列は、実際の配列に関して、既知であっても未知であってもよい。いくつかの例において、用語「標的」、「テンプレート」およびこれらの改変体は、交換可能に使用される。
本発明の増幅方法の実施例は、以下の通りである。上に提供した一般的な記載が与えられれば、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。例えば、複合プライマーを用いることの参照は、本明細書に記載される任意の複合プライマーを使用し得ることを意味する。
本発明は、複合プライマーおよび第2プライマー、ならびに鎖置換を用いることにより、目的のRNA配列を増幅する方法を提供する。これらの方法による増幅は直線的であり、そして等温で達成され得る。転写工程を含まない実施形態において、増幅産物は、標的RNA中の目的のRNA配列に相補的な配列を含む一本鎖DNAである。転写を含む実施形態において、増幅産物は、標的RNA中の目的のRNA配列のセンスRNAコピーである。
A)直線的増幅のための二本鎖cDNA基質の形成
1.プライマー1が、ランダム配列部分A(この配列は、少なくとも一部、mRNAのポリA配列に基づき得る)のハイブリダイゼーションによりサンプル中のRNA種に結合し、複合体Iを形成する(図1A)。
2.逆転写酵素(「RT」と示される)が、ハイブリダイズされている標的RNA鎖に沿って、ハイブリダイズしたプライマー1を伸長し、RNA/DNA二本鎖を形成する。RNase Hは、ハイブリッド二本鎖の標的RNA鎖を分解し、一本鎖の第1鎖cDNA(「II」と示される)を生成する。IIの5’末端はプライマー1である。
3.プライマー2が、配列Fのハイブリダイゼーションにより第1鎖cDNA(II)と結合し、複合体IIIを形成する。
4.プライマー2は、DNAポリメラーゼによりcDNA鎖IIに沿って伸長され、二本鎖産物(「IV」と示される)を形成する。RNA依存的DNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)によるIIの5’RNA部分に沿ったプライマー伸長は、複合体IVの1つの末端でのRNA/DNAハイブリッド部分の形成を生じる。
5.RNase Hは、複合体IVの1つの末端のRNA/DNAハイブリッドのRNA部分を分解し、3’DNA一本鎖末端を有する部分的な二本鎖複合体(「V」と示される)を生成する。この配列は、複合プライマー1の部分Bの相補体である配列を有する。RNase H活性は、RNA依存的DNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)により供給され得るか、または別々の酵素において提供され得る。本発明のために有用な逆転写酵素は、RNase H活性を有しても有さなくてもよい。
1.プライマー1を、RNA部分の、それに相補的な一本鎖DNA末端へのハイブリダイゼーションにより、複合体Vに結合させ、複合体VIを形成する。プライマー1の3’DNA配列は、ハイブリダイズされない。
2.複合体VIの結合したプライマー1の3’末端およびすぐ上流にあるDNA鎖の5’末端は同一であり、そして反対鎖へのハイブリダイゼーションについて競合する。学説に束縛されることを望まないが、プライマーのハイブリダイズした3’末端へのDNAポリメラーゼの高親和性は、新しいプライマーの3’末端のハイブリダイゼーションおよび以前のプライマー伸長産物(「VII」と示される)の5’末端の置換の方へ、2つの競合する構造の平衡を推進すると考えられる。第2鎖(センス)cDNA鎖に沿ったプライマー伸長は、以前の第2プライマー伸長産物(VII)と置き換わり、そしてプライマー2のE配列を複製して、複合体VIIIを形成する。
3.複合体VIIIは、一方の末端に、配列Bとその相補鎖から構成されるRNA/DNAハイブリッドを有する。このハイブリッドのRNAセグメントは、RNase Hにより分解され、複合体IXを形成し、これにより、新しいプライマー1がその5’B部分に結合可能である一本鎖3’末端を形成する。
4.二本鎖における以前のプライマー伸長産物の最5’末端の置換、プライマー伸長、および以前の産物の置換による、結合したプライマー1の3’末端配列Aのハイブリダイゼーションのプロセスは、図1A〜Bに示されるように続き、そしてこれにより、複数コピーのアンチセンス一本鎖DNA産物(「XII」と示される)が蓄積される。これらの産物は、3’末端にプライマー2の部分Eに相補的な配列を有し、そして5’末端に複合プライマーの配列Aに実質的に同一(全体的に同一)の配列を有する。Kurn、米国特許第6,251,639号(B1)。
1.PTO(図2Cを参照のこと)は、DNA産物XIIの3’末端配列へのその3’末端配列のハイブリダイゼーションにより、DNA産物XIIに結合し、複合体XIIIを形成する。PTOの3’末端は、好ましくは(しかし、必ずしもそうではない)ブロックされ、その結果、DNAポリメラーゼにより伸長され得ない。
2.DNAポリメラーゼは、PTOテンプレートに沿って、複合体XIIIにおける産物XIIの3’末端を伸長し、一方の末端に二本鎖プロモーター配列を含む複合体XIVを形成する。
3.DNA依存的RNAポリメラーゼは、複合体XIVにおける二本鎖プロモーターに結合し、アンチセンス一本鎖DNA産物を転写して、複数コピーのセンスRNA産物(「XV」と示される)を生成する。多数の種の産物XVが、インプットRNAのプール由来の複数コピーの複数配列を表わす。Kurn、米国特許第6,251,639号(B1)。
本発明はまた、単一のプライマー(複合プライマー)、標的RNAフラグメント、および鎖置換を用いることにより、目的のRNA配列を増幅する方法を提供する。これらの方法による増幅は直線的であり、そして等温で達成され得る。転写工程を含まない実施形態において、増幅産物は、標的RNA中の目的のRNA配列に相補的な配列を含むDNAである。転写を含む実施形態において、増幅産物は、標的RNA中の目的のRNA配列のセンスRNAコピーである。
本明細書中で記載されるように、全mRNAは、メッセージの実質的に全集団とハイブリダイズするのに十分な長さのポリ(T)(すなわち、ポリ(T)n、ここで、nは、典型的には、約5〜50以上である)を含む複合プライマーを使用して増幅され得る。図5は、本発明の鎖置換に基づく方法の非拡張実施形態の概略的な説明を例示し、これは、ポリ−dT配列を含む3’−DNA部分を含み、そしてさらに無作為な配列3’ポリdT配列を含む単一複合プライマーの使用を包含する。複合プライマー1は、さらに、RNA標的配列に実質的にハイブリダイズ可能でない5’−RNA部分(すなわち、ポリ−dT配列がハイブリダイズする条件下のテール(tail))をさらに含む。必要に応じて、第2複合プライマーが、以下に記載されるように使用され得る。
本発明は、第1複合プライマー、第2鎖cDNAを作製するために使用される第2複合プライマー、および標的RNAを使用する、一本鎖アンチセンスおよび目的のRNA配列のセンスポリヌクレオチド(一般的にDNA)コピーを作製する方法を提供する。本発明のこの局面において、第1複合プライマーは、第1伸長産物(一般的に、cDNA)を作製するために使用され、これは、上記のように、複合プライマーを使用する直線的増幅に対する基質である。さらに、第2複合プライマーは、直線的増幅のための基質である第2鎖cDNAを作製するために使用され、目的のRNA配列の一本鎖ポリヌクレオチドコピーの作製を生じる。
A)直線的増幅のための二本鎖cDNA基質の形成
1.複合プライマー1が、プライマー部分A(これは、mRNAのポリA配列に少なくとも一部基づき得る)のハイブリダイゼーションによってサンプル中のRNA標的に結合し、複合体Iを形成する。
9.反応Aにおいて、第1複合プライマーは、複合体VIIIに結合する。プライマー伸長および置換産物は、第1置換産物Aを生成する。RNase切断は、第1複合プライマーの結合、および引き続くプライマー伸長のための部位を作製し、これによって、一本鎖アンチセンスDNA産物が蓄積する。
(テンプレート核酸)
増幅されるRNA標的としては、精製形態または非精製形態の、任意の供給源由来のRNAが挙げられ、これは、RNA全体、tRNA、mRNA、rRNA、ミトコンドリアRNA、葉緑体RNA、DNA−RNAハイブリッド、またはこれらの混合物のようなRNAであり得、ヒト、動物、植物、ならびに細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物およびこれらのフラグメントのような微生物を含む任意の供給源および/または種由来であり得る。RNAは、当該分野で標準的な技術を使用して得られ得、そして精製され得る。DNA標的(ゲノムDNA標的を含む)の増幅は、RNA形態へのDNA標的の最初の転写を必要とし、これは、Kurn、米国特許第6,251,639 B1号に開示される方法を使用して、そして当該分野において公知の他の技術(例えば、発現系)によって達成され得る。DNA−RNAハイブリッドの増幅は、ssRNAを得るためのハイブリッドの変性、または変性し、続いてDNA鎖を転写してRNAを得るためのハイブリッドの変性を必要とする。標的RNAは、複合体混合物(例えば、生物学的サンプル)の単なる微小画分であり得、当該分野で周知の手順によって種々の生物学的材料から得られ得る。標的RNAは、公知であっても、公知でなくても良く、1つより多くの所望の特定の目的の核酸配列を含み得る。これらのそれぞれは、互いに同じであっても、異なっていても良い。従って、増幅プロセスは、大量の一種類の特定の核酸配列を生成するだけではなく、同じかまたは異なる核酸分子上に位置する、一種類より多くの異なる特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
本発明の方法は、RNA部分およびDNA部分から構成される複合プライマーを使用する。本明細書中に記載されるように、ハイブリダイズおよび本明細書中に記載されるRNA増幅の方法を開始するために使用される場合、複合プライマーは、一般的に、RNA標的(これは、本明細書中に記載されるように、増幅が設計されるRNAの性質(種であろうと集団であろうと)に依存して、多数の配列順序のうちのいずれかを有し得る)にハイブリダイズするDNA部分を含む。本明細書中に記載される本発明の方法によって生成されるcDNA鎖を増幅するために使用される場合、複合プライマーは、新規な(さらなる)複合プライマーの結合およびポリメラーゼによる新規なプライマーの伸長による、プライマー伸長産物の引き続く置換が達成され得るように、設計される。さらに、プライマー伸長産物のRNA部分の切断は、複合プライマーによる増幅のための基質ではない増幅産物の生成を導く。以下の節において、本発明の方法に使用される複合プライマーの局面を一般的に記載することが理解され、記載される特徴は、ハイブリダイズおよびRNA増幅を開始する(第1伸長産物の生成)ため、および/または直線的な置換増幅のために使用される場合、そのプライマーに適用可能であり得る。
