JP2788034B2 - ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法 - Google Patents

ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 核酸ハイブリダイゼーションは、その同一性の検討お
よび核酸の存在の確立に用いられてきた。ハイブリダイ
ゼーションは相補性塩基の対の形成に基づいている。相
補性の単一鎖を一緒にインキユベーションすると、相補
性塩基配列は対になつて、二本鎖ハイブリツド分子を形
成する。一本鎖デオキシリボ核酸（ssDNA）またはリボ
核酸（RNA）が相補的核酸配列と水素結合構造を形成す
る能力は、分子生物学の研究において解析用の道具とし
て使用されてきた。放射比活性の高い放射性ヌクレオシ
ドトリホスフエートおよびT4キナーゼとDNAの32Pの標識
の利用により、生物学的に重要な様々の核酸配列の同
定、単離および特徴づけが可能になつた。核酸ハイブリ
ダイゼーシヨンは、独特な核酸配列に関連する疾患状態
の診断に偉大な力を示す。これらの独特な核酸配列は、
挿入、欠失、点突然変異、またはバクテリア、糸状菌、
真菌およびウイルスの感染による外来性DNAまたはRNAの
取得によつてDNAに遺伝子的または環境的変化を生じる
結果である。これまで核酸ハイブリダイゼーシヨンは主
として、学問的および工業的分子生物学実験に用いられ
てきた。核酸ハイブリダイゼーシヨンの臨床医学におけ
る診断道具としての応用は、患者の体液中に存在する疾
患関連DNAまたはRNAの濃度がきわめて低いことが多いた
め、また核酸ハイブリダイゼーシヨン解析の十分感度の
高い方法がないため、限られている。
特異的な核酸配列を検出するための現在の方法は、一
般的に、標的核酸を固体支持体たとえばニトロセルロー
ス濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ化濾紙またはナイロン
膜上に固定化するものである。標的核酸を支持体上に固
着させたのち、支持体を、適当に標識したプローブ核酸
と約２〜48時間接触させる。上記時間後に固体支持体を
制御された温度で数回洗浄して、ハイブリダイゼーシヨ
ンしなかつたプローブを除去する。ついで支持体を乾燥
し、ハイブリダイゼーシヨンした物質をオートラジオグ
ラフイーまたは分光法で検出する。
きわめて低濃度を検出しなければならない場合、現在
の方法は時間と労力を要し、放射性標識よりも検出が困
難な非同位元素標識は多くの場合不適当である。したが
つて、簡単な、迅速な、同位元素を用いない、均一もし
くは不均一な、核酸配列検出のための方法を利用可能に
する感度増大方法が望まれている。
最近、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法として知られ
るDNAの特異的セグメントの酵素的増幅方法が発表され
ている。このin vitro増幅操作は、変性、オリゴヌクレ
オチドプライマーアニーリング、および好熱性ポリメラ
ーゼによるプライマー延長のサイクルの反復に基づくも
のであり、プライマーと接する領域のコピーが指数的に
増大する。
DNAの逆の鎖にアニーリングするPCRプライマーを、一
方のプライマーのポリメラーゼ触媒延長生成物が他方の
鋳型鎖として働くように位置させると、オリゴヌクレオ
チドプライマーの５′末端間の距離によつて定められる
長さの個別フラグメントの蓄積が起こる。
先行技術 核酸配列の増幅、検出および／またはクローニング方
法はヨーロツパ特許出願０ 200 362号および０ 201
184に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応による
配列ポリメリゼーシヨンはSaikiら（Science,230:1350
〜1354、1986）によつて報告されている。オリゴヌクレ
オチドの製造方法はヨーロツパ特許出願０ 194 545号
に記載されている。ベルギー特許第904 402号にはDNA
検出プローブを作るための鋳型が開示されている。原生
細胞における遺伝子の増幅は米国特許第4,656,134号に
開示されている。
Langerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:6633〜6637、
1981）は、ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的合成
およびこれらの物質の新規核酸アフイニテイープローブ
としての使用を開示している。培養細胞およびパラフイ
ン包埋組織切片中のウイルスゲノムをビオチン標識ハイ
ブリダイゼーシヨンプローブの使用によつて検出する方
法は、Brigatiら（Virology,126:32〜50、1983）によつ
て論じられている。米国特許第4,486,539号には、一工
程サンドイツチハイブリダイゼーシヨン試験による微生
物の核酸の検出が開示されている。DNA検出に基づく悪
性腫瘍の感度のよい試験が米国特許第4,490,472号に記
載されている。米国特許第4,480,040号には、植物のウ
イロイド疾患およびウイルスの高感度かつ迅速な診断が
開示されている。これは、診断すべきウイロイドまたは
ウイルスの核酸に対して相補的な放射標識DNAを使用す
るものである。ヨーロツパ特許出願83106112.2号（1982
年６月23日出願の米国特許出願第391,440号に基づく優
先権主張）には、改良された標識ヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチド、ならびにそれらの製造、使用および検
出方法が教示されている。細胞DNAの検出および定量の
ための方法および組成物は、米国特許第4,423,153号に
開示されている。診断微生物学における特異的DNAプー
ロブについては米国特許第4,358,535号に論じられてい
る。多型性制限部位および核酸配列の検出方法はヨーロ
ツパ特許出願0164054号に記載されている。米国特許第
4,663,283号には二本鎖DNAの変更方法が記載されてい
る。
発明の要約 本明細書に開示される発明は、基本ポリヌクレオチド
配列の多重コピーを製造するための方法および試薬を包
含する。この方法は、ポリヌクレオチドの３′末端に位
置する標的ポリヌクレオチド配列の存在によつて開始さ
れる。この方法は、（ａ）ヌクレオシドトリホスフエー
トと鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在
下、それぞれ１個または２個以上の切断部位（たとえば
部位特異性切断配列）を含有する２個またはそれ以上の
鋳型配列からなる一本鎖パターンポリヌクレオチドの鋳
型配列とハイブリダイゼーシヨンした基本ポリヌクレオ
チド配列の延長を形成し、（ｂ）この延長が上記鋳型配
列（たとえばその中の部位特異性切断配列）とハイブリ
ダイゼーシヨンした場合その切断可能部位（たとえばポ
リヌクレオチド配列）を特異的に切断する手段の存在
下、その延長を切断可能部位（たとえばポリヌクレオチ
ド配列）でフラグメントに切断し、（ｃ）そのフラグメ
ントを解離し、（ｄ）そのフラグメントを上記一本鎖パ
ターンポリヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンし、
上記工程（ａ）〜（ｄ）を反復することを特徴とする。
この方法および試薬は、標的ポリヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド分析対象の存在が疑われるサンプ
ル中におけるそのポリヌクレオチド分析対象の存在の決
定を容易にするために応用できる。標的ポリヌクレオチ
ド配列はDNAでもRNAでもよい。この分析方法では、標的
配列が３′−OHで終結していない場合は標的配列をたと
えば酵素で切断して遊離の３′−OHを形成させる。この
標的配列を相補性核酸から解離させ、一本鎖パターンポ
リヌクレオチド中の２個またはそれ以上の鋳型配列の
３′末端に位置する相補性結合配列にハイブリダイゼー
シヨンさせる。標的配列をヌクレオシドトリホスフエー
トおよび鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼによ
つて鎖を延長させ、延長中の切断可能ポリヌクレオチド
配列を切断すると本発明の基本ポリヌクレオチド配列が
得られる。
本発明はまた、上記方法を実施するための組成物を包
含する。ひとつの組成物は、約８〜100個の塩基と少な
くとも１個の制限部位を有するオリゴヌクレオチド鋳型
からそれぞれ構成されるモノマー単位３〜1000個を含む
オリゴマーの一本鎖パターンポリヌクレオチドである。
モノマー単位は同一であることが好ましいが、必ずしも
必須ではない。オリゴマーは３′末端が標的配列と相補
性の結合配列で置換されていて、３′末端ヌクレオチド
は好ましくは、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼでの鎖延長反応を阻止する化学官能基によつて置換さ
れている。また、一本鎖パターンポリヌクレオチドは環
状であつてもよい。本発明の方法および組成物をサンプ
ル中のポリヌクレオチド分析対象の存在の決定に使用す
る場合は、切断されたフラグメントを、DNAフラグメン
トを検出できる任意の手段によつて検出する。このフラ
グメントまたはそれと相補性のフラグメントの存在はサ
ンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在ｉを示す。
図面の簡単な記述 第１図は、本発明に従つて基本ポリヌクレオチド配列
の多重コピーを得る方法を示す図である。
第２図は、本発明に従つて、ポリヌクレオチド分析対
象の存在に応じた基本ポリヌクレオチド配列の形成を行
う方法を示す図である。
第３図〜第６図は、ポリヌクレオチド分析対象の存在
により基本ポリヌクレオチド配列の形成を行う別法を示
す図である。
特定の態様の説明 本発明によれば、基本ポリヌクレオチド配列の多重コ
ピーの製造が可能になる。基本ポリヌクレオチド配列の
形成は、ポリヌクレオチドの３′末端に位置する標的ポ
リヌクレオチド配列の存在によつて開始され、このよう
な標的配列の検出に有用である。標的ポリヌクレオチド
配列は、サンプル中にその存在が疑われるポリヌクレオ
チド分析対象中に含有されるものであつてもよい。基本
ポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチド配列と同
一であつてもよいが、異なることが好ましい。基本ポリ
ヌクレオチド配列の多重コピーの製造には、以下の要素
が必要である。すなわち、（ｉ）基本ポリヌクレオチド
配列、（ii）それぞれ１個または２個以上の部位特異性
切断配列を含有する２個またはそれ以上の鋳型配列から
なる一本鎖パターンポリヌクレオチド、（iii）ヌクレ
オシドトリホスフエート、（iv）鋳型依存性ポリヌクレ
オチドポリメラーゼ、および（ｖ）基本ポリヌクレオチ
ド配列の延長が部位特異性切断配列とハイブリダイゼー
シヨンした場合に切断可能ポリヌクレオチド配列を特異
的に切断する手段である。鋳型配列は基本ポリヌクレオ
チド配列と相補性で、それとハイブリダイゼーシヨンで
きる。基本ポリヌクレオチド配列と一本鎖のパターンポ
リヌクレオチドの複合体は、その他の要素と同時にまた
はその全部もしくは一部と順次、切断可能なポリヌクレ
オチド配列を介して連結した基本ポリヌクレオチド配列
の１個または２個以上のコピーからなる基本ポリヌクレ
オチド配列の延長の形成、この延長の切断可能なポリヌ
クレオチド配列におけるフラグメントへの切断、基本ポ
リヌクレオチド配列と同一である切断基本ポリヌクレオ
チド配列と鋳型配列の複合体の解離、および基本ポリヌ
クレオチド配列と通常過剰に存在する一本鎖パターンポ
リヌクレオチドとの複合体の再形成を同時にまたはその
全部もしくは一部を順次行える条件下にインキユベーシ
ヨンする。上述の工程は所望の数のコピーが得られるま
で反復する。
標的ポリヌクレオチド配列は、検出すべきポリヌクレ
オチド分析対象の一部とすることができる。本発明の一
態様は、多重コピーを製造するための上記方法を開始さ
せて標的ポリヌクレオチド配列を生成させ、ポリヌクレ
オチド配列を定量するものである。この方法において
は、ポリヌクレオチド分析対象中の標的ポリヌクレオチ
ド配列が３′−ヒドロキシル基で終結していない場合
は、３′−ヒドロキシル基で終わるようにする。これは
通常、制限エンドヌクレアーゼとのインキユベーシヨン
によつて行われる。標的配列を相補性ポリヌクレオチド
から解離させ、鋳型配列の３′末端に結合した相補性結
合ポリヌクレオチド配列を有する一本鎖パターンポリヌ
クレオチドとハイブリダイゼーシヨンさせる。基本ポリ
ヌクレオチド配列の多重コピーの形成は、次に、標的配
列を一本鎖パターンポリヌクレオチドに沿つて延長さ
せ、基本ポリヌクレオチド配列と一本鎖パターンポリヌ
クレオチドのハイブリツドについて上述したと同様にし
て延長をフラグメントに切断する。切断されたフラグメ
ントを検出すれば、その存在はサンプル中におけるポリ
ヌクレオチド分析対象の存在を示す。ハイブリダイゼー
シヨン、鎖の延長および切断は、一本鎖ポリヌクレオチ
ドまたはヌクレオチドトリホスフエートが使い果たされ
るまであるいは鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼが不活性になるまで反復することができるが、標的ポ
リヌクレオチド配列によつて誘導された切断フラグメン
トと非特異的に誘導されたフラグメントの比が上昇しな
くなつたのちは反復しないことが好ましい。本方法はDN
AおよびRNA両配列の検出に使用できる。
本発明のひとつの組成物は、３〜100個のモノマー単
位からなるオリゴマーで構成された一本鎖パターンポリ
ヌクレオチドである。各モノマー単位は約８〜100個、
好ましくは10〜100個の塩基と少なくとも１個の制限部
位を有する同一のオリゴデオキシヌクレオチド鋳型から
構成される。このオリゴマーは、３′末端で、標的ポリ
ヌクレオチド配列に相補性の15個またはそれ以上の塩基
の結合ポリヌクレオチド配列によつて置換されているこ
とが好ましい。一本鎖パターンポリヌクレオチドは３′
末端で鋳型依存性ポリヌクレオチドポリマーによる鎖の
延長を阻止する化学的官能基で置換されているかまたは
環状である。
本発明の特定の態様についてさらに詳細に説明する前
に、以下に多くの用語について定義する。
ポリヌクレオチド分析対象−約20〜500,000個または
それ以上のヌクレオチド、通常は約100〜200,000個のヌ
