HU218095B - Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban - Google Patents

Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban Download PDF

Info

Publication number
HU218095B
HU218095B HU9200301A HU30192A HU218095B HU 218095 B HU218095 B HU 218095B HU 9200301 A HU9200301 A HU 9200301A HU 30192 A HU30192 A HU 30192A HU 218095 B HU218095 B HU 218095B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
amplification
modified
amplification product
product
kit
Prior art date
Application number
HU9200301A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT60331A (en
HU9200301D0 (en
Inventor
Gregory S. Brown
Theodore Jones
Rodney M. Richards
David L. Snitman
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27059197&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU218095(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of HU9200301D0 publication Critical patent/HU9200301D0/hu
Publication of HUT60331A publication Critical patent/HUT60331A/hu
Publication of HU218095B publication Critical patent/HU218095B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Abstract

A találmány tárgya eljárás az amplifikációs eljárás során azamplifikációs termék szennyeződésének csökkentésére. A találmányszerinti eljárást az jellemzi, hogy (a) az említett amplifikációstermékbe legalább egy módosítást visznek be úgy, hogy az így kapottmódosított amplifikációs termék megkülönböztethető legyen az említettcélszekvenciától, ahol a módosítás valamely ligandum, enzimfelismerésihely és/vagy kémiailag hasítható hely; és (b) az amplifikációstermékből valamilyen módon szelektíven kizárják az említett módosítottamplifikációs terméket. ŕ