本発明の方法における第2プライマー(この第2プライマーは、第2鎖cDNAとして交換可能に称される、第2プライマー伸長産物の産生を初回刺激する)は、(所定の一定の条件下で)第1鎖cDNA(この第1鎖cDNAは、第1プライマー伸長産物として交換可能に称される)に、この第2鎖cDNAが目的のRNA配列を含むように第1鎖cDNA上の部位においてハイブリダイズし得る配列(この配列は、プライマーの全体であっても、そうでなくてもよい)を含む。いくつかの実施形態において、第2プライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第1鎖cDNA上の所望の結合部位の公知の配列に基づいて設計される。他の実施形態において、このハイブリダイズ可能な配列は、例えば、複数のRNA種から産生される、第1鎖cDNAをランダムに初回刺激するのに適していると当該分野で公知である、ランダム配列に基づいている。他の実施形態において、第2プライマーは、米国特許第5,692,271号および同第5,962,272号に記載される、鎖スイッチオリゴヌクレオチドを含み、これは、mRNA上に存在するCap配列にハイブリダイズし得、そして逆方向逆転写酵素により、mRNAテンプレートからスイッチオリゴヌクレオチドにスイッチさせ、「スイッチオリゴヌクレオチド」によって初回刺激される第2鎖cDNAの産生を可能にする。あるいは、ホモポリマーの尾部を、第1プライマー伸長産物の3’末端に付加し、そして第2プライマーは、このホモポリマーの尾部の相補体を含む。
いくつかの実施形態は、プライマー伸長産物にハイブリダイズするプロプロモーターおよび領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、プロプロモーターポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、PTOとして提供される。
いくつかの実施形態において、この方法は、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド(PTO)によって提供される転写のためのプロモーター配列を使用する。
本発明の増幅方法は、以下の酵素を使用する:RNA依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA−DNAハイブリッドのRNA鎖を切断し得る因子(例えば、RNaseHのようなリボヌクレアーゼ)、およびいくつかの局面において、DNA依存性RNAポリメラーゼ。これらの活性の1以上は、1つの酵素に見出されそして使用され得る。例えば、RNaseH活性は、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)によって供給され得るか、または別の酵素において提供され得る。本方法に有用な逆転写酵素は、RNaseH活性を有しても有さなくともよい。
本発明の方法を行うために適切な反応媒体および条件は、本発明の方法に従って核酸の増幅を可能にするものである。このような媒体および条件は、当業者に公知であり、そして種々の刊行物(例えば、米国特許第5,554,516号;同第5,716,785号;同第5,130,238号;同第5,194,370号;同第6,090,591号;同第5,409,818号;同第5,554,517号;同第5,169,766号;同第5,480,784号;同第5,399,491号;同第5,679,512号;およびPCT公開番号WO99/42618)に記載される。例えば、緩衝液は、Tris緩衝液であり得るが、他の緩衝液もまた、その緩衝液成分が本発明の方法の酵素成分に対して非阻害性である限り、使用され得る。pHは、好ましくは、約5〜約11、より好ましくは、約6〜約10、さらにより好ましくは、約7〜約9、そして最も好ましくは、約7.5〜約8.5である。反応媒体はまた、Mg2+またはMn2+のような二価の金属イオンを、約0.01〜約15mM、そして最も好ましくは、約1〜10mMの範囲内の遊離イオン最終濃度で含み得る。反応媒体はまた、その媒体の総イオン強度に寄与する他の塩(例えば、KClまたはNaCl)を含み得る。例えば、KClのような塩の範囲は、好ましくは、約0〜約125mM、より好ましくは、約0〜約100mM、そして最も好ましくは、約0〜約75mMである。反応媒体は、増幅反応の実行に影響を及ぼし得るが、これらの方法の酵素成分の活性に不可欠ではない添加剤をさらに含み得る。このような添加剤としては、BSA、一本鎖結合タンパク質(例えば、T4遺伝子32タンパク質)のようなタンパク質、およびNP40またはTritonのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。酵素活性を維持し得る試薬(例えば、DTT)もまた、含まれ得る。このような試薬は、当該分野で公知である。適切な場合、この方法において使用されるRNaseの活性を阻害しないRNaseインヒビター(例えば、Rnasin)もまた、含まれ得る。本発明のこれらの方法の任意の局面が、同じ温度または種々の温度で生じ得る。好ましくは、増幅反応(特に、第1鎖および第2鎖cDNA合成工程以外のプライマー伸長、および鎖置換)は、等温で行われ、これは、煩わしい熱サイクルプロセスを回避する。増幅反応は、テンプレートポリヌクレオチドおよびプライマー伸長産物に対する本発明のオリゴヌクレオチド(プライマーおよび/またはPTO)のハイブリダイゼーションを可能にし、かつ使用される酵素の活性を実質的に阻害しない温度で行われる。温度は、好ましくは、約25℃〜約85℃、より好ましくは、約30℃〜約80℃、そして最も好ましくは、約37℃〜約75℃の範囲にあり得る。RNA転写を含むいくつかの実施形態において、その転写工程のための温度は、先行する工程の温度よりも低い。これらの実施形態において、転写工程の温度は、好ましくは、約25℃〜約85℃、より好ましくは、約30℃〜約75℃、そして最も好ましくは、約約37℃〜約70℃の範囲にあり得る。
本発明はまた、本明細書中に記載される方法において使用される組成物およびキットを提供する。組成物は、本明細書中に記載される任意の成分、反応混合物および/または中間体、ならびに任意の組み合わせであり得る。例えば、本発明は、複合プライマーおよび第2のプライマーを含む組成物を提供し、ここで、第2のプライマーは、ランダムプライマーである。いくつかの実施形態において、第2のプライマーは、DNAを含む。他の実施形態において、第2のプライマーは、DNAからなる。なお別の例において、組成物は、複合プライマーおよび第2のプライマーを含み、その第2のプライマーは、置換プライマー伸長産物の生成の目的のために含まれる非標的配列を含み、そこに、プロプロモーターポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る。この第2のプライマーはまた、ランダムプライマーであり得る。
本発明の方法および組成物を、種々の目的で使用し得る。例示の目的で、配列決定、遺伝子型決定(核酸変異検出)、目的の配列の存在または非存在の決定、固定された核酸の調製(これは、マイクロアレイ上に固定された核酸であり得る)、および本発明の方法によって生成した増幅核酸産物を使用して、核酸を特徴付ける方法が記載される。発現プロファイリングの方法、差引きハイブリダイゼーションの方法および差引きハイブリダイゼーションのためのプローブの調製、ならびにライブラリー(これは、cDNAライブラリーおよび/または示差的ハイブリダイゼーションライブラリーであり得る)を調製する方法もまた、記載される。
本発明の増幅方法は、例えば、目的のRNA配列の配列決定のために有用である。この配列決定プロセスは、本明細書中に記載される方法のいずれかによって、目的の配列を含む標的RNAを増幅することによって、実施される。プライマー伸長の間のヌクレオチドの付加は、当該分野において公知の方法(例えば、ターミネーターヌクレオチドの組み込みまたは合成による配列決定(例えば、熱配列決定(pyrosequencing)))を使用して分析される。
本発明の方法によって生成されたDNAまたはRNAの増幅産物はまた、配列の変更以外は標的核酸配列と同一である参照核酸配列と比較した場合の、標的核酸配列における任意の変更の検出のための分析に適切である。配列の変更は、ゲノム配列に存在する配列変更であり得るか、またはゲノムDNA配列には反映されない配列変更(例えば、転写後改変に起因する変更、および/またはスプライス改変体を含むmRNAプロセシング)であり得る。配列変更(互換可能に「変異」と称される)としては、1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および/または転換が挙げられる。
本発明の等温増幅方法において使用するための、第2の複合プライマーの独自の特性は、標的核酸配列における規定された変異(変異の位置が規定されているという意味で規定されている)、または多型部位(例えば、SNP)の検出のための等温方法に対する基礎を提供する。この方法は、遺伝子型決定、薬物耐性を導く変異の検出などのために有用である。
本発明のいくつかの増幅方法の一本鎖産物は、表面に対する固定に適切である。一本鎖産物は、一本鎖増幅産物を含むマイクロアレイを調製するために特に適切である。
本発明の方法によって得られた増幅産物は、さらなる特徴付けをしやすい。この方法のいくつかの産物の一本鎖の性質によって特徴づけが容易になる。一本鎖産物を生成する本発明の方法は、特に定量的分析に適している。なぜなら、十分な一本鎖DNAおよびRNAの産物が生成され、これは出発物質における種々のmRNAの提示を通常正確に反映しているからである。