クレオチド、多くの場合500〜15,000個のヌクレオチド
を有する重合ヌクレオチドであつて、測定される化合物
または組成物である。ポリヌクレオチド分析対象には任
意の起源の、精製されたまたは精製されていない形の核
酸が包含され、DNA（dsDNAおよびssDNA）およびRNA、tR
NA、mRNA、ｒ−RNA、ミトコンドリアDNAおよびRNA、ク
ロロプラストDNAおよびRNA、DNA−RNAハイブリツド、ま
たはそれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、微
生物のような生物学的材料たとえばバクテリア、酵母、
ウイルス、ウイロイド、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒ
トのゲノム、そのフラグメント等が含まれる。ポリヌク
レオチド分析対象は、生物学的サンプルのような複雑な
混合物の微小部分のみであつてもよい。分析対象は、様
々な生物学的材料から本技術分野においてよく知られた
操作によつて得ることができる。このような生物学的材
料の例を以下の第１表に掲げるが、これは単に例示の意
味であつて、本発明を限定するものではない。
第１表 微生物の例 コリネバクテリウム ジフテリア菌 ニユーモコツカス 肺炎双球菌 連鎖球菌 化膿連鎖球菌 Streptococcus salivarus ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌 白色ブドウ球菌 ナイセリア 髄膜炎菌 淋菌 腸内細菌 大腸菌 アイロゲネス菌 コリ型バクテリア 肺炎桿菌 腸チフス菌 豚コレラ菌 サルモネラ属 ネズミチフス菌 赤痢菌 Shigella schmitzii Shigella arabinotarda シゲラ属 フレキシナー菌 ボイド菌 ゾンネ菌 その他の腸内細菌 尋常変形菌 奇怪変形菌 プロテウス種 モルガン変形菌 縁膿菌 アルカリ大便菌 コレラ菌 ヘモフイラス−ボルデテラ インフルエンザ菌、軟下疳菌 Hemophilus hemophilus パラインフルエンザ菌 Bordetella pertussis パスツレラ ペスト菌 野兎病菌 ブラセラ マルタ熱菌 ウシ流産菌 ブタ流産菌 好気性胞子形成桿菌 炭疽菌 枯草菌 巨大菌 セレウス菌 嫌気性胞子形成桿菌 ポツリヌス菌 破傷風菌 ウエルチ菌 ノービ菌 セプチツクス菌 ヒストリチクス菌 第３型ロデラ菌 Clostridium difermentans スポロゲネス菌 マイコバクテリウム 人型結核菌 牛型結核菌 瀬菌 パラ結核性腸炎菌 放線菌（真菌様細菌） Actinomyces Isaeli 牛放線菌 Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis スピロヘータ 梅毒トレポネーマ 小スピリルム フランベジアトレポネーマ Streptobacillus monoiliformis ピンタトレポネーマ オーベルマイネル回帰熱スピロヘータ 黄疽出血症レプトスピラ 犬レプトスピラ トリパノゾーマ マイコプラズマ Mycoplasma pneumoniae その他の病原 Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis リケツチア（細菌様寄生体） Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetti Rickettsia quintana クラミジア（分類不能寄生体、バクテリア／ウイル
ス） クラミジアエージエンツ（命名不確定） 菌類 Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Hisoplasma capsulatum Coccidioides immitis Pracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer（Absidia corymbifera） Mycoplasma pneumoniae Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizua Phycomycetes Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Flonsecaea pedrosoi Fonsecaea compact Fonsecaea dermatidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialophora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Microsporum adouini ウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純疱疹 水痘 帯状疱疹 ウイルスＢ サイトメガロウイルス ポツクスウイルス 痘瘡 ワクシニア 牛痘ウイルス パラワクシニア Molluscum contagiosum ピコルナウイルス コツクスサツキーウイルス エコーウイルス ライノウイルス ミクソウイルス インフルエンザ（A,BおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） マンプスウイルス ニユーキヤツスル病ウイルス ミースレスウイルス リンダーペストウイルス 犬ジステンバーウイルス RSウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス 東部ウマ脳炎ウイルス 西部ウマ内炎ウイルス シンドビスウイルス チクグニアウイルス セムリキ森林熱ウイルス マヨラウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリホルニア脳炎ウイルス コロラドダニ熱ウイルス イエローフイーバーウイルス デングウイルス レオウイルス レオウイルス１〜３型 レトロウイルス ヒト免疫不全ウイルス（HIV） ヒトＴ細胞リンパ性白血病ウイルスI,II（HTLV） 肝炎 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス ラウシヤー白血病ウイルス グロスウイルス マロニー白血病ウイルス ヒト乳頭腫ウイルス ポリヌクレオチド分析対象は、適当な場所で切断処理
して、ポリヌクレオチドの３′末端に位置する標的ポリ
ヌクレオチド配列を含有するフラグメントを得る。すな
わち、分析対象を公知の方法で、たとえば制限エンドヌ
クレアーゼ処理または他の部位特異性化学切断法によつ
て切断することができる。この処理は末端３′−ヒドロ
キシ基または３′−ヒドロキシル基に変換可能な基を生
成するものでなければならない。
本発明の目的においては、ポリヌクレオチド分析対象
から得られた切断フラグメントは通常、少なくとも一部
変性しているかもしくは一本鎖であるか、または処理し
て変性するかもしくは一本鎖にする。このような処理は
本技術分野においてよく知られているとおりで、たとえ
ば熱またはアルカリ処理がある。たとえば、二本鎖DNA
は90〜100℃に約１〜10分間加熱すると変性した材料が
得られる。
標的ポリヌクレオチド配列−同定すべきヌクレオチド
の配列の少なくとも一部である。その配列は、それに対
して相補性でそれとハイブリダイゼーシヨンできる結合
ポリヌクレオチド配列の製造が可能な程度までわかつて
いる。標的ポリヌクレオチド配列は、通常約12〜1,000
個またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは15〜50個
のヌクレオチドを含有する。標的ポリヌクレオチド配列
は、３′−ヒドロキシル基で終結しているか、または
３′−ヒドロキシル基で終結させることができ、多くの
場合、ポリヌクレオチド分析対象の一部である。標的ポ
リヌクレオチド配列は一般にもつと大きな分子の部分で
あるが、実質的に全分子であつてもよい。標的ポリヌク
レオチド配列中のヌクレオチドの最小の数は、サンプル
中のポリヌクレオチド分析対象の存在が、そのポリヌク
レオチド分析対象を含まないサンプル中に偶然存在する
ことが期待できる標的ポリヌクレオチド配列のコピー数
の少なくとも２倍になるように選択される。一般に、偶
然に存在することが期待されるコピー数はLG/4nで表さ
れるが、特異的配列がサンプル中に存在する頻度はこの
偶然に期待される値の上下になる。式中、ｎは標的ポリ
ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数であり、Ｌはサ
ンプルの生物学的起源のゲノム中における塩基対の数で
あり、Ｇはサンプル中に存在するゲノムコピーの数であ
る。標的配列中のヌクレオチドの最大数は通常、ポリヌ
クレオチドの分析対象の長さ、および剪断力、内因性ヌ
クレアーゼまたは標的配列を切断するために用いられる
試薬によつて切断されやすさによつて決定される。
標的ポリヌクレオチド配列は通常、ポリヌクレオチド
分析対象の一部である。分析対象の一部でない場合は、
標的ポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチドの
３′末端以外の位置のポリヌクレオチドの部分として与
えられる。この場合は、ポリヌクレオチド分析対象の存
在が標的配列の切断を生じ、それを３′末端で終結させ
る。たとえばポリヌクレオチド分析対象は、切断部位を
含む標的ポリヌクレオチド配列を含有する相補性一本鎖
プライマーポリヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨン
できるRNAであつてよい。ハイブリダイゼーシヨンしたR
NA:プライマー分子を、ヘテロ二重鎖の切断が可能な制
限エンドヌクレアーゼのような切断剤で処理し、ついで
変性させると、３′−OH基で終結する一本鎖標的配列を
得ることができる。
基本ポリヌクレオチド配列−標的ポリヌクレオチド配
列と同一でも異なつていてもよいポリヌクレオチド配列
で、通常異なつている。基本ポリヌクレオチド配列は鋳
型配列に対して相補性である。通常８〜100個の塩基か
らなり、通常DNAで、好ましくは10〜75個の塩基、さら
に好ましくは12〜50個の塩基を有する。多くの場合、基
本ポリヌクレオチド配列は誘導ヌクレオチドを含有し、
４種のヌクレオチドＡおよびdAまたはその誘導体、Ｕお
よびdTまたはその誘導体、ＣおよびdCまたはその誘導
体、ならびにＧおよびdGまたはその誘導体のうちの２種
または３種のみから構成される。基本ポリヌクレオチド
配列の多重コピーは、本発明の方法により、標的ポリヌ
クレオチド配列の存在の結果として生成される。
一本鎖パターンポリヌクレオチド−基本ポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイゼーシヨンできる天然または合
成のヌクレオチド配列である。一本鎖パターンポリヌク
レオチドは、それぞれ１個もしくは２個以上の切断可能
部位たとえば部位特異性切断配列を含有する２個または
それ以上の鋳型配列、好ましくは２個またはそれ以上の
コピー、好ましくは少なくとも３個の、好ましくは同一
の鋳型配列のオリゴマーから構成される。鋳型配列は、
ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよびその誘導か
らなる群より選ばれる２種または３種、好ましくは３種
を含有させることができる。たとえば、鋳型配列は、４
種のヌクレオチド、ＡおよびdAまたはその誘導体、Ｕお
よびdTまたはその誘導体、ＣおよびdCまたはその誘導
体、ならびにＧおよびdGまたはその誘導体のうちの３種
のみから構成されるのが好ましい。鋳型配列は基本ポリ
ヌクレオチド配列と相補性である。オリゴマーはその
３′末端において直接または結合中間ヌクレオチドを介
して、標的ポリヌクレオチドに相補性または実質的に相
補性の結合ポリヌクレオチド配列の５′末端に付着でき
る。通常、オリゴマーの結合ポリヌクレオチド配列への
付着は１個または２個以上の部位特異性切断配列を介し
て行われる。オリゴマーが結合ポリヌクレオチド配列に
中間ヌクレオチドを介して結合し、２種または３種の塩
基のみから構成されるときには、中間ヌクレオチドもそ
れらの塩基から選択される。一本鎖パターンポリヌクレ
オチドは、結合ポリヌクレオチド配列および鋳型配列中
のヌクレオチド以外のヌクレオチドでも、それが本発明
の方法の妨害にならない限り含有することができる。こ
のような他のヌクレオチドは通常、結合ポリヌクレオチ
ド配列およびオリゴマーの外側に存在する。
一本鎖パターンポリヌクレオチドは、通常36〜4,000
個のヌクレオチド、好ましくは80〜1,000個のヌクレオ
チドを含有し、好ましくは３〜100個、さらに好ましく
は６〜50個の鋳型ポリヌクレオチド配列を含有する。一
本鎖パターンポリヌクレオチドはDNAでもRNAでもよいが
DNAであることが好ましく、線状でも環状でもよいが、
環状であることが好ましい。合成オリゴヌクレオチドで
も、またウイルス、プラスミド等から構築されてもよ
い。環状でない場合は、通常、３′末端は核酸ポリメラ
ーゼによる鎖の延長を阻止できる基で終わつている。
一本鎖パターンポリヌクレオチドに必須の特徴は、鋳
型配列もしくは結合ポリヌクレオチド配列に対し相補性
であるか、または一本鎖パターンポリヌクレオチド配列
に沿つてそれらと相補性の延長を形成できるいかなるポ
リヌクレオチド配列も含まないことである。さらに、一
本鎖パターンポリヌクレオチドが非環状である場合は、
３′末端が、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ
による鎖延長反応配列に反応できない基で終結すること
が好ましい。この方法により、鋳型にそつた鎖延長のラ
ンダムな開始が防止される。このような基の例として
は、たとえば、ジデオキシヌクレオチドたとえばジデオ
キシチミジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシグア
ノシンおよびジデオキシシチジン、イソプロピルホスホ
リル、ホスフエート、Ｎ−（トリメチルアンモニウムエ
チル）カルバモイル、ポリサツカライドたとえばデキス
トラン、ポリスチレン、ヒドラゾン、蛋白質ならびにデ
オキシリボース−３′−ホスホリル等を挙げることがで
きるが、これに限定されるものではない。
ジドデキシヌクレオチドキヤツピングは慣用技術たと
えばAtkinsonら（Biochem.,８:4897〜4904、1969）の記
載に従つて実施できる。ヒドラゾン形成は、リボヌクレ
オチドの３′末端を過ヨウ素酸で酸化してジアルデヒド