Description

A találmány háttere
A diagnosztikai méréseket a gyakorlatban betegekből vagy más alanyokból származó vizsgálandó mintákban jelen lévő analitikumok (analytes) jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározására alkalmazzuk. Az analitikumok (analytes) általában antigének és antitestek, melyek mérése céljából immunodiagnosztikai eljárásokat alkalmazunk az egyes betegségek és a különböző típusú, nem betegség típusú állapotok (non-diasease conditions), mint például a terhesség, azonosítására. A legtöbb diagnosztikai mérés során rendkívül fontos a magas fokú érzékenységi szint és specifitás elérése. Ez különösen fontos azokban az esetekben, amikor a vizsgálandó analitikumok viszonylag kis koncentrációban fordulnak elő. Számos fejlesztés ismeretes, mely az immundiagnosztikai eljárások során a magasabb érzékenységi szint elérésére irányult, ezek a mérési eljárások során monoklonális antitesteket alkalmaznak, valamint az ismétlődésként alkalmazott jel amplifikálása céljából az egyes mérési eljárásokat egyesítik.
Az utóbbi időben a molekuláris biológia fejlődésének eredményei szondadiagnosztika (probe diagnostic) eljárás néven a vizsgálandó mintában található specifikus nukleinsavszekvenciák detektálását tették lehetővé. A szondadiagnosztikai eljárások során egy nukleinsavszekvenciát alkalmazunk, mint a minta-„szondát”, mely specifikusan kapcsolódik a komplementer nukleinsav célanalitikumhoz. Ez a betegség korai állapotának detektálását teszi lehetővé, mivel a nukleinsav genetikai anyag gyakran hónapokkal vagy évekkel előbb megjelenik a mintában, és így elegendő idő telik el a nukleinsav-célszekvenciának az antigénbe történő transzkripciójáig. Ez különösképpen érvényes a szexuális úton átvitt betegségek egyes típusai, például a humán immunhiányos betegséget okozó vírus esetében, Ranki és társai, The Láncét, 85(59) 589-593 (1987). Továbbá az egyes betegségek és genetikai rendellenességek kimutatása és a specifikus gének azonosítására alkalmas szondadiagnosztizálások képessége segítségével megfelelő genetikai információkat kaphatunk, például az átültetések kilökődéséért felelős antigének jelenlétéről vagy a rák és az onkogének vizsgálata esetén, illetve a törvényszéki orvostanban alkalmazott genetikai információkról.
A szondadiagnosztizálások elméletileg olyan kisméretű részecskék kimutatására alkalmasak, amekkora egy molekula a vizsgálandó mintában. A szondadiagnosztizálások teljes hatékonysága elérésénél a legfőbb akadály az, hogy a vizsgálandó mintában a célszekvencia csak rendkívül kis mennyiségben detektálható. Ennek következtében a szondadiagnosztizálások javítására irányuló törekvések középpontjában a cél-nukleinsavszekvencia amplifikálásának eljárása áll. A célszekvencia amplifikálása számos ismert eljárással történhet, így például az adott DNS vagy RNS cél-nukleinsavszekvencia ismételt előállításával vagy replikációjával, mely az alkalmazott eljárástól függően lineáris vagy exponenciális amplifikációt eredményez.
Korábban általában a cél-nukleinsavszekvencia megfelelő gazdasejtbe klónozásával a nukleinsavszekvencia többszörös másolatát állították elő. Ezek az eljárások hagyotúányos klónozási módszereket alkalmaznak, melyekben a kívánt nukleinsavat megfelelő vektorba illesztették, majd ezt alkalmazták a gazda transzformálására. Amikor a gazda a tenyészetben növekedett, a vektor replikálódott, és így a kívánt nukleinsav szekvenciájáról további másolatok készültek. A vektorba illesztett célnukleinsavszekvencia természetes eredetű vagy szintetikus lehet. Másképpen megfogalmazva, a kívánt cél-nukleinsavszekvenciát in vitro megszintetizáljuk, majd vektorba illesztjük, mely az amplifikáció során növekszik, lásd 4.293.652 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.
A 4.683.195 és a 4.683.202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások automatikusan működő eljárásokat ismertetnek a vizsgálandó mintában jelen lévő cél-nukleinsavszekvencia mennyiségi amplifikálása céljából, melyekre általánosan mint polimerázláncreakcióra (PCR) hivatkoznak. A PCR-amplifikáció két oligonukleotidprimert alkalmaz, melyek a célszekvencia egy szakasza ellentétes szálainak különböző részei végződésével komplementerek. Az említett primereknek a célszekvenciákhoz történő hibridizációja során a kapott, a nukleinsav-célszekvenciával komplementer termékek DNS-polimeráz jelenlétében és nukleozid-trifoszfátok feleslege mellett jönnek létre. A primerek a polimeráz hatására úgy orientálódnak, hogy a DNS-szintézis a két primer területén keresztül halad. Ezután a hibridizált terméket denaturáljuk a célszekvenciáról, és a ciklust úgy ismételjük meg, hogy a megsokszorozás eredményeképpen kapott termék a következő amplifikációs ciklusok során a megsokszorozások templátjaként szerepel. A ciklusokat addig folytatjuk, amíg elegendő mennyiségű, a mérések során mérhető jelet eredményező cél-nukleinsavszekvenciát kapunk. A sikeresen végrehajtott ciklusok elméletileg megkétszerezik az előző ciklusban szintetizált nukleinsav mennyiségét, és ennek eredményeképpen az amplifikált termék exponenciálisan felhalmozódik.
A WO 89/02649 számú nemzetközi közzétételi irat más típusú automatikusan működő eljárást ismertet. Az ilyen típusú amplifikációs eljárásokban az előre szintetizált amplifikációs szondapárok (amplification probe pairs) a célszekvencia megfelelő részével határosán hibridizálódnak. Ezután a határos végeket ligáljuk, és így megkapjuk a komplementer amplifikációs terméket. A ligálás után a kész amplifikációs terméket hődenaturálással szeparáljuk a célszekvenciától. Ezután az eljárást megismételjük, mégpedig úgy, hogy mind a célszekvencia, mind a keletkező amplifikációs termék a következő ciklus szondájának a templátjaként szerepel, amíg elegendő mennyiségű, a mérések során mérhető jelet eredményező cél-nukleinsavszekvenciát kapunk. A PCR-hez hasonlóan a sikeresen végrehajtott ciklusok elméletileg megkétszerezik az előző ciklusban szintetizált nukleinsav mennyiségét. Az előre szintetizált amplifikációs szondákat alkalmazó amplifikációs eljárásokra általánosan mint ligáz-láncreakcióra (ligásé chain reaction; LCR) hivatkozunk, bár a szondák ligálását mást módon is elérhetjük, így például kémiai vagy fotokémiai ligálással.
HU 218 095 Β
Bár a nukleinsavamplifikációs eljárások azáltal forradalmasították a szondadiagnosztikát, hogy lehetővé tették a mintában rendkívül kis mennyiségben jelen lévő nukleinsavszekvenciák detektálását, ugyanakkor alkalmazásuk esetén a rutin diagnosztizálási eljárásokban az a probléma merült fel, hogy az átvitt szennyeződés hatására hibás pozitív eredmények jelentek meg. A nukleinsavanalitikumok ismételt amplifikációja során azok koncentrációja több millió- vagy billiószorosára dúsul fel a vizsgálandó mintában, ami az amplifikálandó célszekvenciát tartalmazó mintákból kapott új mintákban tovább fokozza az átvitt szennyeződést. így viszont a következő vizsgálandó mintákban mesterségesen magas jeleket kapunk, a negatív minták szennyezettsége következében hibás pozitív eredményekkel.
Az átvitt szennyeződés a mintáról mintára történő mechanikus szennyeződések, valamint a légúti szennyeződések következtében fordul elő. A légúti szennyeződések elkerülhetetlenek az olyan helyeken, ahol a vizsgálandó amplifikációs termékeket tartalmazó edények valamilyen okból kifolyólag, például a reagensek adagolása vagy az amplifikált analitikum detektálás céljából történő mintavétele miatt nyitottak. Ez a művelet maga az amplifikációs termékek millióit juttathatja a levegőbe, és így molekulák százaival fertőzi meg a laboratórium munkaterét. Eddig lehetetlennek tűnt a légúti kapcsolat következtében megjelenő más fajok elleni teljes védekezés, ami a kezelést végző egyének figyelmetlenségéből adódhatott.
Az alábbi eljárások a célszekvenciák amplifikálása során fellépő szennyeződést problémákhoz kapcsolódnak, és bár a PCR típusú amplifikációs eljárásokhoz kapcsolódnak, más típusú amplifikációs eljárások esetén is általánosan alkalmazhatók: (1) az előre amplifikált és utólag amplifikált minták fizikai elválasztása (például a térben történő elválasztás); (2) a reagensek elkülönített tárolása és alikvot mennyiségek létrehozása; (3) pozitív mozgású (positive displacement) pipetták alkalmazása; (4) gondosan kivitelezett laboratóriumi eljárások; és (5) a kontrollok körültekintő elválasztása, Amplifications - A fórum fór PCR users, 2, 4 (1989). Ezek a mérések azonban, bár költségesek, a legideálisabb mérési körülményeket biztosítják. Továbbá, bár az említett költséges eljárások kivitelezése igényes munkát követel, a fenti elővigyázatosságok sem zárják ki teljes mértékben a szennyeződésekből adódó problémákat. Továbbra is maradnak nehézségek, így például a laboratóriumi dolgozók testükön és ruhájukon állandóan hordozzák a szennyeződést, valamint a szennyezett levegő a légáramlások következtében helyiségről helyiségre áramlik, Kitchin, Natúré, 344, 201 (1990).
A reagensek ultraviola fénnyel történő kezelését javasolják a PCR típusú amplifikációs eljárások amplifikációs termékeinek ellenőrzése céljából. Ezt a javaslatot az ultraviola fénynek azon képességére alapozták, mely szerint az képes a DNS-t teljes egészében elpusztítani. Bár a reakció hatásmechanizmusa ismeretlen, bemutatták, hogy a PCR típusú amplifikációs eljárások szennyező amplifikációs terméke pufferekben, valamint primer, dNTP és Taq polimerázkészítményben, ultraviola fénnyel történő besugárzás hatására elpusztul, Sarkar és társai, Natúré, 343, 27 (1990). Bár az egyszálü PCR-primerek az említett kezelést látszólag túlélik, a kétszálú LCR-szondák a sugárzásos kezeléssel szemben hasonlóképpen érzékenyek és elpusztulnak. Továbbá az ultraviola fénnyel történő sugárzásos kezelést nem alkalmazhatjuk a még meg nem mért mintákban, mivel ez a kétszálú célmolekula pusztulását eredményezné.
A találmány tárgya egy hatásos eljárás, amely a diagnosztikai mérések során alkalmazott amplifikációs eljárások során felmerülő átvitt szennyeződések jelentős lecsökkentését eredményezi. A találmány tárgya továbbá egy egyszerűen végrehajtható és számos más amplifikációs eljárásra adaptálható szennyeződést lecsökkentő eljárás biztosítása.
A találmány összefoglalása
A jelen találmány hatásos és gazdaságos eljárást biztosít az amplifikációs eljárások amplifikációs termékei szennyeződésének lecsökkentésére. A találmány szerinti eljárás kivitelezése az amplifikációs termék olyan módosításával történik, melynek eredményeképpen a módosított amplifikációs termék a célszekvenciától megkülönböztethetővé válik. Mielőtt a vizsgálandó új mintában amplifikálnánk a cél-nukleinsavszekvenciát, a vizsgálandó új mintát megfelelő módon kezeljük, és így a módosított szennyező amplifikációs terméket szelektíven eltávolítjuk, elpusztítjuk vagy más módon tesszük életképtelenné úgy, hogy a következő amplifikációs eljárás során ne tudjon amplifikálódni. Az ilyen módon elvégzett kezelések az átmeneti szennyeződés és az ilyen típusú szennyezés által okozott hibás pozitivok lecsökkentését eredményezik anélkül, hogy a természetes eredetű célszekvencia szintjét jelentős mértékben léc sokkén tenék.
Az ábrák rövid ismertetése
1. ábra
Egy LCR eredetű amplifikációs termék ligandummódosítását, majd a módosított amplifikációs termék immobilizált, specifikusan kapcsolódó partnerrel történő eltávolítását bemutató ábra.
2. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs termék ligandummódosítását, majd a módosított amplifikációs termék immobilizált, specifikusan kapcsolódó partnerrel történő eltávolítását bemutató ábra.
3. ábra
Egy LCR eredetű amplifikációs termék keresztkötéses szer alkalmazásával kialakított módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő irreverzíbilis keresztkötéseinek kialakítását bemutató ábra.
4. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs termék keresztkötéses szer alkalmazásával kialakított módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő irreverzíbilis keresztkötéseinek kialakítását bemutató ábra.
5. ábra
Egy LCR eredetű amplifikációs termék restrikciós helyének módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő, restrikciós enzimmel történő hasítását bemutató ábra.
HU 218 095 Β
6. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs termék restrikciós hellyel történő módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő, restrikciós enzimmel történő hasítását bemutató ábra.
7. ábra
Egy restrikciós enzimmel elhasított, módosított, PCR eredetű amplifikációs termék restrikciós helye egy részének részleges indítását (partial priming) bemutató ábra.
8. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs termék restrikciós hellyel történő módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő, távol hasító restrikciós enzimmel (remote cutting restriction enzyme) történő hasítását bemutató ábra.
9. ábra
Egy LCR eredetű amplifikációs termék restrikciós hellyel történő módosítását, majd a módosított amplifikációs termék soron következő, távol hasító restrikciós enzimmel (remote cutting restriction enzyme) történő hasítását bemutató ábra.
10. ábra
Kémiai úton hasító helyet tartalmazó oligonukleotid amplifikációs szonda vagy primer előállítását bemutató ábra.
11. ábra
Az amplifikációs szekvenciát, az amplifikációs szondát, a keletkező amplifikációs terméket és az 1., illetve a 2. példa szerinti szonda detektálását mutatja be.
12. ábra
A célszekvencia és a módosított amplifikációs termék restrikciós enzimmel történő kezelése után kapott célszekvencia és a restrikciós enzimmel módosított amplifikációs termék amplifikációjának arányos hatékonyságát bemutató autoradiográfia fényképe.
13. ábra
A 3. példában a távol hasító restrikciós enzimek (remote cutting restriction enzymes) kiértékelése céljából alkalmazásra kerülő többértékű DNS-t (polysite DNA) mutatja be.
14. ábra
A különböző távol hasító restrikciós enzimek (remote cutting restriction enzymes) hasításának arányos hatékonyságát bemutató fénykép és autoradiográfia a többértékű DNS-re vonatkoztatva.
15. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs tennék kétértékű restrikciós helyének módosítását, majd a módosított amplifikációs tennék soron következő, távol hasító restrikciós enzimmel (remote cutting restriction enzyme) történő hasítását bemutató ábra.
16. ábra
Egy, a módosított és a nem módosított PCR eredetű amplifikációs primemek megfelelő, 147 bázispárból álló amplifikációs szekvenciát (beleértve a pUC 9-et) és egy, a 4. példában bemutatásra kerülő detektálási prímért bemutató ábra.
17. ábra
Módosított és nem módosított primereket alkalmazó PCR-amplifikáció arányos hatékonyságát, valamint a kezelt módosított amplifikációs terméknek a következő amplifikációban primerként történő alkalmazásra való alkalmatlanságát bemutató fénykép és autoradiográfia.
18. ábra
Egy PCR eredetű amplifikációs terméknek a 4. példában bemutatásra kerülő, megfelelő hasítószerrel való kezeléssel kapott, hatásos elpusztítását bemutató autoradiográfia fényképe.
19. ábra
Két távol hasító restrikciós enzimet tartalmazó, PCR eredetű amplifikációs termék egyszeres és kétszeres hasítása eredményeképpen kapott terméket bemutató ábra.
20. ábra
Egy, az 5. példában bemutatásra kerülő, a megfelelő módosított amplifikációs primemek megfelelő, 162 bázispárból álló HIV-amplifikációs szekvenciát bemutató ábra.
21. ábra
Egy, az 5A. példában bemutatásra kerülő módosított amplifikációs termék képződését és mennyiségi meghatározását bemutató ábra.
22. ábra
Egy, az 5B. példában bemutatásra kerülő, PCR eredetű amplifikációs termék átvitt szennyeződésének hatásos preamplifikációs elpusztítását bemutató autoradiográfia fényképe.
23. ábra
Egy, a 6. példában alkalmazásra kerülő 75 bázispárból álló HIV-amplifikációs szekvenciát, két ribonukleotidmódosítású PCR eredetű amplifikációs szekvenciát és egy detektálási prímért bemutató ábra.
24. ábra
Egy, a megfelelő 3’-végen egyszeri ribonukleotidszubsztitúciót tartalmazó PCR-primert alkalmazó PCRamplifikációt bemutató autoradiográfia fényképe.
25. ábra
Egy, a 6A. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású PCR eredetű amplifikációs termék standarddal történő összehasonlításának mennyiségi értékelését bemutató autoradiográfia fényképe.
26. ábra
Egy, a 6B. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású PCR eredetű amplifikációs tennék RNáz A hasítószer alkalmazásával történő teljes elpusztítását bemutató autoradiográfia fényképe.
27. ábra
Egy, a 6C. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású, PCR eredetű amplifikációs termék erős bázissal mint hasítószerrel történő hatásos preamplifikációs elpusztítását bemutató autoradiográfia fényképe.
28. ábra
Egy, a 7. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású, LCR eredetű amplifikációs termék létrehozásához alkalmazott, 45 bázispárból álló HlV-amplifikációs szekvenciát és a megfelelő ribonukleotidmódosítású amplifikációs szondát bemutató ábra.
29. ábra
Egy, a 7A. példában bemutatásra kerülő, a megfelelő 3’-végeken egyszeri ribonukleotidszubsztitúciót tartalmazó amplifikációs szondákat alkalmazó LCR-amplifikációt bemutató autoradiográfia fényképe.
HU 218 095 Β
30. ábra
Egy, a 7A. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású, LCR eredetű amplifikációs termék standardokkal történő összehasonlításának mennyiségi értékelését bemutató autoradiográfía fényképe.
31. ábra
Egy, a 7B. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású, LCR eredetű amplifikációs termék erős bázissal mint hasítószerrel történő hatásos preamplifikációs elpusztítását bemutató autoradiográfía fényképe.
32. ábra
Egy, a 7C. példában bemutatásra kerülő, ribonukleotidmódosítású, LCR eredetű amplifikációs termék RN-áz A hasítószer alkalmazásával történő teljes elpusztítását bemutató autoradiográfía fényképe.
A találmány részletes ismertetése
A jelen találmány az amplifikációs termékben - legalább egy módosítás végrehajtásával - a szennyező amplifikációs termékek által okozott háttér csökkentését, illetve megszüntetését teszi lehetővé. A vizsgálandó mintában módosított amplifikációs terméket könnyen megkülönböztethetjük a célszekvenciától és ezáltal szelektíven eltávolíthatjuk abból.
A találmány jobb megértése céljából az alábbiakban ismertetjük az alkalmazott definíciókat és kifejezéseket.
Az amplifikáció a vizsgálandó mintában lévő nukleinsav-célszekvencia másolatai számának növelését jelenti. Az amplifikáció során létrehozott másolatok pontos (exact) másolatok vagy komplementer másolatok lehetnek. Továbbá a másolatokat kontrollszennyeződés előállítása céljából módosíthatjuk. Az amplifikáció kivitelezése lineáris vagy exponenciális módon, azaz a lineáris amplifikációnál nagyobb arányban történhet.
A nukleinsavszekvencia egy dezoxiribonukleotid vagy egy ribonukleotid lehet, melyet az alábbiak figyelembevételével módosíthatunk: (1) a foszfátváz, (2) a nukleozid és/vagy (3) az oligonukleotid cukorrésze. A nukleinsavszekvencia-jelzéseket vagy más kapcsolódó részeket tartalmazhat, és más részek jelenléte által lehet megszakítva, valamint hibridizációja fordulhat elő.
A célszekvencia egy, a speciális mérés során keresett nukleotidszekvencia.
Az amplifikációs szekvencia egy hosszú, jelzett célszekvencia, mely az amplifikációs eljárás kezdetén mint templátszekvencia szerepel. Az amplifikációs szekvencia a célszekvencia teljes hosszát vagy annak egy jellemző részét tartalmazhatja.
A templátszekvencia egy olyan nukleinsavszekvencia, melyen az amplifikációs termék képződik. Az amplifikáció első ciklusában templátszekvenciaként az amplifikációs szekvencia szerepel. Az amplifikáció következő ciklusai során templátszekvenciaként az amplifikációs termékek szerepelnek.
Az amplifikációs szonda egy nukleinsavszekvencia, mely : (1) a kétszálú amplifikációs szekvencia egy szála valamelyik részével komplementer; vagy (2) egy egyszálú amplifikációs szekvencia egy részével azonos vagy komplementer. Az amplifikációs szondák elég közel hibridizálódnak az amplifikációs szekvenciához, és így lehetővé válik a szondák összekapcsolódása. Az amplifikációs szonda a másik amplifikációs szondával való összekapcsolódás céljából egyik vagy mindkét végén módosított, illetve nem módosított lehet. Továbbá az amplifikációs szonda a szennyezés ellenőrzése céljából valamilyen módon módosítva lehet, illetve nem módosított lehet.
Az amplifikációs primer az itt alkalmazottak szerint egy, az amplifikációs szekvencia végső részével komplementer nukleinsavszekvenciára vonatkozik, mely képes egy, az amplifikációs szekvenciával komplementer primer kiterjesztési termék szintézisének kiindulási pontjaként szerepelni. A primer kiterjesztési terméket nukleotidok és egy, a polimerizáció céljára alkalmas anyag, például DNS-polimeráz jelenlétében képezzük. Az amplifikációs primer a szennyezés ellenőrzése céljából nem lehet módosítva.
A preszintetizált szonda vagy primer az itt alkalmazottak szerint egy oligonukleotidszekvenciát jelöl, melyet a vizsgálandó mintát tartalmazó reakcióelegybe történő bevitel előtt szintetizáltunk meg.
Az amplifikációs primer kiterjesztési vége egy amplifikációs primer végét jelenti, mely egy polimeráz hatására kiterjesztett terméket hoz létre. A kiterjesztési vég 3’-vég lehet.
Az amplifikációs termék egy amplifikációs szekvencia hasonló másolatára és/vagy komplementer másolatára vonatkozik. Az amplifikációs terméket egy amplifikációs eljárás során in situ szintetizálhatjuk meg. Az amplifikációs tennék a ligáit nukleinsavszekvencia lehet, mely az amplifikációs szekvenciához szomszédosán (contiguously) hibridizált amplifikációs termékek sorozatának ligálása során keletkezik. Az amplifikációs termék egy polimeráz-láncreakció kiterjesztési terméke lehet. Az amplifikációs termék kifejezés a módosított amplifikációs terméket is magában foglalja.
A módosított amplifikációs termék az itt alkalmazottak szerint legalább egy módosítási helyet tartalmazó amplifikációs termékre vonatkozik.
A módosítási hely olyan lokáció, melyben az amplifikációs termék szennyeződésének ellenőrzése céljából valamilyen változtatást hajtottunk végre. A módosítási hely az enzimfelismerési hely céljából korlátozások nélkül ligandumbevitelt, keresztkötéses anyag vagy kémiailag hasítható hely bevitelét, valamint báziscseréket tartalmazhat.
A szennyező amplifikációs termék egy olyan amplifikációs termék, mely a vizsgálandó mintában eredetileg jelen lévő amplifikációs szekvencia amplifikációjától eltérő úton kerül be. A szennyező amplifikációs termék például az előzőleg amplifikált mintából vagy mintákból származó vizsgálandó minta amplifikációs tennékéből származó átmeneti mechanikai szennyezés vagy átmeneti légúti szennyezés következménye lehet.
A komplementaritás olyan mértékű komplementaritásra vonatkozik, mely a hibridizációt lehetővé teszi.
A szubsztanciálisan komplementer (substantially complementary) kifejezés az olyan komplementaritásra vonatkozik, melynek esetén legalább egy bázis hibásan illeszkedik.
HU 218 095 Β
A pszeudorestrikciós hely egy nukleinsav-gyökszekvencia, ahol legalább egy nukleotid megváltoztatása esetén egy restrikciósenzim-felismerési helyet kapunk. A pszeudorestrikciós hely, melyet a restrikciós enzim nem hasít el, a változatlanul meg nem változott szekvenciát jelzi. Bár alkalmaztuk a „módosítás” kifejezést, a pszeudorestrikciós hely természetes eredetű, és érzékelhetjük, hogy minden olyan nukleotidszekvencia, mely nem mutat restrikciós helyet, egy pszeudorestrikciós hely lesz.
Az előnyben részesített pszeudorestrikciós hely egy olyan pszeudorestrikciós hely, amelynek esetén csak egy bázist kell módosítani ahhoz, hogy enzimfelismerési helyet kapjunk.
A felismerési hely az itt alkalmazottak szerint egy enzimet, például restrikciós endonukleázt vagy RN-áz által felismert speciális szekvenciát jelez.
Az enzimhasítási hely foszfodiészterkötést jelöl, melyet egy enzim, például a restrikciós endonukleáz vagy az RN-áz elhidrolizál.
A távol hasító restrikciós endonukleázok (remote cutting restriction endonuclease) vagy távol hasító (remote cutter) enzimek egy, a kétszálú DNS-t az enzimfelismerési hely külső részén elhasító restrikciós endonukleázok.
A jelen találmány a szennyező termék által okozott átvitt szennyezés ellenőrzésére szolgál. A módosított amplifikációs terméket az amplifikációs eljárás részeként hozzuk létre, mégpedig úgy, hogy az amplifikációs termékbe legalább egy módosítási helyet viszünk be, melynek eredményeképpen a módosított amplifikációs termék a célszekvenciától megkülönböztethetővé válik. Ennek a módosításnak az eredményeképpen a módosított szennyező amplifikációs terméket szelektíven eltávolítjuk, elpusztítjuk vagy más módon tesszük életképtelenné úgy, hogy a következő amplifikációs eljárás során ne tudjon amplifikálódni. A módosított amplifikációs termék szelektív kizárása természetesen az amplifikációs termékbe bevitt speciális módosításra való tekintettel változhat.
A találmány szerinti szennyezőkontroll bevitele a vizsgálandó minta preamplifikációs kezelésével, posztamplifikációs kezelésével, illetve a pre- és posztamplifikációs kezelés kombinálásával történhet. A posztamplifikációs kezelés esetén a módosított amplifikációs terméket az amplifikációs eljárás után szelektíven kizárjuk a vizsgálandó amplifikált mintából. Ez az eljárás hatásosan kizárja a módosított termék elterjedését a laboratóriumban, ahol az megszennyezheti az új mintákat, és így hibás pozitív eredményeket okozhat. Ugyanakkor a posztamplifikációs kezelés nem tudja teljes mértékben kizárni a szennyeződésből adódó problémát, mivel a reagensek (például a hasítószerek) nyitott reakciótérben történő adagolása során kialakuló légúti szennyeződés továbbra is előfordulhat.
A legtöbb esetben azonban előfordulhat, és ez tulajdonképpen előnyös, hogy az új vizsgálandó mintát előkezeljük, és így szelektíven kizárjuk a szennyező módosított amplifikációs terméket az új vizsgálandó minta amplifikálása előtt. A preamplifikációs kezelés esetén a módosított amplifikációs termék az új vizsgálandó mintát megszennyezheti a szennyező amplifikációs termékkel, melyet magából az új vizsgálandó mintából tökéletes mértékben eltávolítunk vagy abban elpusztítjuk. Amennyiben az amplifikálóreagensek (például az amplifikációs szondák vagy primerek) a szennyező amplifikációs termék szelektív kizárása céljából alkalmazott anyag által történő elpusztításra alkalmasak, szükségessé válik az amplifikálóreagenseknek a vizsgálandó minta preamplifikációs kezelés után történő adagolása. Ugyanakkor, ha az amplifikálóreagensek ellenállók a szennyező termék szelektív kizárása céljából alkalmazott anyagokkal szemben (például ahol távol hasító restrikciósenzim-felismerő módosítási helyeket vagy ribonukleotidszubsztitúciókat alkalmazunk), a pusztítószert közvetlenül az amplifikáció előtt alkalmazhatjuk; azaz azután, hogy minden szükséges reagenst a vizsgálandó mintához adtunk, így biztosítva a legerősebb mértékű szennyezőkontrollt.