本発明の増幅方法は、サンプル中の1つ以上の遺伝子の発現のレベルを決定するのにおける使用に特に適切である。なぜなら、本明細書に記載の方法は、同じサンプル中で、1つ以上の、好ましくは複数の標的RNAを増幅し得るからである。上記のように、増幅産物は、本明細書に記載の、および/または当該分野で公知の種々の方法によって検出および定量され得る。RNAは、遺伝子発現の産物であるので、サンプル中の種々のRNA種(例えば、mRNA)のレベルは、種々の遺伝子の相対的発現レベル(遺伝子発現プロフィール)の指標である。従って、サンプル中に存在する目的のRNA配列の量の決定(配列の増幅産物を定量することにより決定される)によって、サンプル供給源の遺伝子発現プロフィールの決定が得られる。
本発明の方法の一本鎖のDNA産物およびRNA産物は、ライブラリー(cDNAライブラリーおよびサブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリーを含む)を調製するのに有用である。本発明の方法を用いて、限られた量の出発材料(例えば、限定された量の組織、または単一の細胞であっても、それから抽出したmRNA)からライブラリーを調製し得る。従って、1つの局面において、本発明の方法は、本発明の一本鎖のDNA産物またはRNA産物からライブラリーを調製する方法を提供する。別の局面において、本発明は、2つの複合プライマーを含む、本発明の方法によって生成された二本鎖cDNAからライブラリーを調製する方法を提供する。二本鎖cDNAからライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知である。なお別の局面において、本発明はライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法は、以下:本明細書に記載の任意の方法を用いてサブトラクティブハイブリダイゼーションプローブを調製する工程、を包含する。
本発明の増幅方法は、サブトラクティブハイブリダイゼーション方法における使用に特に適切である。この方法では、(少なくとも)第1および第2の標的RNA集団が比較される。なぜなら、本明細書に記載の方法は、同じサンプル中で複数の標的RNAを増幅し得るからである。そして本発明の方法は、サブトラクティブハイブリダイゼーションにおける「ドライバー(driver)(駆動物)」としての使用に適切な大量の一本鎖アンチセンス核酸を生成するために適切である。例えば、2つの核酸集団(1つはセンス、そしてもう1つはアンチセンス)が、モル過剰で存在する1つの集団(「ドライバー」)と一緒に混合することが可能にされ得る。両方の集団において存在する配列は、ハイブリッドを形成するが、1つの集団にしか存在しない配列は、一本鎖のままである。その後、種々の周知の技術を用いて、示差的に発現された配列を示すハイブリダイズしていない分子を分離する。例えば、Hamsonら、米国特許第5,589,339号;Van Gelder、米国特許第6,291,170号を参照のこと。
(実施例1:総ポリA mRNAの増幅)
MOLT−4細胞株(CLONTECH 6587−1)由来のポリA mRNAを、増幅のための標的として用いた。増幅のプロセスは以下の3つの工程であった:1)第一cDNA鎖の合成;2)サンプルの総mRNAから二本鎖cDNAを生成するための第二cDNA鎖の合成;および3)総mRNAの増幅。この二本鎖cDNA産物は、一端でRNA/DNA異種二重鎖を含み、これはRNase Hの基質である。この異種二重鎖部の2つの鎖の配列は、標的とは無関係であり、そして複合(第1)プライマーの利用によって組み込まれる。
MTA1:GACGGAUGCGGUCUTTTTTTT
(ここでGACGGAUGCGGUCUはイタリック表記である)
MTA2:GACGGAUGCGGUCUTTTTTTTN
(ここでGACGGAUGCGGUCUはイタリック表記である)
MTA3:GACGGAUGCGGUCUTTTTTTTNN
(ここでGACGGAUGCGGUCUはイタリック表記である)
ここでイタリック表記のヌクレオチドは、リボヌクレオチドを示し、そして「N」は、縮重ヌクレオチドを示す(すなわち、これは、A、T、C、またはGであり得る)。
0.1μgの総ポリA mRNAを、総容積10μl中で、以下の試薬と混合した:
0.2μl プライマーMTA3(100μM)
0.5μl dNTPs(25mM)
0.1μl Rnasin
0.1μl DTT
2μl 5×AMV逆転写酵素反応緩衝液
DEPC処理水(を用いて総容積を10μlに)。
第一鎖cDNA反応混合物を、以下を含有する10μlの第二鎖 cDNA合成混合物と混合した。
0.1μl dNTPs(25mM)
0.5μl Klenow(USB 2141Y 5U/μl)DNAポリメラーゼ
8.4μl 水。
2つの複合プライマー(MTA1およびMTA2)を試験した。
1μl cDNA反応物
0.2μl MTA1プライマーまたはMTA2プライマー(各々100μM)
0.2μl 25mM dNTP
0.1μl Rnasin
0.1μl DTT
17.2μl 水。
実施例1の増幅反応において、「特有」配列(すなわち、RNAテンプレートにハイブリダイズ可能ではない配列)は、使用する複合プライマーの5’ RNA部分の「特有」配列に起因して、第2鎖cDNAの3’末端で作製されると予想される。この配列(第2鎖cDNAの3’末端)は、複合プライマーの5’−RNA部分に相補的であり、そして標的RNA中の配列に関連しない。得られる第2鎖cDNA中のこの配列の存在を決定するために、反応産物(実施例1の工程2の反応混合物中に見出されるような)のPCR増幅を、順方向プライマーとして第2鎖cDNAの3’末端における予想配列に相補的であるプライマーを使用し、そして逆方向PCRプライマーとしてG3PDH特異的プライマーを使用して実行した。このプライマー対は、「特有」配列を有する二本鎖cDNAから特異的産物を増幅することが予想される。しかし、アンチセンスDNA産物(実施例1の工程3の反応混合物中で見出されるような)の増幅産物から特異的産物を生成することは、予想されない。なぜなら、これらの産物は、「特有」配列(これは、RNase Hによって切断される複合プライマーのRNA部分によって導入される)を含むことが予想されないからである。実施例1の工程3の反応混合物は、主に増幅DNA産物(これは、「特有」配列を含むべきではない)を含むので、この反応混合物のPCR増幅は、工程2の反応混合物のPCR増幅(これは、主に二本鎖cDNA産物を含む)よりも、はるかに非効率的である(従って、実質的により少ない産物を生成する)ことが予想される。
各50μlのPCR反応物は、以下を含む:
0.4μM 各プライマー(Biosource International)
100μM 各dNTP(Epicenter)
2mM 塩化マグネシウム(Epicenter)
1〜2単位 ポリメラーゼ(MasterAmp taqまたはMasterAmp Tflのいずれか(共に、Epicenterより))
5μl 酵素と共に提供される10×緩衝液
実施例1の第3工程からの直線増幅反応物の0.5μlまたは実施例1の工程2で作製されたcDNAの1:20希釈物。
総RNA調製物から総mRNAを増幅する能力は、mRNA精製工程を排除することによってそのプロセスを大きく単純化する。本発明の方法を用いて総RNA調製物から総mRNAを増幅する実験的な実証を、乳癌腫瘍由来の市販の総RNA調製物(CLONTECH;カタログ番号:64015−1)を用いて実行した。総mRNAの増幅プロセスを、以下に記載するように3工程で実行した。
各反応混合物は、以下を含んだ:
4μl 5×緩衝液(250mM Tris−HCl、pH8.3;375mM KCl、15mM MgCl2)
MTB2プライマー@1μM
25mM dNTP
0.2μl RNasinリボヌクレアーゼインヒビター(Promega N2511、40u/μl)
1μl 0.1M DTT
1反応当たり、5μg、1μg、0.2μgまたは40ngの総RNA
総容量19μlまでのDEPC処理水。
10μlの第1鎖cDNA合成反応混合物を、個々の反応チューブへアリコートに分けた。20μlの第2鎖合成ストック反応混合物を、各チューブに添加した。第2鎖合成ストック反応混合物は、以下を含んだ:
2μl 10×Klenow反応緩衝液(10×緩衝液:500mM Tris−HCl、pH8.0;100mM MgCl2、500mM NaCl)
2U Klenow DNAポリメラーゼ(BRL 18012−021)
0.1μl AMV逆転写酵素(BRL 18020−016、25U/μl)
0.2μl E.coli リボヌクレアーゼH(BRL 18021−014、4U/μl)
0.2μl(25mM)dNTP
0または0.2μl E.coli DNAリガーゼ(BRL 18052−019、10U/μl)。
増幅を、上記の第2鎖cDNA反応混合物の1μl、T4遺伝子32タンパク質の存在下でMTA1複合プライマーを用いて、50℃で60分間実行した。
2μl 10×緩衝液(200mM Tris−HCl、pH8.5、50mM MgCl2、1% NP―40)
0.2μl dNTP(25mM)
0.2μl MTA1(100μM)
1μl 第2鎖cDNA合成混合物
0.1μl Rnasin
0.1μl DTT(0.1M)
総容量18.8μlまでのDEPC処理水。
HCT116細胞株から調製した総RNA(1μg)、またはMOLT4細胞株(Clontech)から調製したmRNA(100ng)を、第2鎖cDNA中の追加された規定され配列を含む中間体二本鎖cDNA産物の産生のための標的として、使用した。追加された配列は、合成(第1)プライマーの利用によって組み込む。
1)第2cDNA鎖の3’末端の配列の追加に依存する203bpの産物の作製のための、特有配列(DMTA1)に相補的なプライマーおよびGAPDH mRNA(GAPDH5−4)の配列に相補的なプライマー。
1.マーカー
2.HCT116由来のcDNA GAPDH3/GAPDH5−4
3.HCT116由来のcDNA GAPDH3/GAPDH5−4
4.MOLT4由来のcDNA GAPDH3/GAPDH5−4
5.MOLT4由来のcDNA GAPDH3/GAPDH5−4
6.テンプレートなし GAPDH3/GAPDH5−4
7.HCT116由来のcDNA dMTA1/GAPDH5−4
8.HCT116由来のcDNA dMTA1/GAPDH5−4
9.MOLT4由来のcDNA dMTA1/GAPDH5−4