を生成させ、これを置換ヒドラジンたとえばジニトロフ
エニルヒドラジン、陽性に荷電したヒドラジンたとえば
２−トリメチルアンモニウム−１−エチルヒドラジン、
デキストランおよび蛋白質に結合したヒドラジン、とく
にカルボキシアルキルデトランおよび蛋白質等のヒドラ
ジン誘導体などと反応させることによつて行われる。こ
のような３′保護物質はついで、アフイニテイ−クロマ
トグラフイーおよびその他の本技術分野でよく知られた
技術によつて他の反応混合物成分から分離できる。アル
デヒドの生成ついでアルデヒドの誘導体の形成は、鋳型
の３′末端を保護するための一般的方法のひとつである
（たとえばReines:ら:Nucl.Acids Res.,１:767〜786、1
974参照）。３′末端ホスフエート基は、たとえばリボ
ヌクレオチドで終結している一本鎖ポリヌクレオチドを
過ヨウ素酸で処理と、シクロヘキシルアミンまたはベン
ジルアミンによる（Krynetskayaら:Nucleosides and Nu
clotide,５（１）:33〜43,1986）β−除去またはDNAの
３′末端標識に通常用いられるようなpCp（３′,5′−
ジホスフエートシチジン）のT4RNAリガーゼ付加によつ
て行われる。
末端３′の保護は、３′末端のガラスビーズ、樹脂ま
たは他の任意の適当に改良された粒子またはビーズに共
有結合させることによつても達成できる。この３′の官
能性を遮断する手段は一般に、オリゴヌクレオチドの合
成における多くの方式で実施される。
本発明に使用できる一本鎖パターンポリヌクレオチド
の特定の態様には、dA、dC、dGおよびdTからなる群より
選ばれる３種だけのヌクレオチドまたは母体のヌクレオ
チドとヌクレオチド塩基への結合で同じ相補性を有し、
鋳型ポリヌクレオチド配列中に挿入された場合、鋳型依
存性ポリヌクレオチドポリメラーゼを妨害しないこれら
のヌクレオチドの誘導体から構成されるオリゴマーがあ
る。
一本鎖パターンポリヌクレオチドはクローニングまた
は合成で得られる。合成操作および単離方法は自動化さ
れていてもされていなくてもよい。このような方法に
は、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル合成法
（Narangら:Meth.Enzymol.,68:90、1979）および支持体
上合成法（Beaucageら:Tetrahedron Letters、22:1859
〜1862、1981）ならびにホスホルアミダイト法およびそ
の他“Synthesis and Application of DNA and RNA"、
S.A.Narang編、Academic Press,New York,1987とそれに
引用されている文献に記載された方法がある。
一本鎖パターンポリヌクレオチドは多くの場合、１個
または２個以上の部位特異性切断配列によつて連結され
た５〜50個の鋳型配列から構成される。
鋳型配列−ヌクレオチドの配列であり、その少なくと
も１個は基本ポリヌクレオチド配列と相補性であり、一
本鎖パターンポリヌクレオチドの内部に位置し、通常は
１個または２個以上の切断可能部位たとえば部位特異性
切断配列を包含する縦列の反復として存在する。鋳型配
列中のヌクレオチドの数は、基本ポリヌクレオチド配列
とのハイブリダイゼーシヨンに用いられる緊縮条件が過
剰のランダムな非特異的ハイブリダイゼーシヨンを妨害
するのに十分大きく、鋳型配列を基本ポリヌクレオチド
配列から解離させるのに必要な条件が鋳型依存性ポリヌ
クレオチドポリメラーゼを不活性化するほど大きくない
ものでなければならない。鋳型配列中のヌクレオチドの
数は通常、８〜100個、好ましくは10〜75個、さらに好
ましくは12〜30個である。10〜20個もきわめて有用な数
である。通常、鋳型配列の約３〜100個のコピーが一本
鎖パターンポリヌクレオチド中に存在する。
部位特異性切断配列−ポリヌクレオチド中のヌクレオ
チドの配列であつて、切断可能なポリヌクレオチド配列
を有する相補性ポリヌクレオチドと複合体を形成した場
合、このような相補性切断可能ポリヌクレオチド配列の
配列内の特定の部位での切断を促進する。切断には通
常、付加的な試薬が必要である。この部位特異性切断配
列は、通常４〜30個のヌクレオチド、さらに通常は４〜
15個のヌクレオチド、好ましくは４〜８個のヌクレオチ
ドで構成される。通常、部位特異性切断配列と、切断可
能なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと
の複合体は制限エンドヌクレアーゼ部位を構成し、付加
的試薬は制限エンドヌクレアーゼである。
Ｉ型制限エンドヌクレアーゼは特定のヌクレオチド配
列を認識し、切断されるヌクレオチド配列に関しての選
択性はなく、その近くを切断する。したがつて、Ｉ型制
限エンドヌクレアーゼによつて認識される切断促進配列
の利用には、第２の試薬の使用、または特異的部位での
切断を与える部位特異性切断配列中に誘導ヌクレオチド
の存在を必要とする。II型制限エンドヌクレアーゼは特
異的な配列を認識し、その配列内の固定された位置で二
本鎖を切断する。このような配列は通常、対称の中心軸
を有し、その軸から両方向に同様に読み取られる。II型
制限エンドヌクレアーゼは、本発明の方法において最も
一般的に利用できる。III型制限酵素は、特異的配列で
ある非対称の制限部位を認識し、このような配列の側に
数個のヌクレオチドの固定された位置で二本鎖を切断す
る。したがつてIII型酵素も本発明の方法において有用
である。
例示のために、一部のヌクレオチド配列の例とそれら
を認識する制限エンドヌクレアーゼを示せば、以下の第
２表に掲げる例ならびにKassler ＆ Hltke（Gene,47:
1〜153）およびRoberts:Nucl.Acids Res.,15:r189〜r21
7、1987）またはそれらの引用文献中に挙げられた例が
あるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
部位特異性切断配列は、本発明の方法の間に多くの場
合切断されるが、切断に必要な試薬が、特異性切断配列
に相補性でそれに結合しているポリヌクレオチド中の切
断可能ポリヌクレオチド配列を切断できる限りは必ずし
も切断される必要はない。このような部位特異性配列の
例には上記第２表に掲げた配列に相当するメチル化配列
がある。一本鎖パターンポリヌクレオチドの部位特異性
切断配列のメチル化は、一本鎖パターンポリヌクレオチ
ドの合成に際してメチル化ヌクレオチドを導入するか、
またはメチルトランスフエラーゼのような酵素を使用す
る等の方法によつて達成できる。一本鎖パターンポリヌ
クレオチドの部位特異性切断配列に相補性の配列を、本
発明の方法における鎖延長後に実施する場合は、ヘミメ
チル化部位を認識し、切断する切断剤が使用される。た
とえば、 の非メチル化鎖を切断できるTaq I、またはSau 3AI、Ms
p I、Acc IもしくはXho II等が使用できる（Nelson ＆
McClelland:Nucl.Acids Res.,15:r219〜r230、1987およ
びその引用文献参照）。本発明の方法の間に形成される
切断可能な配列の他の例としては、RNA鋳型配列を用い
て形成されたDNA配列またはDNA鋳型配列を用いて作成さ
れたRNA配列で、切断剤がRNAまたはDNAしか切断しない
場合、また同様にDNA/RNAハイブリツドの場合がある。D
NA/RNAハイブリツド中のDNAおよび多分RNAもの切断につ
いては、Molloy ＆ Symms（Nucl.Acids Res.,８:2939〜
2946、1980）に記載されている。
鋳型配列中に含有させる部位特異性切断配列は多くの
場合、すべて同一である。
ヌクレオシドトリホスフエート−５′トリホスフエー
ト置換基を有するヌクレオシドであり、通常はデオキシ
ヌクレオシドトリホスフエートである。ヌクレオシドは
プリンまたはピリミジン誘導体の窒素塩基のペントース
糖誘導体で、ペントース糖の１′炭素に共有結合してい
る。プリン塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
ならびにその誘導体および類縁体が包含される。多くの
場合、デオキシヌクレオシドトリホスフエートはdATP、
dGTP、dCTPおよびdTTPであり、さらに多くの場合は、こ
の群の中の３種またはその誘導体である。
誘導体および類縁体とは、非誘導ヌクレオシドトリホ
スフエートと同様に認識され、重合される誘導体および
類縁体である。このような誘導体の例としては、レポー
ター基の修飾、ビオチニル化、アミン修飾、放射標識、
アル化等が行われた化合物、またチオホスフエート、ホ
スフアイト、環原子修飾誘導体等を挙げることができる
が、必ずしもこれらに限定されるものではない。レポー
ター基は、フルオロセインのような螢光基、ルミノール
のような化学発光基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレ
ンジアミン三酢酸のような遅延螢光で検出できるテルビ
ウムキレーター等である。適当なレポーター基は、ビオ
チン、螢光体、化学発光体および小有機分子からなる群
より選ばれる。
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ（TDPP）−
基本ポリヌクレオチド配列または標的ポリヌクレオチド
配列に、場合に応じて、延長を形成させるための触媒、
通常は酵素であり、延長が鋳型配列に相補性の場合は一
本鎖パターンポリヌクレオチドに沿つて延長を生じる。
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼは５′から
３′方向へ（鋳型に関しては３′から５′方向へ）進行
する延長のための構築ブロツクとして、延長が終結する
まで、ヌクレオシドトリホスフエートを使用する。通
常、触媒は酵素、たとえばRNAポリメラーゼ、好ましく
はDNAポリメラーゼたとえば原生生物DNAポリメラーゼ
（Ｉ、IIまたはIII）、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポ
リメラーゼ、クレノウフラグメント、逆転写酵素、RNA
レフリカーゼ等で、細胞、バクテリアたとえばE.coli、
植物、動物、ウイルス、好熱性バクテリア等の任意の材
料から誘導される。
切断可能ポリヌクレオチド配列が、部位特異性切断配
列を有する相補性ポリヌクレオチドとハイブリダイゼー
シヨンした場合のポリヌクレオチド配列のような切断可
能部位を特異的切断する手段−通常は触媒である。切断
可能なポリヌクレオチド配列が制限エンドヌクレアーゼ
認識部位である場合には、この手段は通常、特定のヌク
レオチド配列またはその付近で二重鎖DNAを切断できる
酵素である。このような手段は、特定の塩基と反応して
切断を生じる化学的化合物であつてもよい（たとえばPe
ter Dervan:Science、232:464〜471、1986参照）。特異
的配列の切断は、部位特異性切断配列に、切断促進基た
とえばキレート鉄原子またはフオトアクテイベーターを
導入することによつても達成できる。
全部または一部を順次−サンプルと本発明に使用され
る各種試剤を同時以外の方法で配合する場合で、１個ま
たは２個以上の試剤を残りの１個または２個以上の試剤
と配合して一部の配合物を形成させることができる。つ
いで、この一部の配合物それぞれを、本発明の方法の１
または２以上の工程に付す。すなわち、一部の配合物そ
れぞれを所望の結果の１または２以上を達成するための
条件下にインキユベートすることができる。
本発明の方法の一態様は、ポリヌクレオチドの３′末
端に位置する基本ポリヌクレオチド配列と実質的に同一
の標的ポリヌクレオチド配列の存在の結果として、基本
ポリヌクレオチド配列の多重コピーを生成させることを
目的とする。配合物は、標的ポリヌクレオチド配列、一
本鎖パターンポリヌクレオチド、ヌクレオシドトリホス
フエート、鋳型依存型ポリヌクレオチドポリメラーゼ、
および切断可能ポリヌクレオチド配列を特異的に切断す
るための手段を、全部もしくは一部を順次、または同時
に合して調製される。この配合物を、標的配列と一本鎖
パターンポリヌクレオチドのハイブリダイゼーシヨン、
切断可能ポリヌクレオチド配列を介して連結した鋳型配
列に相補的なポリヌクレオチド配列１個または２個以上
のコピーからなる標的配列の鎖延長の形成、延長の切断
可能ポリヌクレオチド配列におけるフラグメントへの切
断、このフラグメントの変性、フラグメントと一本鎖パ
ターンポリヌクレオチドとのハイブリダーゼーシヨン、
およびハイブリダイゼーシヨンしたフラグメントの鎖延
長の形成の全部もしくは一部を順次または同時に行うこ
とができる条件下にインキユベーシヨンする。上記工程
は所望数のコピーが得られるまで反復する。
基本ポリヌクレオチド配列の多重コピーを得る一方法
（Ａ）を第１図に示す。
制限エンドヌクレアーゼ部位（△）を含有する鋳型配
列（1a）の反復からなる一本鎖パターンポリヌクレオチ
ド（１）を基本ポリヌクレオチド配列（２）を、少なく
とも（１）と（２）の一部がハイブリダイゼーシヨンし
て、（２）の３′−OHが制限エンドヌクレアーゼ部位に
おける切断点に相当する二重鎖（３）を形成する。好ま
しくは、同じ条件で、二重鎖は、鋳型依存性ポリヌクレ
オチドポリメラーゼ（TDPP）の触媒作用によつてヌクレ
オシドトリホスフエート（NT）と反応して基本ポリヌク
レオチド配列（２）を延長し、延長した二重鎖（４）を
形成する。好ましくは同じ条件で、二重鎖（４）は制限
エンドヌクレアーゼ（RE）と反応して鋳型配列（1a）お
よび基本ポリヌクレオチド配列（２）からなる二本鎖フ
ラグメント（５）を形成する。二本鎖フラグメント
（５）を解離させると一本鎖基本ヌクレオチド配列
（２）の多重コピーが得られ、これを上記サイクル内に
再び入れる。
この方法では、一本鎖パターンポリヌクレオチド
（１）はその３′および５′末端に結合したヌクレオチ
ド配列を包含していてもよく、これらの配列は連結して
環を形成してもよい。通常、付加的配列が一本鎖パター
ンポリヌクレオチドに結合している場合は、反復鋳型配
列は４種の天然ヌクレオチド、dAもしくはＡ、dTもしく
はＵ、またはdGもしくはＧ、およびdCもしくはＣ、ある
いはその誘導体のうち２種または３種、好ましくは３種
のみから構成される。この場合には、２種または３種の
みの相当する相補性ヌクレオシドトリホスフエートまた
はその誘導体をポリメリゼーシヨン反応に加える。
ポリヌクレオチド分析対称を分析する方法では、分析
対称によつて基本ポリヌクレオチド配列を形成させ、こ
れから本発明の方法によつて多重コピーを生成し、これ