A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az átvitt szennyeződés hatásos, megbízható és gazdaságos módon történő ellenőrzését. Ez különösen fontos a diagnosztikai sorozatok esetén, amikor az amplifikációs eljárás kivitelezése rutinból történik. Az ilyen típusú mérési sorozatokban ugyanazt az analitikumot állandóan újra és újra amplifikáljuk, így egyre erősebb mértékben fokozódik az új mintának az amplifikációs termék által létrejött szennyeződése. A legfőbb problémát a szennyeződések szempontjából a speciális analitikum mérésének növekvő időtartama jelenti. így például egy 100 μΐ-es mintából 1 μΐ-nyi mennyiség felszívása, amit 100 femtomól amplifikációs termékké amplifikálunk, a célszekvencia másolatát 600 millió példányban bocsátja ki a levegőbe. Amennyiben ez egy általános munkakörnyezetben diszpergálódik, a munkatérbe a szennyező amplifikációs termékből megközelítőleg 200 000 molekula kerül ki m’-enként.
A jelen találmány szerint a megoldás az áthurcolt szennyezésre nem igényel aprólékos és bonyolult lépéseket. így például a jelen találmány alkalmazása során az amplifikálás végrehajtása és az új minta detektálása céljából nem szükséges külön helyiségeket alkalmazni. Hasonlóképpen nem szükséges az egyszer használatos ruhák, a pozitív mozgású (positive displacement) pipetták és a speciális, egyszer használatos vezetékek, valamint mintakezelő eszközök alkalmazása. A találmány szerinti eljárás kevés változtatást igényel és nem jár korlátozásokkal, így például az amplifikációs eljárás során alkalmazott standardok mennyiségének korlátozásával. A találmány szerinti eljárás a megfelelő szakmai gyakorlattal rendelkezők részére számos más előnyt is nyújt.
A találmány szerinti eljárás az amplifikációs eljárások során létrehozott amplifikációs termékek számos módosítási típusát tartalmazza. Egy speciális amplifikáció szelekciója esetén fontos, hogy a módosítás a következő vizsgálandó mintában futó célszekvenciától megkülönböztethető és/vagy szeparálható vagy elpusztítható amplifikációs terméket biztosítson. így a szennyező amplifikációs terméket eltávolítjuk, elpusztítjuk vagy
HU 218 095 Β más módon tesszük életképtelenné úgy, hogy az új vizsgálandó minta célszekvenciájának amplifikációja során ne működhessen amplifikálótemplátként.
A találmány szerinti módosítások típusai a szennyezett amplifikációs termékek megkülönböztetésére alkalmazhatók. Ezek a módosítások az alábbiak lehetnek: ligandum bevitele, enzimfelismerési hely bevitele (beleértve a restrikciósenzim-felismerési helyet) vagy egyéb megfelelő hasítási hely bevitele. A találmány szerinti módosítások némelyike több limitáló tényezőt tartalmaz, mint a többi, amit a továbbiakban részletesen kifejtünk. Ennek következtében a speciális analitikum jellemzőitől függően a módosítások egyes esetekben előnyösebbek. Egy adott mérés során az amplifikációs termék előnyös módosítását az amplifikálandó analitikum jellemző tulajdonságaira és a találmány eljárására alapozhatjuk.
A módosítás végrehajtása előnyös esetben egy, a választott módosítási helyet tartalmazó, előre szintetizált amplifikációs primer vagy szonda alkalmazásával történhet. Az ilyen módosított primerrel vagy szondával történő amplifikáció viszont a kész amplifikációs termék(ek)be viszi be a módosítás(oka)t. Az amplifikációs primerek vagy szondák módosítását számos, a szakmában jól ismert eljárás alkalmazásával hajthatjuk végre. Ligandumok esetén vagy más, hasonló típusú módosítások esetén a módosítást a kész oligonukleotidszondán vagy -primeren az oligonukleotid szintézise után hajthatjuk végre. Enzimfelismerési helyek esetén a módosítás(oka)t egyszerűen hajthatjuk végre, mégpedig a szintézis során az oligonukleotidszondába vagy -primerbe szubsztituálva. A PCR esetén a célszekvencia polimerázzal történő amplifikálása is lehetséges egy vagy több módosított nukleozid-trifoszfát jelenlétében, így létrehozva az amplifikációs terméket. [Lásd például Langer és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78(11), 6633-6637 (1981).]
Az amplifikációs termékbe bevitt módosítások száma változó lehet, általában egy hely szükséges a szennyezés szignifikáns csökkentése céljából. A legtöbb esetben tulajdonképpen csak egy módosítási hely bevitele előnyös az amplifikáció hatékonyságának várt lecsökkentése érdekében, ami például a szterikus gátlás (amit nagy kiterjedésű rész bevitele okozhat), a hibridizáció zavarása (amit a komplementer nukleotidok közötti hidrogénkötések felszakadása okozhat), vagy a célszekvenciával komplementer amplifikációs primerek vagy szondák hiánya (amit restrikciósenzim-felismerési helyek bevitele okozhat) következtében léphet fel. Ez utóbbi esetben azonban a ciklus hatékonyságának lecsökkenése elsősorban az első amplifikációs ciklusban történik, ahol csak egy amplifikációs szekvencia rendelkezik a templátul szolgáló módosított szondá(k)nak vagy primer(ek)nek megfelelő komplementaritással. így a hatékonyság előre várt értéke a templátként szolgáló (és a szondákkal vagy a primerekkel teljesen komplementer) amplifikációs termék relatív mennyiségével arányosan fog lecsökkenni.
Amennyiben az amplifikáció végső ciklusa után az amplifikációs termék nem denaturálódott, csak egy amplifikációs szondát vagy prímért szükséges módosítani. Ebben az esetben a keletkező módosított amplifikációs termék kétszálú lesz, így lehetővé teszi, hogy az egyik szálba bevitt módosítás útján mindkét szálat eltávolítsuk vagy elpusztítsuk. Ugyanakkor amennyiben a vizsgálandó minta reakcióelegyét a végső amplifikációs ciklus után denaturáló lépésnek vetjük alá, minden amplifikációs primer és legalább két ellentétes szálú amplifikációs szonda [azaz a szondapár alsó („lower”) és felső („upper”) szálai] módosított állapotú kell, hogy legyen, így biztosítva, hogy a következő hibridizációs lépésig minden szennyező amplifikációs termék működésképtelenné alakulhasson.
Amikor a ligandumot bevittük az amplifikációs termékbe, a keletkező ligandummódosítású amplifikációs terméket szelektíven eltávolíthatjuk ügy, hogy a módosított amplifikációs terméket tartalmazó vizsgálandó mintát immobilizált, a ligandumra nézve specifikus kötőpartnerrel hozzuk érintkezésbe. Ezután az immobilizáló hordozót a ligandum és a módosított amplifikációs termék kötése mentén eltávolítjuk. Amennyiben az új vizsgálandó mintán szelektív kizárást végzünk (azaz egy amplifikációs eljárás elkezdése előtt), az immobilizált, specifikus kötőpartnert kapcsolatba kell hozni az új mintával, mielőtt az amplifikációs szondát vagy az amplifikációs prímért az új vizsgálandó mintához adnánk. Amennyiben az új vizsgálandó minta reakcióelegyét ezen reagensek adagolása után adjuk a rendszerhez, a reagensekben lévő módosított szondák vagy primerek a szennyezett amplifikációs termék jelenléte mellett az oldatban legyengült állapotban vannak.
Előnyös esetben a módosítás során bevitt ligandum egy specifikus kötőpár kisebb tagja és mint olyan, minimálisra csökkenti az amplifikáció hatékonyságát, amit az amplifikációs primeren vagy szondán lévő ligandum jelenlétének szférikus gátlása okozhat. A biotin egy példa az előnyben részesített ligandumra. Egy másik előnyben részesített ligandum a fluoreszcein. A ligandumot a PCR esetén legalább egy amplifikációs primerbe visszük be, míg az LCR esetén legalább egy amplifikációs szondába visszük be. Az 1. ábra a ligáz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás (LCR eredetű amplifikációs reakció) során keletkező amplifikációs termék ligandummódosítását szemlélteti, majd a módosított tennék immobilizált, a ligandumra nézve specifikus kötőpartnerrel immobilizált amplifikációs termékének eltávolítását. A 2. ábra hasonló, ez egy polimeráz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás (PCR eredetű amplifikációs eljárás) során keletkező amplifikációs terméket ábrázol. A keletkező, biotinnal, illetve fluoreszceinnel módosított amplifikációs terméket a következő mintából a minta immobilizált avidinnal, illetve antifluoreszceinnel való kontaktusa alkalmazásával választhatjuk el.
A találmány szerinti eljárásban a ligandummódosítás megvalósítása során az amplifikációs primer(eke)t vagy szondá(ka)t a primeren vagy a szondán előnyös módosítani, ami nem zavarja az amplifikációs eljárás során alkalmazott enzim vagy egyéb reagens hatását; így például polimeráz a PCR típusú amplifikációs eljárások esetén és ligáz az LCR típusú amplifikációs eljá7
HU 218 095 Β rások esetén. Abban az esetben, amikor a PCR típusú amplifikációs eljárás során a polimeráz leolvasása a módosított helyen keresztül történik, az amplifikációs prímért inkább a módosítási helyen vagy annak környékén módosítjuk, mint a primerkiterjesztés végén. Ugyanakkor amennyiben a polimeráz leolvasása a módosított helyen keresztül történik, a PCR-primert annak 5’-végén módosítjuk.
Mivel az LCR típusú amplifikációs eljárások nem alkalmaznak polimerázt, az enzimleolvasás korlátái nincsenek kapcsolatban az amplifikációs szondák ligandummódosítási helyeivel. Az LCR esetén az amplifikációs szondát általában előnyösebb a lokációs helyen módosítani, mint a szomszédos végeken. Az amplifikációs szondák esetén, melyek az amplifikációs terméken végső részt (end segment) képeznek, lehetséges azoknak a nem ligáló végen történő módosítása. Másképpen, előnyös esetben minden amplifikációs szondát annak központi része környékén célszerű módosítani.
Az amplifikációs szondákat vagy primereket előnyös esetben fluoreszcein vagy biotin ligandummal módosíthatjuk, a szakmában általánosan ismert eljárások alkalmazásával. így például az oligonukleotidszondákat vagy -primereket a ligandummal kétlépéses eljárással módosíthatjuk, ahol az oligonukleotid szintézise során először egy amincsoportot viszünk be. Ezután az összekapcsolás, az oxidálás, a védettség megszüntetése (deprotection) és a szintézis során alkalmazott hordozó oligoamin-primerjének vagy -szondájának eltávolítása következik, és így megkapjuk a ligandumot.
A szennyező amplifikációs termék átmeneti szennyeződésének ellenőrzésére alkalmas másik eljárás során az amplifikációs eljárás során alkalmazott amplifikációs szondák vagy primerek közül legalább egybe keresztkötéses anyagot viszünk be. A kapott módosított termékben lévő keresztkötéses anyagot kémiai vagy fotokémiai úton aktiválhatjuk, így a módosított amplifikációs termék és a komplementer nukleinsavszál között kovalens keresztkötést hozunk létre. A komplementer nukleinsavszálak komplementer módosított vagy nem módosított amplifikációs termékből származhatnak vagy denaturált, módosított amplifikációs termék esetén carrier DNS formájában lehetnek. Az utóbbi esetben azonban a keletkező amplifikációs tennék szelektív kizárása érdekében az amplifikációs termék mindegyik szálát módosítani kell.
Az irreverzibilis kereszkötésekkel módosított amplifikációs termék a módosított amplifikációs terméket a további amplifikációra nézve semlegessé teszi úgy, hogy ettől a ponttól kezdve meggátolja a módosított komplementer amplifikációs termék teljes denaturálódását. Egyes esetekben a vizsgálandó új minta megfelelő keresztkötéses szerként alkalmazott aktivátonal történő kezelése hatására fennáll a vizsgálandó új minta cél nukleinsavszekvenciája károsodásának veszélye. Ezt a veszélyt elkerülhetjük, amennyiben a fény abszorbeálására létrehozott fotokeresztkötéses csoportok kialakítása során alkalmazott hullámhossz nem káros a nukleinsav-célszekvenciára nézve. Az új vizsgálandó minta kezelését az új amplifikációs szondareagens jelenlétében kell végrehajtani, így az új reagenssel való keresztkötések kialakulása nélkül elpusztíthatjuk a szennyező terméket.
A keresztkötéses anyagokat jól ismert eljárásokkal vihetjük be az amplifikációs próbá(k)ba vagy primer(ek)be. Egy LCR típusú amplifikációs eljárás során a keresztkötéses anyagot az amplifikációs szonda közepén célszerű elhelyezni, így a keresztkötéses anyag a keletkező amplifikációs termék középső részéhez közelebb helyezkedik el, mint ez gyakorlatilag lehetséges. Tekintettel a keresztkötéses anyagot hordozó amplifikációs szondára, a keresztkötéses anyagot előnyös a szonda középső részén elhelyezni, mivel így nem zavatja a végeknek és a módosított szondának a kapcsolódását vagy ligálását. A fentieket a 3. ábra szemlélteti, ahol a keresztkötéses módosítás bevitele az amplifikációs szonda három pár sorozata szondáinak középső párja egyikének amplifikációs termékébe történik.
Egy PCR típusú amplifikációs eljárás során a keresztkötéses anyagot az amplifikációs primer kiterjesztett végéhez olyan közel előnyös elhelyezni, ahogyan csak lehetséges anélkül, hogy a polimerázzal jelentős zavarást okoznánk. A ligandummódosítási esethez hasonlóan, amennyiben a keresztkötéses anyag jelenléte zavarja a primerkiterjesztés során alkalmazott polimeráz leolvasását, a módosítást a primer 5’-végén előnyösebb elhelyezni. A 4. ábra a keresztkötéses módosítás bevitelét ábrázolja egy PCR eredetű amplifikációs termékbe, a közepén vagy középső részén módosított, előre szintetizált primer alkalmazásával.
Ugyanakkor az amplifikációs terméket legalább egy enzimfelismerési helynek az amplifikációs termékbe történő bevitelével előnyösebb módosítani az ellenőrző átmeneti szennyezés útján. Az enzimfelismerési helynek az amplifikációs termékbe történő bevitele módosított amplifikációs termékekkel történhet (azaz módosított amplifikációs primerekkel vagy szondákkal). Egy PCR típusú amplifikációs eljárás során az enzimfelismerési hely bevitele módosított nukleozid-trifoszfátok alkalmazásával történhet, melyek mind enzim felismerési hely, mind a polimeráz szubsztrátjai lehetnek. Az enzimfelismerési módosítási hely a keletkező amplifikációs terméket alkalmassá teszi az enzim hatására végbemenő elpusztításra, mely amplifikációs terméket szelektíven elhasítja, de a célszekvenciát, illetve az amplifikációs szekvenciát sértetlenül hagyja. Az enzimfelismerési helyekre korlátozások nélküli példák a restrikciósenzim-felismerési helyek és az RN-áz felismerési helyek.
A módosítások egyéb típusaival az amplifikációs termékben az enzimfelismerő módosítási helyek felhalmozódása érhető el. Az enzimfelismerő módosítási helyek felhalmozódása az amplifikációs termékben természetesen előnyös, mivel itt a hasítás az amplifikációs tennék teljes elpusztulását eredményezi. Abban az esetben, amikor a célszekvencia lokációja és az előnyös pszeudorestrikciós helyek száma valamilyen mértékben meghatározza az enzimfelismerési helyeket, az enzimfelismerési hely a keresett analitikumra való tekintettel fog változni. Amennyiben az amplifikációs ter8
HU 218 095 Β mék módosítására csak egy enzimfelismerési helyet módosítunk, a tökéletes pusztító hatás elérése céljából általában előnyös az enzimfelismerési helyet a teljes amplifikációs termék középső részéhez legközelebb elhelyezni.
Az enzimfelismerési hely helyközépponti elhelyezkedését sokkal könnyebben érhetjük el az LCR eredetű amplifikációs termékek esetében, mint a PCR eredetű amplifikációs termékeknél. Ennek az az oka, hogy az előre szintetizált LCR-amplifikációs szondák alkalmazásával kapott amplifikációs termék szerkezetében jobb ellenőrzés érhető el, mint amilyen az amplifikálás során az in situ szintetizáláshoz szükséges PCR eredetű amplifikációs termékek predomináns részeivel érhető el. így például a PCR eredetű amplifikációs termékek esetében általában legalább az egyszeri enzimfelismerési hely egy az amplifikációs termék amplifikációs primer egy részén kell elhelyezni inkább, mint a teljes amplifikációs termék nagy kiterjedésű központi területét mutató, a polimeráz által kiterjesztett részen valahol elhelyezkedő teljes restrikciós helyen. Ezzel szemben LCR típusú amplifikációs eljárások esetén az egyszeri enzimfelismerési helyet könnyen bevihetjük az amplifikációs termékek belsejébe.
Egy PCR eredetű amplifikációs termék egyszeri enzimfelismerési helyének elhelyezkedését további tényezők is korlátozzák. Ezek közül legfontosabb az, hogy az egyszeri enzimfelismerési módosítási hely a kész amplifikációs termék leginkább központi részén, az amplifikációs primer kiterjesztett végén helyezi el a módosítást. Mivel a primemek ez a vége a módosítás során a polimeráz hatása eredményeképpen kiterjesztési terméket képez, a lokációs helyen vagy annak környékén elhelyezkedő módosítási hely potenciálisan zavarhatja az amplifikációs terméket képző polimerázkiterjesztést és abban az esetben, amikor maga a célszekvencia a templátszekvencia, lecsökkentheti az amplifikáció hatékonyságát. Abban az esetben azonban, amikor többszörös enzimfelismerési helyekre van szükség, ezeket a többszörös módosítási helyeket a keletkező amplifikációs termék központi (polimerázkiterjesztésű) részébe vihetjük be az amplifikáció során egy vagy több módosított nukleozid-trifoszfát alkalmazásával, például ribonukleozid-trifoszfát (RN-áz) alkalmazásával a megfelelő dezoxinukleozid-trifoszfát helyett.
A jelen találmány szerinti eljárás kivitelezése céljából egy, az RN-áz által felismerhető enzimfelismerési módosítási helyet alkalmazva az amplifikációs primer vagy szonda egy részét előre megszintetizáljuk, mégpedig a DNS-bázisok helyett RNS-bázisok alkalmazásával, melyek a megmaradó amplifikációs terméket hozzák létre. Az RNS-bázisok sorozatai hosszukban olyan rövidek lehetnek, mint egy RNS-bázis (RN-áz A esetén) vagy különböző bázishosszúságúak (RN-áz H esetén) vagy az amplifikációs termék teljes hosszával rendelkezhetnek. A restrikciós enzimfelismerési helyek bevitelétől eltérően az RN-áz-felismerési helyek nem eredményezik a hatékonyság szükségszerű lecsökkenését, mivel az utóbbi esetben nem szükséges lemondani a teljes komplementaritásról. Az RNS-bázist alkalmazó szubsztitúciókkal nemcsak a teljes komplementaritást érhetjük el, hanem az RNS/DNS hibrid képződése is erőteljesebb mértékű lehet, mint a DNS/DNS hibrideké. Az RNS-bázisok sorozatának előnyös elhelyezkedése^) a szakmai gyakorlattal rendelkezők számára a találmány eljárása szerint rövid kísérletezések után világosak) lesz(nek). Általában előnyös az az eset, amikor az RNS-bázisok sorozata a módosított amplifikációs termék szelektív kizárása céljából választott speciális RNáztól függően legalább egy-három bázis hosszúságú.
Az RN-áz enzimek különböző típusait alkalmazhatjuk a módosított amplifikációs termékbe bevitt RN-áz restrikciós módosítási helyek elpusztítására. Az előnyös RN-áz az RN-áz H. Az RN-áz H specifikus az RNS/DNS hibridekre nézve és csak a duplexben lévő RNS-bázist hasítja, míg a DNS-szálat sértetlenül hagyja. Amennyiben a módosított amplifikációs termék enzimfelismerési helyének elpusztítására RN-ázt alkalmazunk, fontos, hogy az RN-áz-felismerési helyet az amplifikációs termék mindkét szálába bevigyük, továbbá hogy az RN-áz-felismerési hely az amplifikációs termék különböző helyzeteibe kerüljön. így az egyes szálakon az RN-áz-felismerési hely az amplifikációs termékkel komplementer DNS-szálon helyezkedik el, és lehetővé teszi, hogy az RN-áz H a módosított amplifikációs termékduplex mindkét szálát elhasítsa. Mivel az RN-áz H enzim nem hasítja el az RNS/RNS vagy a DNS/DNS duplexeket, az új vizsgálandó mintába átkerülő szennyező amplifikációs termék szelektíven kizáródik anélkül, hogy a módosított amplifikációs termékhez hibridizálódó DNS-célszekvencia véletlen elpusztulásától kellene tartanunk.
Más, az egyszálú RNS-re nézve specifikus, előnyben részesített RN-áz enzimek például az alábbiak: RN-áz A, RN-áz CL3, RN-áz T2 és RN-áz U2. Amennyiben ezeket az enzimeket alkalmazzuk, nem léphet fel a DNS-célszekvencia hasításának veszélye. Az RN-áz A különösképpen előnyös, mivel az egyszeri ribonukleotidszubsztitúcióra nézve specifikus.
Egy enzimfelismerési módosítási hely bevitele, amit egy restrikciósenzim-felismer, szintén lehetséges. Az amplifikációs terméken minden restrikciósenzimfelismerési módosítási hely komplementer az amplifikációs szekvencia pszeudorestrikciós helyével. A restrikciósenzim-helyeket, tekintettel a célszekvenciára, az amplifikációs termékbe minimális számú hibásan párosodó bázissal kell bevinni. Előnyös esetben a felismerési hely bevitele esetén csak egy bázist változtatunk meg; azaz így a restrikciósenzim-felismerési hely az előnyben részesített pszeudorestrikciós hellyel szemben helyezkedik el.
A speciális amplifikációs termékben a restrikciós enzim(ek) és a megfelelő restrikciósenzim-módosítási hely(ek) kiválasztását számos tényező befolyásolja, így például a költségek és az egyes restrikciós enzimek elérhetősége. Az enzim kiválasztása során fontos és előnyös a hatékonyan hasító fajták kiválasztása, tekintettel az amplifikációs eljárások során keletkező szintetikus amplifikációs termékekre. Úgy vélik, hogy az egyes restrikciós enzimek sokkal kisebb hatékonysággal hasít9
HU 218 095 Β ják a szintetikus oligonukleotidszekvenciákat, mint a vad típusúakat. A találmány leírása alapján ismertekké válnak az adott analitikumra nézve előnyös restrikciós enzim(ek).
Egy adott restrikciósenzim-módosítási helynek az amplifikációs termékbe történő bevitele előnyös esetben úgy történik, hogy először egy amplifikációs szekvenciát szelektálunk a célszekvenciából, mely legalább egy előnyös pszeudorestrikciós helyet tartalmaz. Ahol a kijelölt amplifikációs szekvencia számos előnyös pszeudorestrikciós helyet tartalmaz, több elérhető lehetőség van, tekintettel a restrikciós hely(ek) módosításának az amplifikációs terméken való elhelyezkedésére. Az amplifikációs terméken lévő restrikciósenzim-módosítási hely(ek) végső kiválasztása előtt fontos a teljes amplifikációs szekvencia ellenőrzése annak megerősítésére, hogy az amplifikációs szekvencián nincsenek természetes eredetű restrikciós helyek, melyek a módosított amplifikációs tennék szelektív hasítása céljából választott restrikciós enzimre hatást gyakorolnak. Amennyiben ilyen természetes eredetű helyek léteznek, alternatív enzimmódosítási helyet kell választani, mivel egyébként az amplifikációs szekvencia a módosított amplifikációs termék mentén elpusztul.
A restrikciós enzim általában csak a kétszálú módosított amplifikációs terméket képes elhasítani. Ezáltal a restrikciós helyen módosított amplifikációs terméket a megfelelő enzimmel való érintkezés előtt nem denaturálhatjuk. Ugyanakkor az egyes denaturáló rendszerekben szükséges az amplifikációs termék denaturálása. Amennyiben a detektálórendszer komplementer szondákat alkalmaz, amint ezt a WO 89/02649 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti, a denaturált terméket a detektálószondákba bevitt restrikciós helyekhez hasonlóan hasíthatjuk, és az így keletkező amplifikációs szonda/detektálási szonda duplex nem lesz denaturálva.
Egy LCR eredetű amplifikációs termék egyszeri restrikciósenzim-módosítási hellyel történő módosítását mutatja be az 5. ábra. Az ábra szerint az amplifikációs termék létrehozása céljából három pár szondát ligáltunk, ahol a szondák középső párját a restrikciósenzim-felismerő módosítási hely alkotta. Ez olyan LCR eredetű módosított amplifikációs terméket eredményez, mely érzékeny a módosított amplifikációs terméket megközelítőleg félbehasítással elpusztító restrikciós enzim hatására. A cél amplifikációs szekvenciája az enzim hatására nézve rezisztens és natív állapotban marad. így az új vizsgálandó mintát a szennyező amplifikációs termék eltávolítása céljából az új szondareagensek hozzáadása előtt kezelni kell, mivel a következő amplifikációs eljáráshoz szükséges módosított amplifikációs szondapárok szintén elpusztulnak.
A 6. ábra ugyanezt az egyszeri helymódosítást ábrázolja, melyet egy PCR típusú amplifikációs eljárásban alkalmazott amplifikációs primerbe vittünk be. A kapott PCR eredetű módosított amplifikációs termék ugyanarra a restrikciós enzimre érzékeny, de a kapott PCR eredetű amplifikációs tennék esetén a hasítás az amplifikációs termék egyik vége irányában történik. A PCR eredetű termék szabálytalan hasításának eredményét a 7. ábrán mutatjuk be, mely a hasított PCR eredetű amplifikációs termék részleges elindítását (partial priming) mutatja be a következő amplifikációs eljárásban. A részleges elindítást (partial priming) az okozza, hogy a hasított amplifikációs termék nagyobb része a primerrel komplementer bázist tartalmaz. A PCR eredetű szennyezett amplifikációs tennék részleges elindítása (partial priming) a következő amplifikációs eljárás során a vizsgálandó mintában mesterségesen magas eredményeket, valamint hibás pozitív értékeket ad.
Egyes esetekben, amikor a restrikciósenzim-módosítási helyet elég közel visszük be a primerkiteijesztett végéhez, elkerülhetjük a részleges elindítást (partial priming), így a keletkező felismerési hely valóban az amplifikációs termék által kiterjesztett részen fordul elő. Ezt azonban nehéz elérni a polimeráz kiindulási primer kiterjesztésének zavarása nélkül. A részleges elindítást (partial priming) előnyös esetben a távol hasító restrikciós enzimek (remote cutting restriction enzymes) alkalmazásával és a megfelelő restrikciós módosítási helynek a PCR típusú amplifikációs eljárás által kapott módosított amplifikációs termékébe való bevitelével kizárhatjuk. A távol hasító restrikciósenzim-felismerési helynek a PCR eredetű amplifikációs termékbe történő bevitelét a 8. ábrán mutatjuk be. Ebben az esetben a távol hasító restrikciósenzim-felismerési helyet előre megszintetizált amplifikációs primerbe visszük, de a restrikciós enzim által történő valódi hasítás a teljes amplifikációs termék kiterjesztett részén jön létre. Ennek eredményeképpen az elpusztított PCR eredetű amplifikációs termék nem tud részt venni a következő amplifikációkban, mivel így a részleges elindítás (partial priming) bekövetkezésének nincs lehetősége.