10.MOLT4由来のcDNA dMTA1/GAPDH5−4
11.テンプレートなし dMTA1/GAPDH5−4。
ヒト結腸腫瘍総RNA由来の総RNA(Clontech カタログ番号64014−1)の200ngを、増幅のための標的として使用した。第1鎖および第2鎖cDNAの調製および引き続く増幅工程を、以下のように改変して、本質的に実施例3に記載されるように実行した:
(1)第2鎖cDNA合成のための反応混合物は、Klenow DNAポリメラーゼ(3’および5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く)を含み、かつリガーゼを欠いた。
cDNAまたは増幅産物をTE緩衝液中に1:10または1:100希釈した。
各反応について、
10μl 2×ABI SYBR Greenマスターミックス(ABI カタログ番号4309155)
0.6μl 10μM 順方向プライマー
0.6μl 10μM 逆方向プライマー
1μl テンプレート(cDNAまたは上記で特定するような増幅産物のいずれかの希釈物)
7.8μl H2O。
DNAポリメラーゼを活性化するために94℃で10分間
94℃で30秒、続いて60℃で30秒を40サイクル。
Claims (161)
- 目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を生成する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを、RNA依存性DNAポリメラーゼで伸長し、それにより、第1のプライマー伸長産物と該標的RNAとを含む複合体が生成される、工程であって、該第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、工程;
(b)工程(b)の複合体中のRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程;
(c)該第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長し、それにより、第2のプライマー伸長産物が生成されて、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体を形成する工程;
(d)第1および第2のプライマー伸長産物の複合体における複合プライマーから、RNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程であって、その結果、複合プライマーが第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、該複合プライマーがRNA部分と3’DNA部分とを包含する、工程;
(e)該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズした該複合プライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程、
を包含し、これにより、該第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれにより目的の該RNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が生成される、方法。 - 前記第2のプライマーが、前記プライマー伸長産物にハイブリダイズする前記標的RNAのフラグメントを包含する、請求項1に記載の方法であって、該フラグメントは、工程(b)の複合体中のRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断することによって生成される、方法。
- 前記第2のプライマーは、DNAを包含する、請求項1に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分は、前記3’DNA部分に関して5’である、請求項1に記載の方法。
- 前記5’RNA部分は、前記3’DNA部分に近接している、請求項4に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーは、前記複合プライマーが前記標的RNAにハイブリダイズする条件下で前記標的RNAにハイブリダイズしない5’部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的RNAがmRNAである、請求項7に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダム配列を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的RNAがmRNAであり、そして標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を包含し、そして該複合プライマーが該標的mRNAにハイブリダイズする条件下で該標的mRNAにハイブリダイズしない、5’部分をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 多数の異なる複合プライマーが前記標的RNAにハイブリダイズするために使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のプライマーがランダムプライマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のプライマーは、第2のプライマーが第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズする条件下で前記第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズしない5’部分を包含する、請求項1に記載の方法。
- RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、RNase Hである、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼとDNA依存性DNAポリメラーゼとが、同じ酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼと、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼと、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素とが、同じ酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼ、前記RNA依存性DNAポリメラーゼ、およびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項1に記載の方法。
- 使用される少なくとも一つの型のdNTPが、dNTPで標識されており、それにより、標識された産物が生成される、請求項1に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーと、第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする複合プライマーとが、同じである、請求項1に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーと、第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする複合プライマーとが、異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、目的の2つ以上の異なる配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を生成する工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、標的RNAにハイブリダイズする少なくとも2つの異なる複合プライマーを包含する、請求項22に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリ−dT部分を包含する、請求項22または23に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダムプライマーである、請求項22または23に記載の方法。
- 多数のコピーの目的のRNA配列を生成する方法であって、該方法が、以下の工程:
(a)RNA依存性DNAポリメラーゼで標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを伸長し、それにより、第1のプライマー伸長産物と該標的RNAとを包含する複合体が生成される、工程であって、該第1のプライマーが、RNA部分と3’DNA部分とを包含する複合プライマーである、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;
(c)第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程であって、それにより、第2のプライマー伸長産物が生成されて、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体が形成される、工程;
(d)第1および第2のプライマー伸長産物の複合体中の複合プライマーからRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断する工程であって、その結果、複合プライマーが該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、ここで、該複合プライマーが、RNA部分と3’DNA部分とを含む、工程;
(e)該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを、DNA依存性DNAポリメラーゼで伸長する工程であって、それにより、該第1のプライマー伸長産物が置換される、工程;
(f)該置換された第1のプライマー伸長産物を、プロポロモーターと、該置換された第1のプライマー伸長産物にRNAポリメラーゼによる転写が生じる条件下でハイブリダイズし得る領域と、を含むポリヌクレオチドに、該置換された第1のプライマー伸長産物に相補的な配列を含むRNA転写物が生成されるようにハイブリダイズさせる工程、