らのコピーを検出する。ポリヌクレオチド分析対称によ
つて基本ポリヌクレオチド配列を形成する一方法（Ｂ）
を第２図に示す。
標的ポリヌクレオチド配列（6a）を含有するポリヌク
レオチド分析対象（６）を変性させ、ついで標的ポリヌ
クレオチド配列（6a）に相補性のその鋳型配列（1a）の
部分を有する一本鎖パターンポリヌクレオチド（１）の
過剰とハイブリダイゼーシヨンさせる。得られたハイブ
リド（７）を次に制限酵素（RE）で処理して、標的ポリ
ヌクレオチド配列（6b）の３′末端に遊離のヒドロキシ
基を形成させる。一本鎖パターンポリヌクレオチド
（１）の少なくとも部分と二重鎖（８）を形成している
この標的ポリヌクレオチド配列を二重鎖（８）から解離
させ、一本鎖パターンポリヌクレオチド（１）の他の分
子とハイブリダイゼーシヨンさせて新たな二重鎖（９）
を形成させる。二重鎖（９）は、鋳型依存性ポリヌクレ
オチドポリメラーゼ（TDPP）の触媒によつてヌクレオシ
ドトリホスフエート（NT）と反応し、標的ポリヌクレオ
チド配列（6b）を延長し、延長された二重鎖（10）を形
成する。好ましくは同じ条件下で、二重鎖（10）は制限
エンドヌクレアーゼと反応して二重鎖フラグメント
（５）を生成し、これは方法（Ａ）に例示したように解
離して基本ポリヌクレオチド配列を与える。
ポリヌクレオチド分析対象の存在によつて基本ポリヌ
クレオチド配列を生成させる他の方法（Ｃ）を第３図に
示す。
ポリヌクレオチド分析対象をまず制限酵素（RE）で処
理すると、標的ポリヌクレオチド配列（6a）を切断し
て、３′−ヒドロキシ基で終結する標的ポリヌクレオチ
ド（6b）を含む二重鎖（11）を生成する。この二重鎖を
次に解離させ、切断された標的ポリヌクレオチド配列を
過剰の一本鎖パターンポリヌクレオチド（１）とハイブ
リダイゼーシヨンさせて二重鎖（９）を生成させる。二
重鎖（９）を方法（Ｂ）に従つて延長すれば、基本ポリ
ヌクレオチド配列が生成する。
他の方法（Ｄ）では（第４図参照）、ポリヌクレオチ
ド分析対象の存在による基本ポリヌクレオチド配列の生
成は、二重鎖（11）を解離し、少なくとも１個の鋳型配
列（1a）と、標的配列（6b）と相補性の結合ポリヌクレ
オチド配列（12a）をその３′末端に含有する一本鎖パ
ターンポリヌクレオチド（12）と再びハイブリダイゼー
シヨンさせることにより行われる。好ましくは（12）は
環状で、切断剤の不存在下、鋳型依存性ポリヌクレオチ
ドポリメラーゼによる鎖延長を受けてはならない。
生成した二重鎖（13）は鋳型依存性ポリヌクレオチド
ポリメラーゼ（TDPP）の触媒作用によりヌクレオシドト
リホスフエート（NT）と反応して標的ポリヌクレオチド
配列（6b）を延長し、延長二重鎖（14）が生成する。二
重鎖（14）は制限酵素（RE）と反応し、二重鎖フラグメ
ント（５）が生成し、これは方法（Ａ）に例示したよう
に解離して基本ポリヌクレオチド配列（２）を与える。
一本鎖パターンポリヌクレオチド（12）がただ１個の鋳
型配列（1a）を含有する場合には、方法（Ａ）によつて
基本ポリヌクレオチド配列の多重コピーを生成させるた
めには、少なくとも２個の鋳型配列を含む一本鎖パター
ンポリヌクレオチド（１）を包含する必要がある。
ポリヌクレオチド分析対象が好ましくはRNA分析対象
（６′）で、同定すべきポリヌクレオチド配列（6a′）
を有する場合、分析対象の存在によつて基本ポリヌクレ
オチド配列の生成導くさらに別の方法（Ｅ）では、（第
５図参照）、分析対象が一本鎖でないときはまず分析対
象を一本鎖に解離させる。ついでこれを、基本ポリヌク
レオチド配列（２）がその３′末端で結合ポリヌクレオ
チド配列（15a）と結合してなるプライマーポリヌクレ
オチド（15）とハイブリダイゼーシヨンさせる。
ハイブリツド（16）の生成後、ハイブリツドを制限酵
素で切断すると、方法（Ａ）による多重コピーの生成に
適した遊離の３′−OHを有する基本ポリヌクレオチド配
列（２）が得られる。
ポリヌクレオチド分析対象の存在の結果として、基本
ポリヌクレオチド配列を生成させる他の方法（Ｆ）は
（第６図参照）、その５′末端で、鋳型配列（1a）のオ
リゴマーに連結した結合ポリヌクレオチド配列（18a）
からなる一本鎖パターンポリヌクレオチド（18）を必要
とする。３′−ヒドロキシル基で終結する標的ポリヌク
レオチド配列（6b）を含有する二重鎖は、ポリヌクレオ
チド分析対象の存在に応じて、方法（Ｂ）または（Ｃ）
により作成される。この二重鎖を変性し、配列（6B）を
一本鎖パターンポリヌクレオチド（18）とハイブリダイ
ゼーシヨンさせる。生成したハイブリツド（19）を、鋳
型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ（TDPP）の触媒
により、ヌクレオシドトリホスフエート（NT）と反応さ
せると、標的ポリヌクレオチド配列（6b）を延長し、延
長した二重鎖（20）が生成する。二重鎖（20）を制限酵
素（RE）と反応させると、二重鎖フラグメント（５）が
生成し、これは方法（Ａ）に例示したように基本ポリヌ
クレオチド配列（２）に解離させることができる。さら
に二重鎖（21）が認められ、これを解離し、一本鎖パタ
ーンポリヌクレオチド（18）とハイブリダイゼーシヨン
させるとハイブリツド（19）を再生することができる。
本発明の方法を実施するに際しては、水性メジウムが
使用される。他の極性共溶媒、１〜６個、さらに通常で
は１〜４個の炭素原子を有する通常酸素化された有機溶
媒、たとえばアルコール、エーテル等も使用できる。こ
れらの共溶媒は通常約70重量％未満、さらに通常では30
重量％未満添加される。
メジウムのpHは通常約4.5〜9.5の範囲、さらに通常で
は約5.5〜8.5の範囲、好ましくは約６〜８の範囲が用い
られる。pHおよび温度は、場合に応じて、標的配列と一
本鎖パターンポリヌクレオチドのハイブリダイゼーシヨ
ン、標的配列の延長、切断可能なポリヌクレオチド配列
において延長のフラグメントへの切断、フラグメントの
可逆的変性、フラグメントと一本鎖パターンポリヌクレ
オチドのハイブリダイゼーシヨン、およびハイブリダイ
ゼーシヨンされたフラグメントの延長を同時にまたは順
次行えるように選択し、変動させる。上述した各工程
を、順次、あるいは同時のいずれによつて実施するか
が、これらの問題の間の調整が可能か否かにかかつてく
る場合もある。所望のpHを達成し、そのpHを測定時を通
じて維持するためには、様々な緩衝液が使用できる。緩
衝液の例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタール等を挙げることができる。本発明は使
用される特定の緩衝液によつて限定されるものではない
が、各方法にはそれぞれ最適の緩衝液がある。
本発明の方法を実施するにあたつては、通常、隠和な
温度が使用され、この方法を実施している間は温度を一
定に保つことが望ましい。一定の温度は、通常、基本ポ
リヌクレオチド配列と標的配列との複合体の融解温度付
近で選択される。一定の使用温度の選択は、基本ポリヌ
クレオチド配列と新たに生成したそのコピーが同一にな
るので、本発明を実現するのに有利である。本発明の方
法における温度は一般に約20〜90℃、さらに通常では約
30〜70℃、好ましくは37〜50℃が用いられる。しかしな
がら、温度は、上述の工程を順次または同時のいずれに
よつて行うかよつても変動する。たとえば、鎖の延長お
よび切断工程は、約20〜40℃の比較的低温で行われる
が、変性およびハイブリダイゼーシヨンには約40〜80℃
の範囲の温度が用いられる。
本発明の方法を実施するのに要する時間は一般に、基
本ポリヌクレオチド配列のコピーの所望数を達成するの
に十分な時間である。したがつて、それは、増幅を行う
目的、たとえばポリヌクレオチド分析対象のアツセイに
依存して決定される。一般に、本方法を実施するのに要
する時間は約５〜200分である。この時間は通常、最小
にすることが便宜上望ましい。一般には、所定の増幅度
が得られるまでの時間は、たとえば、鋳型依存性ヌクレ
オチドポリメラーゼを飽和するのに十分なヌクレオシド
トリホスフエート濃度の選択および鋳型依存性ポリヌク
レオチドポリメラーゼの濃度の上昇によつて短縮するこ
とができる。とくに重要な因子は、部位特異性切断配列
を切断する手段の効率である。一般には、たとえば高い
代謝回転を有する制限酵素の使用と至適温度の採択によ
り、切断速度を最大にする条件を選択することが望まし
い。時間を短縮するために重要な他の因子は、一本鎖パ
ターンポリヌクレオチド中に存在する鋳型配列の数であ
る。
少なくとも２個の鋳型配列が存在すれば、生成するポ
リヌクレオチドのコピー数は、各延長で指数函数的に増
大する。縮なくとも３個の鋳型配列が存在すれば、基本
ポリヌクレオチド配列の各延長でのコピー数は２倍にな
り、好ましい。さらに好ましくは、少なくとも５個の鋳
型配列が存在すれば、コピー数は各延長で３倍になる。
一般に、各延長後に存在するコピー数は約（ｎ＋１）/2
倍（ｎは一本鎖パターンポリヌクレオチド中の鋳型配列
の数である）になる。
コピーされる標的ポリヌクレオチド配列の濃度は、サ
ンプル中１〜２分子という低濃度であつてもよいが、一
般には約102〜1010個、通常は約103〜108個存在する。
一本鎖パターンポリヌクレオチド配列の濃度は通常、所
望のコピー数およびこのコピーが生成される速度に依存
する。この速度は、他の試薬の濃度および一本鎖パター
ンポリヌクレオチド中の鋳型配列の数によつて決定され
る。
各試薬の最終濃度は通常、標的配列のコピー数を最適
にするように経験的に決定される。
メジウム中の一本鎖パターンポリヌクレオチドおよび
デオキシヌクレオシドトリホスフエートの濃度は広範囲
に変動させることができるが、これらの試薬は過剰量存
在させることが好ましい。デオキシヌクレオシドトリホ
スフエートは通常10-6〜10-2M、好ましくは10-5〜10-3M
存在させる。一本鎖パターンポリヌクレオチドは通常、
少なくとも−10-2M、好ましくは10-10M、さらに好まし
くは少なくとも約10-8M存在させる。
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ、および切
断可能部位たとえば部位特異性切断配列を切断するため
の手段すなわち通常は制限エンドヌクレアーゼおよびそ
の補因子のメジウム中の濃度も広範囲に変動させること
ができる。これらの試薬は10-12M程度の低濃度でもよい
が、一本鎖パターンポリヌクレオチドの濃度と少なくと
も同程度またはそれ以上の濃度存在させる。第一の制限
因子は、通常は酵素である試薬の価格である。
各種試薬を配合して配合物を作成する際の順序は適宜
変更できる。一般には、ポリヌクレオチドの３′末端に
存在する標的ポリヌクレオチド配列が得られる。これ
を、予め調製した一本鎖パターンポリヌクレオチド配
列、ヌクレオシドトリホスフエート、鋳型依存性ポリヌ
クレオチドポリメラーゼ、および切断剤の配合物と合す
る。しかしながら、上記試薬の同時添加、ならび他の段
階ごとのまたは他の順序での添加も可能である。
試薬の濃度および添加順序ならびに本発明の方法の条
件は、一般に、基本ポリヌクレオチド配列のコピー数と
そのコピーの生成速度を最大にすることの所望程度に支
配される。
本発明の一態様は、３′−ヒドロキシヌクレオチドで
終結するあるいは３′−ヒドロキシヌクレオチドで終結
するようにしたポリヌクレオチド分析対象の定量または
検出に関するものである。このポリヌクレオチド分析対
象は一般に、その含有が疑われるサンプル中に存在する
ものであり、この方法は、１種または２種以上のポリヌ
クレオチド分析対象と、外から与えられ、ポリヌクレオ
チド分析対象とハイブリダイゼーシヨンできる一本鎖パ
ターンポリヌクレオチド、ヌクレオシドトリホスフエー
トおよび鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼを順
次または同時に水性メジウム中に配合することによつて
行われる。このメジウムを、少なくともポリヌクレオチ
ド分析対象中の標的配列と一本鎖パターンポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーシヨン、標的配列の鋳型に沿つ
た延長の形成、延長のフラグメントへの切断、フラグメ
ントと一本鎖パターンポリヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーシヨンによるフラグメントの変性、およびフラグ
メントの延長の生成を順次または同時に実施できる条件
下にインキユベーシヨンする。上記工程をその反応条件
下に、検出可能な数のフラグメントが得られるまで反復
する。次に、そのフラグメントまたはそれと相補性のフ
ラグメントを検出すれば、フラグメントの存在はサンプ
ル中におけるポリヌクレオチド分析対象の存在を示すこ
とになる。
上述の配合物を調製する前に、サンプルを（１）鋳型
依存性ポリメラーゼと反応する遊離の３′末端を除去す
るため、サンプル中のポリヌクレオチドの３′末端を改
変する試薬、および（２）測定すべきポリヌクレオチド
分析対象の３′末端にヒドロキシル基を生成できる制限
酵素、と順次インキユベーシヨンすることができる。ポ
リヌクレオチドの３′末端を改変する試薬は、ポリヌク
レオチド３′−ヒドロキシル基の反応を触媒できる酵素
である。このような酵素の例には、大腸菌バクテリアガ
ーゼ、T4フアージDNAリガーゼ、哺乳類動物DNAアガーゼ
等、末端デオキシヌクレオチドトランスフエラーゼ、T4
RNAリガーゼ等がある。上述のリガーゼにはさらに、
３′末端が鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼに
よる鎖延長反応を起こさない基で終結したオリゴヌクレ
オチドが包含される。末端トランスフエラーゼにはジデ
オキシヌクレオシドトリホスフエート、メチル化ヌクレ
オシドトリホスフエートが包含される。このような試薬
および反応は、他の応用に際し、本技術分野においてよ
く知られているので、さらに詳細な説明はここでは省略
する。
pH、温度、溶媒および時間の問題は、増幅方法につい
て上述したのと同様である。一般に条件は、ポリヌクレ
オチド分析対象と一本鎖パターンポリヌクレオチドのハ
イブリダイゼーシヨン、パターンポリヌクレオチドに沿
つた延長の生成、延長のフラグメントへの切断、フラグ
メントの可逆的変性、フラグメントと一本鎖パターンポ
リヌクレオチドのハイブリダイゼーシヨン、およびフラ
グメントの延長の生成を順次または同時に行えるように
選択される。アツセイに付されるポリヌクレオチド分析
対象の濃度は、標的ポリヌクレオチド配列の濃度につい