A távol hasító restrikciós enzimek tehát alkalmazhatók és egyes esetekben előnyösek az LCR eredetű amplifikációs termékek módosítására. Amennyiben a felismerési hely és a megfelelő hasítási hely az amplifikációs tennék területén helyezkedik el, amit különböző szondapárok mutatnak, lehetőség van az új vizsgálandó mintának a restrikciós enzimmel való reagáltatására, még akkor is, amikor az amplifikációs szondareagenseket a célszekvenciát tartalmazó mintához hozzáadtuk már, annak veszélye nélkül, hogy ugyanebben az időben a szonda, mint szennyezett amplifikációs termék, elpusztult volna. A 9. ábra a távol hasító restrikciós enzim felismerési helyének a három pár szonda sorozatának végső párjába történő bevitelét ábrázolja úgy, hogy a teljes LCR eredetű amplifikációs termék a kész terméknek megközelítőleg a középső részén hasad el. Ebben az esetben a hasítási hely megegyezik a kész amplifikációs termék részével, amit az amplifikációs szonda középső párja mutat be.
Az amplifikációs termékbe még további, kémiailag hasítható helyeket vihetünk be az amplifikációs eljárás során alkalmazott amplifikációs szondák vagy primerek nukleinsavvázának módosítása által. Ezt sokkal előnyösebb az LCR típusú amplifikációs eljárások esetén alkalmazni, mint a PCR eredetű amplifikációs eljárások esetén, mivel a kémiailag hasítható helyek jelenléte a polimeráz leolvasási képességét hasonló módon zavar10
HU 218 095 Β ja. A kémiailag hasítható módosítási helyet tartalmazó, módosított amplifikációs terméket egy, a módosítási helye(ke)n hasító reagenssel pusztíthatjuk el. A kémiailag hasítható rész bevitele a szintetikus szekvenciákra való tekintettel lecsökkentheti az egyes restrikciós enzimeknél megfigyelt, csökkent hasítási hatékonyságot, mivel a kémiailag hasítható reakciók nem a biológiailag aktív enzimeken alapulnak és így nem képesek megkülönböztetni a szintetikus eredetű és a vad típusú nukleinsavakat. Továbbá a legtöbb kémiailag hasítható rész által végbemenő hasítás annak figyelembevétele nélkül történik, hogy a módosított amplifikációs termék egyszálú vagy kétszálú.
így a hasítási helyeket előre megszintetizált szondákba vagy primerekbe vihetjük be, általánosan elérhető reagensek alkalmazásával, a 10. ábrán bemutatott eljárás szerint. A szondák vagy primerek részleges szekvenciáját először úgy szintetizáljuk meg, hogy a 3’vagy az 5’-végükön aminocsoportot tartalmazzanak. Ezeket az aminnal jelzett végeket ezután homobifunkcionális kapcsolóreagensekkel kapcsoljuk, így teljes, de megszakított szekvenciát kapunk, amit amplifikációs szondaként vagy primerként alkalmazunk. így például a részleges primer- vagy szondaszekvenciák 3’vagy az 5’-jelzett végeinek összekapcsolására DSP-t [ditio-bisz(szukcinimidil-propionát)], DST-t (diszukcinimidil-tartarát) vagy EGS-t [etilénglikol-bisz(szukcinimidil-szukcinát)] alkalmazhatunk (lásd 10. ábra), így teljes, a hasítási helyet tartalmazó szondareagenst hozhatunk létre. Ebben az esetben az említett szondák vagy primerek alkalmazásával létrehozott módosított amplifikációs terméket redukálószerrel, például ditioeritrollal (ahol a DSP-t mint homobifunkcionális kapcsolószert alkalmazzuk), egy oxidálószerrel, például nátrium-perjodáttal (amennyiben DST-t alkalmazunk) vagy hidroxil-aminnal (amennyiben EGS-t alkalmazunk) történő hasítással pusztíthatjuk el.
A kémiailag hasítható módosítási helyeket az amplifikációs szonda vagy primer közepe környékén előnyös elhelyezni, így a hibridizáció következtében fellépő pusztulás mértéke minimális lesz. A módosított amplifikációs szondák vagy primerek létrehozása az amplifikációs szekvenciával teljesen komplementer módon [a hasítható rész kigöngyölt („loop-out”) részt tartalmaz] vagy nagyjából komplementer módon (a hasítható részt a szondaszekvencia valamelyik nukleozidjával helyettesítjük) történhet. Egyes esetekben, mint például a kémiailag hasítható részt nyújtó ribonukleotidszubsztitúciók esetén, a reagensek teljesen komplementerek lehetnek az amplifikációs szekvenciával, a kigöngyöltség („loop-out”) igénye nélkül.
A ribonukleotidszubsztitúció néhány labilis kötés bevitele által mind a keletkező módosított amplifikációs termék enzimfelismerési helyeként, mind kémiailag hasítható helyeként egyszerre szerepel. Ez a módosított amplifikációs termék labilis az alábbiak mindegyikével vagy valamelyikével szemben: erős bázis (kémiai hasítás) és egyes RN-ázok (enzimes lebontás). A keletkező hasítási termékek a továbbiakban egyik esetben sem funkcionálnak amplifikációs templátként.
Ezeket a labilis kötéseket a módosított amplifikációs termékbe a megfelelő 3’-végükön egyszeri ribonukleotidszubsztitúciót tartalmazó amplifikációs szondák vagy primerek alkalmazásával előnyös bevinni. PCR esetén minden amplifikációs primer ribonukleotidszubsztitúciót fog tartalmazni. LCR esetén legalább egy felső szál és egy alsó szál tartalmaz ribonukleotidszubsztitúciót. Mivel a ribonukleotidszubsztitúció a primerek vagy szondák 3’-végén megy végbe, a módosított amplifikációs termékek labilis kötéseit tulajdonképpen az in situ amplifikáció során hozzuk létre. Ennek eredményeképpen az amplifikációs reagensek nem tartalmazhatnak labilis kötéseket (azaz lúgokra nézve nem labilisak), így lehetővé teszik az átmeneti szennyeződések elpusztítását, mégpedig erős bázissal vagy RN-ázzal való kezeléssel, az említett, a kezelésre nézve ellenálló reagensek jelenlétében anélkül, hogy az amplifikáció teljességét megsértenék. Továbbá a vad típusú célszekvenciák azon képessége, mely szerint az amplifikáció során templátként szolgálnak, lehetővé teszi a labilis átmeneti szennyeződéseket tartalmazó amplifikációs termékek elpusztítását, mind a célszekvenciának, mind az amplifikációs reagensnek új vizsgálandó mintában való jelenlétében.
A ribonukleotidszubsztitúciót tartalmazó, PCR és LCR eredetű módosított amplifikációs termékek létrehozásánál két fontos követelmény van. Az első szerint az amplifikációs tennék létrehozásához szükséges enzimnek hatásosan kell működnie a szubsztitúció jelenlétében. PCR esetén a polimeráznak a hibridizált primer 3’-vége egyik hidroxilcsoportján keresztül kell a kiterjesztést folytatnia. LCR esetén a ligáznak az oligonukleotidszonda 3’-ribózcsoportjának egy másik oligonukleotidszonda 5’-foszfátcsoportjához való kapcsolódását kell katalizálnia. A második követelmény szerint a keletkező módosított amplifikációs terméknek (mely egy vagy több közbenső ribonukleotidot tartalmaz) működőképes templátként kell szolgálnia a következő amplifikációs ciklusok során. (Azaz PCR esetén a polimeráznak a ribonukleotidkapcsolódáson keresztül kell leolvasnia.)
A jelen találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk a PCR és az LCR típusú amplifikációs eljárásokra, de ugyanakkor alkalmazhatjuk az amplifikációs eljárások során felmerülő átmeneti szennyeződéses problémák ellenőrzésére, így például a transzkripciós típusú amplifikációs eljárások és a javító láncreakciós amplifikációk esetén.
Az alábbi példák a jelen találmány és a felsorolt igénypontok megértését segítik. Meg kell azonban jegyezni, hogy a felsorolt eljárásokban végrehajthatók módosítások a találmánytól való eltávolodás nélkül.
A jelen találmány jelentőségének szemléltetése céljából számos különböző szintetikus nukleinsavszekvenciát alkalmaztunk: (1) amplifikációs szekvenciákat, (2) amplifikációs termékeket, (3) módosított amplifikációs termékeket, (4) amplifikációs szondákat, (5) detektálási szondákat, (6) amplifikációs primereket, (7) detektálási printereket és (8) polilinkereket alkalmaztunk a restrikciós enzimek szintetikus nukleinsavszekvenciákra gya11
HU 218 095 Β korolt hasítása hatékonyságának meghatározása céljából. Ezeket a szintetikus szekvenciákat all., 13., 16., 20., 23. és 28. ábrákon mutatjuk be.
1. példa
A szintetikus szekvenciák létrehozása
A szintetikus amplifikációs szekvenciákat (AS), amplifikációs szondákat (AP), a kémiailag foszforilezett amplifikációs szondákat (pAP), a detektálási szondákat (DP), a kémiailag foszforilezett detektálási szondákat (pDP) (lásd 11. ábra) és a többértékű DNS-eket (lásd 13. ábra) Applied Biosystems model 380B szintetizátor alkalmazásával szintetizáltuk, a WO 89/02649 számú nemzetközi közzétételi irat kapcsolódó részei alapján, melyeket itt referenciaként említünk meg.
Az oligonukleotidokat a Glen Research Corporationtól (Hemdon, Virginia) beszerzett, 10-1900-90 katalógusszámú foszforilezőreagens alkalmazásával foszforileztük. A reagenst először T. Horn és M. Urdea ismertette, Tetrahedron Lett., 27, 4705-4708 (1986), és standard foszforamidit automatizált szintéziseljárások ellenőrzésére alkalmazható. Az automatizált oligonukleotidszintézis az Applied Biosystems készülékében a 3’->5’ irányban történt, az amplifikáció utolsó ciklusában kovalensen bevitt kémiai foszforilezőanyag hatására. A foszforilezés hatékonyságát az utolsó ciklusban felszabadult dimetoxil-tritil-csoport mennyiségének mérésével határoztuk meg. A kívánt, 5’-végén kémiailag foszforilezett oligonukleotid izolálása a védettség szabályos megszüntetésével, hasítással és tisztítási eljárásokkal történt.
2. példa
Egyszeri restrikciós helyen módosított amplifikációs termék
A restrikcióshely-mödosítás bevitele az amplifikációs termékbe
Ez a példa a restrikciósenzim-módosítási helyeknek az amplifikációs termékbe történő bevitelét mutatja be, LCR típusú amplifikációs eljárások során. A példában a restrikciósenzim-módosítási helyek bevitele restrikciósenzim-módosítási helyeket tartalmazó, előre szintetizált amplifikációs szondák alkalmazásával történt, így az előnyben részesített pszeudorestrikciós helyeknek megfelelő amplifikációs szekvenciát amplifikáltunk. A restrikciósenzim-módosítási helyeket úgy választottuk ki, hogy a hat amplifikációs szondából (azaz három pár) mindegyik egy restrikciósenzim-módosítási helyet tartalmazott, tekintettel az amplifikációs szekvenciára (így az amplifikációs termékben a szemben lévő, előnyben részesített pszeudorestrikciós hellyel fog hibridizálni).
Szükséges a restrikciós enzimmel módosított amplifikációs termék szelektív kizárásának bemutatása, ami a megfelelő restrikciós enzimmel történő kezelés után a kapott restrikciósenzim-módosítási helyek hatástalan amplifikációját (azaz teljes elpusztítását) szemlélteti, míg a megfelelő pszeudorestrikciós helyet tartalmazó amplifikációs szekvenciát a restrikciós enzimmel való kezelés nem befolyásolta.
Bár a módosított amplifikációs terméket (AMP,) úgy szerkesztettük meg, hogy egy HaelII és kéb Bbvl restrikciós endonukleázhelyet tartalmazzon a szelektált módosítás során, az amplifikációs termék hasításának szemléltetésére csak a HaelII helyet használtuk. Az amplifikációs szekvencia (AS) abban különbözik az amplifikációs terméktől, hogy a három pár amplifikációs szondán (ΑΡ,/ρΑΡ,, AP2/pAP2, AP3/pAP3) keresztül csak három bázispárt vittünk be az amplifikációs termékbe (AMP,), melyek mindegyike három bázispárban különbözött. Az amplifikációs szekvencia az amplifikációs termékbe a restrikciós endonukleázhelyek céljából bevitt, megfelelő pszeudorestrikciós helyeket tartalmazza.
A Az amplifikációs szekvencia, a módosított amplifikációs termék és a karrier DNS restrikciós endonukleázzal történő feltárása
Az amplifikációs terméknek a következő eljárások templátjaként való képessége megszüntetése céljából a restrikciós enzimes hasítás hatékonyságának meghatározására az alábbi, restrikciós endonukleázzal végzett reakciót ismertetjük, ahol a végső 100 μΐ puffer az alábbiakat tartalmazta: 0,05 mg/ml BSA (szarvasmarhaszérum-albumin), 50 mM Tris.HCl, 6,6 mM MgCl2, 6,6 mM DTT (ditioeritrol):
1. reakció: 2 femtomól AMP, + 20 egység aktív HaelII restrikciós enzim,
2. reakció: 2 femtomól AMP, + 20 egység hőinaktivált HaelII restrikciós enzim,
3. reakció: 2 femtomól AS + 20 egység aktív HaelII restrikciós enzim,
4. reakció: 2 femtomól AS + 20 egység hőinaktivált HaelII restrikciós enzim,
5. reakció: 1 pg humán placenta-DNS + 20 egység aktív HaelII restrikciós enzim,
6. reakció: 1 pg humán placenta-DNS + 20 egység hőinaktivált HaelII restrikciós enzim.
Mind a hat reakciót 37 °C-on 16 órát inkubáltuk, majd a megmaradó HaelII-aktivitás elpusztítása céljából 90 °C-on 10 percet.
B. Szintetikus amplifikációs szekvenciák és restrikcióshely-módositású amplifikációs termékek amplifikálása, majd aktív és inaktív Hae restrikciós enzimmel történő kezelése
A fenti hat reakcióból származó amplifikációs szekvenciát (AS), a restrikciósenzim-felismerési helyen módosított amplifikációs termékeket (AMP,) és a humán placenta-DNS-t (HP-DNS) egy LCR típusú amplifikációs eljárás 15 ciklusában, három pár amplifikációs szonda alkalmazásával (ΑΡ,/ρΑΡ,, AP2/pAP2, AP3/pAP3) megkétszereztük, lásd 5. ábra. Meg kell jegyeznünk, hogy az említett szondák az amplifikációs szekvenciával három bázispárban hibásan párosodnak, de az AMP,-gyei teljesen komplementerek.
Számos különböző típusú ligázt alkalmazhatunk az LCR típusú amplifikációs eljárások folyamatosan hibridizálódó szondáinak ligálása során. így például a WO 89/02649 sorozatszámú nemzetközi közzétételi irat az amplifikációs szondák ligálására az E. coli ligázt ismerteti [beszerezhető például az alábbi helyről: New
HU 218 095 Β
England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts)]. Ez egy általánosan előnyben részesített enzim, de ugyanakkor szükséges egy termostabilis ligáz (TSL) alkalmazása is, az LCR típusú amplifikációs ciklusok során való folyamatos adagolás elkerülése céljából. Ebben a példában Miho Takahashi adományaként (Mitsubishi-Kaséi Institute of Life Science, Protein Chemistry Laboratory, 11 Minamiooya, Machida-shi, Tokyo 194, Japán), Thermus thermophilusból (AACC #27634) izolált termostabilis HB8 DNS-ligázt alkalmaztunk az amplifikációs szondák ligálására az amplifikációs ciklusok során.
A lOx koncentrációjú termostabilis DNS-ligáz-puffer 500 ml Tris-HCl-ot (pH-amplifikációs 7,6), 66 mM MgCL-ot, 10 mM EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsav), 66 mM DTT-t és 500 pg/ml BSA-t tartalmazott.
A futtatópuffer 11,8 mM EDTA-t, 6,3 M ureát, 0,02% bróm-fenolkéket és 0,02% xilén-cianolt tartalmazott.
Az 1-4. reakcióig 100 attomol DNS-t, míg az 5. és 6. reakciókban 5 ng HP-DNS-t amplifikálással megkétszereztünk, egy Perkin-Elmer/Cetus Thermocycler (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut) alkalmazásával. Az egyes amplifikációs reakciók során 50 pl mennyiségű 1 χ TSLB-ből indultunk ki, mely az egyes amplifikációs szondákból (AP|/pAP,, AP2/pAP2, APj/pAPj) 2 pikomól mennyiséget, 0,03 egység TSL-t és 0,66 pM NAD-ot tartalmazott, 0,5 ml-es Eppendorfr-csövekben. Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. Az amplifikációs reakciókat 15 ciklusban hajtottuk végre, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel.
C. A restrikciós helyen módosított amplifikációs termék detektálása
Az IB. példában kapott amplifikációs termékeket kétszondás detektálórendszer alkalmazásával detektáltuk, a WO 89/02649 sorozatszámú nemzetközi közzétételi irat szerint, melynek idevonatkozó részeire referenciaként hivatkozunk. A HB8 DNS-ligázt és a TSLBpuffert a WO 89/02649 sorozatszámú nemzetközi közzétételi irat szerinti E. coli-ligázzal és E. coli-ligázpufferrel helyettesítettük. Az amplifikációs termék detektálására all. ábrán látható DP) és DP2 detektálási szondákat alkalmaztuk.
A módosított amplifikációs termékek autoradiográfiás eljárással történő láthatóvá tétele céljából a DP,-detektálási szondát r32-ATP-vel és polinukleotid-kinázzal (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) foszforileztük, megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitású radioaktív foszfor alkalmazásával. A x32-ATP-felesleget a foszforilezett oligonukleotidból gélszűréssel, G50/50 SephadexR (Pharmacia, Uppsala, Sweden) alkalmazásával távolítottuk el.
A detektálási reakciók során 50 pl mennyiségű lx TSLB-ből indultunk ki, mely az egyes detektálási szondákból (t32-DP| és DP2) 200 femtomól mennyiséget, 0,03 egység TSL-t és 0,66 pM NAD-ot tartalmazott. A detektálási reakciót 5 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 10 perces 50 °C-os kezeléssal hajtottuk végre. A reakció leállítása azonos mennyiségű futtatópuffer hozzáadásával történt, majd további 3 perces 90 °Con történő hőkezeléssel. A terméket elektroforézissel szeparáltuk, 15%-os denaturáló poliakrilamidgélen és autoradiográfiával tettük láthatóvá (lásd 12. ábra). Az amplifikáció relatív hatékonyságát lézerdenzitométerjelek alapján, LKB UltroScanR XL készülék (Pharmacia LKB Biotech, Inc., Piscataway, New Yersey) értékeltük.
A hasított amplifikációs termék (1. reakció, 1. és 2. sáv) a nem hasított amplifikációs termékhez képest (2. reakció, 3. és 4. sáv) csak 7%-os hatékonysággal amplifikálódott. Ez a szennyezett amplifikációs termék hatékonysága 93,5%-os csökkenésének felel meg.
A hasított (3. reakció) és a nem hasított (4. reakció) amplifikációs szekvencia (5. és 6., illetve 7. és 8. sáv) közel azonos mértékű hatékonysággal amplifikálódott. Ez azt mutatja, hogy a pszeudorestrikciósenzim-felismerési helyeket tartalmazó amplifikációs szekvenciát nem befolyásolta az ugyanazzal az enzimmel történő kezelés, mely a megfelelő módosított amplifikációs terméket pusztítja el.
A hasított (5. reakció) és a nem hasított (6. reakció) hordozó HP-DNS (9-12. sáv) nem mutatott jelet, eszerint az 1-8. sáv jelei nem a reakcióelegyben lévő DNS vagy más komponens valamilyen nem specifikus kapcsolatának következtében jelentkeztek.
Meg kell jegyeznünk, hogy a nem hasított amplifikációs szekvencia (AS, 4. reakció, 7. és 8. sáv) a sértetlen amplifikációs termékhez (AMP,, 2. reakció, 3. és 4. sáv) képest csak 18%-os hatékonysággal amplifikálódott. Ez valószínűleg az amplifikációs szekvenciára nézve három hibás párosodást tartalmazó és a csak az amplifikációs termékkel teljesen komplementer amplifikációs szondák következtében volt.
3. példa
A távol hasító enzim (remote cutting enzyme) értékelése
A 2. példában kapott módosított amplifikációs terméket Bbvl távol hasító enzimmel hasítottuk. Ebben az esetben a 2. példa szerinti ΑΡ,/ρΑΡ/, pAP2/pAP2’, pAP3/AP3’ amplifikációs szondákat a Bbvl enzimmel nem hasítottuk el. Mind a PCR, mind az LCR típusú amplifikációs eljárások során más távol hasító enzimeket is alkalmazhatunk a megfelelő módosított amplifikációs termék hasítása céljából.
A távol hasító enzimek azonosítása céljából nyolc különböző, viszonylag erőteljes hasítási képességgel rendelkező enzimet (melyeket az alábbi helyről szereztük be: New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) választottunk ki, mint a jelen találmány szerinti restrikciósenzim-felismerő módosítási helyek hatásos elhasítására alkalmas enzimeket. Egy DNS 42 bázisból álló, kétszálú szekvenciája mind a nyolc távol hasító restrikciós enzim felismerési helyét tartalmazta, lásd 13. ábra. Ennek a többértékű DNS-nek az alsó és a felső szálát az 1. példa szerint, Applied Biosystems model 380B szintetizátor alkalmazásával szintetizáltuk meg. Ezek a komplementer szekvenciák lehetővé tették a hib13
HU 218 095 Β ridizációt, így a távol hasító enzimek azonosítása céljára alkalmas kétszálú szekvenciát kaptunk. A többértékű DNS-nek azonos mennyiségű alsó és a felső szálát elegyítettük, az elegyet azonnal 90 °C-ra melegítettük, majd hagytuk szoba-hőmérsékletűre lehűlni, így a restrikciós endonukleáz hasítására alkalmas kétszálú DNS-t kaptunk.
A többértékű DNS 20 pikomól mennyiségét minden 5’-végen y32-vel jeleztük, a 2. példáa y32-DP] leírása szerint.
Ezután a többértékű DNS-t a kiválasztott nyolc restrikciós enzimmel elhasítottuk nyolc különböző reakcióban, melyek mindegyike az 50 μΐ-es reakciótérfogatban 200 femtomól y32-vel jelzett többértékű DNS-t, 1 χ puffermennyiséget tartalmazott és egyet az alábbi enzimek közül:
Reakció Restrikciós enzim Restrikciós enzim mennyisége (egység) Puffer
1. ALWI 4 lxTSLB
2. Bbvl 2 lxTSLB
3. BspMI 4 lxTSLB*
4. Foki 8 lxTSLB
5. Plel 1 lxTSLB
6. Hgal 8 lxTSLB
7. Hphl 0,8 lxTSLB
8. SfaNI 3 lxTSLB
* +100mM NaCl
Mind a nyolc reakciót 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáltuk. Az inkubálás után az egyes reakcióelegyek felét azonos mennyiségű EDTA/festőreagenssel elegyítettük, a reakció leállítása céljából az elegyeket 90 °Con 3 percig melegítettük, majd a szakmai körökben általánosan ismert eljárás alkalmazásával, 10%-os denaturálógélen megfuttattuk azokat, és autoradiográfiával láthatóvá tettük az eredményeket. Amint a 14. ábrán láthatjuk, míg a módosított, többértékű DNS-t minden távol hasító enzim elhasitotta, a rendszerben a legnagyobb hatást a Fok I mutatta.
4. példa
A PCR eredetű amplifikációs termékek kettős távol hasító helyű enzimmel (double remote) történő módosítása
A 3. példa távol hasító enzimmel kapott eredményei alapján további kísérleteket terveztünk, a Fok I távol hasító restrikciós enzim alkalmazásával, PCR típusú amplifikációs eljárásokban. Két Fok I távol hasító restrikciósenzim-módosítási helyet vittünk be a PCR eredetű amplifikációs termékbe, lásd 15. ábra. A módosítási helyeket az amplifikációs termékbe két megfelelően módosított amplifikációs primer alkalmazásával vittük be, melyek mindegyike az amplifikációs szekvenciában elhelyezkedő, előnyben részesített pszeudo Fok I restrikciós helyre nézve egyszeri hibás bázispárosodást tartalmazott. A nem távoli hasítási helytől (non-remote cutter site) eltérően a távol hasító restrikciósenzim-felismerési hely bevitele a módosított amplifikációs termékbe - az amplifikációs termék kiterjesztett részén
Fok I hasítási helyeket tartalmazó módosított amplifikációs termékben - a primer eredetű részen belül elhelyezkedő megfelelő felismerési helyeket eredményez. Ennek következtében a módosított amplifikációs termék Fok I restrikciós enzimmel történő kezelése hasított termékeket eredményez (lásd 15. ábra), melyek a fenti leírtakhoz hasonlóan nem érzékenyek a részleges elindításra (partial priming).
A pUC 9-ben lévő 147 bp-ból álló szekvenciát választottuk ki a példában alkalmazásra kerülő amplifikációs szekvenciaként. A kiválasztott 147 bp-ból álló részt a 16. ábrán mutatjuk be, az AP6 és az AP7 natív amplifikációs primerek (melyek a célszekvenciára nézve nem tartalmaznak hibás párosodási), az AP8 és az AP9’ egyszeri hibás párosodást tartalmazó amplifikációs primerek (a Fok I restrikciósenzim-felismerési helynek az amplifikációs termékbe történő bevitele céljából) és a PAD22 detektálási primer mentén.
A. A pUC 9 célszekvencia létrehozása az amplifikálás céljára
A példában cél-DNS-ként a 2707 bp-ból álló pUC 9 plazmidot alkalmaztuk. A pUC 9 cél-DNS-t úgy hoztuk létre az amplifikálás céljára, hogy a cirkuláris plazmidot Fok I restrikciós endonukleázzal elhasitottuk, így az amplifikálás céljára megfelelő lineáris szekvenciát kaptunk. A Fok I restrikciós enzim alkalmazása kézenfekvő volt, mivel ez az az enzim, melyet a már megfelelően módosított amplifikációs termék elpusztítására alkalmaztunk. Ugyanakkor más restrikciós enzimek is alkalmazhatók a plazmid ffagmentálására vagy linearizálására, melyek hatására a plazmidon elhelyezkedő megfelelő restrikciós helyet kapunk. A pUC 9 plazmid öt Fok I felismerési helyet tartalmaz, mely a legnagyobb (1340 bázispár) Fok I fragmentumon belül elhelyezkedő, a linearizációs kezelés eredményeképpen kapott amplifikációs szekvenciával rendelkezik.
Meg kell jegyeznünk, hogy amennyiben az amplifikáció hőmérséklete 95 °C alatt marad, a plazmidot, a kromoszómát vagy a vizsgálandó minta más célszekvenciáját általában fragmentálni vagy linearizálni szükséges, ezzel elősegítve az első amplifikációs ciklus során bekövetkező teljes denaturálódást. Amennyiben az amplifikáció hőmérséklete túllépi a 95 °C-ot, a fragmentálás és/vagy linearizálás szükségszerűen az amplifikálás során következik be.
Az alábbi reagenseket alkalmaztuk.
A 0,45 μΙ/pg koncentrációban alkalmazott plazmid DNS-t és a pUC 9-et az alábbi helyről szereztük be: Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, Maryland).
A reakciópuffert a Perkin-Elmer/Cetus cég (Norwalk, Connecticut) GeneAmp™ DNS Amplification Reagent Ki tjében lévő [10 x] reakciópuffer 1/10 hígításával kaptuk. A [10 χ ] reakciópuffer 100 mM Tris.HCl-ot, 500 mM KCl-ot, 15 mM MgCl2-ot és 0,1% (w 'v) zselatint tartalmaz. így a kísérletek során [lx] reakciópuffert alkalmaztunk.
A 4 egység/μΐ koncentrációjú Fok I restrikciós endonukleázt az alábbi helyről szereztük be: New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts).
HU 218 095 Β
Az [1 χ] reakciópufferben a plazmid-DNS hasítása 2 μΐ (0,9 μg) pUC 9 DNS és 2 μΐ (8 egység) Fok I restrikciós enzim hatására ment végbe 50 μΐ [ 1 χ ] reakciópufferben. Az így kapott reakcióelegyet 37 °C-on 45 percig inkubáltuk, a megmaradt enzimaktivitást a 45 perces inkubálás után 90 °C-on 10 percig tartó kezeléssel pusztítottuk el. Az így kapott reakcióelegyben lévő célszekvencia koncentrációját 9,25 femtomól/μΐ értékre becsültük.
B. PCR amplifikálás/detektálás natív amplifikációs primerek és a fenti módosított amplifikációs primerek alkalmazásával
Annak meghatározása céljából, hogy a módosított PCR-primerekben lévő egyszeri bázispárosodási hibák alkalmasak-e a PCR típusú amplifikációs eljárások során történő alkalmazásra, natív amplifikációs primerek (AP6 és AP7’, melyek teljesen komplementerek az amplifikációs szekvenciával), illetve módosított amplifikációs primerek (AP8 és AP9’, melyek részlegesen komplementerek az amplifikációs szekvenciával) alkalmazásával mellékreakciókat hajtottunk végre. Az amplifikációs mellékreakciók elegyei 20 ciklusban vettek részt, a terméket PAD22 detektálási primerrel tettük láthatóvá.
A következő reagensek a Perkin-Elmer/Cetus GeneAmp™ DNS Amplification Reagent Kitjéből származtak: 10 mM az egyes dNTP-kből (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), [10χ] reakciópuffer (lásd 4A. példa, fenti) és AmpliTaq™ DNS-polimeráz (5 egység/μΐ).
A futtatópuffer azonos volt a 2B. példában alkalmazottal.
A PAD22 detektálási prímért megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitású 32P-vel jeleztük, lásd 2C. példa.
A pUC 9 DNS-célszekvenciát a Fok I enzimmel hasított plazmid (lásd 4A. példa) TE-ben (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) történő megfelelő hígításával kaptuk.
Minden amplifikációs reakciót 50 μΐ-es Eppendorfö csövekben hajtottuk végre, 50 μΐ össztérfogatú 1 χ reakciópufferben, mely az egyes dNTP-kből 250 μΜ mennyiséget és 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt tartalmazott. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
Amplifikációs pUC 9 primer célszekvencia (attomól)
1. reakció 25 pmol AP8 és AP9’ lOOamol
2. reakció 25 pmol APg és AP9’ 0,0 amol
3. reakció 25 pmol APS és AP7’ 100 amol