を包含し、それにより、多数のコピーの目的の該RNA配列が生成される、
方法。 - 前記第2のプライマーが、前記プライマー伸長産物にハイブリダイズした前記標的RNAのフラグメントを含み、前記フラグメントが、工程(b)の複合体中のRNAを、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素で切断することによって生成される、請求項26に記載の方法。
- 前記第2のプライマーがDNAを包含する、請求項26に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に関して5’である、請求項26に記載の方法。
- 前記5’RNA部分が前記3’DNA部分に隣接している、請求項29に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、該複合プライマーが該標的RNAにハイブリダイズする条件下で該標的RNAにハイブリダイズし得ない5’部分を含む、請求項26に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を包含する、請求項26に記載の方法。
- 前記標的RNAがmRNAである、請求項26に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダム配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記標的RNAがmRNAであり、そして標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含み、かつ該複合プライマーが該標的mRNAにハイブリダイズする条件下で、該標的mRNAにハイブリダイズ可能でない5’部分をさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 複数の異なる複合プライマーが、前記標的RNAにハイブリダイズするために用いられる、請求項26に記載の方法。
- 前記第2のプライマーがランダムプライマーである、請求項26に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、該第2のプライマーが前記第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズする条件下で、該第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能でない5’部分を含む、請求項26に記載の方法。
- RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、RNase Hである、請求項26に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびDNA依存性DNAポリメラーゼが、同じ酵素である、請求項26に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項26に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項26に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼ、前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項26に記載の方法。
- 用いられる少なくとも1つの型のdNTPが標識されたdNTPであり、それによって標識産物が生成される、請求項26に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが、同じである、請求項26に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが異なる、請求項26に記載の方法。
- 前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を3’末端に含み、それによって、置換されたプライマー伸長産物のDNAポリメラーゼ伸長が、転写が起こる二本鎖プロモーターを生じる、請求項26に記載の方法。
- 前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド(PTO)である、請求項26に記載の方法。
- 用いられる少なくとも1つの型のrNTPが、標識されたrNTPであり、それによって標識産物が生成される、請求項26に記載の方法。
- 前記方法が、複数コピーの2以上の異なる目的配列を作製する工程を包含する、請求項26に記載の方法。
- 前記方法が、標的RNAにハイブリダイズする少なくとも2つの異なる複合プライマーを含む、請求項50に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT部分を含む、請求項50または51に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダムプライマーである、請求項50または51に記載の方法。
- 目的のRNA配列を増幅する方法であって、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下:
(a)請求項1の工程(c)の第1および第2のプライマー伸長産物の複合体;
(b)該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし得る複合プライマーであって、ここで、該複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、プライマー;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼ;ならびに
(d)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素;
を含み、ここで、該インキュベーションは、そのRNAが切断され、かつ複合プライマーが該複合体中の該第2のプライマー伸長産物に結合し、そして伸長される場合に、請求項1の工程(c)の複合体へのプライマーハイブリダイゼーション、請求項1の工程(c)の複合体のRNA切断、および請求項1の工程(c)の複合体からの該第1のプライマー伸長産物の置換を可能にする条件下であり、それによって、該目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される、方法。 - 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に関して5’であり、そして前記5’RNA部分が、該3’DNA部分に隣接する、請求項54に記載の方法。
- 前記標的RNAが、mRNAである、請求項54に記載の方法。
- 用いられる少なくとも1つの型のdNTPが、標識されたdNTPであり、ここで、標識産物が作製される、請求項54に記載の方法。
- 目的のRNA配列を増幅する方法であって、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物が、以下:
(a)第1の複合体であって、ここで、該第1の複合体は、請求項1の工程(c)の第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体である、第1の複合体;
(b)該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である複合プライマーであって、ここで、該複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、複合プライマー;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼ;
(d)RNAポリメラーゼ;
(e)プロプロモーターおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド;ならびに
(f)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素;
を含み、ここで、該インキュベーションが、そのRNAが切断され、かつ複合プライマーが該第1の複合体中の該第2のプライマー伸長産物に結合した場合、該第1の複合体へのプライマーハイブリダイゼーション、該第1の複合体のRNA切断、該第1の複合体からの該第1のプライマー伸長産物の置換、該置換されたプライマー伸長産物および該プロプロモーターポリヌクレオチドを含む第2の複合体を形成する、該置換された第1のプライマー伸長産物への該プロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ならびに該第2の複合体からのRNA転写を可能にする条件下であり、それによって、多数のコピーの該目的のRNA配列が作製される、方法。 - 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に関して5’であり、そして前記5’RNA部分が、該3’DNA部分に隣接する、請求項58に記載の方法。
- RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、RNase Hである、請求項58に記載の方法。
- 前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、前記置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズし、それによって置換されたプライマー伸長産物のDNAポリメラーゼ伸長が、転写が起こる二本鎖プロモーターを生じる領域を3’末端に含む、請求項58に記載の方法。
- 用いられる少なくとも1つの型のrNTPが、標識されたrNTPであり、それによって標識産物が作製される、請求項58に記載の方法。
- 前記標的RNAが、mRNAである、請求項58に記載の方法。
- 多数のコピーの目的のRNA配列を作製する(増幅する)方法であって、以下:
(a)反応混合物をインキュベートする工程であって、該反応混合物が、以下:
(i)標的RNA;
(ii)標的RNAにハイブリダイズ可能である第1のプライマーであって、ここで、該第1のプライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、第1のプライマー;
(iii)RNA依存性DNAポリメラーゼ;ならびに
(iv)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素
を含み;ここで、該インキュベーションが、プライマーハイブリダイゼーション、第1のプライマー伸長産物および該標的RNAを含む複合体の形成、ならびに第1のプライマー伸長産物および該標的RNAを含む該複合体中のRNAの切断を可能にする条件下である、工程;
(b)反応混合物をインキュベートする工程であって、該反応混合物は、以下:
(i)該第1のプライマー伸長産物;
(ii)DNA依存性DNAポリメラーゼ;および
(iii)必要に応じて、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素
を含み;ここで、該インキュベーションが、該第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む複合体の形成、ならびに必要に応じて、第1のプライマー伸長産物および該標的RNAを含む該複合体中のRNAの切断を可能にする条件下である、工程;
(c)反応混合物をインキュベートする工程であって、該反応混合物は、以下:
(i)該第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む該複合体;
(ii)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断し得る酵素;
(iii)複合プライマーであって、該複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む、複合プライマー;
(iv)該第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む該切断された複合体;ならびに
(v)DNA依存性DNAポリメラーゼ
を含み、ここで、該インキュベーションは、該第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む該複合体中のRNAの切断、複合プライマーハイブリダイゼーション、ならびに該第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物を含む該複合体からの該第1のプライマー伸長産物の置換を可能にする条件下であり;それによって、該目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される、工程、
を包含する、方法。 - 工程(b)が、(iv)第2のプライマーをさらに含む反応混合物をインキュベートする工程を包含し;ここで、該インキュベーションが、該第2のプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下である、請求項64に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、DNAを含む、請求項65に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に関して5’である、請求項64に記載の方法。
- 前記5’RNA部分が、前記3’DNA部分に隣接する、請求項67に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、該複合プライマーが該標的RNAにハイブリダイズする条件下で、該標的RNAにハイブリダイズ可能でない5’部分を含む、請求項64に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記標的RNAが、mRNAである、請求項64に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダム配列を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記標的RNAが、mRNAであり、そして標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含み、そして該複合プライマーが該標的mRNAにハイブリダイズする条件下で、該標的mRNAにハイブリダイズ可能ではない5’部分をさらに含む、請求項64に記載の方法。
- 複数の異なる複合プライマーが、前記標的RNAにハイブリダイズするために用いられる、請求項64に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、ランダムプライマーである、請求項64に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、該第2のプライマーが前記第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズする条件下で、該第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能ではない5’部分を含む、請求項64に記載の方法。
- RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、RNase Hである、請求項64に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびDNA依存性DNAポリメラーゼが同じ酵素である、請求項64に記載の方法。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項64に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項64に記載の方法。
- 前記DNA依存性DNAポリメラーゼ、前記RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する前記酵素が、同じ酵素である、請求項64に記載の方法。
- 用いられる少なくとも1つの型のdNTPが、標識されたdNTPであり、それによって標識産物が作製される、請求項64に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが同じである、請求項64に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが異なる、請求項64に記載の方法。
- 前記方法が、2以上の異なる目的配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を作製する工程を包含する、請求項64に記載の方法。
- 前記方法が、標的RNAにハイブリダイズする少なくとも2つの異なる複合プライマーを含む、請求項85に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT部分を含む、請求項85または請求項86に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ランダムプライマーである、請求項85または請求項86に記載の方法。
- 目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)複合プライマーが第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズするように、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、第1のプライマー伸長産物および該第2のプライマー伸長産物の複合体からRNAを切断する工程であって、ここで、該複合プライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含み、ここで、該第1のプライマー伸長産物が、RNA依存性DNAポリメラーゼを用いた、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーの伸長によって産生され、ここで、該第1のプライマーが、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、工程;
(b)該第2のプライマー伸長産物に複合プライマーをハイブリダイズさせ、そしてDNA依存性DNAポリメラーゼを用いて該複合プライマーを伸長させる工程であって、それによって該第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれによって、該目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列が作製される、工程
を包含する、方法。 - 前記第2のプライマーが、DNAを含む、請求項89に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に関して5’である、請求項89に記載の方法。
- 前記5’RNA部分が、前記3’DNA部分に隣接する、請求項91に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、該複合プライマーが該標的RNAにハイブリダイズする条件下で、該標的RNAにハイブリダイズ可能ではない5’部分を含む、請求項89に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含む、請求項89に記載の方法。
- 前記標的RNAが、mRNAである、請求項94に記載の方法。
- 目的のRNA配列に相補的な多数のコピーのポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、該方法は、複合体中の複合プライマーを伸長する工程を包含し、該複合体が、以下:
(i)第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の複合体であって、該第1のプライマー伸長産物は、RNA依存性DNAポリメラーゼを用いた、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーの伸長によって産生され、ここで、該第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーであり、該第2のプライマー伸長産物は、該第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーの伸長によって作製され、ここで、第1のプライマー伸長産物および第2のプライマー伸長産物の該複合体由来のRNAは、RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて切断される、複合体;ならびに
(ii)複合プライマーであって、該複合プライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含み、ここで、該複合プライマーは、該第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズし、ここで、該複合プライマーは、該第1のプライマーと同じであっても異なっていてもよい、複合プライマー;
を含み、
それによって、該第1のプライマー伸長産物が置換され、そしてそれによって、該目的のRNA配列に相補的な複数コピーのポリヌクレオチド配列が作製される、方法。 - 前記第2のプライマーがDNAを含む、請求項96に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーの前記RNA部分が、前記3’DNA部分に対して5’側である、請求項96に記載の方法。
- 前記5’RNA部分が前記3’DNA部分に隣接する、請求項98に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、該複合プライマーが該標的RNAにハイブリダイズする条件下で、該標的RNAにハイブリダイズ可能でない5’部分を含む、請求項96に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーが、ポリdT配列を含む、請求項96に記載の方法。
- 前記標的RNAがmRNAである、請求項101に記載の方法。
- 目的のRNA配列を配列決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)プライマー伸長がdNTPアナログの取り込みの際に終了するように、dNTPおよびdNTPアナログの混合物の存在下で、請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法によって、目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)配列を決定するために、増幅産物を分析する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項103に記載の方法。
- 目的のRNA配列を配列決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)転写がrNTPアナログの取り込みの際に終了するように、rNTPおよびrNTPアナログの混合物の存在下で、請求項26および58のいずれか1項に記載の方法によって、目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)配列を決定するために、増幅産物を分析する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項105に記載の方法。
- 一本鎖コンホメーション多型によって標的RNA中の変異を検出する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、26、54、58、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法によって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)一本鎖コンホメーションについて増幅産物を分析する工程であって、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合のコンホメーションにおける差異が、該標的ポリヌクレオチドにおける変異を示す、工程、
を包含する、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項107に記載の方法。
- 目的の配列の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下:
(i)目的の配列を含む標的RNAを増幅する工程であって、該増幅する工程が、請求項1に記載の工程(d)の複合体にハイブリダイズした複合プライマーを伸長する工程を包含し、該複合プライマーの該RNA部分の配列が既知である、工程;および
(ii)存在する場合、工程(i)由来の該増幅産物を、参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較する工程、
を包含し、
ここで、(1)該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な領域を含む該参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較した場合に、該テンプレート由来の検出可能に少ない増幅産物の生成は、第2のプライマー伸長産物が、該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な配列を含まず、そして該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な配列に関して配列改変体であることを示す;または
(2)該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な領域を含まない該参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較した場合に、該テンプレート由来の検出可能に多い増幅産物の生成は、第2のプライマー伸長産物が、該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な配列を含み、そして該複合プライマーの該RNA部分にハイブリダイズ可能な配列に関して配列改変体でないことを示す、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項109に記載の方法。
- 基材に固定された核酸を生成する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、26、54、58、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法によって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)基材上に該増幅産物を固定する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項111に記載の方法。
- 前記基材がマイクロアレイである、請求項111に記載の方法。
- 目的のRNA配列を特徴付ける方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法によって標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)該DNA産物を分析する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項114に記載の方法。
- 前記DNA産物が標識されている、請求項114に記載の方法。
- 工程(b)の前記DNA産物を分析する工程が、該産物の量を決定する工程を包含し、これにより、サンプル中に存在する目的の前記RNA配列の量が定量される、請求項114に記載の方法。
- 工程(b)が少なくとも1つのプローブと前記DNA産物を接触させる工程を包含する、請求項114に記載の方法。
- 前記DNA産物が標識され、そして前記少なくとも1つのプローブがマイクロアレイとして提供される、請求項118に記載の方法。
- 請求項119に記載の方法であって、前記マイクロアレイが、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、および光ファイバーからなる群より選択される材料から作製された基材上に固定された少なくとも1つのプローブを含む、方法。
- 請求項120に記載の方法であって、前記プローブが、ピン、ロッド、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、およびシリンダーを含む二次元構造または三次元構造で、前記基材に固定される、方法。
- 目的のRNA配列を特徴付ける方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項26および58のいずれか1項に記載の方法によって、標的RNAを増幅する工程;ならびに
(b)該RNA産物を分析する方法。 - 前記標的RNAがmRNAである、請求項122に記載の方法。
- 前記RNA産物が標識される、請求項122に記載の方法。
- 工程(b)の前記RNA産物を分析する工程が、該産物の量を決定する工程を包含し、これにより、サンプル中に存在する目的の前記RNA配列の量が定量される、請求項122に記載の方法。
- 工程(b)が、標識されたRNA産物を少なくとも1つのプローブと接触させる工程を包含する、請求項122に記載の方法。
- 前記RNA産物が標識され、そして前記少なくとも1つのプローブがマイクロアレイとして提供される、請求項122に記載の方法。
- 請求項127に記載の方法であって、前記マイクロアレイが、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、および光ファイバーからなる群より選択される材料から作製された基材上に固定された少なくとも1つのプローブを含む、方法。
- 請求項128に記載の方法であって、前記プローブが、ピン、ロッド、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、およびシリンダーを含む二次元構造または三次元構造で、前記基材上に固定される、方法。
- サンプル中の遺伝子発現プロフィールを決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法を使用して、該サンプル中の目的の少なくとも1つのRNA配列を増幅する工程;ならびに
(b)目的の各RNA配列の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで、各該量が該サンプル中の目的の各RNA配列の量を示し、これにより、該サンプル中での遺伝子発現プロフィールが決定される、工程、
を包含する、方法。 - 各標的RNAがmRNAである、請求項130に記載の方法。
- ライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下:
請求項1、26、54、58、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法を使用して、少なくとも1つの目的のRNA配列を増幅する工程、
を包含する、方法。 - 標的RNAにハイブリダイズする第1のプライマーがランダムプライマーである、請求項132に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする第1のプライマーがポリdT部分を含む、請求項132に記載の方法。
- 減算的ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法であって、該方法は、請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法を使用して、第1のRNA集団から少なくとも1つの目的のRNA配列の相補体の多数のDNAコピーを作製する工程を包含する、方法。
- 減算的ハイブリダイゼーションを実行する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法を使用して、第1のRNA集団から少なくとも1つの目的のRNA配列の相補体の多数のDNAコピーを作製する工程;ならびに
(b)該多数のコピーを第2のmRNA集団にハイブリダイズさせる工程であって、これにより、該第2のmRNA集団の部分集団が、DNAコピーと複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項136に記載の方法であって、該方法は、以下:
(c)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;および
(d)前記第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅する工程であって、これにより、該第2のmRNA集団の該ハイブリダイズしていない部分集団に相補的な多数のコピーの一本鎖DNAが作製される、工程、
をさらに包含する、方法。 - 1つ以上の目的のRNA配列の示差的な増幅のための方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1、54、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法を使用して、第1のRNA集団から1つ以上の目的のRNA配列の相補体の多数のポリヌクレオチドコピーを第2のmRNA集団にハイブリダイズする工程であって、これにより、該第2のmRNA集団の部分集団が、該ポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズして、複合体を形成する、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の複合体中のRNAを切断する工程;ならびに
(c)該第2のmRNA集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅する工程であって、これにより、該第2のmRNA集団の該ハイブリダイズしていない部分集団に相補的な多数のコピーの一本鎖DNAが作製される、工程、
を包含する、方法。 - cDNAライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下:
請求項84に記載の減算的ハイブリダイゼーションプローブを調製する工程、
を包含する、方法。 - RNA部分および3’DNA部分、および第2のプライマーを含む複合プライマーを含む組成物。
- 前記第2のプライマーがDNAを含む、請求項140に記載の組成物。
- 前記第2のプライマーがランダムプライマーである、請求項141に記載の組成物。
- 前記第2のプライマーが、前記プライマー伸長産物にハイブリダイズした標的RNAのフラグメントを含む、請求項140に記載の組成物。
- RNA依存性DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項140に記載の組成物。
- 請求項140に記載の組成物であって、前記複合プライマーは、該複合プライマーが前記標的RNAにハイブリダイズする条件下で、目的の該RNA配列にハイブリダイズ可能でない5’領域をさらに含む、組成物。
- 複合プライマーおよび第2のプライマーを含む組成物であって、該組成物は、該複合プライマーが標的RNAにハイブリダイズする条件下で、第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能でない配列を含む、組成物。
- (a)複合プライマー;(b)第2のプライマー;および(c)プロプロモーターポリヌクレオチドを含む、組成物。
- 前記第2のプライマーがランダムプライマーである、請求項147に記載の組成物。
- (a)第1のプライマー伸長産物であって、該第1のプライマーがRNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、第1のプライマー伸長産物;ならびに(b)プロプロモーターポリヌクレオチド、の複合体を含む、組成物。
- (a)第1のプライマー伸長産物であって、該第1のプライマーがRNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、第1のプライマー伸長産物;ならびに(b)第2のプライマー伸長産物であって、該第2のプライマーがDNAを含む、第2のプライマー伸長産物、の複合体を含む、組成物。
- (a)第1のプライマー伸長産物であって、該第1のプライマーがRNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、第1のプライマー伸長産物;ならびに(b)第2のプライマー伸長産物であって、該第2のプライマーが標的RNAのフラグメントを含む、第2のプライマー伸長産物、の複合体を含む、組成物。
- (a)切断されたプライマー伸長産物であって、該プライマーがRNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーである、切断されたプライマー伸長産物;(b)第2のプライマー伸長産物;ならびに(c)第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする複合プライマー、の複合体を含む、組成物。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが、同じである、請求項152に記載の方法。
- 標的RNAにハイブリダイズする前記複合プライマーおよび第2のプライマー伸長産物にハイブリダイズする前記複合プライマーが、異なる、請求項152に記載の方法。
- (a)標的RNA;(b)3’DNA部分およびRNA部分を含む複合プライマー;(c)第2のプライマー;ならびに(d)DNAポリメラーゼを含む、反応混合物。
- (e)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素をさらに含む、請求項155に記載の反応混合物。
- (e)プロプロモーターポリヌクレオチドをさらに含む、請求項155に記載の反応混合物。
- (a)3’DNA部分およびRNA部分を含む複合プライマー;(b)第2のプライマー;および(c)請求項1、26、54、58、64、89、および96のいずれか1項に記載の方法に従って、RNAを増幅するための説明書を備える、標的RNAを増幅するためのキット。
- (d)プロプロモーターポリヌクレオチドをさらに備える、請求項158に記載のキット。
- RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素をさらに備える、請求項158または159に記載のキット。
- 3’一本鎖部分を含む第1および第2のプライマー伸長産物の複合体を作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)RNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、標的RNAにハイブリダイズした第1のプライマーを伸長させる工程であって、該第1のプライマーは、RNA部分および3’DNA部分を含む複合プライマーであり、これにより、第1のプライマー伸長産物および該標的RNAを含む複合体が生成される、工程;
(b)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、工程(b)の該複合体中のRNAを切断する工程;
(c)DNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、該第1のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させる工程であって、これにより、第2のプライマー伸長産物が形成され、第1および第2のプライマー伸長産物の複合体を形成する、工程;
(d)RNA/DNAハイブリッドからRNAを切断する酵素を用いて、第1および第2のプライマー伸長産物の該複合体中の該複合プライマーからRNAを切断する工程を包含し;
これにより、3’一本鎖部分を含む第1および第2のプライマー伸長産物の複合体が生成され;
これにより、該3’一本鎖部分が、該複合プライマーの該RNA部分に相補的である、方法。
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