て上述したのと同じである。
各種試薬の濃度は一般に、ポリヌクレオチド分析対象
の問題になる濃度範囲によつて決定される。各試薬の最
終濃度は通常、上述の問題の範囲における感度を最適に
するように経験的に決定される。アツセイにおけるその
他の試薬の濃度は一般に、上述の増幅方法に関連して述
べたと同じ原理によつて決定される。主要な問題は、ポ
リヌクレオチド分析対象に関連して基本ポリヌクレオチ
ド配列のコピーが、容易に検出されたままポリヌクレオ
チド分析対象の正確な定量を可能にする十分な量生成す
ることである。
メジウムを上述の条件下に、同時にまたは順次インキ
ユベーシヨンしたのち、存在するフラグメントを検出す
る。フラグメントの存在はサンプル中におけるポリヌク
レオチド分析対象の存在を示す。フラグメントは多くの
方法で検出することができる。核酸の任意の検出方法
が、本発明のアツセイ方法で生成したフラグメントの検
出に主として用いられる。別法として、ポリメリゼーシ
ヨンの間に生成するピロホスフエートを検出する方法を
利用することもできる。二本鎖核酸を検出するための任
意の標準方法、たとえば、一本鎖配列のトリクロル酢酸
による沈殿ついで溶液の光吸収の測定、たとえばエチジ
ウムブロミド等のような染料の挿入ついで分光光度法に
よる測定、濃色効果の変化の測定、旋光度の測定、核酸
プローブハイブリダイゼーシヨン法等が使用できる。上
述の検出方法は、ハイブリダイゼーシヨンされたまたは
されていない基本ポリヌクレオチド配列のサイズをメジ
ウム中の高分子量または低分子量物質と分離し、二本鎖
フラグメントを得る予備的クロマトグラフイー分離操作
と組み合わせて利用することができる。この分離操作
は、本技術分野においてよく知られていて、詳細な説明
は不要と思われるが、以下に要約して説明する。
核酸を検出する一方法には核酸プローブを使用する方
法がある。この方法は一般に、標的核酸を固体支持体た
とえばニトロセルロース濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ
化濾紙またはナイロン膜上に固定化するものである。標
的核酸が支持体上に固定されたのち、支持体を適当に標
識したプローブ核酸と約２〜48時間接触される。上記時
間の経過後、固体支持体を加温しながら数回洗浄して、
結合しなかつたプローブを除去する。次に支持体を乾燥
し、ハイブリダイゼーシヨンした物質をオートラジオグ
ラフイーまたは比色法で検出する。
プローブを使用する一方法が米国特許出願第773,386
号（1985年９月６日出願）（ヨーロツパ特許出願公告第
0224995号）に記載されている。この特許出願の開示を
参考として本明書に導入する。この方法はアツセイメジ
ウム中に、サンプルおよび、核酸フラグメントに相補性
の第一および第二のポリヌクレオチド試薬を混合する。
第一および第二の試薬はそれぞれ、核酸フラグメントの
異なる領域にハイブリダイゼーシヨンする。第一の試薬
は、第一の試薬を非共有結合的に重合可能にする手段を
含んでいる。第二の試薬は第二の試薬を検出可能にする
手段を含んでいる。サンプルおよび第一と第二の試薬を
アツセイメジウム中に、第一の試薬が重合し、第二の試
薬はサンプル中にDNAフラグメントが存在する場合のみ
重合した第一の試薬に結合する条件で合する。ついで、
第二の試薬が重合した第一の試薬に結合したかどうかを
測定する。
本発明の方法では、試薬の配合物中にリガンド置換ヌ
クレオチドトリホスフエートを存在させることにより、
基本ポリヌクレオチド配列をリガンドで標識させること
ができる。鋳型配列は第二のリガンドで標識できる。こ
の方法で生成するこれらの２つの配列の複合体は、リガ
ンドの一方の受容体を結合させた表面への複合体の結合
によつて検出できる。検出可能な基たとえば酵素または
螢光発光団で標識された他のリガンドの受容体への他の
リガンドの結合は、表面に結合した複合体の量に比例す
る。
核酸フラグメントを検出する他の方法には、DNAまた
はRNAと親和性を有する染料を用いる方法がある。この
ような染料の例としてはDNA挿入剤があり、これらは一
般によく知られている化合物で、大部分は市販品を入手
できる。このような試薬の代表的なものには、アクリフ
ラビン、アクリフラビン塩酸塩等、アクリジン誘導体、
およびエチジウムハライドたとえばエチジウムブロマイ
ドがある。
上述の方法は、RNA分析対象の含有が疑われるサンプ
ル中のRNA分析対象の存在を決定するためにも応用でき
る。RNAポリヌクレオチド分析対象の場合は、水性メジ
ウム中に、サンプル、制限部位を含有しそのRNA配列と
ハイブリダイゼーシヨンできるデオキシ核酸配列からな
る一本鎖DNAプライマー、プライマーがRNA配列とハイブ
リダイゼーシヨンした場合にプライマーを制限部位で切
断できる制限酵素と合する。この配合物を、ハイブリダ
イゼーシヨンしたプライマーが制限部位で切断される条
件下、切断が起こるのに十分な時間インキユベーシヨン
する。この条件は、上述の部位特異性切断配列の切断の
場合についての条件と同じである。切断されたプライマ
ーが、上述の方法の場合の標的配列としての役割を果た
す。
DNAプライマーは環状でも、また鋳型依存性ポリヌク
レオチドポリメラーゼによつて触媒される反応が不可能
な基によつて３′末端が終結していてもよい。
本発明の一態様は、ポリヌクレオチドサンプル中のヌ
クレオチド標的配列の存在の函数として多数のポリヌク
レオチド分子を生成させる方法である。この方法では、
ポリヌクレオチドサンプルを、（１）標的配列が３′ヒ
ドロキシ基で終結していない場合は標的配列を３′ヒド
ロキシ基で終結させる手段、（２）実質的にすべて標的
配列と相補性の結合ポリヌクレオチド配列からなり、結
合ポリヌクレオチド配列の５′末端で合体した部位特異
性切断配列を有し、部位特異性切断配列の５′末端は鋳
型配列の３′末端に連結している一本鎖パターンポリヌ
クレオチド、（４）ヌクレオシドトリホスフエート、
（５）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およ
び（６）部位特異性切断配列とハイブリダイゼーシヨン
した場合、部位特異性切断配列に相補性な配列を切断す
る手段を、同時にまたは全部もしくはその一部を順次、
合する。配合は、標的配列が二本鎖の場合には標的配列
の変性、標的配列と鋳型のハイブリダイゼーシヨン、鋳
型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼによる標的配列
の延長の結果の二重鎖の生成、二重鎖の延長のフラグメ
ントへの切断、二重鎖の変性、フラグメントの一本鎖パ
ターンポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーシヨン、
およびそのフラグメントの延長の全部もしくは一部を順
次または同時に促進できる条件下に行う。上記工程は所
望数のコピーが得られるまで反復する。
本発明の他の態様は、ポリヌクレオチド分析対象の含
有が疑われるサンプル中の分析対象の存在を決定するた
めの方法である。この方法は、水性メジウム中に、
（１）上記サンプル、（２）ポリヌクレオチド分析対象
から標的配列を得、その配列を３′−OH基で終結させる
ための手段、（３）標的配列に相補性の配列がその５′
末端で少なくとも12個のヌクレオチドの多数反復配列に
結合し、その相補性配列にハイブリダイゼーシヨンさせ
制限酵素とインキユベーシヨンした場合に相補性配列の
切断を促進し制限フラグメントを生成する一本鎖パター
ンポリヌクレオチド配列、（４）デオキシヌクレオシド
トリホスフエート、（５）標的配列を延長し上記相補性
配列を与えるDNA依存性ヌクレオチドポリメラーゼ、お
よび（６）制限フラグメントを生成させる制限エンドヌ
クレアーゼ、の全部または一部を順次または同時に合す
る。この配合は、ポリヌクレオチド分析対象からの標的
配列の取得、標的配列と一本鎖パターンオリゴヌクレオ
チドのハイブリダイゼーシヨン、標的配列の延長による
相補性配列の生成、相補性配列のフラグメントへの切
断、相補性配列と反復配列がハイブリダイゼーシヨンし
た二重鎖の変性、フラグメントと一本鎖パターンポリヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーシヨン、およびフラグ
メントの延長による相補性配列の生成の全部もしくは一
部を順次または同時に行うことができる条件下に実施す
る。この方法はさらに、切断された相補性配列の検出を
包含する。切断された相補性配列の存在は上記サンプル
中におけるポリヌクレオチド分析対象の存在を示すもの
である。
本発明の他の態様は、ポリヌクレオチド分析対象の含
有が疑われるサンプル中におけるポリヌクレオチド分析
対象内の標的ヌクレオチド配列の存在の決定を目的とす
るものである。この方法は、上記サンプルを、（１）標
的配列を３′−OH基で終結させることができる手段、
（２）標的配列に相補性の配列からなり、その配列はそ
の５′末端で少なくとも12個のヌクレオチドの多数反復
配列と結合し、相補性配列にハイブリダイゼーシヨンし
た場合その相補性配列の切断によるフラグメントの生成
が可能な一本鎖パターンオリゴヌクレオチド配列、
（３）デオキシヌクレオシドトリホスフエート、（４）
DNA依存性DNAポリメラーゼ、および（５）相補性配列が
切断促進配列にハイブリダイゼーシヨンした場合、相補
性配列を切断する制限酵素、のうちの１種または２種以
上の全部もしくは一部を順次または同時に合することに
よつて行われる。この方法では、さらに個々の成分また
はそれらの混合物を、（ａ）標的配列が二本鎖である場
合には標的配列の変性、（ｂ）標的配列と鋳型のハイブ
リダイゼーシヨン、（ｃ）標的配列のDNA依存性DNAポリ
メラーゼでの延長による相補性配列を含有する二重鎖の
生成、（ｄ）二重鎖中の相補性配列のフラグメントへの
切断、（ｅ）二重鎖の融解、および（ｆ）フラグメント
の一本鎖パターンポリヌクレオチドとのハイブリダイゼ
ーシヨンおよびDNA依存性DNAポリメラーゼでのフラグメ
ントの延長による相補性配列含有二重鎖の生成、の全部
もしくは一部を順次または同時に促進できる条件下にイ
ンキユベーシヨンし、上記工程を反復する。ついで、上
記相補性配列の切断時に生成した相補性配列または鋳型
のフラグメントを検出する。その存在はサンプル中の分
析対象の存在を示すものである。
本発明は他の態様として、約３〜100個、好ましくは
６〜50個のオリゴヌクレオチド単位と少なくとも１個の
制限部位からなる一本鎖DNAオリゴマーによつて構成さ
れるポリデオキシヌクレオチドを包含する。各オリゴデ
オキシヌクレオチド単位は、少なくとも１個の制限部位
を含有し、約８〜100個、好ましくは10〜50個のヌクレ
オチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド鋳型であ
る。モノマー単位は同一であることが好ましい。オリゴ
デオキシヌクレオチドは環状でも非環状でもよいが環状
であることが好ましい。このDNAオリゴマーはその３′
末端で、少なくとも約15個のヌクレオチドからなる一本
鎖ポリヌクレオチド結合配列に結合させることができ
る。オリゴマーおよびこのオリゴマーに連結するポリヌ
クレオチド配列ならびに結合配列は、ヌクレオチドおよ
びデオキシヌクレオチドまたはその相当する誘導体から
なる群より選ばれる２種または３種、好ましくは３種か
ら構成されることが好ましい。ヌクレオチドはＡおよび
dAまたはその誘導体、ＵおよびdTまたはその誘導体、Ｇ
およびdGまたはその誘導体、ならびにＣおよびdCまたは
その誘導体からなる群の３種から選ばれことが好まし
い。環状の場合は、DNAオリゴマーの５′末端は、直接
またはポリヌクレオチド配列を介して、結合配列の３′
末端に連結して、環を生成する。オリゴヌクレオチドは
約３〜100個、好ましくは６〜50個の鋳型配列を含有す
ることが好ましく、鋳型配列はそれぞれ約８〜100個、
好ましくは10〜50個、さらに好ましくは10〜20個のヌク
レオチドで構成されているのが好ましい。DNAオリゴマ
ーにはレポーター基を結合させることができ、モノマー
単位あたり１個のレポーター基が結合していることが好
ましい。レポーター基としては、放射性分子、螢光体、
化学発光体、分子量17〜1000の小さな有機基たとえばビ
オチン、NH2、OH、SH、フルオレスセイン等、などを挙
げることができる。
本発明による一本鎖パターンポリヌクレオチドの製造
には、様々な技術を使用することができる。鋳型配列の
オリゴマーを製造するための一方法においては、一本鎖
パターンポリヌクレオチドは酵素的リゲーシヨンによつ
て製造できる。鋳型と同一かまたはそれ自体のリゲーシ
ヨンによつて鋳型配列を形成する適当なオリゴヌクレオ
チドは、標準的な自動化技術で合成できる。それをつい
で、酵素的に、たとえばT4リガーゼを用いてリゲーシヨ
ンさせて一本鎖パターンポリヌクレオチドを生成させ
る。所望の長さのオリゴマーをついで、たとえばポリア
クリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラ
フイー（HPLC）によつて単離する。多くの場合、オリゴ
マーの３′末端は、鋳型依存性DNAポリメラーゼとの反
応を防止するため、または結合配列を付加するために、
好ましくはリガーゼを触媒として修飾される。３′末端
はまた、ジデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドのリゲーシヨン、ついでリボースの過ヨウ素酸による
酸化、ついで生成したジアルデヒドの水素化ホウ素ナト
リウムと崇の大きいアミンたとえばアミノデキストラン
との還元アミノ化によつて修飾することもできる。
他の方法では、一本鎖ポリヌクレオチドは、組換えDN
A技術によつて製造される。また別の方法では、一本鎖
パターンポリヌクレオチドは、たとえばホスホアミデー
トを使用し、標準的な固相自動化方法で全合成すること
もできる。この方法の場合、合成配列を固体支持体に係
留している基を最終工程で脱離させれば３′末端のDNA
ポリメラーゼによる反応を防止するのに有効である。ま
た別法として、一本鎖パターンポリヌクレオチドは３′
末端を固体支持体と共有結合したままにしておいて保護
することもできる。固体支持体は、たとえば、合成また
は天然材料たとえば有機ポリマー、ガラス、無機ポリマ
ー等から作られたビーズ、シート、粒子等である。この
材料は、ついで、他のオリゴヌクレオチドと化学的また
は酵素的リゲーシヨンを行つて、その５′末端を延長
し、その鋳型単位の数を増加させてもよい。好ましい方
法においては、一本鎖パターンポリヌクレオチドは、標