4. reakció 25 pmol AP8 és AP7’ 0,0 amol
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 20 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel.
Az amplifikációs termékeket szelektíven tettük láthatóvá, az alábbi polimerázzal kapcsolt detektálási rendszer (polimerase-associated detection system, PAD) alkalmazásával. Az eljárás során a keletkezett amplifikációs termékhez a DNP-k és egy polimeráz feleslegének jelenlétében egy jelzett PAD-primert hibridizáltunk, így egy jelzett kiterjesztett (detektálási) terméket hoztunk létre. Ezt a jelzett detektálási terméket a jelzett PADprimer feleslegétől PAGE-n választottuk el, majd autoradiográfiával tettük láthatóvá. Mivel a PAD-primemek az amplifikációs termék feleslegével a hibridizációban versenyeznie kell, a PAD-primert hosszabbra terveztük (így Tm magasabb), mint az amplifikációs prímért. Ezáltal a reakció hőmérsékletét úgy állíthatjuk be, hogy az kedvezzen a PAD-primer hibridizációjának.
Az egyes reakcióelegyek 1/10 mennyiségéhez (5 μΐ) 1 μΐ olyan elegyet adtunk, mely 200 femtomól 32P-vei jelzett detektálási prímért (PAD22) és 0,25 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt tartalmazott. A PAD-primert temperáltuk és 5 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel, majd 10 perces 65 °C-os kezeléssel kiterjesztettük. Miután a reakcióelegy szoba-hőmérsékletűre hűlt le, a reakciót 15 μΐ futtatópuffer hozzáadásával leállítottuk, és a rendszert 5 percre 90 °C-ra melegítettük. A reakciók Hpa II enzimmel hasított pBR 32 2 32P-vel jelzett marker mellett, 10%-os denaturáló poliakrilamid gélen futottak, és az eredményeket autoradiográfiával tettük láthatóvá.
Az egyes reakcióelegyekben a 147 bázispárból álló PAD-termékek relatív intenzitását a 17. ábrán mutatjuk be. Az amplifikációs szekvencia pszeudorestrikciós helyén egyszeri bázispárosodási hibát tartalmazó módosított amplifikációs primerek a natív primerhez közel hasonló intenzitással amplifikálódtak. (Hasonlítsd össze az 1. reakció sávját és a 3. reakció sávját.) A 0 kontroll eredményei (2. reakció és 4. reakció) nem mutattak a célszekvencia jelenlétében a ciklusokban termék-felhalmozódást.
C A módosított, PCR eredetű amplifikációs termékek elpusztítása
A 4. példában alkalmazott reakcióelegyet aktív Fok I restrikciós enzimmel vagy hőinaktivált Fok I restrikciós enzimmel (kontroll) kezeltük, majd a hasítás hatékonyságát PAD-detektálással értékeltük.
A Fok I restrikciós enzimet a módosított, PCR eredetű amplifikációs termékek elpusztítására használtuk. Minden más reagens, amit a példa során felhasználtunk, a Perkin-Elmer/Cetus GeneAmp™ DNS Amplification Reagent Kitjéből származott, lásd 4B. példa.
A hőinaktivált Fok I restrikciós endonukleázt (dFok I) az enzimalapoldat 10 perces, 65 °C-on történő hőkezelésével kaptuk. A kapott dFok I inaktivitását a pUC 9 DNS-plazmid hasítására való alkalmatlansággal igazoltuk.
Az 1 χ reakciópuffer 25 μΐ-es alikvot mennyiségeit adtuk a 4B. példa szerinti amplifikációs reakcióelegy (1., 2., 3. és 4.) fio részéhez, 2 μΐ (8 egység) aktív Fok I (1A., 2A., 3A., 4A., illetve 5A.) vagy 2 μΐ dFok I (ld. 2d. 3d. és 4d.) jelenlétében. Az így kapott reakcióelegyeket 16 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk, majd 90 °C-on 5 percig.
A Fok I és a dFok I enzimeknek a PCR eredetű amplifikációs termékre gyakorolt hasítását PAD-detektálással
HU 218 095 Β értékeltük. A restrikciós enzimmel való kezelés után az egyes reakcióelegyekből 15 μΐ-es alikvotokat vettünk és 10,5 μΐ oldathoz adtuk, mely 0,95 χ reakciópufferben 200 femtomól 32P-PAD22-t (7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás), 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt és az egyes dNTP-kből 952 μΜ mennyiséget (végső koncentráció : 392 μΜ) tartalmazott. A reakcióelegyet 90 °C-on 5 percig melegítettük, majd 65 °C-on 10 percig kezeltük a reakció lejátszódása céljából. A reakciót 25 μΐ futtatópufferrel állítottuk le, majd 90 °C-on 5 percig melegítettük. A leállított reakcióból származó mintákat 10%-os poliakrilamidgél-elektroforézissel vizsgáltuk, és az eredményeket autoradiográfiával tettük láthatóvá. A filmet az autoradiográfiás lépés során túlexponáltuk, így a még nyomnyi mennyiségben jelen lévő hasítási termékek is kimutathatóvá váltak.
Amint a 18B. ábrán láthatjuk, az egyszeri bázispárosodási hibát tartalmazó módosított amplifikációs primerek (Fok I helyeket tartalmaz) alkalmazásával kapott módosított amplifikációs terméket az aktív Fok I enzimmel való kezelés teljes mértékben elpusztította (3A. reakció). Ezzel szemben a natív primerekkel létrehozott amplifikációs termék a hasonló aktivitású Fok I enzimmel szemben hatástalan volt (3A. reakció), amint azt a 147 bázispárból álló termék erőteljes PAD-jele mutatja. Amint vártuk, sem a módosított, sem a nem módosított amplifikációs terméket nem befolyásolta a hőinaktivált Fok I enzimmel való kezelés (ld., illetve 3d. reakciók). A 0 célszekvencia-kontrollok (2A., 4A., 2d. és 4d. reakciók) nem mutattak terméket a 147 bázispáron az autoradiogramon, ez azt igazolta, hogy minden megfigyelt 147 bázispárból eredő jel valóban az amplifikációs termékből származik.
Az 1A. reakció PAD-detektálása során tapasztalt gyenge jel a 127 bázispárból származott. Ez a hibás jel a módosított amplifikációs termék templátja PAD-primerkiterjesztése során keletkezett, mely csak a két elérhető Fok I hely egyikét hasítja el, lásd 19. ábra. Amint az a 19. ábrán látható, a Fok I enzimmel történő hasítás eredményeképpen két termék keletkezhet, melyek közül csak az egyik adhat választ a PAD-detektálási lépés során és hozhat létre 127 bázispárból álló terméket. Fontos megjegyezni, hogy ezek közül a speciálisan hasított, módosított amplifikációs termékek közül egyik sem kommplementer minden módosított amplifikációs primerrel, ami a következő amplifikációs eljárásokban templátként való részvételhez szükséges.
D. A Fok I-gyel kezelt amplifikációs termékek PCR-amplifikációja
A 4C. példa reakciójának további vizsgálata céljából a fenti reakcióelegyet hígítottuk és az AP8, illetve az AP9’ módosított amplifikációs primerek alkalmazásával további 20 ciklusból álló PCR-amplifikációnak vetettük alá, lásd fent, 4B. példa. A kapott amplifikációs terméket ezután PAD-detektálással vizsgáltuk, lásd 4C. példa. Az „újraamplifikált” minták esetén átmeneti szennyezéses termékként még nyomnyi mennyiségű amplifikációs termék detektálható szintű amplifikációját vártuk, mely a klinikai mérési sorozatokban detektálható jelet eredményezhet. Minden reagens, amit az amplifikáció során alkalmaztunk, a fent ismertetettekkel azonos volt.
A 4C. példa hasítási reakciója eredményeképpen kapott elegyből TE-vei 1/100 000 faktorú hígítási sort készítettünk. Mivel maguk a hasítási reakciók az eredeti amplifikációs reakcióelegy 1/6-szoros hígítását eredményezik, az 1/100 000-szeres hígítás az eredeti amplifikációs reakcióelegyre nézve 1/600 000-szeres hígítást ad. Továbbá, mivel a hígított mintából csak 5 μΐ-t amplifikáltunk újra, az amplifikációs reakcióelegy 50 μΐ-es eredeti térfogatával összehasonlítva az újraamplifikálás az összes amplifikációs terméke számának (mind a módosított, mind a nem módosított) csak 1/600 000-szeresét reprezentálja, ami a 4B. példa szerinti eredeti PCRamplifikáció következtében in situ szintetizálódott. Ez az 1/600 000-szeres számérték a tipikus laboratóriumi mérési sorozatokban kialakuló, vitt szennyeződés szintjét mutatja.
A hasítás során kapott reakcióelegyek egyes végső hígításainak (1/600 000) 5 μΐ-nyi mennyiségét 45 μΐ oldathoz adtuk, melyet úgy állítottunk be, hogy az 5 μΐ hígított mintát tartalmazó végső elegyben a hígított minta lx reakciópufferben volt, 200 μΜ mennyiségű dNTP-k, az egyes amplifikációs primerek (AP8, illetve az AP9’) 25 pikomól mennyisége és 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimeráz jelenlétében. Az 1A., 2A., 3A., 4A., ld., 2d., 3d. és 4d. reakciókat mint 1A. + , 2A. + , 3A. + , 4A. + , ld.+, 2d. + , 3d.+, illetve 4d. + reakciókat jelöltük. (A „+” jel azt mutatja, hogy a reakciókat egy 20 ciklusból álló PCR-amplifikáció során 20 ciklusban újraamplifikáltuk.) Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából, majd a 0,5 ml-es EppendorP-csöveket lezártuk, és a Perkin-Elmer/Cetus Thermocycler alkalmazásával az amplifikációs reakciót 20 ciklusban hajtottuk végre, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 3C-os kezeléssel.
Az újraamplifikált reakcióelegy egytized részéhez (5 μΐ) 1 μΐ alikvot mennyiségű, 32P-vel jelzett detektálási prímért (PAD22) és 0,25 egység AmpliTaq™ DNSpolimerázt tartalmazó oldatot adtunk. A PAD-detektálási reakció 5 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel, majd 5 perces 50 °C-os kezeléssel történt. A reakciótermékeket 15 μΐ futtatópufferrel lehűtöttük, majd 5 percre 90 °C-ra melegítettük, és ezután 10%-os denaturáló PAGE-n, Hpa II enzimmel hasított pBR 32 2 32P-jelzett marker jelenlétében megfuttattuk és autoradiográfiásan tettük láthatóvá. Az eredmények fényképét a 17. ábrán mutatjuk be. (Meg kell jegyezni, hogy a gél és az autoradiogram a fenti 4B. példa 1., 2., 3. és 4. reakcióinak eredményeit is tartalmazza.)
Az ld.+ és a 3d.+ reakciók az 1., illetve a 3. reakciók termékének 1/600 000-szeres mennyiségével szennyezett minták PCR-amplifikációjának eredményeként várt jelek típusait mutatják be. Az eredmények a 20 ciklusos PCR-amplifikáció szennyezési szintjéből származó tipikus hibás pozitív értékeket mutatják be. Ezzel szemben az előzőleg aktív Fok I restrikciós enzimmel kezelt módosított amplifikációs termékből származó
HU 218 095 Β minta amplifikációja (1A.+ reakció) nem adott 147-mer terméket, vagyis nem adott hibás pozitív eredményeket. A nem módosított amplifikációs terméket Fok I restrikciós enzimmel történő kezelése (3A.+ reakció) a hasonló nem módosított, hőinaktivált Fok I enzimmel történő kezelésével (3A.+ reakció) összehasonlítva azonos intenzitású jelet adott. Ez a módosított amplifikációs termék szelektív elpusztítását szemlélteti, natív célszekvencia jelenlétében, az aktív Fok I restrikciós endonukleázzal történő kezelés hatására, amit a kezelés nem befolyásol. A 0 célszekvencia amplifikációi (2A. + , 2d.+, 4A.+, 4d.+ reakciók) nem mutattak detektálható termékeket, megerősítve, hogy a 147-mer termék valóban az amplifikációs termék templátjából származik és nem valamilyen egyéb, általános képződményből.
5. példa
A PCR eredetű amplifikációs termékek kettős távol hasító restrikciós helyű módosítása, a szennyezés után történő hasítás
Míg a 4. példa az előzőleg amplifikált minta átmeneti szennyeződése eltávolításának az amplifikáció után történő sikeres kezelését szemlélteti, mint feljebb már említettük, sokkal hatásosabb lenne a vizsgálandó mintát a megfelelő hasítószerrel közvetlenül az amplifikáció előtt előkezelni („pre-treat”). Ilyen módon az előinkubációs lépés során az új mintában minden szennyező amplifikációs tennék elpusztulása, az előinkubációs lépés az amplifikáció elkezdése előtt a hasítószer (például a Fok I) hozzáadását és az összes amplifikációs reagens jelenlétét jelenti, zárt csőben.
A vizsgálandó új mintában jelen lévő rendkívül alacsony kiindulási koncentrációjú szennyező amplifikációs terméknek az előre kezelt szennyezőkontrollal kapcsolatban történő hatásos alkalmazását mutatjuk be. Ez a kapcsolat az ilyen alacsony koncentrációjú hasítószerek katalitikus aktivitásának csökkenéséből ered. így a hasítószerek hatásossága az új vizsgálandó mintában lévő módosított amplifikációs termék elpusztításában minimálisra csökkenti az előre kezelt szennyezőkontroll hatásosságát. (A 4. példa a hasitószer rendkívüli hatásosságát szemlélteti a módosított amplifikációs terméknek közvetlenül az amplifikálás után, viszonylag magas koncentrációjú hasítószerrel történő kezelése esetén.)
Annak megvizsgálása céljából, hogy a szennyezés ellenőrizhető-e ilyen módon, a HIV-pol gén egy részét AP16 és AP,7’ módosított amplifikációs primerekkel amplifikáltuk, így az amplifikációs termékekbe Fok 1 restrikciós helyeket vittünk be. A termék mennyiségi meghatározása a keletkező termékek PAD4 detektálásiprimer-kiterjesztése során kapott jelek PAD-detektálásának a kapott standardokkal történő összehasonlításával történt. A vizsgálat során alkalmazott oligonukleotid-szekvenciát a 20. ábrán mutatjuk be. Ezután a kapott módosított amplifikációs terméket felhígítottuk és a következő, a natív célszekvenciát tartalmazó amplifikációs reakcióhoz adtuk, így ellenőrzött szennyezettségű kísérletet hoztunk létre. Ezután a kapott szennyezett mintákat az amplifikálás előtt aktív hasítószerrel (Fok I) vagy inaktivált hasítószerrel (dFok I) kezeltük. A kapott jelek összehasonlítása a hasítószerrel kezelt szennyezett termék hatásos elpusztítását mutatta.
A. A HÍV módosított amplifikációs primerekkel történő amplifikálása és a módosított termék mennyiségi meghatározása
A következő kísérletben alkalmazott nukleinsav és célszekvencia egy megközelítőleg 6 kb HIV-részt tartalmazó, 10 kb méretű pBR 322 klón volt [BHlO-izolátum; Gallo és társai, Natúré, 313, 277-284 (1985)]. Az amplifikáció céljára a kiónt BamHI-hasítással linearizáltuk. Ugyanezt a kiónt alkalmaztuk a termék mennyiségi meghatározására használt standardok létrehozásához a PvuII-vel és a HaelII-mal történő detektálási lépés során, amikor az amplifikálandó, 162 bázispárból álló részt tartalmazó, 255 bázispárból álló fragmentumot hoztuk létre. A PAD4 detektálási primemek ezen a fragmentumon keresztül kell átterjednie, hogy létrehozza a 192 bázispárból álló terméket. A PCR-termék hozamát a kapott 162-mer detektálási terméknek és az ismert mennyiségű standardból kapott 192-mer terméknek az összehasonlításával kaptuk meg.
A következő reagensek a Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, Connecticut) GeneAmp™ DNS Amplification Reagent Ki tjéből származtak: 10 mM dNTP-k (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), [10x] reakciópuffer (lásd 4A. példa, fent).
Az AmpliTaq™ DNS-polimerázt (8 egység/μΐ) a Perkin-Elmer/Cetus cégtől szereztük be.
A termofil DNS-polimerázt (3 egység/μΐ) a Molecular Biology Resources, Inc. (Milwaukee, Wisconsin) cég adományaként kaptuk.
A BamHI (25 egység/μΐ) restrikciós endonukleázt, a PvuII (50 egység/μΐ) restrikciós endonukleázt, a HaelII (10 egység/μΐ) restrikciós endonukleázt és azok megfelelő 10x hasító pufferjeit a New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts) cégtől kaptuk. A lOx BamHI puffer 1500 mM NaCl-ot, 60 mM Tris-t (pH 7,9), 60 mM MgCl2-ot, 60 mM β-merkapto-etanolt és 100 pg/ml koncentrációjú BSA-t tartalmazott. A lOx HaelII puffer 200 mM Tris-t (pH 7,9), 100 mM Mgacetátot, 500 mM K-acetátot és 10 mM DTT-t tartalmazott. A lOx PvuII puffer 100 mM Tris-t (pH 7,9), 100 mM MgCl2-ot, 500 mM NaCl-ot és 10 mM DTT-t tartalmazott.
Az AP|6, AP17’ és a PAD4 oligonukleotidszekvenciák szintetizálása és tisztítása az 1. példa eljárása szerint történt.
A PAD4 oligonukleotidot az 5’-végén 32P-vel jeleztük, megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitású radioaktív foszfor alkalmazásával, lásd 2C. példa.
Hordozó DNS-ként humán placenta-DNS-t (ΗΡ-DNS, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) alkalmaztunk, amit a 10 mg/ml koncentrációjú, 5 mM MgCl2-ot tartalmazó oldat 10 perces, 90 °C-on melegítésével kezeltünk.
A célszekvenciát megközelítőleg 5700 bázispárból álló HIV-szekvenciát tartalmazó, pBR 322-ben lévő (HÍV-11) HIV-klón BamHI-gyel történő linearizálásával kaptuk. A kiónt (0,026 pg) 25 egység BamHI en17
HU 218 095 Β zim 20 μΐ lx BamHI pufferrel készült elegyében 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáltuk. A hasítás után a célszekvenciát felhígítottuk úgy, hogy a célmolekulák kívánt száma 5 μΐ TE HP-DNS-sel készült elegyében 1 pg/pl volt.
Az amplifikációs termékek mennyiségi meghatározásánál alkalmazott standardok az alábbiak voltak: a célszekvencia előállításánál alkalmazott kiónnal azonos kiónból 2 pg-ot 250 egység PvuII-t tartalmazó, 100 pl mennyiségű lx PvuII hasítópufferben 37 °C-on 1 órát inkubáltunk. Az oldat NaCl-koncentrációját 0,3 pM értékre állítottuk be, 5,0 M NaCl alkalmazásával és a DNS kicsapása céljából 3 térfogatnyi etanolt adunk hozzá. 14 000xg fordulatszám mellett 30 percig centrifugáltuk az elegyet, a DNS-pelletet a felülúszó dekantálásával izoláltuk, és a DNS-t vákuumban megszárítottuk. Ezután a DNS-t 100 pl lx HaelII restrikciós pufferben lévő, 50 egység mennyiségű HaelII restrikciós enzimmel 37 °C-on 1 órás inkubálással elhasítottuk. A megmaradt enzimaktivitást 5 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel pusztítottuk el. A kapott 255 bázispár méretű restrikciós fragmentumot, mely a 162 bázispár méretű amplifikációs régiót tartalmazta, a PAD4 detektálási printerrel hibridizáltuk és a dNTP-k, valamint a polimeráz jelenlétében kiterjesztettük, így 192 bázispár méretű terméket kaptunk, amit a 162 bázispár méretű amplifikációs kiterjesztett termék mennyiségi meghatározásánál alkalmaztunk.
Minden amplifikációs reakciót 50 pl-es EppendorUcsövekben hajtottunk végre, 50 pl össztérfogatú 1 x reakciópufferben, mely 200 pM mennyiségben dNTP-ket tartalmazott, 25 pmolt az egyes amplifikációs primerekből (AP[6 és AP17’), 5,0 pg HP-DNS-t és 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
1. reakció: 25 000 célszekvencia-molekula,
2. reakció: 1000 célszekvencia-molekula,
3. reakció: 0,0 célszekvencia-molekula.
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 25 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. Az amplifikációs terméket a standardok mellett PAD4 detektálási printerrel tettük szelektíven láthatóvá, lásd fent.
A detektálási reakciókat 30 pl mennyiségű lx reakciópufferben hajtottuk végre, mely az egyes dNTP-kből 333 pM-t, 200 femtomól PAD4-et (7000 Ci/mmol) és 0,6 egység termofil polimerázt (MBR) tartalmazott. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
Reakció PvuII/HaelII Amplifikációs hasítóstandard reakció
IS. 50 femtomól
2S. 40 femtomól
3S. 30 femtomól
4S. 20 femtomól
5S. 10 femtomól
Reakció PvuII/HaelII hasítóstandard Amplifikációs reakció
6S. 2,0 femtomól
1A. 5,0 pl az 1. reakcióból
2Λ. 5,0 pl a 2. reakcióból
3A. 5,0 pl a 3. reakcióból
A detektálási reakciók 3 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 10 perces 60 °C-os inkubálással történtek. A reakciókat 30 pl futtatópuffer hozzáadásával állítottuk le, 3 percre 90 °C-ra melegítettük, majd hagytuk az elegyeket szoba-hőmérsékletűre lehűlni. A termékeket 15%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk. Amint a 21. ábrán, az autoradiogram fényképen láthatjuk, a standardok (1S.-6S. sáv) által termelt detektálási termék valamivel alacsonyabb jelet adott, mint az amplifikációs reakciókból kapott detektálási termék (1A.-3A. sáv). Ez megfelel a 192 bázispár méretű, illetve a 162 bázispár méretű szekvenciák kalkulált méretének.
Az amplifikációs reakciók lineáris választ adtak a kiindulási célszekvenciák és a 0 célszekvenciák (3A. sáv) mennyiségével, melyek a termék keletkezésének nem mutatták a jelét. Az értékelések szerint a 2. reakció (2A. sáv) megközelítőleg 10 femtomól/5 pl reakcióterméket tartalmazott, összehasonlítva a 10 femtomól standard által adott jellel. Az amplifikáció által kapott módosított reakcióterméket az alább bemutatásra kerülő ellenőrzött szennyezési kísérletek során alkalmaztuk.
B. A HÍV PCR-amplifikációja, szennyezés jelenlétében, hasítással vagy anélkül
A kísérlet során vad típusú célszekvenciákat (1000 vagy 0 molekula) szennyeztünk meg a 2A. reakcióból származó, 200 000, 20 000 vagy 0 mennyiségű módosított amplifikációs termékkel. A reakcióelegyeket aktív hasítószerrel (Fok I) vagy inaktív hasítószerrel (dFok I) kezeltük. Az inkubálás a hasítószerrel előre meghatározott ideig, zárt rendszerben történt, majd utána amplifikációs ciklusokat hajtottunk végre. Az első PCR-ciklus 90 °C-os hőmérséklete valamennyire elpusztította a Fok I aktivitást, így az újonnan keletkezett, az ép, vad típusú célmolekulákból származó, módosított amplifikációs termékek exponenciálisan halmozódtak fel.
Az alábbiak kivételével minden, a példa során alkalmazásra került reagens azonos volt az 5A. példában alkalmazottakkal. A 4 egység/pl koncentrációjú Fok I restrikciós enzim beszerzési helye: New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts).
Az inaktív hasítószert, a dFok I-et, a Fok I enzim egy részének forró vízfürdőben történő, 10 perces hőkezelésével kaptuk.
A futtatópuffer azonos volt a 2B. példában alkalmazottal.
A minták szennyezésére a 2A. reakcióban kapott módosított amplifikációs terméket (kiindulási koncentráció 2 femtomól/pl) alkalmaztuk, melyből vízzel hígítási sort készítettünk, és így a szennyező molekulák kívánt mennyiségét tartalmazó elegyet kaptunk, melyet a mintákhoz adhattunk.
HU 218 095 Β
Minden amplifikációs reakciót 50 μΐ-es Eppendorfrcsőben hajtottunk végre, 50 pl össztérfogatú lx reakciópufferben, mely 200 pM mennyiségben dNTP-ket tartalmazott, 25 pmolt az egyes amplifikációs primerekből (AP|6 és AP17’), 5,0 pl HP-DNS-t és 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
Reakció Célmolekula Szennyező Hasítószer molekula
1. 1 000 20 000 Foki
2. 1 000 20 000 Foki
3. 0 20 000 Foki
4. 0 20 000 Foki
5. 1 000 20 000 dFok I
6. 1 000 20 000 dFokl
7. 0 20 000 dFok I
8. 0 20 000 dFokl
9. 1 000 200 000 Foki
10. 1 000 200 000 Foki
11. 0 200 000 Foki
12. 0 200 000 Foki
13. 1 000 200 000 dFokl
14. 1 000 200 000 dFok I
15. 0 200 000 dFokl
16. 0 200 000 dFok I
17. 1 000 0 nincs
18. 1 000 0 nincs
19. 0 0 nincs
20. 0 0 nincs
A Fok I enzimmel végrehajtott reakcióelegyek 8 egység mennyiségű aktív enzimet tartalmaztak. A dFok Igyel jelölt reakciók során azonos mennyiségű hőinaktivált enzimet alkalmaztunk. Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben hajtottuk végre, először 37 °C-on 60 perc alatt a hasítási reakció ment végbe, majd a 2 perces 90 °C-on történő hőkezelés következett, és 5 perces 50 °C-os kezeléssel fejeztük be a reakciót. A reakciótermékeket az egyes reakcióelegyek 5 pl mennyiségének 1 pl 32P-vel jelzett PAD4 (megközelítőleg 7000 Ci/'mmol fajlagos aktivitás) TEben készült elegyével detektáltuk, majd 5 perces 90 °C-on történő hőkezelés és 10 perces 60 °C-on történő kezelés következett. Miután az elegy szoba-hőmérsékletűre hűlt, 10 pl futtatópuffert adtunk hozzá, 3 percig 90 °C-on melegítettük és ismét szoba-hőmérsékletűre hűtöttük. A termékeket 15%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Amint a 22. ábrán, az autoradiogram fényképén láthatjuk, az amplifikáció előtt inaktív hasítószerrel kezelt, szennyezett minták erőteljes hibás pozitív értékeket adtak (162-mer termék) a 0 célsávokban (7., 8., 15. és 16. reakció). Ez a háttérjelek magas szintje miatt nem tette lehetővé az igazi reakciók (5., 6., 13. és 14. reakció) láthatóvá tételét. Ezzel szemben az amplifikáció előtt aktív hasítószerrel kezelt szennyezett minták erőteljes 1000 molekula kontrollt adtak (1., 2., 9. és 10. reakció) a megfelelő 0 molekula kontrolijaikhoz képest (3., 4., 11. és 12. reakció). Meg kell jegyeznünk, hogy a Fok 1-gyel elhasított szennyezés 1000 molekulájából származó jelek (1., 2., 9. és 10. reakció) sokkal jellegzetesebbek voltak, mint a nem szennyezett vagy a Fok Igyel nem kezelt (17. és 18. reakció) célszekvenciák 1000 molekulájából származó jelek. Bár a jelenség általánosan megfigyelhető volt, nem tudjuk megmagyarázni, mi okozta ezt a jelenséget a Fok I-et tartalmazó reakciók fokozott amplifikációs jeleinél.
Ez az eljárás megfelel a szennyeződések ellenőrzésére, mivel az amplifikációs eljárások során a hasítószerrel történő kezelés után soha nem alkalmazunk nyitott reakcióedényt. így az eljárás biztosítja, hogy az amplifikáció előtt ne kerüljön szennyező anyag a reakcióedénybe és ne kapjunk hibás pozitív eredményeket.
6. példa
A PCR eredetű amplifikációs termék ribonukleotidmódositása: a módosított amplifikációs termék kémiai és enzimes hasításának összehasonlítása
A példában az egyes amplifikációs primereken egyszeri ribonukleotidszubsztitúciót hajtottunk végre, így a kapott PCR eredetű amplifikációs termék szálaiba labilis módosítást vittünk. A kapott amplifikációs termékek labilis kötéseit a megfelelő 3’-végeken egyszeri ribonukleotidmódosítást tartalmazó módosított amplifikációs primerek polimerázkiterjesztésével hoztuk létre, így a módosított amplifikációs termék mind az enzimes lebontásra (alacsony hőmérsékleten RN-áz H), mind a kémiai lebontásra (magas hőmérsékleten, erős bázis jelenléte) alkalmassá vált.
Amplifikációs szekvenciaként 75 bázispárból álló HIV-szekvenciát alkalmaztunk. Ezt a 75-mer célszekvenciát két 15-mer amplifikációs primer (API8 és AP21’) és egy 26-mer detektálási primer (PAD5) alkalmazásával amplifikáltuk, lásd 23. ábra.
A. A HÍV módosított amplifikációs printerrel történő PCR-amplifikációja és a kapott módosított amplifikációs termékek mennyiségi meghatározása
A példában HIV-pBHIO kiónt [Hahn és társai, Natúré, 312, 166 (1984)] amplifikáltunk, a megfelelő 3’-végeken egyszeri ribonukleotid-módosítást tartalmazó AP,8- és AP2l’-módosított amplifikációs primerek alkalmazásával. A kapott módosított amplifikációs termékek mennyiségi meghatározását hígítást sorral és ismert mennyiségű vad típusú célszekvencia-standard újraamplifikálásával végeztük. Az így meghatározott mennyiségű módosított amplifikációs terméket alkalmaztuk a következő kísérlet során.
Az AmpliTaq™ DNS-polimerázt (8 egység/pl) a Perkin-Elmer/Cetus cégtől szereztük be.
A 10 mM koncentrációjú dezoxinukleozid-5’-trifoszfátok (dATP, dCTP, dGRP és dTTP) a Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, Connecticut) GeneAmp™ DNS Amplification Reagent Kitjéből származtak.
A reakciópuffer [lOx] 100 mM Tris-t, 30 mM KCl-ot és 1 pg/ml koncentrációjú zselatint (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) tartalmazott.
Az AP|8, az AP21’ és a PAD5 oligonukleotidszekvenciákat az 1. példa eljárása szerint szintetizáltuk és
HU 218 095 Β tisztítottuk, azzal az eltéréssel, hogy az APls-at guanozinnal kezdődő hordozó RNS-ről szintetizáltuk, és az AP2|’-et uracillal kezdődő hordozó RNS-ről szintetizáltuk. Az RNS-t a Glen Research Corporationtól szereztük be (Hemdon, Virginia).
A PAD5 detektálási oligonukleotidot az 5’-végén megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitású 32Pvel jeleztük, lásd 2C. példa.