準のクローニング技術により、たとえば環状一本鎖M13
フアージを用いて製造することができる。この方法で
は、切断された制限部位に終わる合成オリゴマーを、M1
3のポリリンカー領域における相当する制限部位に挿入
される。所望により、結合ポリヌクレオチド配列も同様
に挿入できる。ついでフアージをクローン化し、収穫す
る。
一本鎖パターンポリヌクレオチドの製造にどのような
方法を利用した場合も、重要な点は、一本鎖パターンポ
リヌクレオチドが相補性のポリヌクレオチド配列を含ま
ないことである。相補性の配列が存在すると、鎖延長の
ランダムな開始を生じることになる。
本発明の方法に使用するのにとくに好ましい組成物
は、少なくとも３個の連続した、好ましくは同一のポリ
デオキシヌクレオチドの鋳型配列を有する環状一本鎖パ
ターンポリヌクレオチドである。各鋳型配列は少なくと
も１個の制限部位を含有する。これらの配列および鋳型
配列オリゴマーと結合ポリヌクレオチド配列を連結する
配列は、アデニン（Ａ）およびデオキシアデニン（d
A）、グアニジン（Ｇ）およびデオキシグアニジン（d
G）、シチジン（Ｃ）およびデオキシシチジン（dC）、
ならびにチミジン（Ｔ）およびデオキシチミジン（dT）
またはそれらの相当する誘導体からなるヌクレオチド群
の１種を欠いている。この塩基の１種の不存在と、デオ
キシヌクレオチドポリメラーゼによつて触媒される反応
において残りの３種の塩基と相補性のヌクレオチドホス
フエートのみを使用することによつて、鋳型配列オリゴ
マーの外部のポリヌクレオチド配列およびそれを結合ポ
リヌクレオチド配列に連結する配列における鎖延長のラ
ンダムな開始を著しく低減するかまたは消失させること
ができる。すなわち、鎖延長は鋳型配列に沿つて起こる
が、環状パターンポリヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チド分析対象上の他の点でランダムなハイブリダイゼー
シヨンが起こつた場合には、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフエート混合物中に存在しないヌクレオチドと相補
性のヌクレオチドに遭遇した時点までのきわめて短い長
さしかその延長は続かないからである。
上記環状パターンポリヌクレオチド中の鋳型配列は８
〜100個のヌクレオチドを含有することが好ましい。環
状パターンポリヌクレオチドは、通常、約３〜50個、好
ましくは少なくとも６個の鋳型配列を含有する。本発明
の方法に使用される好ましい環状パターンポリヌクレオ
チドはM13、φX174等にクローン化された合成配列であ
る。
便宜上、本発明に使用される試薬は、基本ポリヌクレ
オチド配列の多重コピーを得るための試薬またはサンプ
ル中のポリヌクレオチド分析対象のアツセイのための試
薬の既定量を組合わせて包装したキツトとして提供する
こともできる。たとえば、本発明の方法に有用なキツト
は、上記試薬の組成物を他の試薬と組合せて包装したも
のである。このキツトの包装配合物中にはさらに、デオ
キシヌクレオシドトリホスフエートたとえばデオキシア
デノシントリホスフエート（dATP）、デオキシグアノシ
ントリホスフエート（dGTP）、デオキシシチジントリホ
スフエート（dCTP）およびデオキシチミジントリホスフ
エート（dTTP）のようなヌクレオシドトリホスフエート
を含有させることもできる。このキツトには、さらに、
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ、また部位特
異性切断配列もしくはその相補性配列または両者を切断
する手段を包含させることもできる。標的ポリヌクレオ
チド配列がRNAの場合には、包装配合物中にさらに一本
鎖DNAプライマーを包含させることができる。DNAプライ
マーは、RNAとハイブリダイゼーシヨンが可能で、制限
部位を含有する核酸配列である。プライマーはその３′
末端が、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存
在下の鎖延長反応ができない基によつて終結している。
標的配列が３′ヒドロキシル基で終結させるために制限
酵素を使用する場合には、切断可能な配列の切断用と別
の制限酵素を使用するので、キツトの包装配合物中には
さらに、標的配列または相補的配列を３′ヒドロキシ基
で終結させるための制限酵素を包含させる。ポリヌクレ
オチド分析対象の測定のためのアツセイに際しては、キ
ツトの包装配合物中に上述の組成物１種または２種以上
のほかに、アツセイを行うための他の試薬および上述し
たようなDNAフラグメントを検出するための試薬を包含
させることができる。キツト中の各試薬の相対量は、基
本ポリヌクレオチド配列の多重コピーの生成およびその
生成速度を至適にするような試薬濃度を与えるように広
範囲に変動させることができる。アツセイを行うために
用いられるキツトの場合は、試薬はさらにアツセイの感
度を最適するように選択される。適当な場合には、キツ
ト中の試薬の１種または２種以上を賦形薬を含んだ乾燥
粉末、通常は凍結乾燥物として与え、溶解させたとき、
本発明による方法またはアツセイの実施に適当な濃度の
試薬溶液が得られるようにすることもできる。
例 本発明をさらに以下の例示的実施例によつて説明す
る。
例 １ ポリメラーゼー仲介DNA標的増幅は、合成標的DNAパタ
ーンポリヌクレオチドとして環状M13を用いた実験にお
いて明らかにされた。17塩基合成標的DNAポリヌクレオ
チドを、２個の非同一鋳型配列M13mp19DNAを含有する相
補的一本鎖パターンポリヌクレオチドにアニーリング
し、クレノウフラグメントポリメラーゼと４個のデオキ
シヌクレオシドトリホスフエート（dNTPs）すべてで延
長した。延長した二本鎖DNAをポリメラーゼ反応条件下
に制限エンドヌクレアーゼEcoR I、BamH IおよびHind I
IIで切断した。生成した一次ポリヌクレオチドフラグメ
ントの量は、反応混合物の熱環化によつて実質的に増加
した。この環化は、反応混合物を煮沸し、温度を下げて
過剰のパターンポリヌクレオチド鋳型の存在下にDNA鎖
を再結合させ、ついで新たな酵素を添加して重合／切断
を続けた。一次ポリヌクレオチドフラグメントは変性条
件下のゲル電気泳動によつて認められた。標的DNAを加
えなかつた対照反応ではフラグメントは認められなかつ
た。
核酸： M13mp19一本鎖DNA（ロツト番号63102）および17塩基D
NA（ロツト番号62101）はBathesda Research Labs（BR
L,Gaithereburg,MD）から購入した。17塩基DNAのヌクレ
オチド配列は である。
このDNAは本明細書に記載のシステムにおいて標的ポ
リヌクレオチド配列として機能し、本明細書では、標的
ポリヌクレオチドとも呼ぶ。
酵素： クレノウフラグメントDNA−依存性DNAポリメラーゼ
（ロツト番号NM92818、7.2単位／μのFPLCpureとして
供給）は、Pharmacia Inc.（Piscataway,NJ）から購入
した。制限エンドヌクレアーゼEcoR I（ロツト番号411L
1、10単位／μ）、Hind III（ロツト番号51111、10単
位／μ）およびBamH I（ロツト番号461D1、10単位／
μ）はBRLから購入した。
緩衝液およびその他の試薬： クレノウポリメラーゼ緩衝液（10X）は70mM Tris−CH
l（pH＝7.5）、70mM MgCl2および500mM NaClとした。４
種のデオキシヌクレオチドトリホスフエート（dATP、dG
TP、dCTPおよびdTTP）は100mM溶液としてPharmacia In
c.から購入した。水は滅菌濾過Milli−Ｑ試薬用を用い
た。すべての薬品は試薬用またはそれ以上の等級品とし
た。電気泳動用試薬は、Bio−Rad Inc.（Richmond,CA）
から購入した。α−32PdTTP（3,000Ci/mmol;10mCi/ml）
は、New England Nuclear corp.（Boston,MA）から購入
した。
ハイブリダイゼーシヨン反応条件： 17塩基DNA（2ng/ml;2ng180fmole）1.0μ、M13mp1
9一本鎖DNA（10μg/41μ:4μｇ2.1pmole）20.5μ
および10×クレノウポリメラーゼ緩衝液6.0μを滅菌
1.5mlエツペンドルフ管に加え、ボルテツクスで混合
し、短時間回転させて反応液を管の底に沈めた。混合物
を60℃で５分間インキユベーシヨンし、ついで放置して
室温まで冷却した（約30分）。冷却後、α−32P−dTTP2
1.5μ、dNTPs4.0μ（いずれも0.4mM）、およびDTT
4.0μ（0.1M）を反応液に加えた。酵素添加前にサン
プル0.4μを反応液から採取し、ゼロ時間とした。上
述の反応液を含む標的と平行して、標的ポリヌクレオチ
ド配列を水1.0μで置換した同じ対照反応液を準備し
た。
増幅反応： 最初のサイクルでは、クレノウポリメラーゼ1.0μ
と３種の制限エンドヌクレアーゼ（EcoR I、Hind IIIお
よびBamH I）各１μを反応液に加えた。反応液を37℃
で２分間インキユベーシヨンし、ついで沸騰水浴に５分
間移して生成したフラグメントの変性を行つた。以前の
実験により、本条件では、３種の制限エンドヌクレアー
ゼ部位を越えた一次ポリヌクレオチド延長は２分後に完
結することが明らかにされていた。変性後、チユーブを
60℃に10分間、ついで37℃に５分間置いた。反応液を短
時間回転させて、液体をすべてチユーブの底に沈め、つ
いでその一部4.0μを分析用に採取した（サイクル
＃１）。新しい酵素を加え、第２のポリメリゼーシヨン
を開始させた。この操作を計４サイクル反復した。
結果： 各サイクルののちに、標的ポリヌクレオチドおよび対
照を含む両チユーブから採取したサンプルを、変性条件
下（8M尿素;56℃）、20％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によつて解析した。放射標識したDNAマーカーを一
緒に電気泳動させて、観察されたバンドのサイズを評価
した。
第３表には、ゲルオートラジオグラムの解析で得られ
た濃度計によるデータを要約する。この表には、相対ピ
ーク強度についての測定値と理論的に期待される値との
比較も示す。
標的DNAを加えなかつた反応液のいずれにもバンドが
検出されなかつたことは特記に値する。すなわち、アツ
セイは完全に標的DNAに依存している。さらに、第３表
から明らかなように、一次ポリヌクレオチドの量の増幅
は連続したサイクルを通じて起こる。
例 ２ 以下の配列 の反復ポリデオキシヌクレオチドおよび配列 のオリゴデオキシヌクレオチド（17マー）はホスホルア
ミダイト法で合成した。17マーの一部（50ng、8.9pmol
e）を標準方法（Maxam,A.＆ Gilbert,W.;Methode in En
zymology,65:499,1980）により、α−32P ATP（ロツト
番号＃2387〜299NEN、3,000Ci/mmole、10mCi/ml）T4ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端で放射標識
し、以後の酵素反応を追跡した。放射性17マーはNENSOR
B クロマトグラフイーにより（DuPot/New England Nuc
lear）、供給者のプロトコールに従つて精製した。
120マー（１μｇ＝25pmole）を、上述の放射標識17マ
ーすべてを含む10倍モル過剰（1.4μｇ＝250pmole）の1
7マーと60℃で５分間インキユベーシヨンし、ついで1.3
×ウレノウ緩衝液（１×クレノウ緩衝液は7mM Tris−HC
l、pH7.5、7mM MgCl2、50mM NaClである）中容量20.2μ
で30分を要して徐々に37℃に冷却した。この冷却反応
混合物に、0.4mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP（終濃度は各
dNTPにつき32μＭ）の溶液２μ、0.1Mジチオスレイト
ール（終濃度7.2μＭ）およびクレノウポリメラーゼ（P
harmacia、ロツト番号＃NM92818）7.2単位の終濃度１×
クレノウ緩衝液中溶液20μを加えた。この反応液を37
℃で30分間インキユベーシヨンした。さらにクレノウポ
リメラーゼ7.2単位（１μ容量）を加え、反応をさら
に１時間続けた。
この反応生成物を、0.3M酢酸ナトリウム（pH5.4）375
μとエタノール1.1ml（−20℃）の添加によつてエタ
ノール沈殿させ、ついで15,000gで30分間遠心分離し
た。沈殿したDNAを水25μ中に再懸濁し、100％エタノ
ール1ml（４℃）で再沈殿させ、上記と同様に遠心分離
した。上澄液を除去し、沈殿したDNAペレツトを真空下
に乾燥した。
このペレツトを蒸留水17μ、EcoR I制限酵素緩衝液
（終濃度＝50mM Tris、pH8.0、10mM MgCl2、100mM NaC
l）２μおよびEcoR I制限エンドヌクレアーゼ（Bethe
sda Research Labs、終濃度＝１単位／μ）１μ（2
0単位）に再懸濁した。37℃に１時間放置して反応を進
行させた。この反応液１μを20％ポリアクリルアミド
/8M尿素ゲル電気泳動に付してEcoR I制限部位の完全な
消化を確認した。反応生成物の残部（19μ）をNENSOR
B クロマトグラフイーで精製し、蒸発乾固した。
バクテリオフアージM13mp19複製型DNA（Garisch−Per
ran,C.,Vieira,J.＆ Messing,J.:Gene,33:103〜119、19
85）1.3μｇをEcoR I制限酵素で消化し、凍結して制限
酵素を不活性化した。この線状化M13mp19（135ng）を上
述の全クレノウポリメリゼーシヨン/EcoR I制限生成物
に加え、さらに0.5mM ATP、T4DNAリガーゼ（Bethesda R
esearch Lsbs、ロツト番号＃51131）１単位、66mM Tris
−HCl（pH7.6）、6.6mM MgCl2および10mMジチオスレイ
トールを加えて、最終反応容量を20μとした。反応は
12℃で18時間行つた。
この反応混合物10μを各２μの５個に分け、標準
プロトコール（Maniatisほか：“Molecular Cloning"、
Cold Spring Harbor Laboratorty,1982）を用いてDNAト
ランスホーメーシヨンのためたコンピーテントとしたE.
coli JM 101細菌細胞とインキユベーシヨンした。５個
のトランスホーマントをペトリ皿中YTメジウム上に置
き、一夜37℃でインキユベーシヨンした（Maniatis,pp3
20〜321）。これらのペトリ皿を標準方法（Benton,W.D.
＆ R.W.Davis:Science、196:180、1977）により、ニト
ロセルロース濾紙レプリカを用い、２回スクリーニング
した。スクリーニングに用いた放射性プローブは、比活
性約２×107cpm/μｇに５′32P標識した出発の120マー
である。
乾燥濾紙のオートラジオグラフイーにより、５個のペ
トリ平板中の放射性プローブにハイブリダイズした約10
0個のM13mp19感染JM101コロニーが認められた。これら
の陽性クローンから無作為に７個を採取した。これらに
ついてサンガーのジデオキシ配列決定法（Sanger,F.ほ
か:J.Mol.Biol.,143:161、1980）により配列を決定し、
それぞれが、期待されたEco RIではさまれた反復ポリヌ
クレオチド配列の同じ方向性での１個の挿入体を含有す
ることが明らかにされた。このクローンを以下、“M13m
p19Dra Iクローと呼ぶ。
標的DNA配列に直接隣接したこの配列（またはそのマ
ルチマー）は多くの利点を有する。すなわち、 （１） 多数のフラグメントの生成に単一の制限エンド
ヌクレアーゼのみを要する。
（２） フラグメントの６個は同じ配列、長さなので、
増幅の改良が可能である。
（３） ポリメリゼーシヨンには３個の塩基のみが必要
なので、線状DNAからのバツクグラウンドはdGTP（相補
体をウイルス鎖にクローニングする場合はdCTP）を反応
から除外することにより著しく減少できる。
（４） この配列で、一般的増幅試薬または増幅カセツ
トが可能になる。
例 ３ M13mp19Dra Iクローン鋳型でのプライマーのポリメラー
ゼに基づく延長 配列 を有する23塩基長オリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーを、容量50μ中、M13mp19Dra Iクローンにハイブリ
ダイゼーシヨンさせた。ハイブリダイゼーシヨンに用い
たプライマーの総量は0.021pmole、M13mp19Dra Iクロー
ンの総量は2.1pmoleであつた。ハイブリダイゼーシヨン
は前述の温度および緩衝液条件で実施した。
４回の平行ポリメリゼーシヨン反応を37℃で実施し
た。使用したポリメラーゼは、２つの別個の反応容量で
のクレノウポリメラーゼ（Pharamacia、ロツト番号＃NM
92818）14.4単位または２つの残りの反応でのT7ポリメ
ラーゼ（United States Biochemical Corporation、ロ
ツト番号＃51255）2.75単位のいずれかである。クレノ
ウポリメリゼーシヨンの一方およびT7ポリメリゼーシヨ
ンの一方には40単位の制限エンドヌクレアーゼDra Iを
加えた。ポリメリゼーシヨンには、３個のデオキシヌク
レオシドトリホスフエート、dATP、dCTPおよびdTTPのみ
を用い、終濃度は各32μＭとした。
反応液から、０、２、４、６、10、20および30分にサ
ンプルを採取した。これらを適当な容量の95％ホルムア
ミドおよびプロモフエノールブルー、キシレンシアノー
ル染料と混合し、20％変性アクリルアミドゲル上電気泳
動に付した。ゲルのオートラジオグラフイーにより、反
応液がポリメラーゼとDra I制限酵素の両者を含む場合
には、期待された12塩基長のオリゴヌクレオチドバンド
と高分子量の12マーのマルチマーが認められた。ポリメ
ラーゼは存在してもDra Iを添加しない場合には、オー
トラジオグラム上に放射性生成物は認められなかつた。
第４表には、Dra Iの存在下T7ポリメラーゼ延長で得ら
れた各フラグメントバンドの集積面積を示す。濃度測定
はZeinehのソフトレーザー濃度計SL−504−XL型（Biome
d Instruments Inc.,Fullerton,CA）によつて行つた。D
ra I制限エンドヌクレアーゼの存在しないゲル中にはバ
ンドは認められなかつた。
例 ４ 反復Mbo II制限酵素部位からなる一本鎖DNA分子上にお
けるプライマーのポリメラーゼによる延長 オリゴデオキシリボヌクレオチド配列１および２ をホスホルアミダイト法で合成し、変性ポリアクリルア
ミドゲル上で精製した。オリゴマー１と２をアニーリン
グするとプライミングされた鋳型が創製され、これから
DNAポリメラーゼは、オリゴマー１を鋳型として使用し
て３′末端からオリゴマーを延長させることができ、こ
のようにして二本鎖DNA分子が合される。オリゴマー１
および２は単独では制限酵素Mbo IIの基質にはならない
が（データは示していない）、アニーリングされた１＋
２とDNAポリメラーゼとdGTPとdATPから得られた二本鎖
生成物は、７個のMbo II制限部位を含有する。この二本
鎖生成物をMbo IIで完全に消化すると、他の生成物のほ
かに、15マーのリピートが生成し、各リピートは次の生
成を有する。
これらの15マーリピートは50℃を越える温度で融解分
離し、１モル過剰のオリゴマー１の存在下、15マー一本
鎖オリゴマー（Ｂ）は、反応液を約37℃に冷却すると、
オリゴマー１とハイブリダイゼーシヨンする。したがつ
て、継続してDNAポリメリゼーシヨン、Mbo II制限消化
および加熱／冷却（融解／アニーリング）工程を行うこ
とにより、さらにプライミングされた鋳型が反応液中に
導入される。このプロトコールを反復すると、プレカー
サーdNTPが使い果たされるかまたは基質の一本鎖オリゴ
マー１の限界まで、DNAの合成が継続される。好熱性微
生物Thermus aquaticusからの熱に安定なDNAポリメラー
ゼを使用すれば、連続した加熱／冷却のサイクルを通じ
てDNAポリメラーゼ活性が維持され、新たな酵素を繰り
返し添加する必要はなくなる。
オリゴマー１および２を用いた増幅実験は、典型的に
は１〜2pmoleの１を用い、５〜10fmoleの２を添加また
は添加しないで実施した。オリゴマーを1.4×Taq緩衝液
（10×Taq緩衝液:0.5Mトリス、pH8.5、25℃;0.1M NaC
l、0.1M MgCl2）中、65℃で３分間インキユベーシヨン
し、ついで徐々に（約30分）、37℃以下に冷却した。次
にdNTP、通常は0.5nmoleのdATP、100pmoleのdGTPおよび
10〜50μCiのα−32P dATP（比活性200〜800Ci/mmole）
を添加した。これらの反応混合物中におけるα−32P dA
TPの最終比活性は、通常５〜10Ci/mmoleで、最終Taq緩
衝液の濃度は容量50μ中１×であつた。Taqポリメラ
ーゼ１〜５単位を添加したのち、エツペンドルフ1.5ml
反応チユーブを65℃で５分間、37℃で５分間インキユベ
ーシヨンし、ついで５単位のMbo II（0.5μ）制限酵
素を加えた。インキユベーシヨンをさらに10分間続けて
消化させたのち、Taqポリメラーゼは加えないことと、M
bo II酵素は以後の20分ごとに添加したほかは、上述の
温度条件での処理を反復した。生成物はTCA（10％トリ
クロル酢酸）沈殿および／または変性ゲル電気泳動で分
析した。
Taq DNAポリメラーゼはPerkin−Elmer Cetusから、Mb
o II制限酵素はPharmaciaから購入した。
増幅実験の様々な時点で採取したサンプルのTCA沈殿
の結果を第５表に示す。プレカーサーα32P dATPからポ
リヌクレオチドへの32Pの導入は、標準的なTCAプロトコ
ール（Maniotis、473頁）によつて追跡した。この実験
は、1pmoleのオリゴマー１と、5fmoleのオリゴマー２の
存在または非存在下に行われた。
第５表から明らかなように、ポリヌクレオチドへの32
Pの導入速度は、5fmoleのプライマー、オリゴマー２の
存在により、プライマーが存在しない場合に比し著しく
加速された。プライマーの存在は、インキユベーシヨン
２〜４時間の間に最も劇的に評価された。すなわち、こ
れらの条件下には、プライマー依存性DNAポリメリゼー
シヨンと、プライマー非依存性DNAポリメリゼーシヨン
は約２時間まで明らかに分離される。
例 ５ M13mp18“Mbo IIリピート”クローン化鋳型上における
ポリメラーゼでのプライマーの延長 下記のポリヌクレオチド配列 （標準技術によつて製造できる）をBamH IとEcoR I制限
酵素によつて線状化したM13mp18バクテリオフアージRF
（市販品をたとえばBethesdaから入手できる）中に標準
方法でクローン化した。一本鎖環状ゲノムをクローン化
挿入体とともに含有するバクテリオフアージを、感染さ
せた、プラーク精製E.coli J M101宿主細胞から単離し
た。これらのバクテリオフアージから単離されたDNAはD
NA挿入体を、期待された配列および方向性で有すること
が明らかにされた。すなわち“TTCTTC（Ｔ）9"反復オリ
エンテシヨンである。このバクテリオフアージDNAはMbo
II制限酵素の基質にはならない（データは示していな
い）。
以下に示すオリゴデオキシヌクレオチド を、標準的なホスホルアミダイト化学方法によつて合成
した。このDNAはプライマーとして働き、M13mp18DNA配
列側面配列の部分、ならびに挿入体の短い領域にわたつ
てハイブリダイゼーシヨンする。
このM13mp18“Mbo IIリピート”クローンを用い、オ
リゴマー３プライマーの存在下または非存在下に増幅反
応を実施した。代表的な実験からのTCA沈殿データを第
６表に示す。この表から明らかなように、Mbo II酵素を
添加しないとポリヌクレオチドへのα−32P dATPの有意
な導入は認められない。プライマーとMbo IIの存在下に
は、プライマーを添加しなかつた場合に比べて、32Pの
導入は有意に加速される。これらの２つの反応は、4.2
時間目と6.5時間目の間で、10fmoleのプライマーの存在
を検出する能力により容易に識別できる。
以上、本発明を、その理解を容易にするために、例を
挙げて詳細に説明したが、本発明はこれらの例に限定さ
れるものではなく、特許請求の範囲の記載の範囲内にお
いて多くの改変および修飾が可能なことは自明である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明に従つて基本ポリヌクレオチド配列の
多重コピーを得る方法を示す図である。 第２図は、本発明に従つて、ポリヌクレオチド分析対象
の存在に応じた基本ポリヌクレオチド配列の形成を行う
方法を示す図である。 第３図〜第６図は、ポリヌクレオチド分析対象の存在に
より基本ポリヌクレオチド配列の形成を行う別法を示す
図である。
フロントページの続き (72)発明者 サムエル ローズ アメリカ合衆国カリフォルニア州マウン ティン ビュー，タイラー パーク ウ ェイ 1469 (72)発明者 エドウィン エフ．ウルマン アメリカ合衆国カリフォルニア州アサー トン，セルビィ レーン 135

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリヌクレオチドの３′末端に存在する基
    本ポリヌクレオチド配列の多重コピーを製造するにあた
    り、（ａ）ヌクレオシドトリホスフェートと鋳型依存性
    ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下、それぞれ１個
    または２個以上の切断可能部位を含有する２個またはそ
    れ以上の鋳型配列からなる一本鎖パターンポリヌクレオ
    チドの鋳型配列とハイブリダイゼーションした基本ポリ
    ヌクレオチド配列の延長を形成し、（ｂ）この延長が上
    記鋳型配列とハイブリダイゼーションした場合その切断
    可能部位で特異的に切断する手段の存在下、その延長を
    切断可能部位でフラグメントに切断し、（ｃ）基本ポリ
    ヌクレオチド配列からなるそのフラグメントを解離し、
    （ｄ）そのフラグメントを上記一本鎖パターンポリヌク
    レオチドとハイブリダイゼーションし、上記工程（ａ）
    〜（ｄ）を同時にまたは全部もしくは一部を順次行うこ
    とによって工程（ａ）〜（ｄ）を反復することを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】ポリヌクレオチドの３′末端に存在する基
    本ポリヌクレオチド配列の多重コピーを製造するにあた
    り、（ａ）ヌクレオシドトリホスフェートと鋳型依存性
    ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下、それぞれ１個
    または２個以上の部位特異性切断配列を含有する２個ま
    たはそれ以上の鋳型配列からなる一本鎖パターンポリヌ
    クレオチドの鋳型配列とハイブリダイゼーションした基
    本ポリヌクレオチド配列の延長を形成し、（ｂ）この延
    長が上記部位特異性切断配列とハイブリダイゼーション
    した場合その切断可能なポリヌクレオチド配列を特異的
    に切断する手段の存在下、その延長を切断可能ポリヌク
    レオチド配列においてフラグメントに切断し、（ｃ）基
    本ポリヌクレオチド配列からなるそのフラグメントを解
    離し、（ｄ）そのフラグメントを上記一本鎖パターンポ
    リヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、上記工程
    （ａ）〜（ｄ）を同時にまたは全部もしくは一部を順次
    行うことによって工程（ａ）〜（ｄ）を反復することを
    特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われ
    るサンプル中の上記分析対象の存在を決定する方法にお
    いて、（ａ）ヌクレオシドトリホスフェートと鋳型依存
    性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下、３′−ヒド
    ロキシヌクレオチドを含有し、その３′−ヒドロキシヌ
    クレオチドを包含する部位が、それぞれ１個または２個
    以上の部分特異性切断配列を含有する２個またはそれ以
    上の鋳型配列に５′末端で連結した結合ポリヌクレオチ
    ド配列からなる一本鎖パターンポリヌクレオチドの結合
    ポリヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションしたポ
    リヌクレオチド分析対象の延長を形成し、（ｂ）上記延
    長が上記部位特異性切断配列とハイブリダイゼーション
    した場合その切断可能なポリヌクレオチド配列を特異的
    に切断する手段の存在下、その延長を切断可能ポリヌク
    レオチド配列においてフラグメントに切断し、（ｃ）そ
    のフラグメントを解離し、（ｄ）そのフラグメントを上
    記一本鎖パターンポリヌクレオチドとハイブリダイゼー
    ションし、（ｅ）上記ヌクレオシドトリホスフェートと
    上記鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在
    下、上記一本鎖パターンポリヌクレオチドとハイブリダ
    イゼーションした上記フラグメントの延長を形成し、
    （ｆ）上記工程（ｂ）〜（ｅ）を同時にまたは全部もし
    くは一部を順次行うことによって工程（ｂ）〜（ｅ）を
    反復し、（ｇ）その存在が上記サンプル中における上記
    ポリヌクレオチド分析対象の存在を示す上記フラグメン
    トまたはそれに対応する相補性フラグメントを検出する
    ことを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】RNA分析対象の含有が疑われるサンプル中
    の上記RNA分析対象の存在を決定する方法において、上
    記ポリヌクレオチド分析対象が３′−ヒドロキシヌクレ
    オチドで終わっている場合、水性メジウム中にサンプ
    ル、制限部位を含有し上記RNA配列とハイブリダイゼー
    ション可能なデオキシ核酸配列からなる一本鎖DNAプラ
    イマー、及び上記プライマーが上記RNA配列とハイブリ
    ダイゼーションした場合に上記プライマーを上記切断部
    位で切断できる制限酵素を合し、上記メジウムを切断が
    生じるのに十分な時間インキュベーションする特許請求
    の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】ポリヌクレオチドの３′末端に位置する標
    的ポリヌクレオチド配列の存在の結果として基本ポリヌ
    クレオチド配列の多重コピーを製造するにあたり、
    （ａ）ヌクレオシドトリホスフェートと鋳型依存性ポリ
    ヌクレオチドポリメラーゼの存在下、それぞれ１個また
    は２個以上の部位特異性切断配列を含有する２個または
    それ以上の鋳型配列のコピーと結合ポリヌクレオチド配
    列からなる一本鎖パターンポリヌクレオチドの結合ポリ
    ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションした標的ポ
    リヌクレオチド配列の延長を形成し、（ｂ）上記延長が
    上記部位特異性切断配列とハイブリダイゼーションした
    場合その切断可能なポリヌクレオチド配列を特異的に切
    断する手段の存在下、その延長を切断可能ポリヌクレオ
    チド配列部位においてフラグメントに切断し、（ｃ）上
    記基本ポリヌクレオチド配列からなるフラグメントを解
    離し、（ｄ）そのフラグメントを上記一本鎖パターンポ
    リヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、（ｅ）上
    記ヌクレオシドトリホスフェートと上記鋳型依存性ポリ
    ヌクレオチドポリメラーゼの存在下、上記一本鎖パター
    ンポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションした上記
    フラグメントの延長を形成し、（ｆ）上記工程（ｂ）〜
    （ｅ）を同時にまたは全部もしくは一部を順次行うこと
    によって工程（ｂ）〜（ｅ）を反復することを特徴とす
    る方法。
  6. 【請求項６】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われ
    るサンプル中の上記ポリヌクレオチド分析対象の存在を
    検出する方法において、（ｉ）上記サンプル、（ii）上
    記分析対象が３′−OH基で終結していない場合はそのポ
    リヌクレオチド分析対象が３′−OH基で終わるようにす
    る手段、（iii）上記ポリヌクレオチド分析対象とハイ
    ブリダイゼーションが可能で、縦に一列に連結した２個
    またはそれ以上の鋳型配列の鎖の３′末端に連結した結
    合ポリヌクレオチド配列からなり、部位特異性切断配列
    を含む一本鎖パターンポリヌクレオチド、（iv）ヌクレ
    オシドトリホスフェート、（ｖ）鋳型依存性ポリヌクレ
    オチドポリメラーゼ、および（vi）上記切断可能ポリヌ
    クレオチド配列が上記部位特異性切断配列とハイブリダ
    イゼーションした場合、上記部位特異性切断配列に相補
    性の切断可能ポリヌクレオチド配列を特異的に切断でき
    る手段を、同時にまたは全部もしくは一部を順次配合
    し、この配合物を（ａ）上記分析対象が３′−OH基で終
    結していない場合は上記ポリヌクレオチド分析対象の
    ３′−OH基による終結、（ｂ）上記ポリヌクレオチド分
    析対象と上記一本鎖パターンポリヌクレオチドのハイブ
    リダイゼーション、（ｃ）上記鋳型配列および上記部位
    特異性切断配列に相補性の配列からなる上記ポリヌクレ
    オチド分析対象の延長の形成、（ｄ）上記延長の上記切
    断可能ポリヌクレオチド配列におけるフラグメントへの
    切断、（ｅ）そのフラグメントの解離、（ｆ）この解離
    フラグメントを一本鎖パターンポリヌクレオチドとのハ
    イブリダイゼーション、および（ｇ）このハイブリダイ
    ゼーションしたフラグメントの上記パターンポリヌクレ
    オチド方向への延長の形成を同時にまたは全部もしくは
    一部を順次行うことができる条件下においてインキュベ
    ーションし、工程（ｄ）〜（ｇ）を反復し、その存在が
    上記サンプル中における上記ポリヌクレオチド分析対象
    の存在を示す上記フラグメントまたはそれに対する相補
    性フラグメントを検出することを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】ポリヌクレオチドサンプル中に存在するポ
    リヌクレオチドの標的配列の存在の函数として多重ポリ
    ヌクレオチド分子を製造する方法において、（ｉ）上記
    標的配列を含有する上記ポリヌクレオチドサンプル、
    （ii）上記標的配列が遊離の３′−OH基で終結していな
    い場合は上記標的配列を遊離の３′−OH基で終わるよう
    にする手段、（iii）上記標的配列の実質的にすべてと
    相補性で、それぞれ部位特異性切断配列を含有する２個
    またはそれ以上の鋳型配列に５′末端で連結している結
    合ポリヌクレオチド配列からなる一本鎖パターンポリヌ
    クレオチド、（iv）ヌクレオシドトリホスフェート、
    （ｖ）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およ
    び（vi）上記部位特異性切断配列がハイブリダイゼーシ
    ョンした場合、上記部位特異性切断配列に相補性の配列
    を切断する手段を、同時にまたは全部もしくは一部を順
    次配合し、この配合は、（ａ）上記標的配列が二本鎖で
    ある場合にはその標的配列の変性、（ｂ）上記標的配列
    と上記結合ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
    ン、（ｃ）上記標的配列の鋳型依存性ポリメリゼーショ
    ンによる延長での二重構造の作成、（ｄ）上記二重構造
    における上記延長のフラグメントへの切断、（ｅ）上記
    フラグメントの可逆的変性、（ｆ）上記フラグメントの
    一本鎖パターンポリヌクレオチドとのハイブリダイゼー
    ション、および（ｇ）上記ハイブリダイゼーションした
    フラグメントの鋳型依存性ポリメリゼーションによる延
    長での二重構造の作成を同時にまたは全部もしくは一部
    を順次促進する条件下で行い、そして工程（ｄ）〜
    （ｇ）を反復することを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】一本鎖パターンポリヌクレオチドは少なく
    とも３個の同一の鋳型配列のオリゴマーからなる特許請
    求の範囲第１項から第７項までのいずれか一つに記載の
    方法。
  9. 【請求項９】オリゴマーは３′末端が、鋳型依存性ポリ
    ヌクレオチドポリメラーゼによって触媒されるオリゴマ
    ーの鎖延長反応が不可能なように化学基または固体支持
    体で終結している特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】部位特異性切断配列は制限エンドヌクレ
    アーゼ部位であり、切断可能ポリヌクレオチド配列を特
    異的に切断する手段は制限エンドヌクレアーゼからなる
    方法。
  11. 【請求項１１】一本鎖パターンポリヌクレオチド中の鋳
    型配列の３′末端は、ポリヌクレオチド分析対象の含有
    が疑われるサンプル中のポリヌクレオチド分析対象に相
    補性のポリヌクレオチド配列に連結している特許請求の
    範囲第１項から第10項までのいずれか一つに記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】一本鎖パターンポリヌクレオチドは環状
    ポリヌクレオチドの少なくとも一部である特許請求の範
    囲第１項から第11項までのいずれか一つに記載の方法。
  13. 【請求項１３】鋳型配列およびその鋳型配列に連結する
    配列は、ＡとdA、ＵとdT、ＣとdCおよびＧとdG並びにそ
    の誘導体からなる群の３つから選ばれるヌクレオチドの
    連続配列によって構成される特許請求の範囲第１項から
    第12項までのいずれか一つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】誘導体は、メチル化ヌクレオチドおよび
    レポーター基で標識されたヌクレオチドからなる群から
    選ばれる特許請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】それぞれ約８〜100個のヌクレオチドと
    少なくとも１個の制限部位を有する同一のオリゴデオキ
    シヌクレオチド鋳型からなる縦に連結したオリゴヌクレ
    オチド単位Nm約３〜100個からなる一本鎖DNAオリゴマー
    であって、そのオリゴマーの３′末端がそのオリゴマー
    の５′末端に結合して環を形成し、前記オリゴマーが
    式、 式中、Ｎはヌクレオチドであり、ｎは３〜100であり、
    ｍは８〜100である、を有するDNAオリゴマー。
  16. 【請求項１６】少なくとも約16個のヌクレオチドからな
    る一本鎖核酸結合配列Npに３′末端で結合した一本鎖DN
    AオリゴマーNmであって、上記オリゴマーNmはそれぞれ
    約８〜100個のヌクレオチドＮと少なくとも１個の制限
    部位を有する同一のオリゴヌクレオチド鋳型配列からな
    るオリゴヌクレオチド単位約３〜100個から構成され、
    そして上記オリゴマーNmは、dA、dT、dGおよびdC並びに
    その誘導体からなる群のうちの３個から選ばれるヌクレ
    オチドで構成され、前記一本鎖核酸に結合する前記オリ
    ゴマーは式、 （５′Nm3′）ｎ−（５′Np3′） 式中、Ｎはヌクレオチドであり、ｎは３〜10であり、ｍ
    は８〜100であり、ｐは少なくとも16である、 を有するDNAオリゴマー。
  17. 【請求項１７】特許請求の範囲16項に記載のDNAオリゴ
    マーを包装配合したキット。
  18. 【請求項１８】４個から80個までのモノマーTTTAAACCTA
    CCからなる特許請求の範囲第15項に記載のDNAオリゴマ
    ー。
  19. 【請求項１９】モノマーTTCTTC（Ｔ）９のオリゴマー単
    位からなる特許請求の範囲第15項に記載のDNAオリゴマ
    ー。
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Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5622820A (en) * 1988-03-10 1997-04-22 City Of Hope Method for amplification and detection of RNA and DNA sequences
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
GB8818020D0 (en) * 1988-07-28 1988-09-01 Ici Plc Method for amplification of nucleotide sequences
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
FR2648152A1 (fr) * 1989-06-12 1990-12-14 Oris Ind Cie Procede de detection et/ou d'identification d'acides nucleiques par amplification et hybridation en solution et ses applications
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
DE69028257T2 (de) * 1989-07-11 1997-01-09 Gen Probe Inc Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen
EP0409159B1 (en) * 1989-07-18 1998-11-25 Shimadzu Corporation Method for testing causative microorganism of food poisoning and reagents therefor
CA2065424C (en) * 1989-09-06 2003-05-27 Jean-Luc Guesdon Fragments of nucleic acids derived from an appropriate mycobacteria genome, their applications in the diagnosis of mycobacteria infections and plasmides containing said fragments
AU7233691A (en) * 1990-01-16 1991-08-05 Collaborative Research Inc. Dna sequences from specific human genomic loci useful for identification of individuals
DE69121791T2 (de) * 1990-06-08 1997-01-23 Behringwerke Ag Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNS-Sequenzen
US6730305B1 (en) 2000-05-08 2004-05-04 The Uab Research Foundation Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins
HUT67362A (en) * 1990-07-24 1995-03-28 Uab Research Foundation Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells
AU648842B2 (en) * 1990-09-21 1994-05-05 Amgen, Inc. Enzymatic synthesis of oligonucleotides
US5645987A (en) * 1990-09-21 1997-07-08 Amgen Inc. Enzymatic synthesis of oligonucleotides
US5525462A (en) * 1991-05-02 1996-06-11 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Nucleic acid sequence amplification method, detection method, and reagent kit therefor
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5294534A (en) * 1991-08-13 1994-03-15 Miles, Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US5846717A (en) * 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5994069A (en) * 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
USH1985H1 (en) 1992-01-09 2001-08-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method for detecting biological toxins
WO1993022461A1 (en) * 1992-05-06 1993-11-11 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
AU687352B2 (en) * 1992-06-08 1998-02-26 Gen-Probe Incorporated Preparation of nucleic acid from mononuclear cells
AU670116B2 (en) * 1992-08-04 1996-07-04 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification
US6673616B1 (en) * 1992-12-07 2004-01-06 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for characterizing nucleic acids
US6372424B1 (en) * 1995-08-30 2002-04-16 Third Wave Technologies, Inc Rapid detection and identification of pathogens
US5985548A (en) * 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US5824787A (en) * 1993-12-03 1998-10-20 Gensura Laboratories, Inc. Polynucleotide sizing reagent
US6165793A (en) * 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US20060257890A1 (en) * 1996-05-20 2006-11-16 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6335160B1 (en) * 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6995017B1 (en) 1994-02-17 2006-02-07 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6309883B1 (en) 1994-02-17 2001-10-30 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
KR100230718B1 (ko) * 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
EP0705905B1 (de) * 1994-07-16 2001-10-10 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
US5597697A (en) * 1994-09-30 1997-01-28 Diamond; Paul Screening assay for inhibitors and activators of RNA and DNA-dependent nucleic acid polymerases
DE4441626A1 (de) * 1994-11-23 1996-05-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
US5668263A (en) * 1994-12-16 1997-09-16 Smithkline Beecham Corporation Conserved yeast nucleic acid sequences
US5877280A (en) * 1995-06-06 1999-03-02 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Thermostable muts proteins
ES2170861T3 (es) * 1995-06-07 2002-08-16 Merck & Co Inc Procedimiento de ensayo de extension de adn polimerasa.
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5660989A (en) * 1995-06-07 1997-08-26 Merck & Co., Inc. DNA polymerase extension assay for influenza virus endonuclease
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US6506602B1 (en) 1996-03-25 2003-01-14 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6100028A (en) * 1996-06-03 2000-08-08 Merck & Co., Inc. DNA polymerase extension assay
US20070009930A1 (en) * 1996-12-18 2007-01-11 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6482590B1 (en) 1996-12-20 2002-11-19 Aventis Behring Gmbh Method for polynucleotide amplification
US6153410A (en) * 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6136568A (en) * 1997-09-15 2000-10-24 Hiatt; Andrew C. De novo polynucleotide synthesis using rolling templates
IL122147A0 (en) * 1997-11-10 1998-04-05 Technion Res & Dev Foundation Method for labeling polynucleotides
CA2313380C (en) * 1997-12-08 2008-12-30 California Institute Of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7153655B2 (en) * 1998-06-16 2006-12-26 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence
US6365408B1 (en) 1998-06-19 2002-04-02 Maxygen, Inc. Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination
GB9822777D0 (en) 1998-10-20 1998-12-16 Tepnel Medical Ltd Template chain reaction
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
AU2001274635A1 (en) * 2000-11-10 2002-05-21 Amicogen, Inc. Method for generating recombinant dna library using unidirectional single-stranded dna fragments
US6958213B2 (en) * 2000-12-12 2005-10-25 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function
US20020086292A1 (en) * 2000-12-22 2002-07-04 Shigeaki Harayama Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules
US20050153283A1 (en) * 2002-08-08 2005-07-14 Padgett Hal S. Method of increasing complementarity in a heteroduplex
US7582423B2 (en) * 2001-02-02 2009-09-01 Novici Biotech Llc Population of polynucleotide sequence variants
US20040142433A1 (en) * 2001-02-02 2004-07-22 Padgett Hal S. Polynucleotide sequence variants
US7838219B2 (en) * 2001-02-02 2010-11-23 Novici Biotech Llc Method of increasing complementarity in a heteroduplex
DE60234159D1 (de) 2001-02-02 2009-12-10 Large Scale Biology Corp Methode zur erhöhung der komplementarität in einem heteroduplex-polynucleotid
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US20050106587A1 (en) * 2001-12-21 2005-05-19 Micronas Gmbh Method for determining of nucleic acid analytes
US20030157495A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-21 Padgett Hal S. Nucleic acid molecules encoding CEL I endonuclease and methods of use thereof
US7078211B2 (en) * 2002-02-01 2006-07-18 Large Scale Biology Corporation Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof
DE60312507T3 (de) * 2002-05-17 2011-08-18 Alligator Bioscience Ab Eine methode zur in vitro molekularen evolution der proteinfunktion
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
US7169560B2 (en) * 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20060172408A1 (en) * 2003-12-01 2006-08-03 Quake Steven R Device for immobilizing chemical and biochemical species and methods of using same
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
CA2566806A1 (en) * 2004-05-25 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US20060263790A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Timothy Harris Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
GB2432366B (en) * 2005-11-19 2007-11-21 Alligator Bioscience Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070128610A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Buzby Philip R Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing
US20090305248A1 (en) * 2005-12-15 2009-12-10 Lander Eric G Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
US7501254B2 (en) * 2006-07-20 2009-03-10 Ghc Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification and capture of nucleic acid sequences
JP2011509091A (ja) * 2008-01-08 2011-03-24 ザイジェム コーポレイション リミテッド 等温検出法およびその使用
CN106795522A (zh) * 2014-10-17 2017-05-31 上海斯丹赛生物技术有限公司 定向克隆的方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663283A (en) * 1980-03-24 1987-05-05 Genentech, Inc. Method of altering double-stranded DNA
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US4423153A (en) * 1981-12-03 1983-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection and determination of cellular DNA
US4480040A (en) * 1981-12-03 1984-10-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Sensitive and rapid diagnosis of viroid diseases and viruses
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4490472A (en) * 1982-06-17 1984-12-25 Imreg, Inc. Sensitive tests for malignancies based on DNA detection
JPS6091999A (ja) * 1983-10-25 1985-05-23 Fujirebio Inc ポリヌクレオチドの測定方法
US4683194A (en) * 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
US4808525A (en) * 1985-01-31 1989-02-28 University Of Georgia Research Center Site specific cleavage of DNA
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
ES8706823A1 (es) * 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
US4746604A (en) * 1985-05-24 1988-05-24 Enzo Biochem, Inc. Specific binding assays utilizing a viable cell as a label
US4868104A (en) 1985-09-06 1989-09-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous assay for specific polynucleotides
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
BE904402A (fr) * 1986-03-12 1986-09-12 Univ Libre De Bruxelles Iribhn Moule de sonde de detection de sequende d'adn et preparation d'un tel moule et d'une telle sonde.

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