Hordozó DNS-ként humán placenta-DNS-t (HP-DNS, Sigma Chemical Company) alkalmaztunk, amit 10 mg/ml koncentrációban 10 mM MgCl2-ot tartalmazó oldatban 10 perces forró vízfürdőn történő melegítéssel kezeltünk.
A HIV-DNS-célszekvenciát HIV-pBHIO klón TEben történő hígításával kaptuk, és azonos térfogatú, 2 pg/ml koncentrációjú ΗΡ-DNS TE-ben készült elegyét adtuk hozzá. A HP-DNS jelenléte megakadályozta a kis mennyiségű DNS-célszekvenciának a hordozóhoz kötődését.
Minden amplifikációs reakciót 0,5 ml-es Eppendorff-csövekben hajtottunk végre, 100 pl össztérfogatú lx reakciópufferben, mely 100 pM mennyiségben dNTP-ket tartalmazott, 50 pmol-t az egyes amplifikációs primerekből (AP1S és AP2I’), 5,0 pg HP-DNS-t és 3,2 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
1-4. reakció: 1000 célszekvencia-molekula,
5-6. reakció: 0 célszekvencia-molekula.
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 30 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 30 másodperces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel.
A ciklusok lejátszódása után az 1 -4. reakcióelegyeket (1000 célmolekula) és az 5-6. reakcióelegyeket (0 célmolekula) elegyítettük, így minden amplifikációs termékből és a megfelelő 0 molekula kontroliból homogén oldatot kaptunk. Az elegyített 1-4. reakcióelegyre mint 1K reakcióra, míg az elegyített kontrollokra, vagyis az 5-6. reakcióelegyre mint OK reakcióra hivatkozunk.
Az amplifikációs termékeket az egyes reakcióelegyek (1K és OK) 10 pl mennyiségének 1 pl 32P-vel jelzett PAD4 detektálási szondával (megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás) történő elegyítésével detektáltuk, majd 2 perces 95 °C-on történő hőkezelés következett és 10 perces 60 °C-on történő kezelés. Miután az elegy szoba-hőmérsékletűre hűlt, 10 pl futtatópuffert adtunk hozzá, 3 percig 90 °C-on melegítettük és ismét szoba-hőmérsékletűre hűtöttük. A termékeket 10%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Amint a 24. ábrán láthatjuk, az 1000 molekulás reakciók (1K reakció, 1. sáv) a detektálás során erőteljes jelet adtak (a PAD-primeren egy 75-merből és további négy adenozingyökből összeállított 79-mer), ugyanakkor a 0 molekulás reakciók (OK reakció, 2. sáv) nem adtak detektálható jelet. Ez azt mutatja, hogy az ilyen típusú módosított primerek alkalmasak a PCR típusú amplifikációs eljárásokra.
Az amplifikációs termék mennyiségét egy PCR-amplifikáció futtatása alapján határoztuk meg, az 1K reakció hígítási sora és ismert mennyiségű vad típusú célszekvencia mellett.
Minden amplifikációs reakciót 0,5 ml-es EppendorR-csövekben hajtottuk végre, 50 pl össztérfogatú lx reakciópufferben, mely 200 pM mennyiségben dNTPket tartalmazott, 25 pmolt az egyes amplifikációs primerekből (AP18 és AP2i’), 5,0 pg HP-DNS-t és 3,2 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
7. reakció: 1000 célszekvencia-molekula,
8. reakció: 1000 célszekvencia-molekula,
9. reakció: 200 célszekvencia-molekula,
10. reakció: 200 célszekvencia-molekula,
11. reakció: 0 célszekvencia-molekula,
12. reakció: 0 célszekvencia-molekula,
13. reakció: 5 pl jjx 105 hígítású Rxn 1K,
14. reakció: 5 pl 105 hígítású Rxn 1K,
15. reakció: 5 pl jjx 106 hígítású Rxn 1K,
16. reakció: 5 pl )jx 106 hígítású Rxn 1K,
17. reakció: 5 pl fix 107 hígítású Rxn 1K,
18. reakció: 5 pl jjx 107 hígítású Rxn 1K.
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 30 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 30 másodperces 95 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A kapott amplifikációs termékeket az egyes reakcióelegyek 10 pl mennyiségének 1 pl 32Pvel jelzett PAD5 oligonukleotiddal (megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás) való elegyítésével detektáltuk, majd 2 perces 95 °C-on történő hőkezelés következett és 10 perces 60 °C-on történő kezelés. Miután az elegy szoba-hőmérsékletűre hűlt, 10 pl futtatópuffert adtunk hozzá, a denaturálás céljából 3 percig 90 °C-on melegítettük és ismét szoba-hőmérsékletűre hűtöttük. A termékeket 10%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Az autoradiogram 25. ábrán látható fényképe szerint az jjx 107 hígítású 1K reakció terméke (17. és 18. sáv) az 1000 molekulás vad típusú standarddal összehasonlítva (7. és 8. sáv) azonos intenzitású jelet adott. Ezek szerint az 1K reakció elegye 3 χ 10ιθ molekula módosított amplifikációs terméket tartalmaz 5 pl-es térfogatban. Ez az eredeti amplifikáció átlagos ciklusa hatékonysága 92%-ának felel meg.
B. A módosított amplifikációs termék RN-άζ H-val történő hasítása
A kísérlet során a 6A. példában kapott módosított amplifikációs terméket közvetlenül a PAD5 oligonukleotiddal történő detektálás előtt RN-áz H-val kezeltük. Amennyiben az amplifikációs termékben ribonukleotid volt, a termék teljes hosszánál 15 kilobázissal rövidebb termék detektálására számítottunk. Mivel az RN-áz H a ribopirimidinekre nézve specifikus, ebben a reakcióban csak az alsó szál hasítható (azaz az amplifikációs termék alsó szála egyszeri ribonukleotidkapcsolódást tartalmaz, míg a felső szál egyetlen ribonukleotidkomponense, a purin, egy riboguanozin). Továbbá, mivel a jel20
HU 218 095 Β zett detektálási primer az alsó szállal hibridizál és terjeszkedik, a hasítás mértéke egy rövidebb 6(64-mer) detektálási termék jelenlétének tulajdonítható.
Az RN-áz H-t a Sigma Chemical Companytól szereztük be és 10 mg/ml koncentrációban TE/150 mM NaCl-ben oldottuk fel. A DN-áz-aktivitást az oldat 15 perces, forró vízfürdőben történő melegítésével pusztítottuk el. Az alapoldat 1/200 hígítását (50 pg/ml) 150 mM NaCl-ban, további 15 percig forró vízfürdőben melegítettük, majd szobahőmérsékletűre hűtöttük le, a további kísérletek céljára.
A PAD5 detektálási primer azonos volt a 6A. példában alkalmazottal.
Az amplifikációs termék forrása az előző példa 1K és OK reakciója volt.
Az alábbi hasítási reakciókat hajtottuk végre:
Reakció Termék RN-áz
1. 10 pl 1K reakcióelegy lpl
2. 10 pl 1K reakcióelegy 0 pl
3. 10 pl OK reakcióelegy 1 μΐ
4. 10 pl OK reakcióelegy Opl
A hasítási reakció szobahőmérsékleten 2 óra alatt ment végbe, a kapott terméket 1 pl 32P-vel jelzett PAD5 oligonukleotiddal (megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás) detektáltuk, majd 2 perces 95 °C-on történő hőkezelés következett és 10 perces 60 °C-on történő kezelés. Miután az elegy szoba-hőmérsékletűre hűlt, 10 pl futtatópuffert adtunk hozzá, a denaturálás céljából 3 percig 90 °C-on melegítettük és ismét szobahőmérsékletűre hűtöttük. A termékeket 10%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Az autoradiogram fényképe a 25. ábrán látható. Az RN-ázzal kezelt és nem kezelt módosított amplifikációs termékek összehasonlítása (1. reakció, 1. sáv, illetve 2. reakció, 2. sáv) megerősíti azt, hogy a ribonukleotidhelyeken RN-ázzal végzett hasítás az 1. sáv rövidebb detektálási terméke jelenlétének nyilvánítható. Továbbá a reakció kvantitatívnak tűnik. Mint vártuk, a 0 molekulás kontrollok egyike sem adott detektálható jelet (3. és 4. sáv).
C. A HÍV PCR-amplifikációja szennyezés jelenlétében, erős bázissal történő hasítással vagy anélkül
A kísérlet során vad típusú célmolekulát (pBHIO plazmid) szennyeztünk az 1K reakció módosított amplifikációs termékével, majd KOH-ával (hasítószer) vagy KCl-dal (kontroll) kezeltük. A szennyezés hasítással történő elpusztítása után a mintákat semlegesítettük és PCR-amplifikációnak vetettük alá annak megerősítésére, hogy a szennyező molekulák elpusztultak.
A szennyezés az 1K reakcióból származó módosított amplifikációs termék volt, 6χ 109 molekula/pl koncentrációban, amit a 6A. példában határoztunk meg. A mintából hígítást sort készítettünk, így 1000 molekula mennyiségű módosított amplifikációs terméket tartalmazó alapoldatot kaptunk 5 pl-enként. Ez az alapoldat a termékmolekulák nem specifikus kötések létesítésével kialakuló veszteségének megakadályozása céljából 0,25 pg/pl koncentrációjú HP-DNS-t tartalmazott.
A DNS-célszekvencia, a ΗΡ-DNS, a reakciópuffer, a dNTP-k, az AP,S, illetve az AP2i’ amplifikációs primerek és a jelzett PAD5 amplifikációs primer azonos volt a 6A. példában alkalmazottakkal.
Az AmpliTaq™ DNS-polimerázt (5 egység/pl) a Perkin-Elmer/Cetus cégtől szeretük be.
A kálium-hidroxidot (KOH) desztillált vízben oldottuk fel, így 600 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
A kálium-kloridot (KC1) desztillált vízben oldottuk fel, így 600 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
A sósavat (HC1) desztillált vízben hígítottuk fel, így 600 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
A célmolekulákat 5 pl célszekvencia (1000 vagy 0 molekula) 5 pl szennyezett alapoldattal (1000 molekula) készült elegyével szennyeztük. A mintákat ezután 5 pl KOH- vagy KCl-alapoldattal kezeltük (600 mM, 200 mM végső káliumkoncentrációval) és a hasítási reakció lejátszódása céljából 94 °C-on 60 percig melegítettük. A KOH-dal kezelt mintákat 5 pl HCl-dal semlegesítettük, míg a KCl-dal kezelt mintákat 5 pl H2O-zel. A reakciókat az alábbi módon jelöltük:
Reakció KOH KC1 HC1 H,O Cél- molekula
1. Opl 5 pl Opl 5 pl 1000
2. Opl 5 pl Opl 5 pl 1000
3. Opl 5 pl Opl 5 pl 0
4. Opl 5 pl Opl 5 pl 0
5. 5 pl Opl 5 pl Opl 1000
6. 5 pl Opl 5 pl Opl 1000
7. 5 pl Opl 5 pl Opl 0
8. 5 pl 0 pl 5 pl 0 pl 0
lx reakciópufferrel - mely 100 pM mennyiségben dNTP-ket tartalmazott, 50 pmol-t az egyes amplifikációs primerekből (AP!8 és AP21’) és 3,2 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt - minden reakcióelegyet 100 pl végső térfogatúra állítottunk be. A reakciókat 30 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 95 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A kapott amplifikációs termékeket az egyes reakcióelegyek 10 pl mennyiségének 1 pl 32P-vel jelzett PAD5 oligonukleotiddal (megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás) való elegyítésével detektáltuk, majd 2 perces 95 °C-on történő hőkezelés következett és 10 perces 60 °C-on történő kezelés. Miután az elegy szoba-hőmérsékletűre hűlt, 10 pl futtatópuffert adtunk hozzá, a denaturálás céljából 3 percig 90 °C-on melegítettük és ismét szobahőmérsékletűre hűtöttük. A termékeket 10%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Az autoradiogram fényképe a 27. ábrán látható. Amint vártuk, a KCl-dal kezelt minták (1-4. reakció, illetve 1-4. sáv) esetén az 1000 molekulás célreakciók nem különböztethetők meg a 0 molekulás kontrollreakcióktól. Ennek az az oka, hogy az 1000 szennyező molekula jelenlétéből adódó erőteljes hibás pozitív jelekre nézve a KCl-kezelés hatástalan. Ezzel szemben az amplifikáció előtt KOH-dal kezelt minták esetén az 1000 molekulás célreakciók (5. és 6. reakció, illetve 5. és 6. sáv) jól megkülönböztethetők a 0 molekulás kont21
HU 218 095 Β rollreakcióktól (7. és 8. reakció, illetve 7. és 8. sáv). Ennek az az oka, hogy az 1000 szennyező molekula jelenlétéből adódó zavaró jeleket a KOH-kezelés hatásosan eltávolította.
7. példa
Az LCR eredetű amplifikációs termék ribonukleotidmódosítása; a módosított amplifikációs termék kémiai és enzimes hasításának összehasonlítása
A példában egy LCR típusú amplifikáció során előállított amplifikációs termékbe számos labilis módosítást vittünk be. A példa szerinti labilis kötéseket a 3’végükön egyszeri ribonukleotidot tartalmazó amplifikációs szondák ligálásával hoztuk létre. A 6. példa szerinti módosított PCR eredetű amplifikációs termékekhez hasonlóan az ilyen labilis kötések bevitele a módosított amplifikációs termékbe azt mind az enzimes lebontásra (alacsony hőmérsékleten, RN-áz H), mind a kémiai lebontásra (magas hőmérsékleten, erős bázis jelenléte) alkalmassá tette.
Amplifikációs szekvenciaként 45 bázispárból álló HIV-szekvenciát alkalmaztunk. Ezt a 45-mer célszekvenciát három pár amplifikációs szonda (AP|8/pAP|8’, pAP 19/pAP i9’, pAP20/pAP20’) alkalmazásával amplifikáltuk, lásd 28. ábra.
A. A HÍV módosított amplifikációs szondával történő LCR-amplifikáciöja és a kapott módosított szondák mennyiségi meghatározása
A példában a HIV-pBHIO klón 45 bázispárból álló részét amplifikáltuk, három pár amplifikációs szonda (AP18/pAP18’, pAP|9/pAP19’, pAP20/pAP20’) alkalmazásával. Az AP18, pAP|9, pAP|9’, pAP20 és pAP20’ amplifikációs szondák a megfelelő 3’-végeken egyszeri ribonukleotidmódosítást tartalmaztak. A kapott módosított amplifikációs termékek mennyiségi meghatározását hígítási sorral és ismert mennyiségű vad típusú célszekvencia standard újraamplifikálásával végeztük. Az így meghatározott mennyiségű módosított amplifikációs terméket alkalmaztuk a következő kísérlet során.
A Thermus thermophilusból HB8 (ATCC No. 27634) származó termostabilis ligáz (TSL) és a termostabilis DNS-ligáz-puffer (TSLB) azonos volt a 2B. példában alkalmazottakkal.
A 3’-végén riboguanozingyököt tartalmazó AP18 azonos volt a 6A. példában alkalmazottal.
Az 5’-végén kémiai eljárással foszforilezett pAPl8’ ohgonukleotidot az 1. példa eljárása szerint szintetizáltuk és tisztítottuk.
A pAP19, pAP|9’, pAP20 és pAP20’ oligonukleotidokat úgy szintetizáltuk, hogy 5’-végükön foszfátcsoportot és 3’-végükön egyszeri ribonukleotidcsoportot tartalmazzanak. A foszfátcsoportokat kémiai foszforilezéssel vittük be, az 1. példa eljárása szerint. A 3’-ribonukleotidokat a megfelelő RNS-ről induló szintézis kezdetekor vittük be (például a pAP19-et RNS-G-ről, a pAP)9’-et RNS-C-ről, a pAP20-at RNS-A-ról és a pAP20’-at RNS-U-ról szintetizáltuk). Az RNS-t a Glen Research Corporationtól (Hemdon, Virginia) szereztük be. A szintézis után az oligonukleotidok védettségét általánosan ismert eljárásokkal megszüntettük és általánosan ismert eljárásokkal tisztítottuk azokat, lásd 1. példa. A következő kísérletről meg kell jegyeznünk, hogy itt sem az nem szükséges, hogy a pAP20 a 3’-végen ribonukleotidot tartalmazzon, sem az, hogy a pAP20’ az 5’-végen foszforilezve legyen. Ezeket a módosításokat azért hoztuk létre, hogy segítségükkel a további kísérletek során nagyobb számú amplifikációs szondát alkalmazhassunk.
Az AP18/pAP18’ amplifikációs szondapárt a 2. példa eljárása szerint 32P-vel jelzett r-32P-dezoxi-adenozintrifoszfáttal és T4-kinázzal jeleztük (megközelítőleg 7000 Ci/mmol fajlagos aktivitás). Meg kell jegyezni, hogy csak az ΑΡ,8 amplifikációs szondát jeleztük, mivel a pAP(8’ ohgonukleotidot az 5’-végen már foszforileztük.
A ΗΡ-DNS azonos volt a 6A. példában alkalmazottal.
A cél-DNS-t (pBHIO klón) a megfelelő koncentráció eléréséig HP-DNS-ben hígítottuk (1 pg/μΙ), majd a plazmid-DNS fragmentálódása és denaturálódása céljából forró vízfürdőn 15 percig melegítettük.
Minden amplifikációs reakciót 0,5 ml-es Eppendorfö-csövekben hajtottunk végre, 40 μΐ össztérfogatú lx TSLB-ben, mely 2 pikomol mennyiséget tartalmazott az egyes amplifikációs szondákból (pAP18, pAP18’, pAP,9, pAPig’, pAP20 és pAP20’), valamint 100 femtomólt a 32P-vel jelzett APi8/pAP,8’ amplifikációs szondapárból, 0,06 egység TSL-t, 10 pg HP-DNS-t és 66 μΜ NAD-ot. Minden egyes reakcióelegy 2,10 pikomól mennyiségű, 333 Ci/mmol fajlagos aktivitású AP)8/pAP|8’ amplifikációs szondapárt tartalmazott. Ez a jelzés a kapott amplifikációs termékek láthatóvá tételéhez nyújtott segítséget. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta :
1. reakció: 20 attomól célszekvencia,
2. reakció: 20 attomól célszekvencia,
3. reakció: 2 attomól célszekvencia,
4. reakció: 2 attomól célszekvencia,
5. reakció: 0,2 attomól célszekvencia,
6. reakció: 0,2 attomól célszekvencia,
7. reakció: 0,0 attomól célszekvencia,
8. reakció: 0,0 attomól célszekvencia.
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 15 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A reakcióelegyek fi részét (5 μΐ) eltávolítottuk és 10 μΐ futtatópufferhez adtuk. A mintákat 3 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel denaturáltuk, majd hagytuk szoba-hőmérsékletűre hűlni. A termékeket 15%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk. Az amplifikációs termék hozamának meghatározása céljából körülbelül 5 perccel az elektroforézises elválasztás befejezése előtt ismert mennyiségű AP18/pAP]8’ oligonukleotidpárt (a fenti kísérletben alkalmazottal azonos fajlagos aktivitással) futtatunk meg a gélen standardként. Ezeket a standardokat a
9. sávban (25 femtomól), a 10. sávban (2,5 femtomól) és a 11. sávban (0,25 femtomól) láthatjuk.
HU 218 095 Β
Az autoradiogram fényképe szerint (29. ábra) a várt 45-mer amplifikációs termék közvetlenül az amplifikációs reakció kezdetén jelen lévő célszekvencia mennyiségének hatására keletkezik. A 0 molekula kontrollok nem adtak detektálható jelet (7. és 8. reakció, 7. és 8. sáv), míg a 45 bázisos amplifikációs termékek még a legalacsonyabb célszekvenciaszint mellett is (0,2 attomol, 5. és 6. reakció, illetve 5. és 6. sáv) láthatók az autoradiogramon. Az 1-6. reakciók 45-mer amplifikációs termékeiből kapott jelek (1-6. sáv) a standardokkal (9-10. sáv) összehasonlítva 10 000-szeres amplifikációt mutattak. Ezek szerint az átlagos ciklushatékonyság 85%.
A módosított amplifikációs termékek mennyiségi meghatározásának igazolása céljából az 1. reakcióban kapott anyagból hígítási sort készítettünk (a módosított amplifikációs termék hozama szerint) és vad típusú célstandardok mellett újraamplifikáltuk.
Minden amplifikációs reakciót 0,5 μΐ-es Eppendorfr-csövekben hajtottuk végre, 40 μΐ össztérfogatú lx TSLB-ben, mely 2 pikomol mennyiséget tartalmazott az egyes amplifikációs szondákból (pAPi8, pAP|8’, pAP19, pAP,9’, pAP20 és pAP20’), valamint 100 femtomólt a 32P-vel jelzett AP]8/pAP|8’ amplifikációs szondapárból (333 Ci/mmol végső fajlagos aktivitás), 0,06 egység TSL-t, 5 pg HP-DNS-t és 66 μΜ NAD-ot. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta.
Reakció Célmolekula (attomól) Módosított amplifikációs termék (attomól)
12. 10 0
13. 10 0
14. 1 0
15. 1 0
16. 0 0
17. 0 0
18. 0 100
19. 0 100
20. 0 10
21. 0 10
22. 0 1
23. 0 1
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 15 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A reakcióelegyek / részét (10 μΐ) eltávolítottuk és 10 μΐ futtatópufferhez adtuk. A mintákat 3 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel denaturáltuk, majd hagytuk szoba-hőmérsékletűre hűlni. A termékeket 15%-os denaturáló PAGE-n megíúttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Az autoradiogram fényképe szerint (30. ábra) az amplifikációs termékek által létrehozott jelek - 10 attomól módosított amplifikációs termékre (20. és 21. reakció, 20. és 21. sáv) és 10 attomól vad típusú célszekvenciára (12. és 13. reakció, 12. és 13. sáv) számítva egyenlőek. Ezek szerint az 1. reakcióban becsült hozamok értéke pontos volt. Az 1. reakcióban kapott módosított amplifikációs terméket a következő példákban mint szennyező amplifikációs terméket alkalmaztuk. B. A HÍV LCR-amplifikációja szennyeződés jelenlétében, erős bázissal történő hasítással vagy anélkül
A kísérlet során vad típusú célmolekulát (pBH 10 plazmid) szennyeztünk az 1. reakció módosított amplifikációs termékével, majd KOH-dal (hasítószer) vagy KC1dal (kontroll) kezeltük. A szennyezés hasítással történő elpusztítása után a mintákat semlegesítettük és PCR-amplifikációnak vetettük alá annak megerősítésére, hogy a szennyező molekulák elpusztultak.
A reakcióelegyben a szennyeződést az 1. reakcióban kapott módosított amplifikációs termékkel biztosítottuk (mennyiségi meghatározás a 7A. példában), 5 femtomól termék per 1 μΐ reakcióelegy mennyiségben. A terméket felhígítottuk és a kívánt koncentrációban a reakcióelegyhez adtuk.
A kálium-hidroxidot (KOH) desztillált vízben oldottuk fel, így 700 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
A kálium-kloridot (KC1) desztillált vízben oldottuk fel, így 700 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
A sósavat (HC1) desztillált vízben hígítottuk fel, így 700 mM koncentrációjú alapoldatot kaptunk.
Az összes többi reagens azonos volt a 7A. példában alkalmazottakkal.
A reakcióelegyek célszekvenciát (10 attomól, illetve 0 attomól), szennyeződést (10 attomól), HP-DNS-t (5 pg) és amplifikációs szondát (pAP18/AP18’, pAP19/APi9’, pAP20/AP20’, valamint 0,10 pikomol 32Pvel jelzett AP|8/pAP18’-t) tartalmaztak, melyeket 18 μΐ térfogatban 4 μΐ KOH- vagy KCl-alapoldattal kezeltünk (700 mM, 127 mM végső koncentráció) és a hasítási reakció lejátszódása céljából 30 percre 90 °C-ra melegítettünk. A reakciókat 4 μΐ HCl-dal vagy H2O-zel állítottuk le, majd a fent már ismertetett LCR-amplifikáció következett. A reakciókat az alábbiak szerint terveztük meg.
Reakció KOH KC1 HC1 Η2Ο Cél- molekula
1. 4 pl Ομί 4 μΐ 0 μΐ 10
2. 4 pl Ομί 4 μΐ Ομί 10
3. 4 μΐ Ομί 4 μΐ 0 μΐ 0
4. 4 μΐ Ομί 4 μΐ 0 μΐ 0
5. Ομί 4 μΐ Ομί 4 μΐ 10
6. Ομί 4 μΐ Ομί 4 μΐ 10
7. Ομί 4 μΐ Ομί 4 μΐ 0
8. Ομί 4 μΐ Ομί 4 μΐ 0
Minden reakcióelegyet 40 μΐ végső térfogatra állítottunk be úgy, hogy azok 1 x TSLB-ben és 66 pL NADban voltak és 0,06 egység TSL-t tartalmaztak. Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 15 ciklusban hajtottuk végre, Perkm-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A kapott reakcióelegyek / részét (5 pl) eltávolítottuk,
HU 218 095 Β μΐ futtatópufferhez adtuk és 3 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel denaturáltuk. A termékeket 15%-os denaturáló PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk.
Az autoradiogram fényképe a 31. ábrán látható. Amint vártuk, a KCl-dal kezelt minták (5. és 6. reakció, illetve 5. és 6. sáv) 10 attomól céljelet adtak, ami nem különböztethető meg a 0 attomól céljeltől (7. és 8. reakció, illetve 7. és 8. sáv). Ez az eredmény a 10 attomól szennyeződés következtében várható volt. Ezzel szemben a KOH-dal kezelt minták a 0 attomól célreakciók esetén (3. és 4. reakció, illetve 3. és 4. sáv) nem mutattak jelet, míg 10 attomól esetén a céljelek (1. és 2. reakció, illetve 1. és 2. sáv) teljes mértékben pozitívak voltak. Ez azt mutatja, hogy a KOH olyan hasítószer, mely hatásosan kizárja a szennyeződés jelenlétéből adódó zavarást.
C. A HÍVLCR-amplifikációja RN-άζ A-val történő hasítás után
A kísérlet során a HÍV egy részét amplifikáltuk az előző kísérletek során alkalmazott amplifikációs szondák alkalmazásával (28. ábra) és a keletkező tennék RN-áz A hasítószerrel kezelt termékeinek alkalmazásával. Mivel az RN-áz A a pirimidingyökökre nézve specifikus, a kezelés során csak az amplifikációs termék alsó szála hasad el. A keletkező módosított amplifikációs termék alsó szála két közbenső ribopirimidinkötést tartalmaz, míg a felső szál két közbenső ribopuringyököt tartalmaz. Ezért a pAP20’ amplifikációs szondát 23P-vel úgy jeleztük, hogy csak a keletkező amplifikációs tennék alsó szála kapott jelzést.
Mivel a pAP20’ már tartalmaz 5’-foszfátcsoportot, a 23P-jelzést egy, az alábbiakban bemutatásra kerülő, kináz által katalizált kicserélődési reakcióval hajtottuk végre. 10 egység T4 polinukleotid-kinázt (New England Biolabs, Inc.) adtunk az 1,0 pikomól pAP20’ oligonukleotidot, 2,5 nanomól adenozin-5’-foszfátot (ADP, Sigma Chemical Company) és 100 pikomól y-32P-adenozin-5’-trifoszfátot (ATP, 700 Ci/mmol) tartalmazó, 10 pl mennyiségű pufferhez (40 mmol Tris, pH 7,6/10 mM MgCl2/12,5 mM DTT). A reakcióelegyet 30 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd a kicserélődési reakció leállítása céljából 90 °C-on 5 percig. A jelzett oligonukleotidot a jelzőanyag feleslegétől SephadexR G-50 oszlopon (Sigma Chemical Company) történő átnyomással választottuk el, 10 mM trietil-ammónium-bikarbonát eluens alkalmazásával. Az oligonukleotidot tartalmazó frakciókat elegyítettük és SpeedVacR koncentráló alkalmazásával (Savant Instruments, Inc., Farmingdalé, New York) megszárítottuk. A terméket 20 μΐ TEben újra felszuszpendáltuk (50 femtomól/μΐ) és fajlagos aktivitását meghatároztuk, értéke megközelítőleg 3500 Ci/mmol volt.
Az alkalmazott amplifikációs szonda (pAP]g/pAPls’, pAP|9/AP19’, pAP20/AP20’), a termostabilis ligáz (TSL), a termostabilis DNS-ligáz-puffer (TSLB), a hordozó DNS (ΗΡ-DNS) és a cél-DNS (pBHIO plazmid) azonos volt a 7A. példában alkalmazottakkal.
Az RN-áz A-t (Sigma Chemical Company) 10 mg/ml koncentrációban TE/150 mM NaCl-elegyben oldottuk fel. A szennyező DNS-aktivitást 15 perces, forró vízben történő kezeléssel pusztítottuk el. A következő kísérletben az így kapott alapoldat TE-ben készült 1/20 hígítását alkalmaztuk.
Minden amplifikációs reakciót 0,5 ml-es Eppendorfr-csövekben hajtottunk végre, 20 μΐ össztérfogatú lx TSLB-ben, mely 1,0 pikomól mennyiséget tartalmazott az egyes amplifikációs szondákból (pAP18, pAP18’, pAP19, pAP,9’, pAP20 és pAP20’), valamint 50 femtomólt a 32P-vei jelzett AP20’ amplifikációs szondából, 0,03 egység TSL-t, 5 pg HP-DNS-t és 66 μΜ NAD-ot. Minden egyes reakcióelegy 1,05 pikomól mennyiségű, megközelítőleg 167 Ci/mmol fajlagos aktivitású AP20’ amplifikációs szondát tartalmazott. Ez a jelzés a kapott amplifikációs termékek láthatóvá tételéhez nyújtott segítséget. A fentieken kívül a reakcióelegy még az alábbiakat tartalmazta:
1. reakció: 0 attomol célszekvencia,
2. reakció: 0 attomol célszekvencia,
3. reakció: 10 attomol célszekvencia,
4. reakció: 10 attomol célszekvencia.
Az egyes reakciócsövekhez két csepp ásványi olajat adtunk a hőciklusok során fellépő párolgás megakadályozása céljából. A reakciókat 15 ciklusban hajtottuk végre, Perkin-Elmer/Cetus Thermocyclerben, 2 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel és 5 perces 50 °C-os kezeléssel. A reakcióelegyek X részét (5 pl) eltávolítottuk és 5 pl futtatópufferhez adtuk. A mintákat 3 perces 90 °C-on történő hőkezeléssel denaturáltuk, majd hagytuk szoba-hőmérsékletűre hűlni. A reakcióelegyek további X részét (5 pl) eltávolítottuk és 2 pl RN-áz H-val kezeltük (1,0 pg). A reakcióelegyeket szobahőmérsékleten 60 percig inkubáltuk, majd a reakciót 5 pl füttatópufferrel leállítottuk, 3 percig 90 °C-on kezeltük, majd hagytuk szoba-hőmérsékletűre hűlni. Az RN-áz H-val kezelt reakcióelegyeket mint ÍR, 2R, 3R és 4R jelöltük.
A reakciótermékeket 10%-os PAGE-n megfuttattuk, majd autoradiográfiával vizsgáltuk. Az autoradiogram fényképe szerint (32. ábra) a 10 attomólos célreakciókban a várt 45-mer amplifikációs terméket kaptuk (3. és 4. reakció, illetve 3. és 4. sáv), míg a megfelelő 0 célkontrollok (1. és 2. reakció, illetve 1. és 2. sáv) nem mutatták az amplifikációs termék jelét. Ezzel szemben az RN-áz H-val kezelt minták nem mutatták 45-mer amplifikációs termék jelét (ÍR., 2R., 3R. és 4R. reakciók, illetve 5., 6., 7. és 8. sávok). Ez megerősíti azt a megállapítást, mely szerint az RN-áz H hasítószerrel történő kezelés hatásosan elpusztítja a módosított amplifikációs termékeket.

Claims (47)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az amplifikációs eljárás során az amplifikációs termék szennyeződésének csökkentésére, azzal jellemezve, hogy (a) az említett amplifikációs termékbe legalább egy módosítást viszünk be úgy, hogy az így kapott módosított amplifikációs termék megkülönböztethető legyen az említett célszekvenciától, ahol a módosítás valamely
    HU 218 095 Β ligandum, enzimfelismerési hely és/vagy kémiailag hasítható hely; és (b) az említett módosított amplifikációs termékből valamilyen módon szelektíven kizárjuk az említett módosított amplifikációs terméket.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosítást enzimfelismerési helyek alkalmazásával hozzuk létre.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosítás egy enzimfelismerési hely, és az említett módosított amplifikációs terméket szelektíven kizáró enzimet alkalmazunk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy RN-áz-felismerési hely, és az említett módosított amplifikációs terméket RN-áz alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett RN-ázt az RN-áz H, illetve az RN-áz A csoportjából választjuk.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett RN-áz RN-áz A.
  7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy restrikciósenzim-felismerési hely, és az említett módosított amplifikációs terméket restrikciós enzim alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett restrikciósenzim-felismerési helyet távol hasító restrikciós enzim (remote cutting restriction enzyme) határozza meg.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett távol hasító enzim Fok I.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosítás egy ligandum, és az említett módosított amplifikációs tennék szelektív kizárása céljából az említett ligandum immobilizált, specifikus kötőpartnerét alkalmazzuk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett ligandumot a biotin és a fluoreszcein csoportjából választjuk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosítási hely egy kémiailag hasítható hely.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs szondába az említett kémiailag hasítható helyet a szonda részszekvenciái 3’- és 5’végeinek homobifunkcionális kapcsolószerrel történő összekapcsolásával hozzuk létre, ahol a homobifunkcionális kapcsolószert az alábbiak közül választjuk: ditio-bisz(szukcinimidil-propionát), diszukcinimidil-tartarát vagy etilénglikol-bisz(szukcinimidil-szukcinát).
  14. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kémiailag hasítható hely egy közbenső ribonukleotidkötést tartalmaz.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett amplifikációs eljárás egy polimeráz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás vagy egy ligáz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás.
  16. 16. Polimeráz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás céljára alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy legalább egy módosított amplifikációs prímért tartalmaz, mely legalább egy módosítást képes bevinni egy PCR eredetű amplifikációs termékbe úgy, hogy a keletkező PCR eredetű amplifikációs tennék megkülönböztethető legyen a célszekvenciától, ahol a módosítás valamely ligandum, enzimfelismerési hely és/vagy kémiailag hasítható hely; és egy eszközt tartalmaz az említett módosított PCR eredetű amplifikációs tennék szelektív kizárására.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs primer enzimfelismerési helyekkel módosított amplifikációs primer.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs primer egy enzimfelismerési hellyel módosított amplifikációs primer, és az említett PCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása enzimmel történik.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy RN-áz-felismerési hely, és az említett PCR eredetű módosított amplifikációs terméket RN-áz alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett RN-ázt az RN-áz H, illetve az RN-áz A csoportjából választjuk.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett RN-áz RN-áz A.
  22. 22. A 18. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy restrikciósenzim-felismerési hely, és az említett módosított, PCR eredetű amplifikációs terméket restrikciós enzim alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett restrikciósenzim-felismerési helyet távol hasító restrikciós enzim (remote cutting restriction enzyme) határozza meg.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett távol hasító enzim Fok I.
  25. 25. A 17. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs primer egy kémiailag hasítható hellyel módosított amplifikációs primer, és az említett PCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása erős bázissal történik.
  26. 26. A 17. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs primer egy ribonukleotidszubsztitúciót tartalmaz.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett ribonukleotidszubsztitúció az említett módosított amplifikációs primer 3’-végén található.
  28. 28. Polimeráz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás céljára alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy dezoxinukleozid-trifoszfátok elegyét tartalmazza, ahol legalább egy az említett dezoxinukleozid-trifoszfátok közül módosítva van, és így legalább egy módosítást képes bevinni egy PCR eredetű amplifikációs termékbe úgy, hogy a keletkező PCR eredetű amplifikációs tennék megkülönböztethető legyen a célszekvenciától; ahol a módosítás valamely ligandum, enzimfelismerési hely és/vagy kémiailag hasítható hely; és
    HU 218 095 Β egy eszközt tartalmaz az említett módosított PCR eredetű amplifikációs termék szelektív kizárására.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított dezoxinukleozid-trifoszfát enzimfelismerési helyekkel módosított dezoxinukleozid-trifoszfát.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy dezoxiribonukleozid-trifoszfát, és az említett PCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása RN-ázzal történik.
  31. 31. A 29. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett dezoxinukleozid-trifoszfát egy dezoxiribonukleozid-trifoszfát, és az említett PCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása erős bázissal történik.
  32. 32. Ligáz-láncreakció típusú amplifikációs eljárás céljára alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy legalább egy módosított amplifikációs szondát tartalmaz, mely legalább egy módosítást képes bevinni egy LCR eredetű amplifikációs termékbe úgy, hogy a keletkező LCR eredetű amplifikációs termék megkülönböztethető legyen a célszekvenciától; ahol a módosítás valamely ligandum, enzimfelismerési hely és/vagy kémiailag hasítható hely; és egy eszközt tartalmaz az említett módosított LCR eredetű amplifikációs termék szelektív kizárására.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs szonda enzimfelismerési helyekkel módosított amplifikációs szonda.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs szonda egy enzimfelismerési hellyel módosított amplifikációs szonda, és az említett LCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása enzimmel történik.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy RN-áz-felismerési hely, és az említett módosított LCR eredetű amplifikációs terméket RN-áz alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett RN-ázt az RN-áz H, illetve az RN-áz A csoportjából választjuk.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett RN-áz RN-áz A.
  38. 38. A 34. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzimfelismerési hely egy restrikciósenzim-felismerési hely, és az említett módosított, LCR eredetű amplifikációs terméket restrikciós enzim alkalmazásával zárjuk ki szelektíven.
  39. 39. A 38. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett restrikciósenzim-felismerési helyet távol hasító restrikciós enzim (remote cutting restriction enzyme) határozza meg.
  40. 40. A 39. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett távol hasító enzim Fok I.
  41. 41. A 32. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs szonda egy kémiailag hasítható hellyel módosított amplifikációs szonda, és az említett LCR eredetű módosított amplifikációs termék szelektív kizárása erős bázissal történik.
  42. 42. A 32. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett módosított amplifikációs szonda egy ribonukleotidszubsztitúciót tartalmaz.
  43. 43. A 42. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett ribonukleotidszubsztitúció az említett módosított amplifikációs primer 3’-végén található.
  44. 44. Eljárás egy célszekvencia amplifikációs szekvenciájának amplifikálására, azzal jellemezve, hogy (a) az említett amplifikációs szekvenciát legalább két amplifikációs primer és egy dezoxinukleozid-trifoszfát feleslegével hozzuk érintkezésbe polimerizálószer jelenlétében, az említett amplifikációs printernek az említett amplifikációs szekvenciához való hibridizációjának kedvező körülmények között, ahol az említett amplifikációs primereknek legalább az egyikét és/vagy a dezoxinukleozid-trifoszfátot ligandumokkal, illetve enzimfelismerési helyek vagy kémiailag hasítható helyek alkalmazásával alakítjuk ki;
    (b) az említett módosított amplifikációs terméket elválasztjuk az említett célszekvenciától;
    (c) az (a) és (b) lépéseket megismételjük; és (d) az említett módosított amplifikációs termékből szelektíven kizárjuk az említett módosított amplifikációs terméket.
  45. 45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (d) lépést az amplifikációs eljárás kezdetén hajtjuk végre.
  46. 46. Eljárás egy célszekvencia amplifikációs szekvenciájának amplifikálására, azzal jellemezve, hogy (a) az említett amplifikációs szekvenciát legalább két amplifikációs szondapár feleslege mellett ligálószerrel hozzuk érintkezésbe, az említett amplifikációs szondának az említett amplifikációs szekvenciához való hibridizációjának kedvező körülmények között, ahol az említett amplifikációs szondáknak legalább az egyikét ligandumokkal, illetve enzimfelismerési helyek vagy kémiailag hasítható helyek alkalmazásával alakítjuk ki;
    (b) az említett módosított amplifikációs terméket elválasztjuk az említett célszekvenciától;
    (c) az (a) és (b) lépéseket megismételjük; és (d) az említett módosított amplifikációs termékből szelektíven kizárjuk az említett módosított amplifikációs terméket.
  47. 47. A 46. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (d) lépést az amplifikációs eljárás kezdetén hajtjuk végre.
HU9200301A 1990-05-01 1991-04-19 Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban HU218095B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51763190A 1990-05-01 1990-05-01
US68647891A 1991-04-19 1991-04-19

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9200301D0 HU9200301D0 (en) 1992-04-28
HUT60331A HUT60331A (en) 1992-08-28
HU218095B true HU218095B (hu) 2000-05-28

Family

ID=27059197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9200301A HU218095B (hu) 1990-05-01 1991-04-19 Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban

Country Status (15)

Country Link
US (3) US5427929A (hu)
EP (1) EP0481069A4 (hu)
JP (2) JPH04506906A (hu)
KR (1) KR920702726A (hu)
CN (1) CN1059562A (hu)
BR (1) BR9105737A (hu)
CA (1) CA2063432A1 (hu)
FI (1) FI98932C (hu)
HU (1) HU218095B (hu)
IE (1) IE911456A1 (hu)
IL (1) IL97981A (hu)
NO (1) NO305962B1 (hu)
NZ (1) NZ237996A (hu)
PT (1) PT97534B (hu)
WO (1) WO1991017270A1 (hu)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5035996A (en) * 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5683896A (en) * 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5516663A (en) * 1990-01-26 1996-05-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction with endonuclease IV correction and contamination control
US5516292A (en) * 1991-05-02 1996-05-14 The Research Foundation Of State University Of New York Primer directed nucleic acid amplification including the addition of specific template DNA inactivating enzyme
US6207368B1 (en) 1992-08-04 2001-03-27 Beckman Coulter, Inc. Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions
US6180338B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Beckman Coulter, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US5591575A (en) * 1993-04-07 1997-01-07 Amersham International Plc Subtraction hybridization employing aziridinylbenoquinone cross-linking agents
US5462854A (en) * 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
US5605796A (en) * 1994-07-19 1997-02-25 Behringwerke Ag Method for preventing amplification of nucleic acid contaminants in amplification mixtures using nuclease-receptor conjugates
ZA956776B (en) 1994-08-25 1996-03-20 Akzo Nobel Nv A process for making the product of a nucleic acid amplification reaction incapable of being a target for further amplification a diagnostic assay employing said process a kit and a container suitable for carrying out said process for assay
US5843650A (en) * 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5830655A (en) * 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
EP0832280A2 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Abbott Laboratories Probe masking method of reducing background in an amplification reaction
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
EP1164203B1 (en) * 1996-11-06 2007-10-10 Sequenom, Inc. DNA Diagnostics based on mass spectrometry
DE69735445T2 (de) 1996-12-10 2006-08-10 Sequenom, Inc., San Diego Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung
IL121312A (en) * 1997-07-14 2001-09-13 Technion Res & Dev Foundation Microelectronic components, their manufacture and electronic networks containing them
JP2001520054A (ja) 1997-10-23 2001-10-30 エグザクト サイエンシーズ コーポレイション Ｐｃｒを用いる分子診断におけるコンタミネーションを検出するための方法
US6818404B2 (en) 1997-10-23 2004-11-16 Exact Sciences Corporation Methods for detecting hypermethylated nucleic acid in heterogeneous biological samples
US6437099B1 (en) * 1998-01-07 2002-08-20 Hamamatsu Photonics K.K. Fluorescene—activating antisera and IgG fraction therefrom
US6019839A (en) * 1998-04-17 2000-02-01 Applied Materials, Inc. Method and apparatus for forming an epitaxial titanium silicide film by low pressure chemical vapor deposition
US20030203394A1 (en) * 1998-05-04 2003-10-30 Yoav Eichen Detection of a target in a sample
EP1100972B1 (en) 1998-07-31 2006-06-14 Gen-Probe Incorporated Reversible inhibiting probes
IL126776A (en) * 1998-10-27 2001-04-30 Technion Res & Dev Foundation A method of investing gold
AU773978B2 (en) 1999-04-07 2004-06-10 Dennis Michael Connolly High resolution DNA detection methods and devices
US6232104B1 (en) 1999-08-17 2001-05-15 Dade Behring Inc. Detection of differences in nucleic acids by inhibition of spontaneous DNA branch migration
US6383755B1 (en) * 1999-09-08 2002-05-07 Clontech Laboratories, Inc. Methods and kits for determining the fidelity of polymerase chain reaction conditions
ES2447419T3 (es) 1999-09-13 2014-03-12 Nugen Technologies, Inc. Composiciones para la amplificación isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US7364920B2 (en) * 1999-10-27 2008-04-29 Technion Research And Development Foundation Ltd. Method for gold deposition
EP1152058A1 (en) * 2000-05-03 2001-11-07 Institut Curie Methods and compositions for effecting homologous recombination
AU2001268468A1 (en) 2000-06-13 2001-12-24 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
AU2001271595A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-08 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US7846733B2 (en) * 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
KR20020065471A (ko) * 2000-08-30 2002-08-13 산코 준야쿠 가부시키가이샤 유전자의 검출방법
US6815164B2 (en) 2000-10-06 2004-11-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
DE60142709D1 (de) 2000-12-13 2010-09-09 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
JP2005508135A (ja) 2001-03-09 2005-03-31 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｒｎａ配列の増幅のための方法および組成物
ZA200210369B (en) * 2001-03-09 2004-07-08 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for amplification or RNA sequences.
US20030203384A1 (en) * 2002-03-08 2003-10-30 Chafin David R. Multiplex detection of biological materials in a sample
ATE405676T1 (de) * 2002-03-11 2008-09-15 Nugen Technologies Inc Verfahren zur erzeugung doppelsträngiger dna mit einem 3'-einzelstranganteil und verwendungen dieser komplexe zur rekombination
WO2004011665A2 (en) * 2002-05-17 2004-02-05 Nugen Technologies, Inc. Methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
CA2510166A1 (en) * 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
WO2004092418A2 (en) * 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US20050208538A1 (en) 2003-12-29 2005-09-22 Nurith Kurn Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
EP1781813B1 (en) * 2004-06-17 2010-01-27 Epigenomics AG Compositions and methods for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions
WO2007030759A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
US9101160B2 (en) 2005-11-23 2015-08-11 The Coca-Cola Company Condiments with high-potency sweetener
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
US20100022403A1 (en) * 2006-06-30 2010-01-28 Nurith Kurn Methods for fragmentation and labeling of nucleic acids
US8017168B2 (en) 2006-11-02 2011-09-13 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US20090203531A1 (en) * 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
GB2470672B (en) 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
ES2576927T3 (es) 2010-10-22 2016-07-12 T2 Biosystems, Inc. Sistemas de RMN y métodos para la detección rápida de analitos
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
CN102827828B (zh) * 2011-06-16 2014-06-11 华东医学生物技术研究所 一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法
SG11201401628WA (en) 2011-10-19 2014-05-29 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
CA2862552A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
JP6181751B2 (ja) 2012-06-18 2017-08-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
EP2971130A4 (en) 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
US9546399B2 (en) 2013-11-13 2017-01-17 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
CN112301102A (zh) * 2019-07-31 2021-02-02 华南师范大学 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
EP0451141B1 (en) * 1988-05-20 1998-11-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Immobilized sequence-specific probes
US5035996A (en) * 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
FR2649122B1 (fr) * 1989-07-03 1991-10-18 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux techniques d'amplification par reaction de polymerisation en chaine (pcr)
DE69024286T2 (de) * 1989-09-01 1996-05-30 Life Technologies Inc Verfahren zur Überprüfung der Kontamination von oligonukleotidabhängigen Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen
EP0497921B1 (en) * 1989-10-26 1999-05-19 ISAACS, Stephen T. Method for inhibiting enzymatic synthesis of nucleic acids using isopsoralens
WO1992018521A1 (en) * 1991-04-10 1992-10-29 Life Technologies, Inc. Method for amplifying and altering an rna sequence

Also Published As

Publication number Publication date
AU7987191A (en) 1991-11-27
NZ237996A (en) 1993-11-25
NO915136D0 (no) 1991-12-30
JP2000125890A (ja) 2000-05-09
FI98932C (fi) 1997-09-10
HUT60331A (en) 1992-08-28
US6037152A (en) 2000-03-14
NO305962B1 (no) 1999-08-23
EP0481069A1 (en) 1992-04-22
US5876976A (en) 1999-03-02
FI916171A0 (fi) 1991-12-31
CN1059562A (zh) 1992-03-18
EP0481069A4 (en) 1992-06-24
KR920702726A (ko) 1992-10-06
NO915136L (no) 1992-02-28
BR9105737A (pt) 1992-08-18
HU9200301D0 (en) 1992-04-28
WO1991017270A1 (en) 1991-11-14
IL97981A (en) 1996-06-18
AU636499B2 (en) 1993-04-29
IE911456A1 (en) 1991-11-06
FI98932B (fi) 1997-05-30
IL97981A0 (en) 1992-06-21
US5427929A (en) 1995-06-27
CA2063432A1 (en) 1991-11-02
JPH04506906A (ja) 1992-12-03
PT97534B (pt) 1998-11-30
PT97534A (pt) 1993-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218095B (hu) Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban
JP2788034B2 (ja) ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法
US6518026B2 (en) Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
CA2035010C (en) Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
EP0878553B1 (en) Strand displacement amplification of RNA targets
US7687247B1 (en) Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
JP3085409B2 (ja) 標的核酸配列の検出方法およびそのための試薬キット
JP3080178B2 (ja) 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット
EP0379369A2 (en) Nucleic acid amplification using single primer
EP0427074A2 (en) Nucleic acid amplification employing transcribable hairpin probe
NO300782B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve
JPH09107997A (ja) 標的核酸の増幅方法及び増幅キット並びにｐｃｒ用組成物
JPH0723800A (ja) 核酸の検出方法
US5605796A (en) Method for preventing amplification of nucleic acid contaminants in amplification mixtures using nuclease-receptor conjugates
EP0522884A1 (en) Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5650302A (en) Method for reducing carryover contamination in an amplification procedure
AU636499C (en) Method for reducing carryover contamination in an amplification procedure
JPH074275B2 (ja) 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット
JPH03164200A (ja) 液体ハイブリダイゼーションによる遺伝子の分析方法
JPH05199900A (ja) 核酸配列の増幅方法、検出方法およびそれらの試薬キット

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee