JPH04506906A - 増幅法における伝搬汚染の減少方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅法における伝搬汚染の減少方法 背　景 患者ないし他の被検者から採取した試験サンプル中の分析対象物の存在および／ または量を検出するのに、診断測定法が日常的に用いられている。典型的な分析 対象物として、抗原や抗体があるが、これは、免疫診断法を用いて測定され、そ れによって、病状もしくは、妊娠のような、様々の非病的状態を特定することが できる。高い感度と特異性の実現は、多くの診断法にとって重要である。これは 、特に、問題の分析対象物が、比較的低濃度でしか存在しない場合にはそうであ る。免疫診断法において高感度の実現を可能にした各種改良の中には、アッセイ 系の中にモノクロナール抗体を使用したこと、この種のアッセイに、目印として 用いられる信号の増幅法を組み込んだこと、が挙げられる。

比較的最近、分子生物学分野の進歩によって、プローブ診断法として公知の技術 を用いて、試験サンプル中の特定の核酸配列を検出することが可能になった。プ ローブ診断法においては、核酸配列を用いて、その相補的核酸標的分析物に特異 的に結合させることによって、該サンプルを「プローブする」。これによって、 病気を初期の段階で検出することが可能になった。なぜなら、核酸遺伝物質は、 標的核酸が抗原に転写されるに十分な時間が経過する数カ月、場合によっては数 年前の試験サンプル中にしばしば存在するからである。

これは、ある種の性行為を通じて伝染する病気、例えば、ヒト免疫不全ウィルス による感染では、特に当てはまる。Ｒｇｎｋｉ　ら。

出の他に、プローブ診断法は、特定の遺伝子の存在を特定できるために、その他 の関係する遺伝情報の獲得に用いられている。

例えば、移植拒絶をもたらす抗原をコードする遺伝子の存在や、癌や癌遺伝子テ ストおよび法医学で用いられる遺伝情報である。

その能力を完全に発揮するならば、プローブ診断法は、理論的には、１試験サン プル中の僅か１分子を検出することができる。プローブ診断法の能力を完全に発 揮するうえでの大きな障害の一つは、試験サンプル中によく存在しているごく微 量の標的配列の検出の場合に認められる。このため、プローブ診断法の感度を改 善しようという最近の努力は、標的核酸配列の増幅法に集中している。標的配列 の増幅は、所望のＤＮＡないしＲＮＡ標的核酸配列の反復的再生又は複製といっ たようないくつかの方法のどれかを用いて達成されるわけであるが、その使用す る特定の方法にしたがって、直線的増幅となったり、指数関数的増幅となったり する。

初期の、核酸配列の多数コピーの生産に通例用いられていた方法は、標的核酸配 列を適当な宿主細胞系にクローン化することを含んでいた。この方法では、従来 のクローニング技術を用いており、この場合、所望の核酸を適当なベクターに挿 入し、次に、このベクターを宿主の形質転換に使用する。宿主が培養下で増殖す ると、ベクターも複製され、所望の核酸配列のコピーがさらに産生される。この ベクターに挿入される標的核酸配列は、天然に見られるものでも、合成されたも のでもどちらでもよい。換言すれば、所望の標的核酸配列をインビトロで合成し 、次に、ベクターに挿入し、これを増殖させることによって増幅してもよい。こ れについては、米国特許第４．２９３．６５２号明細書に開示されている通りで ある。

米国特許第４．　［３，１９５，４，６８３，２０２号明細書には、自動化法が 開示されている。この方法は、通常、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）と呼ば れているが、試験サンプル中の標的核酸配列の量を増幅するためのものである。

ＰＣＲ増幅では、２種のオリゴヌクレオチドプライマーを利用するが、この二つ のプライマーは、標的配列のある部分の対向鎖の、別々の末端にたいして相補的 な関係にある。このプライマーを標的にたいしてハイブリダイゼーションさせた 後、ＤＮＡポリメラーゼと過剰のヌクレオシド三燐酸の存在下で、標的配列にた いして相補的な伸長生成物を形成させる。これらのプライマーは、ポリメラーゼ によるＤＮＡ合成が、両プライマー間の領域を向かい合わせに一端から他端へと 進行するように配向される。次に、ハイブリダイズした伸長生成物を変性して、 標的から分離し、このサイクルを繰り返す。この時、伸長生成物も、その後の増 幅サイクルにおいて、新たに加わる伸長生成物形成の鋳型となる。このサイクル を、標的核酸配列の十分量が産生され、その結果、選ばれた測定法で、測定可能 な信号が得られるまで、続行する。

理論的には、連続の各サイクルは、その前のサイクルで合成された核酸量を倍に する、その結果、増幅生成物の蓄積は指数関数的になる。

国際特許出願第８９１０２６４９号には、別種の自動増幅法が開示されている。

この種の増幅法においては、あらかじめ合成した増幅プローブ・ペアを、標的配 列のある部分に接触的に／％イブリダイズさせる。次に、その接触末端を結合さ せ、相補的増幅生成物を形成する。結合後、完全増幅生成物を、熱変性によって 、標的から分離する。さらに、標的核酸配列の十分量が産生され、選ばれた測定 法において、測定可能な信号が得られるまでこの過程を繰り返す。その際、標的 と、得られる増幅生成物の両方が、その後のサイクルにおいて、プローブの鋳型 となる。

ＰＣＲの場合と同様、連続の各サイクルは、理論的には、その前のサイクルの核 酸量を倍加する。あらかじめ合成されたプローブを用いる増幅法は、最も、プロ ーブ同士の結合は、リガーゼの作用以外の手段、例えば、化学的結合、光化学的 な結合によっても実行可能であるが、一般に、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）と 呼ばれている。

核酸増幅法は、試験サンプル中の極少量の核酸配列の検出を可能にしたことによ って、プローブ診断に変革をもたらしたのであるが、日常的な診断状況において は、この方法自体問題をもたらしたのである。すなわち、その問題の１つが伝搬 汚染（ｃｕｔ７ｏｗｅｒ　ｃｏｎｌｘｍｉｎｉｔｉｏｎ　）による偽陽性である 。ある分析対象核酸を、サンプル中のその通常濃度の数百万倍ないし数十億倍と なるまで繰り返し増幅すると、増幅標的を含むサンプルから新たに形成されたサ ンプルに持ち込まれる伝搬汚染の可能性が増す。これは、さらに、その後の試験 サンプルにおいて、陰性サンプルが汚染されたことによる偽陽性を含めて、不自 然に高度の信号を生み出すことにもなる。

伝搬汚染は、サンプルからサンプルへの機械的な伝搬の結果として起こることも あるし、空気汚染の結果起こることもある。

空気汚染は、増幅された試験サンプルを含む反応容器がいくつかの理由、例えば 、試薬の添加、検出のために増幅分析対象物をサンプリングする等の理由によっ て開放されている所では、不可避である。こうした行為だけで、増幅生成物の数 百万分子を空気中に吸い込むことがあり、こうして、普通の研究作業領域を、１ 立方インチ当り数百分子の割合で汚染することになる。

これまでは、オペレーターがどんなに注意しても、この空気中に浮遊するコピー との接触による他の検体の汚染を完全に防ぐことは不可能であった。

標的配列の増幅によって生ずる汚染問題を処理するために下記の技術が開発され たが、この技術は、ＰＣＲタイプの増幅法への使用を意図したものではあるけれ ども、他のタイプの増幅法にも一般に使用可能である。すなわち、（１）増幅前 サンプルと増幅後サンプルの物理的隔離（例えば、隔室を設ける）、（２）試薬 を別々に保存し、また小分けする、（３）陽性排除ピペットの使用、（４）細々 とした実験室技術、（５）注意深い対照選択、である。＾１ｐｌｉｆｉｃｘｔｉ ｏｎｓ−＾ＩｏｒｕＩｊｏｒ　ＰＣＲＵｓｅｒｓ。

２、　４　（１９８９）。しかしながら、この測定は、高価であるばかりか、も っとも理想的な条件を前提としている。さらに、この費用のかかる技術をたとえ 厳密に実行し得たとしても、このような事前の注意をもってしても完全には汚染 問題を除去できない。

絶えず、その体や衣服に汚染源を運んでいる検査技師がいるようなところ、及び 、換気口を通じて部屋から部屋へと汚染空気が循環しているようなところでは、 内在的な困難が続く。Ｋｉｔｃｈｉｎ、　Ｎｉ１ｕｒｅ、３４４．２０１　（１ ９９０）。

ＰＣＲタイプの増幅法において、汚染増幅産物の抑制にたいして、紫外線による 試薬の処理が提案されている。この提案は、よく知られているように、紫外線が 、ＤＮＡ本来の全体構造を破壊する能力を持っているという事実に基づくもので ある。この作用機構は不明であるけれども、ＰＣＨによる汚染増幅産物が、プラ イマー、ｄＮＴＰ、　Ｔｅｑポリメラーゼ調製物中はもちろん、バッファー中に おいても、紫外線照射によって破壊されるということが証明されている。Ｓａ＋ ｋｘｒら、Ｎｘ１ｕｒｅ、３４３．　２７　（１９９Ｇ）。−末鎖ＰＣＲプライ マーは、見かけ上、この処理に生き残ることができるようではあるが、ＬＣＲプ ローブの２本鎖ベアは、照射処理にたいしてより感受性が高く、破壊されるよう である。さらに、紫外線による照射は、その照射処理によって２本鎖標的分子の 破壊が起こるため、未測定サンプルにたいして直接使用することはできない。

本発明の目的は、診断プローブ測定法に増幅法を用いる際に遭遇する伝搬汚染を 有意に減少させる、コスト的に有効な方法を提供することである。また、本発明 の別の目的は、実施が簡単で、且つ、いくつかの異なるタイプの増幅法に適用可 能な、汚染減少法を提供することである。

発明の要約 本発明は、増幅法における、増幅産物汚染を減少するための、効率的かつ経済的 方法を提供する。本発明の方法は、修飾された増幅産物が標的配列と区別できる ように増幅産物を修飾することによって実施される。新しいサンプル中の標的核 酸を増幅する前に、その新しいサンプルを適当な方法で処理して、修飾された汚 染増幅産物を選択的に除去、破壊、あるいは、その他のやり方で不活性（ｎｏｎ マ１ａｂｌｅ　）にし、それによって、その産物が、その後の増幅過程において 増幅されないようにする。このように処理すると、天然の標的配列の量には影響 を与えずに、伝搬汚染や、この種の汚染によってもたらされる偽陽性は減少する 。

図面の簡単な説明 第１図は、ＬＣＲ誘導増幅産物のリガンドによる修飾と、その後の、固定化され た特異的結合パートナ−による修飾増幅産物の除去を示す模式図である。

第２図は、ＰＣＲ誘導増幅産物のリガンドによる修飾と、その後の、固定化され た特異的結合パートナ−による修飾増幅産物の除去を示す模式図である。

第３図は、ＬＣＲ誘導増幅産物の架橋剤による修飾と、その後の、修飾増幅産物 の不可逆的架橋を示す模式図である。

第４図は、ＰＣＲ誘導増幅産物の架橋剤による修飾と、その後の、修飾増幅産物 の不可逆的架橋を示す模式図である。

第５図は、ＬＣＲ誘導増幅産物の制限部位修飾と、その後の、制限酵素による修 飾増幅産物の切断を示す模式図である。

第６図は、ＰＣＲ誘導増幅産物の制限部位修飾と、その後の、制限酵素による修 飾増幅産物の切断を示す模式図である。

第７図は、制限酵素で切断された制限部位修飾ＰＣＲ誘導増幅産物の一部の部分 的ブライミングを示した模式図である。

第８図は、ＰＣＲ誘導増幅産物の制限部位修飾と、その後の、隔離切断制限酵素 による修飾増幅産物の切断を示す模式図である。

第９図は、ＬＣＲ誘導増幅産物の制限部位修飾と、その後の、隔離切断制限酵素 による修飾増幅産物の切断を示す模式図である。

第１０図は、化学的に切断可能な部位を組み込んでいるオリゴヌクレオチドまた はプライマーの調製方法を示す。

第１１図は、実施例１及び２からの、増幅配列、増幅プローブ、得られた増幅産 物、検出プローブを示す。

第１２図は、標的配列及び修飾増幅産物の両方を制限酵素によって処理した後の 、標的および制限酵素修飾増幅産物の相対的増幅効率を示すオートラジオグラム の写真である。

第１３図は、隔離切断制限酵素を評価するための、実施例３で用いた多数部位（ ｐｏｌＨｉｌｅ）　ＤＮＡを示す。

第１４図は、多数部位ＤＮＡに対する、種々の隔離切断制限酵素の相対的切断効 率を示すオートラジオグラムの写真である。

第１５図は、ＰＣＲ誘導増幅産物の二重制限部位修飾と、その後の、隔離切断制 限酵素による修飾増幅産物の切断を示す模式図である。

第１６図は、実施例４からの、１４７塩基対増幅配列（ｐＵＣ９に含まれる）、 対応する修飾及び未修飾ＰＣＲ増幅プライマー、検出プライマーを示す。

第１７図は、実施例４．Ｂ、及び４．Ｃ１で実証される、未修飾及び修飾プライ マーを使用するＰＣＲ増幅の相対的効率、及び、処理した修飾増幅産物が、その 後の増幅において鋳型としては役に立たないことを示すオートラジオグラムの写 真である。

第１８図は、実施例４．Ｃ１で実証される、修飾ＰＣＲ誘導増幅産物が、対応す る切断剤の処理によって効果的に破壊されることを示すオートラジオグラムの写 真である。

第１９図は、二つの隔離切断制限部位修飾を含むＰＣＲ増幅産物に、単一および 二重切断を施したときに得られる生成物を示す模式図である。

第２０図は、実施例５からの、１６２塩基対旧Ｖ増幅配列、対応する修飾増幅プ ライマー、検出プライマーを示す。

第２１図は、実施例５．Ａ、で実証される、ＰＣＲ誘導修飾増幅産物の形成と定 量を示すオートラジオグラムの写真である。

第２２図は、実施例５．Ｂ、で実証される、ＰＣＲタイプの増幅法における、伝 搬汚染の「増幅前」破壊の有効性を示すオートラジオグラムの写真である。

第２３図は、実施例６で用いられた、７５塩基対のＨＩｖ増幅配列、２種のりボ ヌクレオチド修飾ＰＣＲ増幅プライマー、検出プライマーを示した模式図である 。

第２４図は、実施例６．Ａ、で実証される、その３′末端それぞれに、単一のり ボヌクレオチド置換体を含むＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅を示すオート ラジオグラムの写真である。

第２５図は、実施例６．Ａ、で実証される、標準との比較による、リボヌクレオ チド修飾されたＰＣＲ誘導増幅産物の定量を示すオートラジオグラムの写真であ る。

第２６図は、実施例６．Ｂ、で実証される、リボヌクレオチド修飾されたＰＣＲ 誘導増幅産物を、切断剤としてＲＮａ　ｓ　ｅを用いて定量的に破壊したことを 示すオートラジオグラムの写真である。

第２７図は、実施例６．Ｃ１で実証される、切断剤として強塩基を用いた場合の 、リボヌクレオチド修飾されたＰＣＲ誘導増幅産物の「増幅前」破壊の有効性を 示すオートラジオグラムの写真である。

第２８図は、４５塩基対ＨＩＹ増幅配列と、対応するりボヌクレオチド修飾増幅 プローブを示す模式図である。このプローブは、実施例７で、リボヌクレオチド 修飾ＬＣＲ誘導増幅産物を生成するのに用いられた。

第２９図は、実施例７．Ａ、で実証される、その３°末端それぞれに、単一のり ボヌクレオチド置換体を含む増幅プローブを用いたＬＣＲ増幅を示すオートラジ オグラムの写真である。

第３０図は、実施例７．Ａ、で実証される、標準との比較による、リボヌクレオ チド修飾されたＬＣＲ誘導増幅産物の定量を示すオートラジオグラムの写真であ る。

第３１図は、実施例７．Ｂ、で実証される、切断剤として強塩基を用いた場合の 、リボヌクレオチド修飾されたＬＣＲ誘導増幅産物の「増幅前」破壊の有効性を 示すオートラジオグラムの写真である。

第３２図は、実施例７．Ｃ２で実証される、切断剤としてＲＮａｓｅを用いた場 合の、リボヌクレオチド修飾されたＬＣＲ誘導増幅産物の定量的破壊を示すオー トラジオダラムの写真である。

発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも１個の修飾を増幅産物の中に組み込むことによって、汚染 性の（ｅｏｎｊｉｍｉｎ！ｎｔ　）増幅産物のもたらすバックグラウンドを減少 ないし除去することを可能にする。この修飾された増幅産物は、試験サンプル中 の標的配列とはすぐに区別できるから、選択的に除去することができる。

本発明をさらに明瞭に理解するためには、ここで用いられている用語のいくつか について、その定義を定めるのが有効であろう。

増幅とは、試験サンプル中の核酸配列のコピー数の増加を意味する。増幅中に生 成されるコピーは、そのもののコピーか、相補的なコピーであろう。さらに、コ ピーは、汚染防止手段（ａ　１ｌｌｅａｎ　ｌｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｃ ｏｎｊｉｍｉ＋ｕｔｉｏ口）によって修飾され得る。増幅は、直線的に進行する か、あるいは指数関数的に、すなわち、直線増幅よりも高い率で進行する。

核酸配列とは、以下の部分について修飾され得る、デオキシリボヌクレオチドか 、リボヌクレチドである。その部分とは、すなわち、（１）燐酸バックボーン、 （２）ヌクレオシド、および／または、（３）オリゴヌクレオチドの糖部分であ る。核酸配列は、標識や、他の付随する部分を含むことができ、また、ハイブリ ダイゼーションが生起し得る限り、さらに他の部分の存在によって中断されてい てもよい。

標的配列とは、特定のアッセイで、探索されるヌクレオチド配列である。

増幅配列とは、標的配列の指定された長さであって、増幅法においては、これが 、最初に、鋳型配列として作用する。増幅配列は、標的配列の全長または、その 代表的部分を構成することができる。

鋳型配列とは、これにより増幅産物が形成される核酸配列である。増幅の１回目 のサイクルにおいては、増幅配列が鋳型配列として作用する。その後の増幅サイ クルにおいては、増幅産物も鋳型配列の役割を担う。

増幅プローブとは、次のいずれかの核酸配列である。すなわち、（１）２重鎖増 幅配列の１本鎖部分に相補的なものか、または、（２）１本鎖増幅配列の一部に たいし相補的か、それと同一であるもの。増幅プローブは、互いに十分近い位置 で増幅配列にハイブリダイズし、そのプローブ同士をともに結合させることがで きる。この増幅プローブは、他の増幅プローブと結合するために一端または両端 を修飾してもしなくてもよい。さらに、増幅プローブは、汚染防止手段を組み込 むことによって修飾されることもあれば、されないこともある。

ここで用いる増幅プライマーとは、増幅配列の末端部分にたいして相補的で、プ ライマー延長産物合成の開始点となることのできる核酸配列を指す。また、この プライマー延長産物は、その増幅配列にたいして相補的である。プライマー延長 産物は、ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼのような重合補助剤の存在下で形 成される。増幅プライマーは、汚染防止手段を組み込むことによって修飾される こともあれば、されないこともある。

ここで用いるプレ合成プローブまたはプライマーとは、試験サンプル反応混合物 に加える前に、あらかじめ合成したオリゴヌクレオチド配列を意味する。

増幅プライマーの延長末端とは、ポリメラーゼの作用を受けて、延長産物を形成 する増幅プライマーの末端を意味する。延長末端は、３′末端であろう。

増幅産物とは、増幅配列そのもののコピー、および／または、相補的コピーを指 す。増幅産物は、生体内で、増幅操作中に合成される。増幅産物は、増幅配列に 接触的にハイブリダイズした、一連の増幅プローブの結合によって生まれる、結 合核酸配列であることがある。増幅産物はまた、ポリメラーゼ連鎖反応の延長産 物であることもある。増幅産物という用語は、修飾された増幅産物を含む。

ここで用いる修飾された増幅産物（修飾増幅産物）とは、少なくとも１個の修飾 部位を含む増幅産物を指す。

修飾部位とは、増幅産物上において、増幅産物汚染防止手段を組み込んだ、単一 位置を指す。修飾部位には、次の例が含まれる。ただ１．これは、これり限定す る意味ではない。すなわち、酵素の認識部位実現のために、リガンドを導入した り、架橋結合剤、化学的に切断可能な部位、または、塩基変更（単数または複数 ）を導入したりすることが含まれる。

汚染性増幅産物とは、もともとサンプル中にあった増幅配列の増幅以外の手段に よってサンプル中に導入される増幅産物である。汚染性増幅産物は、サンプルが 、以前に増幅させた単数または複数のサンプル由来の増幅産物によって、機械的 な伝搬（ｃａ＋ｒ７ｏマｅ＋）によるか、または、空中伝搬による汚染（混入） の結果中ずるものである。

相補的とは、ハイブリダイゼーションを起こさせるほどに十分な相補性を指す。

完全な相補性は必要ない。

実質的相補性とは、少なくとも１塩基が不適合であるような相補性を指す。

偽像制限部位とは、少なくとも１個のヌクレオチドの変更がなければ、制限酵素 認識部位となったであろう、核酸残基の配列である。偽像制限部位は、変更がな ければその配列を認識するはずの制限酵素によっては切断されない。「変更」と いう用語が用いられているけれども、偽像制限部位は天然においても現われてお り、制限部位を表わさないヌクレオチド配列は、いずれのものでも、偽像制限部 位になることがあることも了解されるであろう。

好ましい偽像制限部位とは、制限酵素認識部位となるために、ただ１個の塩基の 変更しか要さない、そのような偽像制限部位である。

ここで用いる認識部位とは、酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼやＲＮＡ５ ｅによって認識される特定配列を意味する。

酵素切断部位とは、酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼやＲＮＡ５ｅによっ て加水分解される燐酸ジエステル結合を意味する。

隔Ｍ　（ｒｅｍｏｌｅ）切断制限エンドヌクレアーゼ、すなわち、隔離カッター とは、酵素認識部位の外側の部位で二重鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレア ーゼである。

本発明は、汚染性増幅産物による伝搬汚染を防止する手段に向けられている。増 幅操作の一部として、少なくとも１個の修飾部位を増幅産物の中に組み込むこと によって修飾増幅産物を作り出す。この修飾は、その修飾された増幅産物が標的 産物と区別されるように行なう。修飾の結果、修飾汚染性増幅産物を選択的に除 去することができる。この除去は、その修飾増幅産物を取り除くこと、破壊する こと、または、その他、その後の増幅工程に対する鋳型配列としては非生存的に なるようにして行なう。修飾増幅産物の選択的除去手段は、もちろん、その増幅 産物に組み込まれる特定の修飾によって変わる。

本発明の汚染防止法は、サンプルの増幅前処理、増幅後処理、増幅前・後処理の 併合の中に組み込むことが可能である。増幅後処理の場合には、増幅操作の完了 後、修飾産物を増幅した試験サンプルから選択的に除去する。これによって、実 験室ないし作業空間全体への修飾産物の拡散は、有効に最小限に止められる。こ の空間において、修飾産物は、新しい試験サンプルを汚染することがあり、これ が偽像陽性を生み出すのである。しかしながら、増幅後処理では汚染問題を完全 に除去することにはならない。なぜなら、汚染性産物を選択的に除去するのに必 要な試薬（例えば、切断剤）を加えるために、試験管を開放するという単純な工 程を通じても、ある程度の空中汚染は依然として生じるからである。

しかしながら、多くの場合、新しい試験サンプルを「前処理」し、この新しいサ ンプルを増幅工程にかける前に汚染性修飾増幅産物を選択的に除去することは可 能でもあるし、実際上好ましいことでもある。増幅前処理の場合には、修飾増幅 産物は新しい試験サンプルを汚染するかもしれないが、その汚染性増幅産物は、 あたらしいサンプルそのものの中で、実質的に完全に、除去ないし破壊される。

増幅用試薬（例えば、増幅用プローブやプライマー）が、汚染性増幅産物を選択 的に除去するのに用いられる、その同じ薬剤による破壊に対して感受性を持つ場 合には、試験サンプルの増幅前処理後に、増幅用試薬を加える必要があろう。一 方、増幅用試薬が、汚染性産物を選択的に除去するのに用いられる薬剤による破 壊に対して抵抗性を持つ場合には（例えば、ある種の、隔離制限酵素認識修飾部 位、または、リボヌクレオチド置換体を使用する場合）、その破壊性薬剤を増幅 の直前に試験サンプルに加えることもできる。すなわち、必要な試薬のすべてを 試験サンプルに加えた後であり、これは、最も高いレベルで混入を防止する。

本発明の方法によって、伝搬汚染を、効率的で信頼性が高く、かつ経済的なやり 方でコントロール（防止）することが可能になる。このことは、増幅操作が日常 的に行なわれている診断分野においては重要である。この分野においては、同一 分析対象が、連続的に繰り返し増幅されており、これがさらに、新規サンプルの 増幅産物汚染問題を悪化させている。ある特定の分析対象の測定に要する期間が 長ければ長いほど、汚染（混入）問題は重大になる。例えば、１本の１００μｍ サンプルからほんの１μＩを吸い上げた場合でさえ、その１００μｍサンプルが 、増幅産物の１００フエムト・モルまで増幅されていた場合、空中に標的のコピ ーを６億個放出する。通常の作業環境で均等に分散した場合、これは、作業域の 各１立方インチ当り、汚染性増幅産物はぼ３５０モルの濃度になる。

本発明による伝搬汚染に対する解決策は、従来の方法に見られ、ろ、（、ば１． ば複雑で手のかかる手続きを要しない。例えば、本発明では、新規の試験サンプ ルの導入、増幅、検出用に別々の部屋を用いることを必要としない。同様に、脱 ぎ捨てできる衣服、高価な陽圧移し替えピペット、特別な、ディスポーザブルな 配管器具や、サンプル採取器具も不要である。本発明の方法は、内因性の変動が 少なく、従来の方法に見られる自己規制的な制限、例えば、増幅操作と平行して 実施する標準量の制限といったものを含まない。本発明の方法のその他の多くの 利点については、本技術に習熟した人々には明かであろう。

本発明の方法は、いくつかの異なる種類の修飾を、増幅操作において生成される 増幅産物の中に導入することを意図し、内包している。ある特定の修飾を選択す るに当たって重要なのは、その修飾が、その後の試験サンプル操作において、増 幅産物を標的配列から区別し、かつ／または、分離ないし破壊するための手段と なるように実施する、ということである。このようにして、新規サンプルを処理 するにあたって、標的配列を増幅する前に、汚染性増幅産物を、除去、破壊、ま たは、その他のやり方によって、増幅の鋳型として生存することを不可能にする 。

汚染性増幅産物を区別するのに有用な修飾の種類は、本発明の教示に基づけば、 本技術に習熟した人々には明かであろう。

この修飾は、例えば、リガンドの導入、架橋結合剤の導入、または、酵素認識部 位ないし、その他の適当な切断可能な部分の導入（制限酵素認識部位を含む）を 含み得る。本発明の修飾のあるものは、他のものよりも、数多くの制限を持つこ とがある。

このことについては、後に、もつと完全に記載するつもりである。その結果、特 定の分析対象の特徴によっては、ある状況では、ある修飾が好ましいことがあろ う。あるアッセイ法において、ある増幅産物に対してどのような修飾が好ましい かは、増幅すべき分析対象の特徴及び本発明の教示に基づけば、本技術において 普通に熟練した人には明かであろう。

修飾は、できれば、選択されたその修飾を含む、あらかじめ合成された増幅プロ ーブもしくはプライマーを用いて、増幅産物に組み込むことが好ましい。これら 修飾プローブないしプライマーを伴う増幅によって、次に、その修飾（単数また は複数）が完成した増幅産物（単数または複数）に組み込むまれる。増幅プロー ブないしプライマーの修飾は、本技術に習熟した人々には既知の、いくつかの方 法のいずれかを用いて実行することができよう。例えばリガンドやその他の同種 の修飾の場合には、その修飾を、オリゴヌクレオチドの合成後に、その完成した オリゴヌクレオチド・プローブないしプライマー中に導入してもよい。酵素認識 部位の場合には、修飾を（単数または複数）、単純に置換によって、そのオリゴ ヌクレオチド・プローブないしプライマーに導入する。ＰＣＲの場合であれば、 １個以上の修飾ヌクレオシド三燐酸の存在下で、標的をポリメラーゼで増幅し、 修飾増幅産物を生成することもできる（例えば、Ｌｘｎｇｅ＋ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａ１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８（ｉｌｌ、６６３３−６６３７（１ ９８１）参照）。

修飾増幅産物の中に組み込まれる修飾部位の数は変えてもよい。もっとも、汚染 を有意に減少させるには、通常は、１部位で十分である。事実、多くの場合、１ 個の修飾部位だけを組み込むのが望ましい。これは、増幅操作において、次の原 因によって、効率の低下が予想されるからである。その原因としては、例えば、 立体障害（かさばった部分（複数）の導入による）、ハイブリダイゼーションに よる干渉（相補的ヌクレオチド間の水素結合の破壊によってもたらされる）、ま たは、標的に対する増幅プローブないしプライマーの完全な相補性の喪失（制限 酵素認識部位（複数）を組み込んだことによってもたらされる）がある。しかし ながら、この一番最後の場合、サイクル効率の損失は、主に、増幅の最初のサイ クルに生ずるということは了解されるであろう。なぜなら、この場合、修飾プロ ーブ（単数または複数）ないしプライマー（単数または複数）と実質的に相補性 を持つ増幅配列のみが鋳型として働くからである。その後は、効率の予想される 損失は、鋳型として働く　（かつ、プローブやプライマーと完全な相補性を持つ ）増幅産物の相対的量が増加するにつれて減少する。

増幅の最終サイクル後、増幅産物を変性しない場合には、１個の増幅プローブな いしプライマーを修飾するだけで十分である。この場合、得られる修飾増幅産物 は二重鎖であって、このため、１本鎖だけに組み込まれた修飾によって、２本鎖 を除去ないし破壊することが可能になる。一方、サンプルの反応混合物を、最終 増幅サイクル後、変性操作にかけるのならば、少なくとも２本の対向鎖増幅プロ ーブ（すなわち、プローブ・ベアの「上方」鎖、「下方」鎖の両方を表わす）を 修飾しなければならないかもしれない。これは、実質的にすべての汚染性増幅産 物を、その後のハイブリダイゼーションにたいして確実に非生存的にするためで ある。

リガンドを増幅産物に組み込んだ場合には、得られるリガンドで修飾され増幅産 物は、その修飾増幅産物を含むサンプルを、そのリガンドに対する固定された特 異的結合用パートナ−に接触させることによって選択的に除去される。次に、こ の固定用支持体を、結合したリガンド修飾増幅産物と共に除去する。新しい試験 サンプルについて選択的除去を行なう場合は（すなわち、増幅操作を開始する前 に）、固定された特異的結合用パートナ−を、その新規サンプルと接触させなけ ればならないが、この操作は、増幅プローブないし増幅プライマー試薬をその新 規サンプルに加える前に行なわなければならない。もし、その新規サンプル反応 混合物に対し、上記試薬の添加後に接触させるならば、試薬内の修飾プローブな いしプライマーも汚染性増幅産物と共に溶液から抽出されてしまう。

修飾として組み込まれたリガンドは、できれば、特異的結合ベアの内の小さいも のの方が望ましい。というのは、この方が、増幅プａ−ブないしプライマー上に リガンドが存在することによってもたらされる立体障害から予想される増幅効率 の低下を最少限とするからである。好ましいリガンドの例としてはビオチンがあ る。もう一つの好ましいリガンドはフルオレセインである。このリガンドを、Ｐ ＣＲの場合ならば、少なくとも１個の増幅プライマーに、ＬＣＲの場合ならば、 少なくとも１個の増幅プローブに、導入する。第１図は、リガーゼ連鎖反応タイ プの増幅法（ＬＣＲ由来増幅産物）によって得られた増幅産物のリガンド修飾と 、その後の、その修飾増幅産物の除去を示したものであり、除去は、そのリガン ドにたいする固定された特異的結合用パートナ−によって行なった。第２図は、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ由来増幅産物）に関して同様の模式図を示す。得 られたビオチン修飾、ないし、フルオレセイン修飾増幅産物は、その後、サンプ ルをそれぞれ固定したアビヂンないし抗フルロレセイン抗体に接触させて、その サンプルから除去することができる。

本発明のリガンド修飾例においては、プローブないしプライマー上で、増幅操作 で用いるいずれの酵素またはその他の試薬の作用を妨げない位置で、増幅プロー ブ（単数または複数）ないしプライマー（単数または複数）を修飾するのが望ま しい。

例えば、ＰＣＲタイプの増幅法であれば、ポリメラーゼを、ＬＣＲタイプの増幅 法であれば、リガーゼを妨げない位置である。

ＰＣＲタイプの増幅法で、ポリメラーゼが、修飾部位を通過して、「読み通す」 ことができる状況では、増幅プライマーは、そのプライマーの延長末端以外なら 、どの位置でもまたはどの位置の近傍でも修飾することができる。一方、ポメラ ーゼが修飾部位を通過して読み通すことができない場合には、ＰＣＲプライマー はその５′末端で修飾しなければならない。

ＬＣＲタイプの増幅法は、ポリメラーゼを用いないのであるから、増幅プローブ 上のリガンド修飾位置を考慮するにあたって、酵素の読み通しに関わる制限は問 題にならない。ＬＣＲの場合は、接触末端（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ　ｅｎｄ）以 外の位置で増幅プローブを修飾するのが望ましい。増幅産物の末端節を形成する 増幅プローブについては、結合していない末端部でそのプローブを修飾すること も可能である。そうでなければ、すべての増幅プローブについて言えることであ るが、そのプローブの中央領域近くのどこかで修飾するのが望ましい。

増幅プローブないしプライマーは、本技術に習熟した人々には既知の方法を用い て、望ましいフルオレセインないしビオチンによって修飾することができる。例 えば、オリゴヌクレオチド・プローブないしプライマーは、２段階法を用いて、 リガンドによって修飾してもよい。この方法においては、そのオリゴヌクレオチ ドの合成中、先ずアミノ基を導入する。結合、酸化、脱保護、さらには、合成の 間に使用した支持体からの、オリゴ−アミン・プライマーないしプローブの除去 の後、リガンドを付着させ得る。

汚染性増幅産物からの伝搬汚染を防止するもう一つの手段は、共有結合している 架橋結合剤を、増幅法に使用される増幅プローブないしプライマーの、少なくと も一個に組み込むことである。得られた修飾増幅産物の架橋結合剤を、化学的に か、光化学的にか、いずれかのやり方で活性化し、その修飾増幅産物を、相補的 核酸鎖と共有結合で架橋させ得る。この相補的核酸鎖は、相補的修飾ないし未修 飾増幅産物から得られるし、または、修飾増幅産物が変性されている場合には、 キャリヤーＤＮＡの形であってもよい。しかしながら、後者の場合であれば、増 幅産物の両鏡を、あらかじめ修飾しておかなければならないであろう。これは、 得られる増幅産物の実質的にすべてを選択的に除去するためである。

非可逆的架橋結合により修飾された増幅産物は、その後の増幅に対して、修飾増 幅産物を非活性にするであろう。これは、この時点以後、修飾相補的増幅産物の 完全変性が妨げられるからである。ある場合には、新規の試験サンプル中の標的 核酸に傷害を加える危険がある。これは、そのサンプルを、その架橋結合剤に対 する適当な活性剤で処理することから生ずる。しかしながら、この危険は、核酸 標的に対し毒性を持たない波長光を吸収するように光架橋結合基を構成する場合 には回避することができる。しかしながら、新規の試験サンプルの処理は、新し い増幅プローブの無いところで進行させなければならない。

これは、その新しい試薬を架橋結合することなく、汚染性産物を破壊するためで ある。

架橋結合剤は、本技術に習熟した人々にとって既知の方法を用いて、増幅プロー ブ（単数または複数）またはプライマー（単数または複数）に組み込むことがで きる。ＬＣＲタイプの増幅法においては、架橋結合剤を、真ん中の増幅プローブ に置くのが望ましい。このプローブが、次に、得られた増幅産物の中心のできる だけ近くにその架橋結合剤を組み込む。架橋結合剤を含む増幅プローブに関して は、さらに、その架橋結合剤を、プローブの中央領域に置くのが望ましい。これ は、修飾性プローブ末端部の関与ないし結合を妨げないためである。これについ ては、図３に示しであるが、この場合、架橋結合性修飾は、３べ７１組の増幅プ ローブの内、真ん中のペアのプローブの一つから、増幅産物に組み込まれている 。

ＰＣＲタイプの増幅法においては、ポリメラーゼの働きを重大に妨げない限り、 架橋結合剤を増幅プライマーの延長末端のできるだけ近くに組み込むのが望まし い。リガンド増幅の場合と同様、もし架橋結合剤の存在がプライマー延長に用い られるポリメラーゼの読み通し能力を妨げるなら、修飾は、できれば、プライマ ーの５゛末端に置くのが望ましい。第４図は、あらかじめ合成されたプライマー を用いて、架橋結合性修飾を、ＰＣＲ由来の増幅産物に組み込む様を示す。この プライマーは、その真ん中で、または、真ん中付辺で修飾されている。

しかしながら、伝搬汚染を防止する手段としては、増幅産物に少なくとも１個の 酵素認識部位を組み込むことによって、その増幅産物を修飾するのが望ましい。

酵素認識部位は、修飾増幅試薬（例えば、修飾増幅プローブないしプライマー） を用いて、増幅産物中に導入してもよい。ＰＣＲタイプの増幅法においては、修 飾ヌクレオシド三燐酸を用いて酵素認識部位を導入することも可能である。この 部位は、酵素認識部位としても、ポリメラーゼに対する基質としても働く。酵素 認識修飾部位が、得られた修飾増幅産物に、その後の酵素による破壊に対する感 受性を持たせる。この酵素は、増幅産物を選択的に切断するが、標的すなわち増 幅配列には作用しない、そのような酵素である。

酵素認識部位の例には、制限酵素認識部位や、ＲＮＡ５ｅの認識部位が含まれる が、これのみに限定されるものではない。

その他の種類の修飾と同様に、増幅産物には、複数の酵素認識修飾部位を組み込 むことが可能である。もちろん、酵素認識修飾部位（単数または複数）を増幅産 物に組み込むには、その位置が（単数または複数）切断されたとき、その増幅産 物のもっとも完全な破壊をもたらすような、そのような位置に組み込むことが望 ましい。酵素認識部位にとって好ましい位置は請求める分析対象によって若干具 なるが、制限酵素認識部位の場合には、標的配列における好ましい偽像制限部位 の位置と数によって指示されるであろう。増幅産物を修飾するのに、ただ１個の 酵素認識部位を用いる場合、もっとも効果的な破壊を実行するためには、完成増 幅産物のできるだけ中央近くに、酵素認識部位を置くのが通常は望ましい。

単一酵素認識部位の中央配置は、ＰＣＲ由来の増幅産物よりも、ＬＣＲ由来の増 幅産物の方が、簡単に達成される。これは、あらかじめ合成されたＬＣＲ増幅プ ローブを用いて増幅産物を構築する方が、ＰＣＲ由来の増幅産物の大部分につい てよりも、よりコントロールし易いからである。というのは、ＰＣＲ由来の増幅 産物は、必然的に、増幅時に生体内で合成されるものだからである。例えば、Ｐ ＣＲ由来の増幅産物では、通常、単一酵素認識部位の少なくとも一部を、増幅産 物の増幅プライマー部分に置かなければならない。すなわち、全制限部位を、完 全増幅産物の広大な中央領域を表わすポリメラーゼ延長部分のどこかに置くとい うことは叶わないのである。逆に、単−酵素認・識部位は、ＬＣＲタイプの増幅 法を用いて、増幅産物の真ん中にすぐに導入することができる。

ＰＣＲ由来の増幅産物上の単一酵素認識部位の配置に関しては、さらに制限のあ ることが自ずから明かである。もっとも重要なのは、単一酵素認識修飾部位を完 成増幅産物のもっとも中央に置くことは、その修飾を増幅プライマーの延長末端 に置くことになるということである。ＰＣＲ増幅法においては、プライマーのこ ちら側の末端にはポリメラーゼが作用し、延長産物を形成するのであるから、修 飾部位をこの位置に、または、その近くに置くことは、ポリメラーゼ延長が増幅 産物を形成するのを妨げる可能性があり、したがって、標的配列が鋳型配列とし て働く増幅の効率を低下させることになろう。一方、多重酵素認識部位を望む場 合には、その多重修飾部位を、得られた増幅産物の中央位置（ポリメラーゼで延 長した）に組み込むことが可能である。この組み込みは、増幅時に、１個以上の 修飾ヌクレオシド三燐酸を用いて、例えば、対応するデオキシリボヌクレオシド 玉燐酸の代わりにリボヌクレオチド三燐酸（ＲＮＡｓｅによって認識される）を 用いて行なう。

ＲＮＡ５ｅによって認識される酵素認識修飾部位を用いて本発明の方法を実行す るには、増幅プローブないしプライマーの選ばれた一部を、増幅産物の残余を形 成するＤＮＡ塩基の代わりに、一連のＲＮＡ塩基を用いてあらかじめ合成する。

この一連のＲＮＡ塩基は、ｌＲＮＡＲＮＡ５ｅ＾Ａｓｅ　Ａの場合）という短い ものでもよいし、数塩基長（ＲＮＡ　ｓ　ｅ　Ｈの場合）であってもよいし、ま たは、増幅産物の全長であってもよい。

制限酵素認識部位の組み込みと違って、ＲＮＡ１ｅ認識部位の場合は必ずしも効 率の損失を招かない。これは、この場合には、完全な相補性が必ずしも犠牲にさ れることはないからである。

ＲＮＡ５ｅ塩基置換の場合は、完全な相補性が存在するばかりでな（、ＤＮＡ／ ＤＮＡハイブリッドの場合よりも、ＲＮ＾／ＤＮＡハイブリッド形成の方がずっ と強力であり得る。この一連のＲＮＡ塩基群に対する好ましい位置（単数または 複数）は、本技術に習熟した人々には、本発明に関するこの教示に照らせば、最 低限の実験で、明かであろう。一般に望まれるのは、このＲＮＡ塩基群は、少な くとも約１から３個の塩基長であるが、これは、修飾増幅産物の選択的除去用薬 剤として選ばれる特定のＲＮＡ５ｅに依存する。

修飾増幅産物に組み込まれるＲＮＡ５ｅ認識修飾部位を破壊するには、各種のＲ ＮＡ１ｅ酵素を用いることができる。好ましいＲＮＡｘｅはＲＮＡ５ｅ　Ｈであ る。ＲＮＡａｅ　Ｒは、ＲＮＡ／ＤＮＡ　ハイブリッドに対して特異的であり、 二重部のＲＮＡ塩基だけを切断し、ＤＮＡ鎖は無傷で残す。酵素認識部位修飾増 幅産物を破壊するのにＲＮＡ５ｅを使用する場合には、そのＲＮＡ５ｅ認識部位 を修飾増幅産物の両方の鎖に組み込むこと、さらに、そのＲＮＡ５ｅ認識部位の 位置（複数）が増幅産物上の異なる位置にあることが重要である。この様にして 、各鏡上のＲＮＡ５ｅ認識部位は、相補的増幅産物のＤＮＡ鎖に向き合う場所に 位置することになり、ＲＮＡｇｅＨは、修飾増幅産物二重部の両方の鎖を切断す ることができる。

ＲＮＡ１ｅ　Ｈは、ＩＩＮＡ／ＲＮ＾またはＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を切断しない から、新しいサンプル中に伝搬された汚染性増幅産物を選択的に除去する際に、 修飾増幅産物にハイブリダイズしたＤＮＡ標的配列を誤って破壊するという心配 はない。

他に、単一鎖ＲＮＡに対して特異的と報告されているもので、好ましいタイプの ＲＮＡ５ｅ酵素としては、例えば、ＲＮＡ５ｅ＾。

ＲＮＡ５ｅ　Ｃｌ３．　ＲＮＡ５ｅ　Ｔ２．　ＲＮＡ５ｅ　Ｕ２がある。この種 の酵素を用いた場合は、標的ＤＮＡを切断する危険はない。単一リボヌクレオチ ド置換体にたいして特異的であるので、ＲＮＡ５ｅは特に好ましい。

制限酵素によって認識される酵素認識修飾部位を組み込むことも可能である。増 幅産物上における制限酵素修飾部位は、各々、増幅配列上の偽像制限部位に対し て実質的に相補的とする。

制限酵素部位は、標的配列に対し、ミスマツチが最小になるように、増幅産物に 組み込むことが望ましい。さらに、認識部位を導入するのに、ただ１個の塩基だ けを変更するのが望ましい。

すなわち、制限酵素認識部位を、好ましい偽像制限部位と向き合う位置に置くこ とが望ましい。

ある特定の増幅産物における、制限酵素（単数または複数）および、対応する制 限酵素修飾部位（単数または複数）の選択は、いくつかの因子によって影響され る。その中には、各種制限酵素のコストや入手のしやすさも含まれる。増幅操作 中に生成される合成増幅産物に対して高い切断効率を持つ酵素を選択することも 重要であり、望ましいことである。例えば、ある種の制限酵素では、合成ヌクレ オチド配列を切断する方が、野生型配列を切断するよりずっと効率が低下すると 考えられているものがある。ある分析対象に対し、好ましい制限酵素（単数また は複数）と増幅システムが何かは、本技術に習熟した人々には、本発明の教示に 基づけば明かであろう。

増幅産物に制限酵素修飾部位を組み込むのは、できれば、先ず標的配列内から少 なくとも１個の好ましい偽像制限部位を含む増幅配列を選ぶことから実行するの が望ましい。好ましい偽像制限配列がいくつか、指定の増幅配列の中に含まれて いる場合は、修飾増幅産物上の制限部位（単数または複数）の位置に関しては、 選択肢の数がより多いことになる。増幅産物における制限酵素修飾部位（単数ま たは複数）の最終選択の前に、全増幅配列をスクリーニングすることが重要であ る。これは、修飾増幅産物の選択的切断に選ばれた制限酵素の作用に対して感受 性を持つ制限部位が、天然１．′″は見られないことを確認するためである。も しもそのような天然性の部位が存在するならば、また別の制限酵素修飾部位を選 ばなければならない。そうでないと、増幅配列がその修飾増幅産物と一緒に破壊 されてしまう。

一般に、制限酵素は、二重鎖の修飾増幅産物を切断することができるだけである 。したがって、適当な制限酵素との接触以前には、制限部位修飾増幅産物を変性 してはならない。しかしながら、検出系によっては、増幅産物を変性することが 必要な場合もあろう。国際特許出願Ｎｏ、　８９１０２６４９に開示されている ように、相補的プローブによる検出系を使用する場合には、変性産物を切断する ことは可能である。ただし、制限部位が検出プローブに組み込まれており、かつ 、得られた増幅プローブ／検出ブローブニ重部が変性されていない場合に限る。

単一制限酵素修飾部位を持つＬＣＲ由来増幅産物の修飾法を、第５図に示す。こ の図において、３対のプローブを結合し、増幅産物を形成した。このうち、真ん 中のベアのプローブには制限酵素認識修飾部位が与えられている。これによって 、制限酵素の作用に感受性を持つ、ＬＣＲ由来修飾増幅産物が形成される。制限 酵素は、この修飾増幅産物をほぼ真二つに切断して、これを破壊する。標的の増 幅配列はこの酵素の作用にたいして耐性を持つから、元の状態を保つ。しかしな がら、この実施態様においては、新規のサンプルを、新しいプローブ試薬を添加 する前に処理して、汚染性増幅産物を除去しなければならない。

なぜなら、次の増幅操作に必要な修飾増幅プローブベアも破壊されるからである 。

第６図は、同じ単一部位修飾が、ＰＣＲタイプの増幅法に用いられる増幅プライ マーに組み込まれる様を示す。得られたＰＣＲ由来の修飾増幅産物は、同じ制限 酵素による破壊にたいして感受性を持つが、得られたＰＣＲ由来増幅産物の場合 には、切断が増幅産物の一端近くで起こる。このようにＰＣＲ由来産物の切断が 不均等に行なわれることによって生ずると考えられる欠点を第７図に示す。ここ には、切断されたＰＣＲ由来増幅産物が、その後の増幅操作において、部分的に ブライミングされる様を示す。部分的ブライミングが起こるのは、切断された増 幅産物の大きい方の部分が、プライマーに対する相補的な塩基を若干含んでいる からである。その後の増幅操作において、切断されたＰＣＲ由来の汚染性増幅産 物の部分的ブライミングがあれば、それは、偽りの陽性を含む、試験サンプルに おける人工的に高められた結果を招くことになる。

ある場合には、部分的ブライミングを次のようにして回避することができる。す なわち、もしも制限酵素修飾部位がプライマーの延長末端の十分近くに組み込ま れ、そのため、得られた認識部位が、実際に、増幅産物のポリメラーゼ延長部位 の中に見られる場合である。しかしながら、これを、ポリメラーゼのプライマー 延長開始能力を妨げずに実行するのは難しい。部分的ブライミングは、できれば 隔離切断制限酵素を用い、適当な対応する制限修飾部位を、ＰＣＲタイプの増幅 法における修飾増幅産物中に組み込むことによって、除去することが望ましい。

隔離切断制限酵素認識部位を、ＰＣＲ由来由来増幅生物中み込む様を第８図に示 す。この場合、隔離切断制限酵素認識部位は、あらかじめ合成した増幅プライン −中に組み込まれるが、その制限酵素による実際の切断は、完成増幅産物の延長 部分で起こる。その結果、破壊されたＰＣＲ由来増幅産物は、その後の増幅反応 に加わることができない。なぜなら、部分的ブライミングの生ずる機会がないか らである。

隔離カッターも役に立つし、ある場合、特にＬＣＲ由来増幅産物の修飾において は望ましくもある。認識部位と、対応する切断部位が、別々のベアのプローブで 表わされる増幅産物上の領域に位置することができる場合には、標的を含むサン プルに増幅プローブ試薬を加えた後からでも、新規の試験サンプルを制限酵素に 接触させることができる。すなわち、この場合、汚染性増幅産物が破壊されるの と同時にプローブを切断する危険は無い。第９図は、隔離切断制限酵素認識部位 を、３ペア一組のプローブの末端ベアの一つに組み込む様を示す。しかも、その 組み込み方は、完成したＬＣＲ由来増幅産物が、その完成産物のほぼ真ん中の位 置で切断されるようにする。この場合、切断部位は、増幅プローブの中央ベアに よって発現された、完成増幅産物の位置に相当する。

さらに、化学的に切断可能な部位を、増幅産物に導入することも可能である。こ れは、増幅法に使用される増幅プローブないしプライマーの核酸バックボーンを 修飾することによって行なう。この実施態様は、ＰＣＲタイプの増幅法でよりは 、ＬＣＲタイプの増幅法で用いる方が好ましい。なぜなら、化学的に切断可能な 部位の存在は、ある種ポリメラーゼの読み通し能力を妨げる可能性が大きいから である。化学的に切断可能な修飾を含む修飾増幅産物は、その修飾部位（単数ま たは複数）で切断する試薬で処理することによって破壊することができる。化学 的に切断可能な部分を組み込むことによって、合成配列に対するいくつかの制限 酵素に観察される、切断効率の低下という問題を緩和し得る。というのは、化学 的切断反応は、生物学的活性を持つ酵素に基づくものではないから、合成核酸と 野生種の核酸とを区別しないからである。さらに、大抵の化学的に切断可能な部 分は、修飾増幅産物が二重鎖であろうが、−重鎖であろうが、それと無関係に切 断される。

この実施例においては、切断可能部位を、市販の試薬を用いて、あらかじめ合成 したプローブないしプライマーの中に組み込むことができる。これについては、 第１０図に示す通りである。先ず、部分的プローブないしプライマー配列を合成 し、部分配列の３′ないし５゛末端にアミノ基を含める。次に、このアミン標識 末端を、ホモ二官能性結合剤薬を用いて接合し、完全ではあるが、途切れのある 配列を形成する。この配列を、増幅プローブないしプライマーとして用いる。例 えば、ＤＳＰ　（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｉｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｐ＋ｏｐｉ ｏｎａｊｅｌ）、ＤＳＴ　（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ７１−ｔｓｒｔｘｒａｌ ｅ）、ＥＧＳ　（ｅｌｈ７１ｅｎｅ　ｇ１７ｃｏｌｂｉｓ　［５ｕｃｅｉｎｉＩ ｌｌｉｄ７１−ｓｕｃｃｉｎｘｊｅｌ）　（第１０図に示す）を用いて、部分プ ローブないしプライマー配列の３゛及び５゛標識末端を結び合わせ、切断可能部 位を含む完全プローブ試薬を形成することができる。この場合には、このプロー ブないしプライマーによって生成される修飾増幅産物は、還元剤、例えばジチオ トレイトール（ＤＳＰがホモ二官能性結合剤として用いられた場合）、酸化剤、 例えば過沃素酸ナトリウム（ＤＳＴが用いられた場合）またはヒドロキシルアミ ン（ＥＧＳが用いられた場合）による切断によって破壊し得る。

化学的に切断可能な修飾部位は、増幅プローブないしプライマーの真ん中通（に 置くのが望ましい。すなわち、これによって、ハイブリダイゼーションが起こら なくなることを最小限に食い止めるためである。修飾増幅プローブないしプライ マーは、次のように構築することもできる。すなわち、これらが増幅配列に対し て、完全に相補的であるか（切断可能な部分は、［はみだしループ（ｌｏｏｐ− ｏｕｔ）　Ｊに含まれる）、または、実質的に相補的である（切断可能な部分を 、プローブ配列中のヌクレオチドの一つと置換する）ようにすることである。あ る場合、例えば、リボヌクレオチド置換が化学的に切断可能な部分を与える場合 がそうであるが、この試薬は、増幅配列と完全に相補的であっても、はみだしル ープを必要としない。

リボヌクレオチド置換は、得られた修飾増幅産物に対して、同じ脆弱結合を組み 込むことによって、酵素認識部位と、化学的に切断可能な部位の両方を、同時に 与える。この修飾増幅産物は、（１）強塩基（化学的切断）と、（２）ある種の ＲＮＡ５ｅ（酵素による破壊）のいずれか、または、両方に感受性を持つ。

いずれの場合においても、得られる切断産物は、もはや増幅用の鋳型としては働 かない。

これら脆弱結合は、できれば、単一のりボヌクレオチド置換体をそれぞれの３” 末端に含む増幅プローブないしプライマーを用いて、修飾増幅産物に組み込むこ とが望ましい。ＰＣＲの場合では、増幅プライマー・の両方がリボヌクレオチド 置換を含むことになる。Ｌ　ＣＲの場合であれば、少なくともｉｌｌの上方鎖増 幅プローブと１個の下方鎖増幅プローブは、リボヌクレオチド置換を含む。リボ ヌクレオチド置換は、プライマーおよびプローブの３°末端で生じるのであるか ら、修飾増幅産物の脆弱結合は、実際に、生体中で増幅中に形成される。その結 果、増幅試薬は、脆弱結合を含まないので（すなわち、塩基にたいして感受性を 持たず）、強塩基ないしＲＮＡ５ｅによる処理によって、伝搬汚染を根絶するこ とができる。すなわち、そのような処理に耐性を持つ試薬の存在下で、処理を行 なえば、増幅に対するその試薬の全体機能性を損なうことがない。さらに、野生 種標的の増幅の鋳型として機能する能力も同様に、塩基やＲＮＡ５Ｃ処理によっ て影響されないので、新規試験サンプル中で、標的および増幅試薬双方の存在下 で、脆弱な伝搬汚染増幅産物の破壊を実行することができる。

リボヌクレオチド置換を含む修飾増幅プライマーないしプローブから、ＰＣＲも しくはＬＣＲ由来の修飾増幅産物を生成するには、二つの重要な必要条件がある 。先ず、増幅産物の形成に必要な酵素は、上記の置換の存在下で、有効に動作し な＆プればならない。ＰＣＲの場合には、ポリメラーゼは、ハイブリダイズした プライマーの３°末端のヒドロキシル基の一つから、延びていかなければならな い。ＬＣＲの場合には、リガーゼは、１つのオリゴヌクレオチド・プローブの３ °　リボース基を、もう一つの別のオリゴヌクレオチド・プローブの５゛燐酸基 に共有的に結合するのを触媒しなければならない。第二に、得られた修飾増幅産 物（１個以上の内部リボヌクレオチドを含む）は、その後の増幅サイクルにおい て、生存鋳型として作用しなければならない。（すなわち、ＰＣＨの場合には、 ポリメラーゼは、リボヌクレオチド結合を読み通さなければならない）。

本発明の方法は、Ｌ　ＣＲ及びＰＣＲタイプの増幅法にのみ限定されるものでは なく、他のタイプの増幅法、例えば、転写タイプの増幅法や修復連鎖反応増幅法 のような増幅法に見られるような汚染問題を防止するのにも用いることができる 。

下記の実施例は、本発明の理解を助けるために与えられるもので、本発明の真の 範囲は、付属の請求の範囲に規定されている。本発明の精神から逸脱することな く、ここに規定された方法に改変を加えることは可能であるということは了解さ れよう。

本発明の有用性を例示するために、いくつかの異なる合成核酸配列を、（１）増 幅配列、（２）増幅産物、（３）修飾増幅産物、（４）増幅プローブ、（５）検 出プローブ、（６）増幅プライマー、（７）検出プライマー、及び（８）ポリリ ンカーをシミュレートするために用いた。これらは、合成核酸配列に対する制限 酵素の切断効率を定量するのに用いた。これらの合成配列を、第１１図、第１３ 図、第１６図、第２０図、第２３図、および第２８図に示す。

合成増幅配列（Ａｓ）、増幅ブロー・プ（Ａ、Ｐ）、化学的燐酸化増幅プローブ （ｐＡＰ）　、検出プローブ（ＤＰ）、化学的燐酸化剤出プローブ（ｐＤＰ）（ 第１１図に示す）、および、多数部位ＤＮＡ　Ｃ第１３図に示す）を、Ａｐｐｌ ｉｅｄ　８ｉｏｓ７ｉ１ｅｉｓｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓ７ｓｔ＜ｍｓ、Ｉｎｃ、、ＦｏｓｔｅｒＣｉ１７．　Ｃａ１ｉｔｏｒ ｎ目）を用いて合成した。操作は、国際特許出願り、８９／［６４９に開示され ている通りであり、その関係部分を、ここで援用する。

オリゴヌクレオチドは、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｇｅｘｒｅｈ　Ｃｏｒｐｏｒｉ目ｏｎ　 （１’１ｅｔｎｄｏｎ、　Ｖｉｒｇｉｎｉｘ）　＊　カタログ番号Ｎｏ、１０− １９００−９０から入手した燐酸化試薬によって、化学的に燐酸化した。この試 薬は、最初に、Ｔ、　Ｈｏｒｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｉｌｒｄｅｍ、　Ｔｅ１ｒｉｈ ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｌ、、　２７．　４７０５−４７０８（１９Ｈ）によって記 載されたもので、標準フオスフオアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｌｅ ）　自動合成プロトコールによって使用できる。

Ａｐｐｌｉｅｄ　１ｆｉｏｓ７＋ｔｅｍｓ装置での自動化オリゴヌクレオチド合 成は、３゛→５゛方向に進む。この時、化学的燐酸化剤は、最後の合成サイクル に都合良く導入される。燐酸化効率は、最後のサイクル後放出されるジメトキシ ルトリチル基の量を測定することによって、定量される。標準的な脱保護、切断 、精製法を用いて、所期の、５′を化学的に燐酸化したオリゴヌクレオチドを単 離した。

制限部位修飾の増幅産物への導入 本実施例は、ＬＣＲタイプの増幅法において、制限酵素修飾部位を、増幅産物に 導入する様を示す。本実施例における、制限酵素修飾部位の挿入は、あらかじめ 合成された増幅プローブを用いて実行する。このプローブは、制限酵素修飾部位 を含むものであるが、対応する、好ましい偽像制限部位を含む増幅配列を増幅す る。この制限酵素修飾部位の選択は次のように行なう。すなわち、６個の＋ｉ！ ！ＩＩブＩ：１−ゴ（すなわち１，３ベア）の各々が、一つの制限酵素修飾部位 を含み、かつ、増幅配列に関して一つの塩基がミスマツチしている（すなわち、 その増幅配列の好ましい偽像制限部位に向き合う位置に交雑することのできる） ように選択する。

また、次のようにして、制限酵素被修飾増幅産物が選択的に除去されることを示 すことが望ましい。すなわち、制限酵素修飾部位を含む、得られた被修飾増幅産 物は、適当な制限酵素による処理後、増幅がきわめて非効率的になる（すなわち 、実質的に、破壊される）が、一方、対応する偽像認識部位を含む増幅配列は、 同じ制限酵素による処理の後も、影響を受けない、ことを実証することによる。

被修飾増幅産物（ＡＰＭＩ）は、１個の、）Ｉｓｅ　ＩＩ！、　２個のｌ１ｂｖ 　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように構築されるけれども、Ｈａｅ　Ｉ １１部位のみが、選ばれた修飾として、増幅産物の切断を実証するのに用いられ る。この増幅配列（ＡＳ）は、ただ３個の塩基ベアに関して、増幅産物と異なる 。このベアは、３ベアの増幅プローブ（＾Ｐ１／ＩＩＡＰ、、、　ｐＡＰ２／９ ＡＰ２．、　ｐＡＰ３／　Ａｒ１、）、この各々が、３個の塩基ベア相違点の１ 個を含んでいるのであるが、そのプローブを介して、増幅産物（八ＭＰＩ）に導 入されている。上記の増幅配列は、増幅産物に組み込まれる制限エンドヌクレア ーゼ部位にとっての、対応する偽像制限部位を含んでいＡ、増幅配列、被修飾増 幅産物、搬送りＮＡの制■エンドヌク制限酵素による、増幅産物の切断による、 その後の増幅操作におけるその増幅産物の鋳型としての作用能力の破壊効率を定 量するために、下記の制限エンドヌクレアーゼ反応を設けた。

すなわち、０．０５　ｍｇ／ｍｌ　３３＾（牛血清アルブミン）　、５Ｑｄ　Ｔ ｒｉｓ。

ＨＣＩ、６．６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　６．６　ｍＭ　ＤＴＴ　（ジチオスレイ トール）を含む、最終容量１００μｍのバッファーにおいて、反応１−２フ工ト モル＾ＭＰｌ＋　２０単位活性Ｈｇｅ　ＩＩＩ制限酵素反応２−２フ工トモル八 ＭＰ１＋　２０単位加熱非活性Ｈａｓ　ＩＩＩ制限酵素 反応３−２フ工トモル＾Ｓ＋２０単位活性ｔｂｅ　ＩＩＩ制限酵素反応４−２フ 工トモル＾Ｓ＋２０単位加熱非活性Ｈｕｅ　ＩＩＩ制限酵素 反応５−１　μｇヒト胎盤ＤＮＡ＋２０単位活性Ｈａｅｔｌｌ制限酵素 反応６−１　μｇヒト胎盤ＤＮＡ＋２０単位加熱非活性Ｈａｅ　ＩＩＩ制限酵素 ６種の反応はすべて３７℃で１６時間インキュベートし、次に、９０℃で１０分 インキュベートし、残存Ｈａｅ　ＩＩＩ活性を破壊した。

上記６種の反応から得た、増幅配列（＾Ｓ）、制限酵素認識部位修飾産物（ＡＭ Ｐｌ）　、および、ヒト胎盤ＤＮＡ　（）ＩＰ−ＤＮＡ）を、３ペアの増幅プロ ーブ（Ａｉ１１／９ＡＰ１．、ｐＡＰ２／ＩＩＡＰ２．、ｐＡＰ、　／＾Ｐ３． ）を用いて、１５サイクルＬＣＲタイプ増幅法で、二倍に増幅した。これについ ては、第５図に示した通りである。なお、このプローブは、増幅配列と３塩基対 だけミスマツチをしているが、ＡＭＰｌとは完全に相補的であることに注意しな ければならない。

ＬＣＲタイプの増幅法においては、各種のりガーゼを用いて、接触して交雑して いるプローブの結合を実行することができる。

例えば、国際特許出願Ｎｏ、８９１０２６４９は、増幅プローブを結合するノニ 、Ｅ、ｃｏｌｉ　リガーゼ（例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｘｂｓ 。

Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭａｓｘｃｈｕａｅＨｓから入手できる）を使用 することを開示している。しかしながら、一般に、熱安定性リガーゼ（ｙｓｔ　 ）を使用するのが好ましい。これは、各ＬＣＲ増幅サイクルの度ごとに、新鮮な りガーゼ試薬を絶えず加える必要を回避するためである。この実施例においては 、）ｈｅｒｍｕｔ　ｌｈｅ＋ｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ　（＾ＡＣＣ１２７６３４）　 、これは、Ｍｉｈｏ　Ｔａｋａｈｇｓｈｉ　（三菱化成生命科学研究所、蛋白化 学研究室、東京、町田市、南おおや、１１）から恵与されたものであるが、それ から単離した熱安定性ＨＢｇ　ＤＮＡリガーゼを用いて、増幅サイクル全体を通 じて、増幅プローブの結合を行なった。

熱安定性Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ・バッフ　ｙ　−（ＴＳＬＢ）を、５００　ｍ ＭＴ＋ｉ３　ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）、　５６　ｄ　ＭｇＣｌ２．１０　ｄ　Ｅ ＤＴＡ　（ｅｔｈ７１ｅｎｅｄｉｔ＋ｅｉｎｅｊｅｔｔａａｃｅｌｉｅ　ａｃｉ ｄ　）　、６６　ｄ　ｎＤＴ、及び５００Ｐｇ／ｉｔ　ＢＳＡを含むよう、１０ 倍濃度で調整した。

負荷用バッファーを、１１．８　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　６．３　Ｍ尿素、［１，０ ２％ブロムフェノールブルー及び０６０２％キシレンチアノールを含むように調 整した。

反応１から４までのそれぞれからＤＮＡ１００アトム・モルと、反応５．６の各 々から）ＩＰ−ＤＮＡのＳｏｙ七を、、Ｐｅｒｋｅｎ−Ｅｌ、ｍｅｒ／Ｃｅｔｕ ｓ熱サイクル装置（Ｐｅ＋ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅ＋　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｎ ｏｒｖａｌｋ。

Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を用いて、二倍に増幅した。各増幅反応は、各増幅プ ローブ（ＡＰ＋７９八Ｐｌ、、ｐＡＰ２／ｐＡＰ２．ｐＡＰ３／　ＡＩ’３．） の２ピコモル、０．０３単位のＴＳＬ、及び６６μＭ　ＩＩＡＤを、０．５１の Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ”管に含む、１ｘＴｓＬＢの５０μｍの容量でスタートした 。各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、加熱サイクル中の蒸発を防止した。

増幅反応は、９０℃で２分、５０℃で５分を１サイクルとし、１５回繰り返した 。

Ｃ９制限部位被修飾産物の検出 実施例ＩＢで得た増幅産物を、２プローブ検出システムを用いて検出しまた。こ のシステムについては、国際特許出願Ｎｏ、　８９１０２６４９に記載されてい る通りである。その関係部分を、援用する。国際特許出願Ｎｏ、　８０１０２６ ４９のＥ、ｃｏｌｉリガーゼと、Ｅ、ｃｏｌｉリガーゼ・バッファーの代わりに 、１１８８　ＤＮＡ　リガーゼと、ＴＳＬＢバッファーを用いた。第１１図に示 しである、検出プローブＤＰ１とｐｉ）Ｐ２、を用いて、増幅産物の検出をした 。

被修飾増幅産物を、その後、オートラジオグラフィーで視像化する手段を得るた めに、検出プローブＤＰＩを、７３２Ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオチドψキナーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｌｉａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｌｎｄｉｘｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉｉｎｉ　）で、放射性燐を用いて燐酸化し た。比活性は、約７０００　Ｃｉ／ｉｍｏｌｅであった。余分の７３２ｐ−ＡＴ Ｐは、Ｇ５Ｇ１５０　ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ（Ｐｈｓｒｍ＊山、　Ｕｐｐｓ山、 　Ｓｗｅｄｅｎ）によるゲルろ過により、燐酸化オリグヌクレオチドから分離し た。

検出反応は、１６μｍのＩＸＴｓＬＢの最終容量で、増幅反応混合体の１０分の １、すなわち、各検出プローブ（７３２Ｐ　−ＤＰＩ、と９ＤＰ２）の２００フ 工ムトモル、０．０３単位の丁Ｓｔ、、　６６μＭに＾Ｄを含んでいた。検出反 応は、９０℃で５分、次に、５０℃で、１０分加熱して、完了した。次に、等容 量の負荷用バッファーを加えて、反応を停止し、さらに、９０℃で３分間加熱し た。

この生成物を、変性用の１５％ポリアクリルアミド・ゲル上で、反応混合物を電 気泳導することにより分離し、オートラジオグラフィーにより視像化した。（第 １２図参照）。相対的増幅効側よ、ＩＪＢυＩＩｒａＳｃａｎ”　Ｘｌ（Ｐｂｉ ｏｕ山ＬＨＢｉｏｊｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃｘｌａｖａ７　、　Ｎｅｗ 　ＩｅｒａｅＴ）によるレーザー密度計測定に基づいて評価した。

切断増幅産物（反応１、レーン１．２）は、非切断増幅産物（反応２、レーン３ ．４）よりも、増幅効率がたった７％しか高くなかった。これは、汚染性増幅産 物の実質的な減少が９３％になることに相当する。

切断増幅配列（反応３）、および非切断増幅配列（反応４）（それぞれ、レーン ５と６、レーン７と８である）の、増幅効率はほとんど同じであった。このこと は、偽像制限酵素認識部位を含む増幅配列は、対応する被修飾増幅産物を破壊す る同じ＠限酵素による処理によっては影響されないことを示している。

切断搬送Ｈ［’−ＤＮＡ　（反応５）、および、非切断（反応６）搬送ＨＰ−Ｄ ｌｌ＾　（レーン９から１２まで）には、信号が見られなかった。これは、レー ン１から８までの信号は、反応混合物中のＤＮＡないしその他の成分との、何ら かの非特異的相互作用によるものでないことを示している。

ここで注意すべきなのは、非切断増幅配列（ＡＳ、反応４、レーン７．８）は、 非切断増幅産物（ＡＭＰＩ、反応２、レーン３．４）に比べて、増幅効率はたっ た１８％しか上回っていないことである。これは、間違いなく、次の事実に基づ くものであろう。すなわち、この増幅プローブは、増幅配列に対して３個ミスマ ツチしており、完全に相補的なのは、増幅産物に対してだけである、ということ である。

実施例２の被修飾増幅産物が、Ｂｂｖ　Ｉ隔離切断用制限酵素によっても切断可 能であることは了知されるであろう。この場合、実施例２の増幅プローブ、ＡＰ Ｉ／ｐＡＰ１１ｐＡＰ２＃ＡＩ’２’　、　ｐＡＰ３／八Ｐ３’は、このＢｂｖ 　Ｉ酵素によっては切断されないであろう。他にも、隔離切断制限酵素を用いて 、相応の修飾を受けた増幅産物を離断することができる。これは、ＰＣＲ，ＬＣ Ｒいずれのタイプの増幅法による増幅産物についても同様である。

比較的高度の切断効率を持つ、隔離切断酵素を特定するために、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　［１ｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、（Ｂｅｗｅｔ１７．　Ｍａ＋５ａｃｈｕ ｓｅ目Ｓ）から購入した８種の酵素を、本発明の制限酵素認識修飾部位における 隔離カッターとして使えるかどうかを調べるために、選びだした。８種すべての 隔離切断制限酵素に対し、４２塩基二重鎖配列のＤＮＡが、制限酵素認識部位を 含むように設計し、た。

第１３図に示す通りである。この多数部位ＤＮＡ配列の下方鎖、下方鎖は、＾ｐ ｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓＨｊｅｍａ　ａ＋ｏｄｅｌ　３１１０Ｂ合成装置（＾ｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｌｅｌ＋、！ｎｃ、、　Ｆｏａｊｅ＋　Ｃ１ｔ７．　Ｃ ａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）を用いて合成した。これについては、実施例１に記載し た通りである。この相補的配列を交雑し、隔離カッター評価用の二重鎖を形成し た。等モル量の、多数部位ＤＮＡ上方鎖、下方鎖を共に加え、手短に９０℃まで 加熱し、次に、室温まで冷却させ、制限エンドヌクレアーゼ切断にふされしい２ 重鎖ＤＮＡを形成した。

２０ピコモルの二重鎖多数部位ＤＮＡの両５゛末端を、γ−３２Ｐで標識した。

これについては、実施例２の７３２Ｐ　−ＤＰＩについて記載した通りである。

次に、この多数部位ＤＮＡを、選ばれた８種の制限酵素による切断作用に暴露し た。すなわち、２００フ工ムトモルの３２Ｐ大標識多数部位ＤＮＡ、ｌｘバッフ ァー、下記の酵素の内の一つを、最終反応容量５０μｍ中に含んだ、８通りの反 応をもってその切断を実施した。

反応　制限酵素　制限酵素の量（単位）　バッファーＩ　ＡＬＷ　Ｉ　４　ｔｘ ＴｓＬＢ ２　８ｂｖ　Ｉ　２　１ｘＴＳＬＢ ３　Ｂ＋ｐＭ　Ｉ　４　１．ｘＴＳＬＢ本４　Ｆｏｋ　Ｉ　８　１ｘＴＳＬＢ ５　Ｐｌｅ　Ｉ　１　１ｘＴＳＬＢ ６　Ｈｇａ　ｌ　８　１ｘＴＳＬＢ ７　）Ｉｐｎ　ｉ　０．８　１ＸｉｓＬ’ｄ８　５ＩａＮ　ｌ　３　１ＸＴＳＬ Ｂ＊傘　＋１００　ｍＭ　ＮＩＣ＋ ８種すべての反応液を３７℃で、４時間インキュベートした。

インキュベーション後、それぞれの反応物の半分を、等量のＥＤＴ＾／染色試薬 と混合し、９０℃で、３分加熱し、反応を停止し、次に、１０％変性ポリアクリ ルアミド・ゲル上に、当業界に既知の標準技法を用いて流し、オートラジオグラ フィーによって視像化した。第１４図に見られるように全隔離カッターが被修飾 多部位ＤＮＡを切断したけれどもこのシステムにおいては、Ｆｏｋ　Ｉがもっと も高い切断効率を示した。

実施例３の隔離切断酵素の評価結果に基づいて、Ｆｏｋ　ｌを、ＰＣＲタイプの 増幅法において、隔離切断制限酵素修飾に使用できるかどうかを見るために、実 施例を計画した。２個の、Ｆｏｋ　Ｉ隔離切断制限酵素修飾部位を、第１５図に 示すように、ＰＣＲ由来増幅産物中に導入した。この修飾部位を、２個の、適当 に修飾されたＰＣＲプライマーによって、増幅産物中に導入した。そのプライマ ーはそれぞれ、増幅配列の中に位置する、ある好ましい偽像Ｆｏｋ　ｌ制限部位 と一つの塩基がミスマツチしている。被隔離切断部位と違って、隔離切断制限酵 素認識部位を、非修飾増幅プライマー中に導入すると、増幅産物の延長部分に、 Ｆｏｋ　Ｉ切断部位を含む、被修飾増幅産物を生ずる。それは、たとえ対応認識 部位がプライマー誘導部分内にあるときでさえ、事実である。したがって、この 被修飾増幅産物を、Ｆｏｋ１制限酵素で処理すると、切断産物（第１５図に示す ）が生ずるが、これは、前述した部分的プライミング現象にたいしては感受性を 持たない。

ｐＵＣ９内部に含まれる１４７塩基対配列を、本実施例の増幅配列として選んだ 。選ばれた１４７塩基対領域を、生来の増幅プライマー、ＡＰ６．　＾Ｐ７．（ 標的に対してミスマツチがない）、一つミスマツチした増幅プライマー、＾Ｐ８ ．　ＡＰ９．　（Ｆｏｋｌ制限酵素認識部位を、増幅産物に組み込むため）、ｌ ’ＡＤ２２、検出プライマー、と並べて、第１６図に示す。

Ａ、増幅用ｐＵＣ９標的の調整 本実施例の標的ＤＮＡ源として、２７０７塩基対の９［ＩＣ９プラスミドを用い た。ｐＵＣ９標的ＤＮＡを次のようにして増幅用に調整した。すなわち、Ｆｏｋ 　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで、円形のプラスミドを切断し、増幅に適当な、直 線配列を得た。

Ｆｏｋ　Ｉ制限酵素を用いると都合がよいのは、これが、適当に修飾された増幅 産物を破壊するためにすでに選ばれたものと同じ酵素であるからである。しかし ながら、このプラスミドを直線化、ないし、断片化するのに、他の制限酵素を用 いることも可能である。もっとも、適当な制限部位が、そのプラスミド内に位置 していなければならない。ｐＵＣ９プラスミドは、５個のＦｏｋ　ｌ制限部位を 含んでおり、その内、増幅配列は、直線化処理によって生じた、最大の（１３４ ０塩基対）　Ｆｏｋ　Ｉフラグメント内に含まれている。

なお、注意しなければならないのは、増幅サイクル温度が、約９５℃を下回り続 ける所では、通常、上記プラスミド、染色体、または、標本中のその他の標的を 断片ないし直線化することが必要になる。これは、最初の増幅サイクルで、完全 な変性が起こるのを促進するためである。増幅サイクル温度が、約９５℃を越え る所では、直線化および／または断片化が、増幅中に、必ず起こる。

下記の試薬を用いた。

０、４５ｕ　ｇ／ｕ　ｌ製産のプラスミドＤＮＡ、、　！ＩＵｃ　９を、Ｂ　Ｐ ｌ、　ｈ、　Ｐ　Ｘ　ｄ　ＡＲｅｓｅ＊ｒｃｂ　Ｌｉｂｏｒａｆｏｒｉｅａ　（ ＧａＮｈｅ＋ｓｂａｒｇ、　Ｍｘｒ７１ａｎｄ）から入手した。

反応バッファーは、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩＩＩｌｅ＋／Ｃｅｌｕｍ　（Ｎｏｒｗｇ ｌｋ、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｌ）の、Ｇｅｎｅ−＾叶（登録商標）ＤＮＡ増幅 試薬キット中に提供される［１０ｒｌ反応バッファーを１／１０希釈して得た。

この［１０ｒｌ　反応バッファーは、Ｉ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ、５００ 　ｍＭ　ＫＣＩ、１５１０Ｍ　ＭｇＣｌ２．０．１％（Ｗ＃）ゼラチンを含む。

本実験に使用のためにこのようにして得た反応バッファーは、［１１１反応バッ ファーである。

４単位／μｍ濃度のＦｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌｓｂａｌｎｅ、（Ｂｅｖｅｒ１７．　Ｍａｉｓａｃｈｕｓｅｌｔｓ ）より入手した。

プラスミドＤＮＡは、２　μｌ　（０，９μｇ）ノｐＨｃ　９　ＤＮＡト、２μ ｍ　（８単位）のＦｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを、５０μｍの１！反応バ ッファーに加えて、［ｌｘ！　反応バッファー中で切断した。

得られた反応混合物を、３７℃で４５分インキュベートし、残存する酵素活性は すべて、４５分間のインキュベーション後に、９０℃で１０分加熱して、破壊し た。この反応混合物における標的配列の濃度は、９．２５フ工ムトモル／μｍと 計算された。

被修飾ＰＣＲプライマー内に含まれる一つの塩基ミスマッチが、ＰＣＲタイプの 増幅法において十分な性能を発揮するかどうかを調べるために、生来の増幅プラ イマー（増幅配列に対して完全な相補性を持つ、八Ｐ６．＾Ｐ７．）、および、 被修飾増幅プライマー（増幅配列に対して実質的な相補性を持つ、八Ｐａ。

Ａｒ９　、）の両方を用いて、平行増幅を実施した。この平行増幅反応混合物を 、２０サイクル反応させ、その産物をその後、ＰＡｌ１２２検出プライマーを用 いて視像化した。

本実施例に用いた下記の試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｌｌ＋ｅｒ／Ｃｅ１ｕｓ　 ＧｅｎｅＡｍｐ　［ｌＮ人増幅試薬キットの一部として入手した。すなわち、１ ゜Ｊ　ｄＮＴＰ’　ｉ　（ｄＡ４Ｐ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ）、 ｌ１ｌｌｘ）反応バッファー（前記、実施例４．Ａ、に記載）　、ＡｍｐｌｉＴ ｘｑ　（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｍ）である。

負荷用バッファーは、実施例２．Ｂ、に記載したものと同じ。

検出プライマーＰＡＤ２２については、その５°末端を３２Ｐで標識した。比活 性は、約７０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅで、実施例２．ｃ、に記載した通りである 。

標的ｐＵＣ９ＤＮＡは、Ｆｏｋ　ｌ切断プラスミド（実施例４．Ａ。

による）を、ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，０、ｌ　ＩＩＩＭ　Ｅ ＤＴ＾）で、望みの濃度が得られるまで、希釈して調整した。

増幅反応はすべて、０．５　μｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒ［（登録商標）管中で、全 容量５０μｌの１ｘ反応バッファーにおいて行なった。この反応ｉ＜　ッ７７− 　ハ、２０Ｑ　ｕＭ　ａ度ノｄＮＴＰ’　ｇ　、２．　５単位０）ＡｍｐｌｉＴ ｓｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。上記に加えて、この反応物にはさらに 次のものが含まれていた。

増幅プライマー　ｐＵＣ９標的 反応１　Ａｒ８．　ＡＰ９’各々に２５ピコモルずつ　ｔｏｏ　ｓｍｏｌｅ反応 ２　Ａｒ１、＾Ｐ９’各々に２５ピコモルずツ０．　Ｏｓｍｏｌｅ反応３　Ａｒ １．ＡＰ？’　各々に２５ピコモルずつ　１００　ａｍｏｌｅ反応４　Ａｒ１． ＡＰ７’　各々に２５ピコモルずツ０．［ｌ　ａｉｏｌｅ各試験管にミネラル・ オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。反応は、ＰｅｒｋｉＩｌ−Ｅｌｓ ｅｒ／Ｃｅ１ｕサイクル加熱装置で、２０サイクル繰り返した。加熱は、各サイ クル、９０℃で２分行い、その後、５０℃で５分であった。

増幅産物は、下記のポリメラーゼ関連検出システム（ＰＡＤ）を用いて、選択的 に視像化した。この方法では、標識ＰＡＤプライマーは、過剰なりＮＰと、ポリ メラーゼとの存在下で、得られた増幅産物と交雑させられ、標識延長（検出）産 物を生成する。次に、この標識検出産物を、ＰＡＧＥ上で、過剰な標識ＰＡＤプ ライマーから分離し、その後、オートラジオグラフィーによって視像化する。そ のＰＡＤプライマーは、増幅産物への交雑のため、過剰な増幅プライマーと競合 しなければならないので、ＰＡＤプライマーは、増幅プライマーよりも長くなる （すなわち、より高いＴｍを持つように）よ・うに設計されている。したがって 、反応温度は、ＰＡＤプライマーの交雑を助長するように調節してもよい。

各反応混合物の１０分の１（５μｍ）に対し、２００フ工ムトモルの３２Ｐで標 識された検出プライマー（ＰＡＤ２２）　と、０．２５単位のＡｍｐｌｉＴＢポ リメラーゼとを含む溶液１μｍを加えた。ＰＡＤプライマーは、反応混合物を９ ０℃で５分、次に、６５℃で１０分、加熱して、アニーリングし、延長させた。

室温に冷却後、１５μｍの負荷用バッファーを加え、その後、９０℃で５分間加 熱して、反応を停止させた。反応混合物を、ＩＩＩ！　ＩＩ切断ｐＢＲ３２２３ ２Ｐ標識マーカーと共に、標準法を用い、１０％変性ポリアクリルアミド・ゲル 上に走らせ、オートラジオグラフィーによって視像化した。

反応混合物それぞれに対する１、４７塩基対ＰＡＤ産物の相対的強度を第１７図 に示す。増幅配列の偽像制限部位に一つの塩基がミスマツチをしている、被修飾 増幅プライマーの増幅効率は、生来のプライマーのものとほとんど同じであった 。（反応ル−ンの結果と、反応３レーンのものと比較されたい）。ゼロ・対照（ 反応２と反応４）の結果は、標的が無い場合には、繰り返し反応によっても、検 出可能な産物の蓄積は起こらない実施例４．Ｂ、から得た、同じ４つの反応混合 物を、活性Ｆｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ、もしくは、加熱非活性化Ｆｏｋ Ｉ　（対照）のどちらかで処理し、次に、ＰＡＤ検出を行なった。

これは、相対的切断効率を評価するためである。

Ｆｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用いて、被修飾ＰＣＲ由来増幅産物を破壊 した。本実施例に用いられる他の試薬はすべて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃ ｅ１ｕｓ　ＧｅｎｅＡｍｐ　（登録商標）　ＤＮＡ増幅試薬キットの一部として 得たものである。

加熱非活性Ｆｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ（△Ｆｏｋ　Ｉ　）は、酵素の濃 縮保存液を、１０分で９０℃まで加熱して調整した。

得られた△Ｆｏｋ　Ｉは、プラスミドｐｔ＋ｃ　９　ＤＮＡを切断できないこと を観察して、その非活性を確認した。

１ｘ反応バッファーの２５μｍ分液を、実施例４．Ｂ、の各増幅反応液（１，２ ，３，４）の１０分の１に、２μｍ　（８単位）の活性Ｆｏｋ　Ｉ　（反応液Ｌ Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ）か、または、２μｍの△Ｆｏｋｌ（反応液１△、２△、 ３△、４△をそれぞれ）のいずれかと共に、加えた。この反応混合物を、３７℃ で１６時間、次に、９０℃で５分インキュベートした。

ＰＣＲ由来増幅産物に対するＦｏｋ　Ｉ、△Ｆｏｋ　Ｉ酵素の切断効率を、ＰＡ Ｄ検出を用いて評価した。制限酵素処理後に、それぞれの反応混合液から１５μ ｍ分液を取り出し、次に、これを、１０．５μｍの溶液に加えた。この溶液は、 反応バッファーの０，９５Ｉに調整され、２００フ工ムトモルの”’ｐ−ＰＡＤ ２２　（比活性は７０００　Ｃｉ／ｍａｏｌｅ　）　、２．　５単位の＾１ｐｌ ｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含み、各ｄＮＴＰは（最終濃度３９２μＭ）で あった。次に、これらの反応混合物を、５分間で９０℃に、その後、６５℃で１ ０分間、加熱した。これは、延長反応を完了するためである。

２５μｍの負荷用バッファーを加え、その後、９０℃で５分間加熱して、反応を 停止した。停止した反応混合物から得た標本を、１０％ポリアクリルアミド・ゲ ル電気泳導にかけ、生成物は、オートラジオグラフィーによって視像化した。オ ートラジオグラフィ一段階で、フィルムを過度に感光させた。これは、ごく微量 なものまでも、切断産物の存在を明らかにするためであった。

第１８図に示すように、一つの塩基がミスマツチした被修飾増幅プライマー（Ｆ ｏｋ　１部位を含む）の使用によって生ずる被修飾増幅産物は、活性Ｆｏｋ　Ｉ 酵素（反応ＩＡ）で処理することによって完全に破壊されｌ；。逆に、生来プラ イマーによって形成される増幅産物は、同じ活性Ｆｏｋ　Ｉ酵素（反応３Ａ）に 暴露しても影響を受けなかった。これは、オートラジオグラム上で１４７塩基ベ アのところに現われる強度のＰＡＤ信号から明かである。予想したように、増幅 産物の内、修飾されたものも、修飾されないものも、加熱非活性Ｆｏｋ　Ｉ酵素 による処理の影響を受けなかった（それぞれ反応１△、３△）。ゼロ標的対照（ 反応液、２Ａ、４Ａ、２△、４△）では、オートラジオグラムの中に、１４７塩 基対位置の産物は見られなかった。このことから、観察された１４７塩基対信号 はすべて、実際に、増幅産物から得られたものであることが確かめられた。

僅かな信号が、反応ＩＡのＰＡＤ検出反応において、約１２７塩基対のところに 認められた。このあやしげな信号は、第１９図で示したように、２個のＦｏｋ　 を部位の内のただ１箇所だけがあらかじめ切断されている被修飾増幅産物鋳型に 延びるＰＡＤプライマーから発するものであることが判明した。第１９図に見ら れるように、単−Ｆｏｋ　Ｉ切断によって生ずる産物には２種類の可能性があり 、その内、ただ一つだけが、ＰＡＤ検出操作に反応し、１２７個の塩基対産物を 生成する。ここで次のことに注意するのは重要である。すなわち、この部分的に 切断された被修飾増幅産物の内のいずれも、両方の被修飾増幅プライマーに対し て相補的でないということである。このプライマーは、その後の増幅操作におい て、鋳型として加わるのに必要なものである。

Ｄ、Ｆａｋｌ処理された増幅産物のＰＣＲ増幅実施例４．Ｃ０で得た反応物にお ける切断の程度をさらに調べるために、同じ反応混合物を、希釈し、もう一度、 ２０サイクルのＰＣＲ増幅操作にかけた。そのときの被修飾増幅プライマーは＾ Ｐ８．八Ｐ９へである。やり方は、すでに、実施例４．Ｂ。

に記載した通りである。次に、得られた増幅産物に対し、実施例４．Ｃ２に記載 したように、ＰＡＤ検出を行なった。この「再増幅」標本の場合、ごく微量の非 切断増幅産物でさえも、検出レベルまで増幅されると期待した。ちょうどこれは 、伝送汚染産物が、臨床状況では、検出可能な信号を生成するにいたると予想す るのと同じであろう。再増幅、および、その後の検出操作に用いた試薬はすべて 、前述した通りである。

実施例４．Ｃ３から得た各切断反応物を、ＴＥ中で、ｌ／１Ｇ０．０００まで、 連続希釈した。切断反応そのものが、実質的に、もとの増幅混合物の１／６希釈 を生じたのであるから、この１／１００．　［１０Ｇ希釈は、もとの増幅反応混 合物に関して言えば、全体で１／６００．０００の希釈となる。さらに、増幅反 応混合物の、もとの容量の５０μｍにくらべて、希釈標本のわずか５μｍが再増 幅されるわけであるから、この再増幅体は、増幅産物（修飾されたものも、修飾 されないものも）全数の１／６．０００．０００に相当する。この増幅産物は、 実施例４．Ｂ、の、最初のＰＣＲ増幅の結果、生体内で合成されるものである。

この１／６．０００．０００という数字は、典型的な臨床検査環境で予想される 伝送汚染レベルを表わしている。

切断反応混合物の最終希釈液（１／６．０［１ｆｌ、　ＯＧＧ　）それぞれの５ マイクロリツトルを、４５μｌの溶液に加えた。この溶液は、５μ（の希釈標本 を含む最終溶液が、次のものを含むように調節されている。すなわち、反応バッ ファーとしてｌ／３　各ｄＮＴＰ　２００μＭを含み、かつ、各増幅プライマー （＾ＰＢ、八Ｐ９へ）を２５ピコモル、及び＾ｍｐｌｉＴｚｑポリメラーゼ２． ５単位を含む。反応ＬＡ、２Ａ、、３Ａ、　４に、１△、２△、３△、４△４か ら得られる反応混合物を、それぞれ、反応物ＩＡ＋、２Ａ＋、３Ａ＋、４Ａ＋、 １△＋、２△＋、３Δ＋、４△＋と名付ける（ここに、１−＋」は、その反応物 が、ＰＣＲ増幅法で、もう一度、２０サイクルで再増幅されたことを表わす）。

各反応混合物にミネラル・オイルを２滴加え、その後、０．５ｍｌのＥｐｐｅｎ ｄｏＨ管をシールし、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｍｅｒ／Ｃｅｔｏｓサイクル加熱装置で 、２０サイクル繰り返した。加熱は、各サイクル、９０℃で２分行い、その後、 ５０℃で５分であった。

２００フ工ムトモルの３２Ｐ標識検出プライマー（ＰＡＤ２２　）、および、０ ．２５単位のＡｌｌ１ｐｌｉＴｘｑポリメラーゼを含む溶液の、１μｍ分液を、 各再増幅反応混合物の１０分の１（５μｌ）に加えた。ＰＡＤ検出反応は、反応 混合物を、９０℃で５分、その後、６５℃で１０分加熱して実施した。反応生成 物は、１５μＩの負荷用バッファーで停止し、５分間で９０℃まで熱した。

その後、Ｈｌｌｌ　ＩＩ切断ｐＨＩ！３２２３２Ｐ−標識マーカーと共に、変性 １０％ＰＡＧＥ上を走らせ、さらに、オートラジオグラフィーで視像化した。そ の結果の写真を第１７図に示す。（このゲルとオートラジオグラムは、前記実施 例４．Ｂ、で得た反応１．２．３．４のデータをも含むことに注意されたい）。

反応１△＋、３△＋は、それぞれ、反応１．３の産物のｌ／６゜（１００，００ ０によって汚染された標本のＰＣＲ増幅から生ずると期待される信号の種類を表 わしている。この結果は、２０サイクルのＰＣＲタイプ増幅では、このレベルの 汚染から、典型的な偽像陽性が得られることを示している。逆に、あらかじめ活 性Ｆｏｋ　ｌ制限酵素（反応物ＩＡ＋）で処理した被修飾増幅産物で汚染された 標本の増幅では、検出可能な１４７マー産物は生成されなかった。換言すると、 偽像陽性は見られなかった。修飾されていない増幅産物をＦｏｋ　ｌ制限酵素（ 反応物３Ａ＋）で処理したものと、その同じ修飾されていない増幅産物を加熱非 活性化Ｆｏｋ　Ｉ酵素（反応３Ａ＋）で処理したものと比較すると、はぼ同じ強 度の信号が得られた。このことから、被修飾増幅産物の選択的破壊は、生来標的 配列の存在下に、活性ＦＯｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼによって処理すると生 じるが、この処理によっては影響されないことが示された。ゼロ標的増幅（反応 ２Ａ＋、２△＋、４Ａ＋、４△＋）には、検出産物は見られなかった。これより 、１４７マー産物は実際に増幅産物鋳型から得られたものであって、誤って形成 されたものでないこが確かめ実施例４では、伝染性汚染を除去するのに、あらか じめ増幅された試験標本を、増幅後処理して好成績をもたらした例を示したが、 前記したように、新規の試験標本を、その標本の増幅直前に、適当な切断剤で「 前処置コする方が、検査室環境では、より効果的であろう。このやり方では、新 規標本における汚染性増幅産物は、インキュベージタン前操作によって破壊され るわけで、この操作では、すべての増幅試薬を入れたままの、密封した試験管に 、増幅開始の直前に、切断剤（例えば、Ｆｏｋ　Ｉ　）を添加する。

前処置汚染防止策を実施するにあｉ；って、ちょっと引っかかるのは、新規の試 験標本では、汚染性増幅産物の初期濃度は極微であることが予想されることであ る。この心配は、このように基質濃度の低いところでは、ある種の切断剤の触媒 活性の喪失が観察されていることから発する。したがって、新しい標本中の被修 飾増幅産物を破壊するに当り、切断剤の効力が、前処置式汚染防止策の効力をひ どく減殺することがあり得る。（実施例４には、被修飾増幅産物を、増幅の直後 に切断剤で処理するときわめて有効であることが示されている。この場合、被修 飾産物は比較的に高濃度に存在する。）汚染をこのようにしてコントロールする ことができるかどうかをテストするために、■’！　ｐｏｔ遺伝子の１６２塩基 対部分を、被修飾増幅プライマー＾Ｐ１６’　＾Ｐ１７．を用いて増幅し、Ｆｏ ｋ　Ｉ制限部位を、増幅産物中に組み込んだ。次に、この産物を、得られた産物 上の検出プライマーＰＡＤ４の延長からのＰＡＤ検出信号を、標準物から得たも のと比較対照して定量した。本実験に用いたオリゴヌクレオチド配列を策２０図 に示す。次に、この被修飾増幅産物を希釈し、生来の標的を含む次段の増幅反応 に加えた。これは、コントロール設定汚染実験を模するためである。次に、得ら れた汚染標本を、増幅前に、活性切断剤（ＦｏｋＩ）または不活性切断剤（△Ｆ ｏｋ　ｌ　）で処理した。得られた信号を比較することによって、切断剤処理に よる汚染産物に関する破壊効率の値が得られた。

下記の実験において標的、標準に使用された核酸は、約６　ｋｂノＩＩＩＶ　（ ８８１０分離株、Ｇａ１ｌｏ　ｅｌ　ｉｆ、Ｎｘ［ｕｒｅ、３１３．２７７−２ ８４（１９８５））を含む、１０．　Ｏｋｂ　ｐＢＲ３２２クローンである。こ のクローンを、Ｂ１１ＨＩで切断し、増幅用に直線化した。同じクローンを用い て、検出段階における産物の定量用の標準を生成した。

これは、Ｐｖｕ　Ｉｆ、　Ｈａｅ　ＩＩＩで切断し、増幅の対象となる１６２塩 基対フラグメントを含む２５５塩基対フラグメントを生成して行なった。検出プ ライマー［’ＡＤ４は、このフラグメント上に延びて、１９２塩基産物を生成し た。ＰＣＲ産物の収量は、得られた１６２マーの検出産物を、既知量の標準から 得た１９２マーの産物と対比して推定することができる。

下記の試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃａｔｕｓ（Ｎｏ＋ｖａｌｋ、Ｃｏ ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＤＮＡ増幅試薬キットの一部として入 手した。すなわち、１０　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄＧＴ Ｐ、　ｄＴＴＰ）、［１０ｘｌ反応バッファーで、これについては実施例４．Ａ に記載した通りである。

７Ｍ ＾ｍｐｌｉＴｘｑ　ＤＮＡポリメラーゼは、８単位／μｌの濃度のものを、Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕ＋から入手した。

Ｔｂｅｒｍｏｐｂｉｌｉｃ　ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｏ１ｅｃｕＩａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇ７　Ｒｅｓ。

ｕｒｃｅｓ、Ｉｎｃ、（Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から恵与 された。濃度は、３単位／μｍであった。

制限エンドヌクレアーゼＲａｍ）ＩＩ（２５単位／　ａ　’　）　、ＰｖｕＩ＋ （５０単位／μｌ　）　、Ｈａｅ　ＩＩＩ　（１０単位／ｕｌ　）及びそれぞれ の１０×切断バツフアーは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｓｂｓ、Ｉｎｃ 。

（Ｉｔｅｖｅｒ１７．　Ｍａｇａａｃｈｏｓｅ目５）から得た。［１０ｘｌ　Ｂ ａ＋＋ＨＩバッファーは、１５００　ｍＭ　ＮａＣ１，６０ｍＭ　ｂｉｓ　（ｐ Ｈ７，９）、６０　ｎｉＭ　ＭｇＣｌ２．　６Ｇ＠Ｍβ−メルカプトエタノール であり、１００　μｇ／ｍ　ｌ濃度のＢＳ＾を含んティた。［１Ｇ！ｌ　Ｈｇｅ 　ＩＩＩＩッファーは、２００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７、９）、　１．［ｌ［ ｌ　ｍＭ酢酸マグネシウム、５０Ｄ　ｍＭ酢酸カリウム、ＩＱ　ｍｌＪ　ＤＴＴ であった。［１０ｘｌ　Ｐｖｕ　ＩＩバッファーは、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ ｐＨ７，９）、１００　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ＧＯｎｉＭ　ＮｌＣｌ　、１０　 ｍｌＪ　ＤＴＴであった。

オリゴヌクレオド配列＾’１６’　＾Ｐ１７．　、ＰＡＤ４は、実施例１に記載 する通りに合成し、精製した。

オリゴヌクレオチドＰＡＤ４の５゛末端に３２ｐを標識した。比活性は約７０［ １０Ｃｉ／ｉｍａｌｅである。これについては実施例２．　Ｃに記載しである通 りである。

ヒト胎盤ＤＮＡ　（ＨＰ−ＤＮＡ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｃｏｍ ｐａｎ７．　Ｈ，Ｌ。

ｕｉ＋、　Ｍｉ＋ｍｏｕ＋ｉ　）を搬送りＮＡとして用い、５　ｍＶ　ｖｇｃ１ ２に溶解したｌＯｍｇ／ｍｌ濃度の溶液として、９０℃で１０分間加熱処理した 。

標的配列は、約５７００塩基対のＨＩＶＩ列を含む、９ＢＲ３２２のＨＩＶＩロ ーン（ＨＩＶ　１．１）を、ＢａｍＨＩによって直線化して調製した。このクロ ーン（０，０２６μｇ　）を２０μ＋のｌｘＢａｍＨＩバッファー中で、２５単 位のＢｇｍＨＩと一緒に、３７℃で４時間インキュベートした。切断後、標的を 次のように希釈した。

すなわち、標的分子の所望の数が、５μｍのＴＥ中に、１Ｈｇ／μｍ濃度のＩＩ Ｐ−ＤＮＡと共に混在するように希釈した。

増幅産物を定量するのに用いる標準は、次のようにして調製した。標的を調製す るのに用いたのと同じクローン２μｇを、２５０単位のＰｙｏ　ＩＩを含む、１ ００μｌの１ＸＰｖｕ　ＩＩ切切断バッフアーマ、３７℃で１時間インキュベー トした。この溶液を、ｓ、　Ｉｌｌ　Ｍ　ＬＣ！を用いて、ＯＪ　μＭ　ＮａＣ １溶液とし、３＠容量ノエタノールを加えて、ＤＮＡを沈澱させた。１４．０Ｏ ＯＸ　ｇで３０分間遠心の後、上溝を傾斜してＤＮＡペレットを分離し、真空中 でこのＤＮＡを乾燥した。次に、このペレット状ＤＮＡを、１００μＩのＩＸ） Ｉａｅ　ＩＩＩＩ限バッファーに溶かした５０単位のＨａｅＩＩ＋制限酵素で切 断した。切断は、３７℃で１時間インキユベートシて行なった。残存酵素活性は 、反応物を５分間に９０℃まで加熱して破壊した。得られた２５５塩基対制限フ ラグメントは、１６２塩基対の増幅領域を含むものであるが、これは、検出プラ イマーＰＡＤ、と交雑し、ｄｌｌτＰｓ　、ポリメラーゼの存在下に延びて、１ ９２塩基産物を形成する。この産物は、１６２塩基増幅延長産物を定量するのに 使用することができる。

増幅反応はすべて、０．５　ｍｌ　ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭ管中で、全容量５０ μＩの１ｘ反応バッファーにおいて行なった。この反応バッファーは、それぞれ ２００ＨＭ濃度のｄＮＴＰ、　それぞれ２５ピコモルの増幅プライマー（＾Ｐ１ ６．＾ｌ’１７．　）　、５．０Ｈｇの）ＩＰ−ＤＮＡ、２゜５単位のＡｌｌ１ ｐｌｉＴａｑＴ！′ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。上記に加えて、この反応 物にはさらに次のものが含まれていた。

反応１　２５．０００分子の標的 反応２　１．　ＨＯ分子の標的 反応３　０．０分子の標的 各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。反応は、Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌａｅｔ／Ｃｅ１ｕｓサイクル加熱装置で、２５サイクル繰り返 した。加熱は、各サイクル、９０℃で２分行い、その後、５０℃で５分であった 。増幅産物は、ＰＡＤ４検出プライマーを用いて、選択的に視像化した。これに ついては次の通りである。

検出反応は、３３３μＭの濃度の各ｄＮＴＰ、２００フェムトモルのＰＡＤ４（ ７０００Ｃｉ／＋ｍｏｌ）、０．　６単位のＴｂｅｒｍｏｐｈｉ　ｌ　ｉｃポリ メラーゼ（ＭＢＲ）を含む、全体容量３０μｍの１ｘ反応バッファー中で行なっ た。上記に加えて、検出反応液はさらに下記のものを含んでいた。

反応　Ｐｖｕ　Ｉｔ／Ｈａｅ　ＩＩＩ切断標準　増幅反応１、Ｓ　５０　フェム トモル ２３　４０　フェムトモル ３５３０　フェムトモル ４５２０　フェムトモル ５Ｓ　１０　フェムトモル ６３　２．０フ工ムトモル １＾　反応１の５．０μｍ ２＾　反応２の５．０μｍ ３＾　反応３の５．０μｍ 検出反応は、試験管を９０℃で５分、その後６０”Ｃで１０分加熱して実施した 。反応は、３０μｍの負荷用バッファーを加え、３分間で９０℃まで熱し、その 後室温に冷却して停止させた。

産物は、標本を変性１５％ＰＡＧＥ上を走らせ、その後オートラジオグラフィー によって分析］、た。第２１図のオートラｓ多オグラムの写真に示すように、標 準（レーンｌＳ−６３）は、増幅反応物（レーンＬＡ−３Ａ）から得られる検出 産物よりも若干遅い移動速度を持つ検出産物を生成する。これは、それぞれ１９ ２．１６２塩基対というサイズの計算値に一致する。

増幅反応物は、開始標的の量に直線的な反応を示すが、ゼロ標的反応物（レーン ３Ａ）は全く産物の印を見せない。反応２（レーン２Ａ）は、１０フェムトモル の標準（反応５Ｓ）から得られる信号と比較すると、反応物を約１０フェムトモ ルフ５μＩ含むと推定することができる。この増幅から得られる被修飾増幅産物 は、下記に詳述するコントロール設定汚染実験に用いた。

本実験においては、野生種標的（１０００ないし０分子）を、反応２Ａから得た 被修飾増幅産物の２００．０００．２０．０００１０分子のいずれかで汚染した 。次に反応物を、活性切断剤（Ｆｏｋ　！　）または非活性切断剤（△Ｆｏｋ　 Ｉ　）で処理した。一定時間、密閉した反応管中で切断剤と共にインキユベーシ ミンした後で、反応を繰り返し、増幅を行なった。９０℃の最初のＰＣＲサイク ルによって、Ｆｏｋ　Ｉ活性はいずれも破壊されるが、その破壊により、新たに 形成される被修飾増幅産物が切断されていない野生種標的分子から指数関数的に 蓄積する。

本実施例で用いられる試薬はすべて、実施例５．Ａで前述したものと同じもので あるが、ただし、下記の試薬をさらに加えているところが異なる。４単位／μｌ の濃度のＦｏｋ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌｉｎｄ　Ｂｉ ｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ　（Ｂｅｖｅｒ１７．　Ｍａｔ■ｅｈａｓｅｌｔｘ）　から 入手した。

非活性切断剤、△Ｆｏｋ　Ｉは、Ｆｏｋ　Ｉ酵素の一部を沸騰水浴中で１０分加 熱して得た。

負荷用バッファーは、実施例２．　８に記載したものと同じである。

反応２Ａ、（開始濃度、２フ工ムトモル／μｍ）から得た被修飾増幅産物を−こ れは標本を汚染するのに用いたものであるが一部に連続的に希釈し、標本添加用 に所望の数の汚染性分子を得た。

反応はすべて、０．５　ｍｌ　ＥｐｐｅｎｄｏｔｆＴＭ管中で、全容量５０μｌ の１ｘ反応バッファーにおいて行なった。この反応バッファーは、それぞれ２０ ０　ｍＭ濃度のｄＮＴＰ、それぞれ２５ピコモルの増幅ブライ７−（ＡＰ、６． 　Ａ［’１７．　）　、５．０　μ＋　ノ）ＩＰ−ＤＮＡ、２．　５単位の＾ｍ ｐｌｉＴｍｑ”　ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。上記に加えて、この反応に はさらに次のものが含まれていた。

反応　標的分子　汚染性分子　切断剤 １　１０００　２０．０００　Ｆｏｋ　１２　１００Ｇ　２［１，０００Ｆｏｋ 　１３　０　２０．０００　Ｆｏｋ　１ ４　０　２０．０００　Ｆｏｋ　Ｉ ５　１０００　２［１，０００△Ｆｏｋ　Ｉ６　１０００　２０．０００　△Ｆ ｏｋ　１７　０　２０、０００　△Ｆｏｋ　１ ８　［１２０，［ｌＯＱ　△Ｆ＋＋ｋ　Ｉ９　１０００　２００．０００　Ｆｏ ｋ　１１０　ＩＯＮ　２００，０００　Ｆｏｋ　１Ｉｆ　Ｏ２００，０００ドｏ ｋ　１ １２　Ｇ　２００，０００　Ｆｏｋ　１１３　１０００　２０Ｇ、０θ０　△Ｆ ｏｋ　１１４　１０Ｈ２００，０００△Ｆｏｋ　１１５　０　２００、　（ｉｏ ｏ　△Ｆｏｋ　１１６　０　２００、０００　ΔＦｏｋ　［１７１ＧＯＯＯなし １８　１．０００　０　なし １９　０　０　なし ２０　０　０　なし Ｆｏｋ　Ｉを含む反応は、８単位の活性酵素を含んでいた。

△Ｆｏｋ　Ｉを含む反応は、その酵素の加熱非活性形を等壷金んでいた。各試験 管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。反応物を、Ｐｅｒ ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／　Ｃｅ１ａｓサイクル加熱装置に移し、３７℃で６０分加 熱して切断反応を完了し、その後９０℃で２分、５０℃で５分の加熱を２５サイ クル行い、増幅反応を完了した。反応産物は、各反応物の５μｍを、ＴＥに溶１ μｍとを結合させ、その後９０℃で５分、次に６０℃で１０分加熱して検出した 。室温に冷却後、１０μｍの負荷用バッファーを加え、さらに反応物を３分間で ９０℃まで加熱し、再び室温に冷却した。反応物は、この標本を１５％変性ＰＡ ＧＥに走らせ、次いでオートラジオグラフィーによって分析した。

オートラジオグラムの写真（第２２図）から、増幅前に非活性の切断剤で処理し た汚染標本は、ゼロ標的レーン（反応７．８．１５．１６）に強い偽陽性（１６ ２マー・産物）を示すことが判る。このため、真の陽性（反応５．６．１３．１ ４）は、大きな背景信号により見ることはできない。逆に、増幅前に活性切断剤 で処理した汚染標本は、それぞれ００モル・コントロール（反応３．４．１１． １２）に対して、強度の１０００モル・コントロール（反応１．２．９．１０） を示す。ここで、１０００モルの標的から得られた信号の方が−この場合Ｆｏｋ Ｉを用いて汚染物を切断する（反応１．２．９．１０）のであるか−、汚染もＦ ｏ）　ｌで処理されてもいない１．０００モル標的（反応１７．１８）から得ら れる信号よりも、はるかに著明であるのは興味あることである。Ｆｏｋ　Ｉを含 む増幅反応において、増幅信号が強化されるという、この現象については何の説 明もできないが、この現象は、日常的に観察されるのである。

この方式の汚染防止策は、特に魅力的である。というのは、切断剤による処理後 、増幅反応を開始するために、増幅反応物を開放するという必要がないからであ る。これによって、増幅前に、未処理の汚染物が反応容器に侵入して偽像陽性を 生ずることを、確実に無くすことができる。

実施例６ ＰＣＲ増幅産物のりボヌクレオチド修飾−被修飾増幅産物の化学的切断対酵素的 切断 この実施例においては、各増幅プライマー中に単一リボヌクレオチド置換体を形 成した。これは、得られるＰＣＲ由来増幅産物の各鎖の中に脆弱な修飾部を導入 するためである。得られた増幅産物中の脆弱結合は、被修飾増幅プライマーから のポリメラーゼ延長によって形成され、このプライマーはそれぞれの３゛末端に 単一リボヌクレオチドを含んでいる。これによって、被修飾増幅産物は、酵素的 破壊（低温ではＲＮＡ５ｅを用いる）及び化学的Ｖ！壊（高温では強塩基を存在 させる）の両方に感受性を持つようになる。

ＨＩＶの７５塩基対領域を増幅配列として選んだ。この７５マー標的を、２個の １５７−増幅プライマー（ＡＰＩ８．＾’２１”及び１個の２６マー検出プライ マー（ＰＡＤ５）を用いて増幅した。

これについれは、第２３図に記載する通りである。

コノ実施例においては、旧ＶクローンｐＢＨ１［ｔ　（Ｈａｈｎ、ｅｌ　ａｌ。

Ｎａ１ｕｅ、３１２．　１６６　（１９８４））を、３゛末端に単一のりボヌク レオチド修飾部を持つ被修飾増幅プライマーＡＰｔｓ、　ＡＰ２＋、を用いて、 増幅した。次に、得られた被修飾増幅産物を、連続希釈と、野生種標的標準の既 知量との同時的再増幅によって定量した。

この定量した被修飾増幅産物の標本は、後の実験の使用に備えて保存した。

Ａ１９１山ＱＴＭＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｍｅｔ／Ｃｅｊｏｓ から入手した。濃度は８単位／μＩであった。

デオキシヌクレオチド−５゛　−三燐酸（ｄＡＴＰ、ｃｃＴＰ、　ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰ）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｍｅｒ／Ｃｅｊｕｓ　ＧｅｎｅＡｍｐ”増幅試 薬キ・ソトの一部として入手した。濃度は、そ机ぞわ１０１であった。

ｆｌＱｘ１反応バッファーは、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐｌ＋　８．３）、 　５００　ｍＭＫＣＩ、３０　ｍＭ　Ｍｇｃ１２．ゼラチン（Ｄｆｌｃｏ　Ｌｚ ｂｏｒｓ＋ｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｊ。

Ｍｉｃｈｉｇｘｏ）を含む。濃度は１μｇ／ｍ　ｌであった。

オリゴヌクレオチド配列ＡＰ、８．　ＡＰ２．、　、ＰＡＤ５は、実施例１に記 載した通りに合成、精製した。ただし、＾’１ｇはグアノシンから始まるＲＮＡ 支持体から合成し、＾Ｐ２１．はウラシルから始まるＲ、　Ｎ　Ａ支持体から合 成した。このＲＮＡ支持体は、Ｇｔｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒｘｌ ｉｏｎ　（Ｈｅ＋ｎｄｏｎ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から市販のものを得た。

検出ヌクレオチドＰ＾θ５の５′末端は　Ｐで標識し、その比活性は約７０００ 　Ｃｉ／ｍｏｏｌｅであった。これについては、実施例２゜０の記載の通りであ る。

ヒト胎・盤ＤＮＡ　（ＨＰ−ＤＮＡ、　５１ｇｍ１　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｇ ＋ｐｘｎｙ）を搬送りＮＡとして用い、１０　ＩＩＭ　ＭｇＣ！２に溶解した！ 、［ｌ　ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を１０分間沸騰水浴で加熱処理した。

標的旧Ｖ　ＤＮＡは、ＨＩＶクローンｐＢＨＩ［ｌをＴＥ中で所望の分子レベル まで希釈し、等容量の）ＩＰ−ＤＮＡ　２μｇ／ｍ　ｌ濃度のＴＥ溶液を加えて 調整した。ＨＰ−ＤＮＡの存在によって、低量の標的ＤＮＡの容器にたいする非 特異的結合を防止することができる。

増幅反応はすべて、Ｏ９５ｉｆ　Ｅｐｐｅｎｄｏ＋＋”管中で、全容量１００μ ｍの１ｘ反応バッファーにおいて行なった。また、この反応は、それぞれ１００ μＭ濃度のｄＮＴＰ、　それぞれ５０ピコモルの増幅プライマー（ＡＰ１８．　 ＾Ｐ２１．　）　、５．　ｆｌμｇのＩＰ−Ｄｌｌ＾、３．２単位の＾ｍｐｌ山 ｑ”　ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。その他、反応容器にはさらに次のもの が含まれていた。

反応１−４　１０００分子の標的 反応５−６　０分子の標的 各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。反応は、Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌａｓｒ／Ｃｅｊｏｓサイクル加熱装置で、３０回サイクル繰り 返した。加熱は、各サイクル、９５℃で３０秒行い、その後、５０℃で５分であ った。

繰り返し加熱完了後、反応物１−４　（１０００分子の標的）を合体した。同様 に、反応物５と６（０分子の標的）を合体した。これは、被修飾増幅産物や対応 するゼロ分子コントロール両方の、均質保存液を作るためである。合体した反応 物１−４を反応物ＩＫと呼び、一方、コントロールすなわち反応物５と６の合体 物を反応物ＯＫと呼ぶ。

増幅産物は、反応物ＩＫまたは反応物ＯＫどちらかの１０μｍと、１μｌの　Ｐ −標識検出フロー１　ＰＡＤ５（７ＧＯ［ｌ　Ｃｉ／ｍ５ｏｌｅ。

１００フェムトモル／μｍ）と結合させ、２分間で９５℃まで加熱し、その後６ ０℃で１０分間加熱して検出した。室温に冷却後、１０μｍの負荷用バッファー を加え、反応物を３分間で９０℃まで加熱し、その後室温に冷却した。反応産物 は、標本を１０％変性ＰＡＧＥ上に走らせた後、オートラジオグラフィーによっ て分析した。

第２４図に示すとおり、１０００モルの反応物（レーン１の反応ＩＫ）からは、 きわめて強力な検出信号（ＰＡＤプライマー上に、７５マーと４個のアデノシン 残基が加わってできた７９７−）が得られたが、０モル反応物（レーン２の反応 ＯＫ）からは検出可能な信号は得られなかった。これによって、このタイプの被 修飾プライマーは、ＰＣＲタイプの増幅法にふされしいことが明かである。

増幅産物の量を、次のようにして推定した。すなわち、ＰＣＲ増幅物を、既知量 の野生種標的と一緒に、反応物ＩＫの連続希釈液上に走らせて行なった。

増幅反応はすべて、０．５　ｉｆ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ”ｉｆ中で、全容量５０ μｌの１ｘ反応バッファーにおいて行なった。この反応は、それぞれ２００μＭ 濃度のｄＮＴＰ、　それぞれ２５ピコモルの増幅プライマー（八Ｐ１＆、＾ｐ２ ．．　）、ｓ、ｏμｇのＨＰ−ＤＮＡ、３．２単位の７Ｍ Ａａ＋ｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。さらに、各反応物には 次のものも含まれ“Ｃいた。

反応物７　１０００分子の標的 反応物８　１０００分子の標的 反応物９２００　分子の標的 反応物１０　２００　分子の標的 反応物１１　０　分子の標的 反応物１２　０　分子の標的 反応物１３　Ｒｘｎ１Ｋの１／３Ｘ１θ５の５ｇ１反応物１４　Ｒｘｎ１Ｋの１ ／３Ｘ１０５の５μｍ反応物Ｌ　５　Ｒｘｎ　ＩＫの１／３Ｘ１０’の５μｍ反 応物１６　Ｒｘｒ　ＩＫ　ｃ７）　Ｉ／３Ｘ　１Ｇ’　（０５μｍ反応物１７　 Ｒｘｎ　ＩＫの１／３ＸＩ［ｉ７の５μｌ反応物１８　ＲＩＩＩ　ＩＫの１／３ Ｘ１０７の５μ＋各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止 し、た０各反応管は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｎｕｒ、／（４１ｎ％サイク４加４％装 置で、３０回サイクル繰り返した。加熱は、各サイクル、９５℃で３０秒行い、 その後、５０℃で５分であった。これによって増幅を行なった。得られた増幅産 物は、各反応管から得た１０μｍを１μｍの３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドＰＡ Ｄ５（７０００Ｃ＋／ｍ５ｏｌｅ、１（１０フェムトモル／μｍ）溶液と合体し 、２分間で９５℃まで加熱し、その後、６５℃で１０分間加熱して検出した。室 温に冷却後、各反応物に１０μｍの負荷用バッファーを加え、検出産物を３分間 で９０℃まで加熱し、その後室温に冷却し７て変性した。検出産物は、標本を１ ０％変性Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅ上に走らせ、次ぎに１−トラジオグラフィ・−によっ て視像化した。

第２５図に示したオートラジオグラムの写真から、反応物ＩＫ（レーン１７．１ ８）の１／３Ｘ１０７希釈液から得られる産物は、１．１１００モルの野生種標 準（レーン７．８）にたいして等しい強度の信号を呈することが分かる。このこ とから、反応物ＩＫは、５μｍの反応容量当り被修飾増幅産物を３Ｘ１．０”分 子含む。

これは、もとの増幅法にたいして、サイクル当り平均９２％の効率に相当する。

Ｂ、ＲＮＡ５ｅ　Ａ　による被修飾増幅産物の切断この実験においては、実施例 ６．　Ａから得た被修飾増幅産物を、オリゴヌクレオチドＰＡＤ５による検出直 前にＲ１１＾ｓｅＡに暴露した。もしもリボヌクレオチドが増幅産物にあるなら ば、完全長の産物より１５塩基短い検出産物を見ることができるはずである。Ｒ ，ＮＡｓｅＡ　はリボ−ピリミジンにたいして特異的であるから、下方路のみが この反応で切断される（すなわち１、被修飾増幅産物の下方路は単一のウラシル ・リボヌクレオチド結合を含んでいるが、」二方鎖の唯一のりボヌクレオチド成 分はリボ・グアノシン、すなわち、プリンである）。さらに、標識検出ブラ・イ マーは下方路と交雑し、延長するのであるから、切断の程度は短い方の（６４マ ー）検出産物の存在によって明かとなる。

ＲＮＡ５ｅＡ　は、　Ｓｉｇｍｚ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＣｏｍｐａＢから購入し 、ＴＥ／１５０　ｄ　ＮａＣｌにｌＱｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＤＮＡ５ｅ 活性は、この溶液を沸騰水浴で１５分間加熱して破壊した。１５０　ｓＭＮ　ｇ 、　ＣＩ中のこの保存液の１／２００希釈液（５（ｌμｇ／ＩＩりを、さらに１ ５分間沸騰水浴で加熱し、室温に冷却し、下記の実験に用いた。

検出プライマーＰＡＤ５は、実施例６．　Ａで既に記載したものと同じである。

前の実験の反応物ＩＫ、ＯＫを被修飾増幅産物の原料として用いた。

切断反応物は下記のように設定した。

反応物　産　物　ＲＮＡ５ｅ １　１０μｍの反応物ＩＫ　１μｍ ２　１１１μｍの反応物ＩＫ　［１μｍ３　１０μｍの反応物ＯＫ　１　μｍ ４　１０μｍの反応物ＯＫ　Ｏμｍ 切断反応を室温で２時間進行させ、得られた産物は、１７ｚ１の　Ｐ標識オリゴ ヌクレオチドＰＡＤ５Ｃ’１０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ｆＯ１ｌフェムトモル ／μｌ）溶液を加え、２分間で９５℃まで加熱し、その後、６５℃で１０分間加 熱して検出した。室温に冷却後、１０μｍの負荷用バッファーを加え、標本を３ 分間で９０℃まで加熱し、その後室温に冷却して変性した。反応産物は、標本を １０％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎにオートラジオグラフィーによって分析し た。

オートラジオグラムの写真を第２６図に示す。ＲＮＡ、ｓｅ熱処理よる被修飾増 幅産物と未処理のもの（それぞれ、反応物１、レーン１、および、反応物２、レ ーン２）とを比較することによって、ＲＮＡ５ｅはリボヌクレオチド部位で切断 することが確かめれた。すなわち、レーン１に短い方の検出産物があるからであ る。さらに、反応は定量的であるようである。予想通り、０分子・コントロール （レーン３．４）のいずれにも、検出信号は存在しなかった。

Ｃ１強塩基切断を受ける、又は受けない、汚染物の存在下におけるＨ■ｖのＰＣ Ｒ増幅 この実験においては、野生種標的分子（プラスミド９８１４１０）を、反応物Ｉ Ｋから得た被修飾増幅産物で汚染し、次ぎに、ＫＯＨ（切断剤）かＫＣＩ　（コ ントロール）で処理した。汚染物を破壊するための切断を行なった後、標本を中 和し、ＰＣＲ増幅を行い、汚染分子が破壊されていることを確かめた。

汚染は、反応物ＩＫから得た。これは、実施例６．　Ａで定量したように、被修 飾増幅産物を６Ｘ　１０９分子／μｍの濃度で含んでいる。この標本を連続的に 希釈し、５μｍ当り被修飾増幅産物１０００モルを含む保存液を得た。この保存 液はまた、１１Ｐ−ＤＮＡを０．２５μｇ／μＩの濃度で含んでいる。これは、 非特異的結合による産物分子の損失を防止するためである。

標的ＤＮＡ、　）ＩＰ−ＤＮＡ１反応バッファー、ｄＮＴＰ＠、増幅プライマー ＾Ｐ　ＡＰ　、標識検出プライマーＰＡＤ５は、実施例６゜１８’　２１’ Ａで前述したものと同じである。

Ａ＋ａｐｌｉＴｉｑＴ１Ｎ＾ポリラーゼは、Ｐｅ＋ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｔ／Ｃｅｔ ｏｇから入手した。濃度は５単位／μｍであった。

水酸化カリウム（ＫＯＨ）は脱イオン水に溶かして、６００　ＩｎＭ濃度の保存 液を得た。

塩化カリウム（ＫＣＩ　）は脱イオン水に溶かして、６００μ濃度の保存液を得 た。

塩酸（１’ｌＣＩ　）は脱イオン水に溶かして、６００　ｍＭ濃度の保存液を得 た。

標的分子は、５μｌの標的（１０００又は０分子）と５μｌの汚染保存液（１０ ００分子）を混ぜることで汚染した。これらの標本を、５μｍのＫＯＩ（または ＫＣＩ保存液のどちらか（６００ｍＭ、最終カリウム濃度が２００　ＩｎＭ　） で処理し、６０分間で９４℃まで加熱して、切断反応を完了した。次ぎに、５μ ｌのＨＣＩをＫＯＩ（処理標本に加えるか、または５μｍのＨ２ＯをＫＣＩ処理 の標本に加えるかして、標本を中和した。この反応は下記のように指定した。

反応　ＫＯＩ（ＫＣＩ　−焦り−１１２０鼾１　０　μｍ　５　μｍ　０　μｍ 　５　μｍ　１０００２　０　μｍ　５　μｍ　０　μｍ　５　μｍ　１０００ ３　０　μｍ　５　μｍ　０　μｍ　５　μｍ０４　ＱμＪ　５　７７ｊ　Ｑμ ｌ　５μｍ　８５　５　μｍ　０　μｍ　５　μｍ　０　μｍ　１００（１６５ μｍ　０　μｍ　５　μｍ０　μｍ　１０（ＩＯ２５μｍ　０　μｍ　５　μｍ 　０　μｍ０８　５　μｍ　０　μｍ　５　μｍ　０　μｍ０次に、反応物すべ てを１００μｍの最終容量になるようにし、反応バッファーが１ｘになるように 調節し、各ｄＮＴＰが１００μＭ。

７Ｍ 各増幅プライマー（ＡＰ１８．＾’２１”が５０ピコモル、＾悶ｐ＋山ｑＤＮＡ ポリメラーゼが３．２単位含まれるようにした。各反応は、［’ｅｒｋｉｎ−Ｅ １ｍｅｒ／Ｃｅｊｕｓサイクル加熱装置で、３０回サイクル繰り返した。加熱は 、各サイクル、９５℃で２分間秒行い、その後、５０℃で５分であった。得られ た増幅産物は、各反応物から得た１０μｍを１μｍの３２Ｐ標識オリゴヌクレオ チドＰＡＤ５（７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、１００フェムトモル／μｍ）溶液と 合体し、２分間で９５℃まで加熱し、その後、６５℃で１０分間加熱して検出し た。室温に冷却後、各反応物に１０μｍの負荷用バッファーを加え、産物を３分 間で９０℃まで加熱し、その後、室温に冷却して変性した。産物は、標本を１０ ％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎに、オートラジオグラフィーによって分析した 。

オートラジオグラムの写真を第２７図に示す。予想通り、標本をＫＣＩで（それ ぞれ、反応物１−４、レーン１−４）処理した場合には、１０００分子標的反応 物と０分子標的コントロールとは区別できない。これは、ＫＣＩ処理では影響さ れない、１０００分子の汚染物が存在するために生ずる、強い偽像陽性信号のた めである。逆に、増幅前に標本をＫＯＨで処理した標本の場合には、１０００分 子標的増幅（それぞれ、反応物５と６、レーン５と６）は対応する０分子・コン ｉ・ロール（それぞれ、反応物７と８、レーン７と８）から簡単に区別される。

これは、１０００分子汚染物由来の干渉性信号がＫＯＨ処理によって有効に取り 除かれたからである。

この実施例では、いくつかの脆弱修飾を、ＬＣＲタイプの増幅によって生産され た増幅産物の各鎖に導入した。本実施例の脆弱結合は、その３°末端に単一のり ボヌクレオチドを含む増幅プローブの結合によって生成した。実施例６の、同様 の修飾を受りた、ＰＣＲ由来の増幅産物の場合と同様に、このタイプの脆弱結合 を、修飾増幅産物に導入すると、その増幅産物は、酵素的破壊にたいしても（低 温では、ＲＮ　Ａ　ｓ　ｅ　）　、化学的破壊（高温での強塩基の存在下で）に たいしても感受性を持つようになった。

本実施例では、）ＩＩＶの４５塩基対領域を、増幅配列として用いた。この４５ マーの標的を、３対の増幅プローブＵｐ、８／ｐＡＰｌ＆１．１ｌＡＰ１９／Ｉ ＩＡＰＩ９−　、　ｐＡＰ２［１／ｐＡＰ２０’　）を用いて増幅［５た。これ については、第２８図に示す通りである。

本実験においては、ＨＩｖクローン、ｐＢＢＯ２４５塩基対領域を、３対の増幅 プローブ（＾Ｐ１８／＾Ｐ１８．　、　ｐＡＰ１９／ｐＡＰ１９．　、　ｐＡｌ ’２０””２Ｇ”を用いて増幅した。これに・ついては第２８図に示す通りであ る。増幅プローブ、＾Ｐｔｓ、　１１ＡＰＩ９．　ｐＡＰ、、、、　１ｌＡＰ２ Ｇ、　ｐＡＰ２Ｇ’　は、その３′末端に単一リボヌクレオチド残基を含むが、 その結合によって、脆弱なリボヌクレオチド結合が生ずる。次ぎに、得られた修 飾増幅産物を、標準との比較、連続希釈、その後の既知量の野生型旧Ｖ標的を標 準とする再増幅によって、定量した。次ぎに、この定量済み増幅産物を、調整伝 搬汚染として後の実験に用いた。

ｔｈｅｒｍａａ　ｌｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、　Ｈ［１８（＾ＴＣＣＮｏ、２７ ６３４）から得た熱安定性リガーゼ（ＴＳＬ　）　、および、熱安定性ＤＮＡリ ガ・−ゼ・バッファ・・−（ＴＳＬＢ）は、実施例２．Ｂ、で用いたものと同じ である。

オリゴヌクレオチド八Ｐ１８は、実施例６、Ａ、と同じもので、その３°末端に リボ・グアノシン残基を含んでいる。

５゛末端が化学的に燐酸化されているオリゴヌクレオチドｐＡＰ、８．は、実施 例１に記載した通りに合成、精製した。

オリゴヌクレオチドｐＡＰ１９．　ｐＡＰ１９．　、　ｐＡＰ２ｏ、　ｐＡＰ２ ｏ、は、５゛末端に燐酸基、３“末端に単一のりボヌクレオチド残基を含むよう に、合成した。燐酸基は、実施例１に記載したように、化学的燐酸化によって、 導入した。３′　リボヌクレオチドは、適当なＲＮＡ支持体（すなわち、ｐＡＰ １９は、ＲＮＡ−Ｃ支持体から合成し、　ＩＩＡＰ　Ｉ９−　は、ＲＮＡ−Ｃ支 持体から合成し、９ＡＰ２０は、ＲＮＡ−Ａ支持体から合成し、９ＡＰ２ｏ、は 、Ｒ１ｉ＾−υ支持体から合成した）から合成を始めることによって合成し、た 。ＲＮＡ支持体は、Ｇｌｅｎ　［１ｅｓｅａｒｅｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　 （Ｈｅ＋ｎｄｏｎ、Ｖｉ＋ｇｉｎｉｔ）　から購入した。合成後、オリゴヌクレ オチドに、標準の脱保護と、精製処理を行なった。これについては実施例１に記 載した通りである。

注意しなければならないのは、下記の実験において、ｐＡＰ２ｏは、その３′末 端にリボヌクレオチドを含まなくてもよいし、また、オリゴヌクレオゲート［１ ＡＰ２０．は、その５′末端が燐酸化されている必要はない、ということである 。この修飾を組み込むのは、このシステムを、将来の実験において、多数の増幅 プローブの使用に適合させるためである。

増幅プローブ・ペア八Ｐ１ｇ””１８’　は、γ−Ｐデオキシアデノシン三燐酸 と、Ｔ４キナーゼを用いて、比活性的７０００　Ｃｉ／ｍＩＩ山まで３２Ｐで標 識した。これについては実施例２．Ｃ９で記載した通りである。注意しなければ ならないのは、増幅プローブＡＰ、８だけを標識するということである。なぜな ら、オリゴヌクレオチドｐＡＰｉｓ、の５゛末端は既に燐酸化されているからで ある。

ＨＰ−１１Ｎ＾は実施例６．Ａ、で記載したものと同じである。

標的ＤＮＡ　（クローンｐＢＨ１［１）を、ＨＰ−１１Ｎ＾溶液中に、適当な濃 度（１μｇ／μｍ）まで希釈し、次に、沸騰水浴中で、１５分加熱し、プラスミ ドＤＮＡを断片化し、変性した。

反応はすべて、０．５　ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏ＋ｆ管中で、全容量４０μ＋の１ 、ＸＴｓＬＢにおいて行なった。この反応バッファーは、それぞれ２ピコモルの 増幅プローブ（ＡＰＨ８，ｐＡＰｘｓｌ、ｐＡＰｌｇ、９ＡＰ１９１．　ｆｌＡ ［’２０’　ｐＡ’２０”　’さらに１００フェムトモルの３２Ｐ標識増幅ペア ＾Ｐ　／＾Ｐ、０．０６単位のＴＳＬ、１０ＰｇのＨＰ−ＤＮＡを含Ｉｌｌ　１ ８’ み、ＮＡＤにおいて６６ＰＭであった。各反応物は、合計２．１０ピコモルの増 幅ベア＾’＋８””１ｇ’　を含んでおり、その平均比活性は、３３３　Ｃｉ／ ＋ｎｍｏｌｅであった。この標識によって、得られた増幅反応物を視像化する手 段を与える。上記に加えて、反応物にはさらに次のものが含まれていた。

反応物］２０　アトモルの標的 反応物２　２０　アトモルの標的 反応物３　２アトモルの標的 反応物４　２７５七ルの標的 反応物５　０．２アトモルの標的 反応物６　０．２アトモルの標的 反応物７　０．０アトモルの標的 反応物８　０．Ｏアトモルの標的 各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。各反応管は 、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｊｕ＋サイクル加熱装置で、１５回サイクル 繰り返した。加熱は、各サイクル、２分間で９０℃まで、その後、５０℃で５分 であった。各反応物（５μｌ）の８分の１を取り出し、１０μｍの負荷用バッフ ァーに加えた。標本は、３分間で９０℃まで加熱し、その後、室温に冷却して変 性した。増幅反応物は、標本を、１０％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎに、オー トラジオグラフィーによって分析した。電気泳導分離が完了する約５分前に、既 知量のオリゴヌクレオチド・ペア人’１８”ＡＰ１８”実験に使用したものと同 じ比活性のもの）を、ゲルに負荷して、増幅産物収量推定用の、標準として用い た。この標準は、レーン９（２５フ工ムトモル）、レーン１０　（２，５フ工ム トモル）、レーン１１　（０，２５フ工ムトモル）に見られる。

オートラジオグラムの写！！ｔ（第２９図）から、予想された４５マ一増幅産物 が、増幅反応の開始時にあった標的の量にたいする直接の反応として形成される ことが分かる。ゼロ分子コントロール（反応７と８、レーン７と８）には検出可 能な信号はないが、一方、最低レベルの標的（０，２アトモル、反応５と６、レ ーン５と６）からでも、４５塩基増幅産物が、オートラジオグラムから見て取れ る。反応物１−６（レーン１−６）における４５マ一増幅産物からのシグナルを 、標準（レーン９−１１）にたいして比較した結果に基づいて言うと、この反応 は、１０、　［１００倍に増幅したと推定される。これは、サイクルあたり８５ ％の平均効率を表わす。

修飾増幅産物の定量の確かさを確保するために、反応物１を連続的に希釈しく修 飾増幅産物の推定収量に基づ＜）、野生型標的標準と共に再増幅した。

反応はすヘテ、０．５　ｐ！　Ｅｐｐｅｎｄｏｔｌ管中で、全容量４０μｍのＩ ＸＴＳＬ［ｌにおいて行なった。この反応バッファーは、それぞれ２ピコモルの 増幅プローブ（＾Ｐ　１８．ｐＡＰ　１８１．　ｐＡＰ　１９．　ｐＡＰ　１９ ７゜ｐＡＰｕ、　１ｌＡＰ２０．）　、さらに１００フェムトモルの　Ｐ標識増 幅ペアへＰ　／＾Ｐ、０．０６単位のＴＳＬ、５μｇのＨＰ−ＤＮＡ１８　１８ ’ を含み、ＮＡＤにおいて６６μＭであった。上記に加えて、反応物にはさらに次 のものが含まれていた。

反応物　標的（アトモル）　修飾増幅産物（アトモル）！２　＋０　０ １８　Ｑ　１．０　［１ 各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。各反応物は 、ｌ’ｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｔ／Ｃｅｊｕｓサイクル加熱装置で、１５回サイク ル繰り返した。加熱は、各サイクル、２分間で９０℃まで、その後、５０℃で５ 分であった。各反応物（１０μｌ）の４分の１を取り出し、１０μｍの負荷用バ ッファーに加えた。標本は、３分間で９０℃まで加熱し、その後、室温に冷却し て変性した。増幅反応物は、標本を、１０％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎに、 オートラジオグラフィーによって分析した。

オートラジオグラムの写真（第３０図）から、計算値１０アトモルの修飾増幅産 物（それぞれ、反応２０と２１、レーン２０と２１）の増幅から得られるシグナ ル、および、１０アトモルの野生型標的（それぞれ、反応１２と１３、レーン１ ２と１３）のシグナルは、等しいということが分かる。このことから、反応物１ の産物推定量は正確であることが確かめられる。

反応物１から得られた修飾産物は、この後の実施例で、汚染性の増幅産物として 用いた。

この実験においては、野生型標的分子（プラスミドｐＢＨＩＧ）を、反応物１か ら得た修飾増幅産物で汚染し、次ぎに、ＫＯＨ（切断剤）かＫＣＩ　（コントロ ール）で処理した。汚染物を破壊するための切断を行なった後、標本を中和し、 ＬＣＲ増幅を行い、汚染分子が破壊されていることを確かめた。

汚染は、反応物１から得た修飾増幅産物の形で与えた。これは、（実施例７．Ａ 、で定量したように）　１μＩの反応混合物当り５フ工ムトモルの濃度である。

この標本を希釈し、所期の濃度が得られるまで、反応混合液に加えた。

水酸化カリウム（ＫＯＨ）は、脱イオン水に溶かして、７００　ｍＭ濃度の保存 液を得た。

塩化カリウム（ＫＣＩ　）は、脱イオン水に溶かして、７００１Ｍ濃度の保存液 を得た。

塩酸（）ＩＣＩ　）は、脱イオン水に溶かして、７００　ｍＭ濃度の保存液を得 た。

他の試薬はすべて実施例７．Ａ、の場合と同様であった。

標的を含む反応物（１０アトモルないし０アトモル）、汚染物（１０アトモル） 　、Ｉ（Ｐ−ＤＮＡ（５μｇ）、増幅プローブ（それぞれ２ピコモルの、＾Ｐ１ ８／９ＡＰ１８．　、　ｐＡＰ１９／ｐＡＰ１９．　、　ｐＡＰ２ｏ／ｐＡＰ２ ０．および、０．１０ピコモルの３２Ｐ標識ＡＰ１８／９ＡＰ１ｇ’　）は、１ ８μＩ容量に含まれるが、次にこれを、４μｍのＫＯＩ（またはＫＣＩ保存液の どちらか（７００ＩｎＭ、最終反応濃度が１２７園Ｍ）で処理し、３０分間で９ ０℃まで加熱して、切断反応を完了した。次ぎに、４μｍのＩ’ＩＣＩまたは、 Ｈ２０で中和し、下記のようにＬ　Ｃ，Ｒ増幅を行なった。

反応物　ＫＯＩ（ＫＣＩ　ＨＣＩ　ｌＴ２Ｏ標的（アトモル）１　４　μｍ　０ μｍ　４μｍ　０μｍ　１０２　４　μｍ　０　μｍ　４　μｍ　０μｍ［０３ ４μｍ　０　μｍ　４　μｍ　０　μｍ０４　４　μｍ　０μｍ　４μｍ　０μ ｍ０５　０μｍ　４　μｍ　０μｍ　４μｍ１０６　０μｍ　４μｍ　０μｍ　 ４μ＋　１［１１０μｍ　４　μｍ　０μｍ　４　μｍ０８　０μｍ　４　μｍ ０　μｍ　４　μｍ０次ぎに、反応物すべてを、４０μｍの最終容量になるよう にし、ＴＳＬＢにおいてｌ　ｘ、　ＨＡＤで６６ＭＭになるようにし、０．０６ 単位のＴＳＬを含んでいた。各反応物にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の 蒸発を防止した。各反応物は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＨＩＩｅｔ／Ｃｅｊｕｓサイクル 加熱装置で、１５回サイクル繰り返した。加熱は、各サイクル、２分間で９０℃ まで、その後、５０℃で５分であった。各反応物（５μｍ）の８分の１を取り出 し、１０μｍの負荷用バッファーに加えた。標本は、３分間で９０℃まで加熱し て変性した。得られた反応物は、標本を、１５％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎ に、オートラジオグラフィーによって分析した。

オートラジオグラムの写真（第３１図）から、ＫＣＩで処理した汚染標本は、１ ０アトモルの標的シグナルを与えたが（それぞれ、反応物５と６、レーン５と６ ）、このシグナルは、ゼロ・アトモルの標的シグナル（それぞれ、反応７と８、 レーン７と８）と区別できなかった。これは、１０アトモルの汚染物から生ずる 干渉性のシグナルがあることから、予想できることであった。逆に、ＫＯＨで処 理された標本では、ゼロ・アトモル標的反応物（それぞれ、反応３と４、レーン ３と４）からは、シグナルが得られないのに、１０アトモルの標的シグナル（そ れぞれ、反応１と２、レーン１と２）は、明らかにゼロよりは正である。これは 、ＫＯＨ切断剤は、汚染によって生ずる干渉性のシグナルを効果的に除去するこ とを示している。

Ｃ，ＲＮＡ５ｅ　Ａによる切断後の、ＨＩＶのＬＣＲ増幅本実施例では、ＨＩＶ の一部を、前の実施例で用いたのと同じ修飾増幅プローブ（箪２８図）を用いて 増幅した。得られた増幅産物を、切断剤としてのＲＮＡ５ｅ＾に暴露した。ＲＮ Ａ５ｅ＾は、ピリミジン残基にたいして特異的であるから、この処置は、増幅産 物の上方績だけを切断する。得られた修飾増幅産物の上方績は、２個の内部的リ ボ・ピリミジン結合を含んでいるが、一方、上方績は２個の内部的リボ・プリン 残基を含んでいる。このため、増幅プローブｐＡＰ２ｏ、は、　Ｐによって標識 されるが、この時、得られる増幅産物の上方績のみが標識される。

１１ＡＰ２０．は既に５゛燐酸基を含んでいるのであるから、　Ｐ標識は、下記 の操作により、交換キナーゼ法によって導入する。

１０単位のＴ４ポリヌクレオチド嗜キナーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ ｓｂｓ、ｔｏｅ、）を、１０μｌのバッファ　−（４０ｌ１１Ｍ　Ｔｒｉｇ、ｐ Ｈ７、５／１０　ｍｌＪ　ＭｇＣｌ２／１２．５　ｍＶ　ＤＴＤ中に、１．０ピ コモルのオリゴヌクレオチドｐＡＰ、２．５ナノモルのアデノシン５′−２０′ 燐酸（＾ＤＰ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｂｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）　、１０ ０ピコモルのγ３２ｐ−アデノシン５°　−三燐酸（ＡＴＰ、７０００　Ｃｉ／ ＋ｍｏｌｅ）を含む溶液に加えた。この反応混合物を、３７℃で３０分、次に、 ５分間で９０℃までインキュベートし、交換反応を停止した。次に標識されたオ リゴヌクレオチドを、余分の標識から分離した。

これは、反応物を、１０ｉの１−リエブ・ル重炭酸アンモニウムを溶出剤として 用い、５ｅｐｈａｄｅｔ　Ｇ−５０カラム（Ｓｉｇｍｇ　ＣｂｅｉｉｃｌＩＣａ ｍｐｕ７　）を通過させて行なった。オリゴヌクレオチドを含む分画を合わせ、 ５ｐｅｅｄＶｘｃ濃縮器（Ｓａｙａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、。

Ｆａ＋ｍｉｎｇｄｘｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ　）を用いて蒸発させた。この産 物を、２０μｍのＴＥ（５０フ工ムトモル／μｍ）で再懸濁し、測定すると、約 ３５（ｔｏ　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの比活性を持っていた。

増幅プローブ（＾Ｐ１８／ｐＡＰ１８．　、ＩＩＡＰ１９／９ＡＰ、９．　、Ｉ ＩＡＰ２ｏ／ＩＩＡＰ２ｏ、　）、熱に安定なりガーゼ（ＴＳＬ）、熱に安定な りＮＡリガーゼ・バッファー（ＴＳＬＢ）、キャリアＤＮＡ　（ＩＩＰ−ＤＩＩ Ａ）　、標的ＤＮＡ　（プラスミド、ｐＢ）１１０　）は、実施例７．Ａ、に記 載したものと同じである。

ＲＮＡ５ｅ＾（Ｓｉｇｍｇ　Ｃｈｅｌｉｃｘｌ　Ｃｏｌｌ１ｐａｎ７）を、ＴＥ ／１５０　ｍＭ中に、１０ｍｇ／＋Ｉの濃度で溶解した。汚染性ＤＮＡ５ｅ活性 は、この溶液を、沸騰水浴中で、１５分間加熱すると、破壊された。ＴＥに溶か したこの保存液のｌ／２０希釈液を下記の実験に用いた。

反応はすべて、０．５　ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で、全容量２０μｌのｌ ｘ　ＴＳＬＢにおいて行なった。この反応バッファーは、それぞれ１．０ピコモ ルの増幅プローブ（ＡＰ、８．　ｐＡＰ、８．　、　ｐＡｆ’１９．　ｐＡＰ１ ９゜、、、、３２ 、ｐＡＰ２Ｑ１ｐＡＰ２ｏ、）、さらに５Ｇフ工モトモｗｃｖ　Ｐ標ｗ４増幅プ ローブｐＡＰ　、０．　０３単位のＴＳＬ、５μｇのＨＰ−ＤＮＡ、を２０′ 含み、ＭＡＤにおいて６６　ｍＭであった。各反応物は、合計１．０５ビコモル の１ｌＡＰ２Ｇ−を含んでおり、その最終的比活性は、１６７　Ｃｉ／ｓｍｏｌ ｅであった。この標識によって、得られた増幅反応物の下方鎖を視像化する手段 が得られる。上記に加えて、反応物にはさらに次のものが含まれていた。

反応物１　０．０アトモルの標的 反応物２　０．０アトモルの標的 反応物３　１０．０　アトモルの標的 反応物４　１０．０　アトモルの標的 各試験管にミネラル・オイルを２滴加え、増幅中の蒸発を防止した。反応物は、 Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｍｅ＋／Ｃｅ１ｕｓサイクル加熱装置で、１５回サイクル繰り 返した。加熱は、各サイクル、２分間で９０℃まで、その後、５０℃で５分であ った。反応物（５μｌ）の４分の１を取り出し、５μｍの負荷用バッファーに加 えた。

次に、３分間で９０℃まで加熱し、室温に冷却して変性した。

さらに各々の反応物の４分の１（５μｍ）を取り出し、２μｍのＲＮＡ５ｅ　Ａ 溶液（１，、ＯＩｔ　ｇ　）で処理した。それぞれの反応物を、室温で６０分イ ンキュベートし、その後、各標本に、５μｍの負荷用バッファーを加え、その後 ９０℃で３分間加熱し、室温で冷却して停止した。ＲＮＡ５ｅ　Ａで処理した反 応物は、反応物１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒと名付けた。

反応産物は、標本を１０％変性ＰＡＧＥ上に走らせ、次ぎに、オートラジオグラ フィーによって分析した。オートラジオダラムの写真（第３２図）から、１０ア トモルの標的反応（それぞれ、反応３と４、ｌ、／−ン３と４）からは、予想通 り４５マーの増幅産物が得られたが、対応するゼロ標的コントロール（それぞれ 、反応１と２、レーン１と２）には、増幅産物の黴は見られなかった。逆に、Ｒ ＮＡ１ｅ　Ａで処理した標本にはいずれのものにも、４５７−増幅標本（それぞ れ、反応ＩＲ，２Ｒ，３Ｒ。

４Ｒ，レーン５．６．７．８）の黴は認められなかった。これによって、修飾増 幅産物は、ＲＮＡ５ｅ　Ａ切断剤によって効果的に破壊されることが確認された 。

ＦＩＧ、Ｉ Ｌ−リガンド修飾 Ｓ＝特異的結合パートナ− ＦＩＧ、２ Ｌ＝リガンド修飾 Ｓ＝特異的結合バートナ− ＦＩＧ、　３ ＸＬ＝架橋剤 ＦＩＧ、４ ＸＬ＝　架橋剤 ＦＩＧ、５ ＝２．＝　増幅プローブベア Ｒ５ Ｒ８；制限部位 ＶＲ３＝偽制陽部位 ｘ、ｘ’＝増幅配列と合わないヌクレオチドＦＩＧ、６ Ｒ５ ＲＳ＝制限部位 ｙＲ５＝偽制限部位 χ、Ｘ°＝増幅配列と合わないヌクレオチドＦＩＧ、７ −　ｘ　Ｐ　ＣＲプライマー ＲＳ＝　制限部位 ８．Ｘ′工増幅配列と合わないヌクレオチドＦＩＧ、８ −ｘ、−１□　ＰＣＲプライマー Ｒ５工制限部位 ｙＲ５＝偽制限部位 Ｃ３＝切断部位 ｘ、ｘ’　＝増幅配７＋１と合わないヌクレオチドＦＩＧ、９ □Ｘ□　増幅プローブペア ー　ｘ　’　− ψＲ５ 増幅配列コピー Ｒ５＝制限酵素 ｖＲ５−偽制限酵素 Ｃ５＝切断部位 ｘ、　ｘ’　＝増幅配列と合わないヌクレオチドＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、　ｌ　Ｉへ 増幅配列 Ａｓ、” ３　、ＴＡＡＣＣＴＡＣ？ＣＧＴＣＧＡＴＴｐ５　＋　３　、τＡＡＧＡＧＣＣ ＣＧＡＣＧＴＴＡＴ５　。

３１ＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＴＣＴＧｐ５　。

ｐＡＰ２“ ＦＩＧ、　Ｉ　Ｉｃ 途１プローブ 増幅産物 ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３Ａ ＦＩＧ、Ｉ５ □Ｘ□　□ｙ′□　ＰＣＲプライマー ｏｋ　Ｉ ｙＦｏｋ　Ｉ＝偽Ｆｏｋｌ制限部位 Ｃ５＝切断部位 ｘ、ｙ“＝　増幅配列と合わないヌクレオチドＦｉＧ、＋６ ｙＦｏｋ　Ｉ ＦＩＧ、Ｉ８ ＦＩＧ、　１９ ＦＩＧ、２０ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２２ ＦＩＧ、２４ ＦＩＧ、２５ レーン　７　８　９１０１１１２１３１４１５１６１７１８ＦＩＧ、２６ ＦＩＧ、２７ レーン　１２３４　５６７８ ＦＩＧ、２８ ＡＰｌ＠　ｐＡＰｌｇ　ＰＡＰ２０ ”ＣＧＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡ（ｒＧ）　ｐＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＦ ｒＧｌ　ｐＡＧｃｃＡＧＴＡＱＡＴｃｃＴ＋ｒＡ）３゜”ＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴ ＧＴＣＴＣｐ　ＴＣｒｌＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＡＣＣｐ　（υｒｌＣＧＧＴＣ ＡＴＣＴＡＧＧＡＴｐ”Ｐ”１８”　ｐＡＰｌ＋７　ｐＡＰ、。

ｐ１１１リン酸基 ｒｌｌ＋リボヌクレオチド レーン　１２３４５６７８９１０１１ ＦＩＧ、３０ １２１３１４１５１６１７　１８１９２０２１２２２３　レーンもｅ−−・・− 龜−−−４５ｂ、ｐ。

％＠＠・・・・　・・・・・・ ＦｆＧ、３ル −ン　１２３４　５６７８ ４５　ｂ、ｐ、→・・・・　・・・− ＦＩＧ、３２ 要　約　書 本発明は、増幅法における、伝搬増幅産物汚染を減少するための、効率的かつ経 済的方法を提供する。本発明は、少なくとも１個の修飾を増幅産物の中に組み込 むことによって、汚染性の（ｃｏｎｔａｉｉｎｘｎｌ　）増幅産物のもたらすバ ックグラウンドを減少ないし除去することを可能にする。この修飾された増幅産 物は、試験サンプル中の標的配列とはすぐに区別できる。新しいサンプル中の標 的配列を増幅する前に、その新しいサンプルを処理して、汚染物を選択的に除去 し、それによって、その産物が新しいサンプル中で増幅できないようにする。

国際調査報告 ；１頁の続き 優先権主張６１９９１年４月１９日＠米国（ＵＳ）＠６８６，４７８発　明　者 　ジョーンズ、シオドー　アメリカ合衆国、コブ・ウェ付４２３ ）発　明　者　スニットマン、ディピッド・エ　アメリカ合衆国、コル　リート ・３４２１ ）発　明　者　ブラウン、グレゴリ−・ニス　アメリカ合衆国、ニス・７４４７ 特表平４−５０６９０６　（４０） コロラド・８０２２６、レイクウッド、サウス・ケーｌロラド・８０３０２、ボ ウルダー、フォース・ストゴロラド・８０３０１、ボウルダー、パーク・プレイ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）少なくとも１個の修飾を増幅産物に組み込み、得られた修飾増幅産物 が標的配列から区別できるようにし；（ｂ）上記修飾増幅産物を該修飾増幅産物 を選択的に除去する手段に接触させる； ことから成る、増幅法における増幅産物汚染を減少させる方法。 ２．前記修飾が、リガンド、架橋結合剤、酵素認識部位、および、化学的に切断 可能な部位、から成るグループから選ばれる請求項１の方法。 ３．前記修飾が酵素認識部位であり、前記修飾増幅産物を選択的に除去する手段 が酵素である請求項２の方法。 ４．前記酵素認識部位がＲＮＡｓｅ認識部位であり、前記修飾増幅産物を選択的 に除去する前記手段がＲＮＡｓｅである請求項３の方法。 ５．前記ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅＨ，及びＲＮＡｓｅＡから成るグループから 選ばれる請求項４の方法。 ６．前記ＲＮＡｓｅがＲＮＡｓｅＡである請求項５の方法。 ７．前記酵素認識部位が、制限酵素認識部位であり、前記修飾増幅産物を選択的 に除去する手段が、制限酵素である請求項３の方法。 ８．前記制限酵素認識部位が隔離切断制限酵素によって認識される請求項７の方 法。 ９．前記隔離切断制限酵素がＦｏｋＩである請求項８の方法。 １０．前記修飾がリガンドであり、前記修飾増幅産物を選択的に除去する前記手 段が前記リガンドにたいして特異的に結合する固定パートナーである請求項２の 方法。 １１．前記リガンドがビオチンとフルオレセインから成るグループから選ばれた ものである請求項１０の方法。 １２．前記修飾が架橋結合剤であり、前記修飾増幅産物を選択的に除去する前記 手段が、前記架橋結合剤にたいする活性化剤である請求項２の方法。 １３．前記修飾が化学的に切断可能な部位である請求項２の方法。 １４．前記化学的に切断可能な部位が、増幅プローブに組み込まれており、部分 的プローブ配列の３′と５′末端を、ジチオビス（サクシニミジル−プロピオネ ート）、ジサクシニミジルータータレート及びグリコビス（サクシニミジルサク シネート）から成るグループから選ばれる相同二官能結合試薬をもって結合する ことにより増幅プローブに組み込まれている請求項１３の方法。 １５．化学的切断可能な部位が内部リボヌクレオチド結合である請求項１３の方 法。 １６．前記増幅法が、ポリメラーゼ連鎖タイプの増幅法であるか、リガーゼ連鎖 反応タイプの増幅法である請求項１の方法。 １７．（ａ）少なくとも１個の修飾をＰＣＲ由来増幅産物中に取り込むことがで きる、少なくとも１個の修飾増幅プライマーであって、得られた修飾ＰＣＲ由来 増幅産物が、標的配列と区別できるようなものであるもの；及び（ｂ）前記修飾 ＰＣＲ由来増幅産物を選択的に除去するための手段； から成るポリメラーゼ連鎖反応タイプの増幅法に使用されるキット。 １８．前記修飾増幅プライマーが、リガンド修飾による増幅プライマー、架橋結 合剤修飾による増幅プライマー、酵素認識部位修飾による増幅プライマー及び化 学的に切断可能な部位のあることによって修飾されている増幅プライマーから成 るグループから選ばれる請求項１７のキット。 １９．前記修飾増幅プライマーが酵素認識部位修飾増幅プライマーであり、前記 ＰＣＲ由来修飾増幅産物を選択的に除去する前記手段が酵素である請求項１８の キット。 ２０．前記酵素認識部位が、ＲＮＡｓｅ認識部位であり、前記ＰＣＲ由来修飾増 幅産物を選択的に除去する前記手段がＲＮＡｓｅである請求項１９のキット。 ２１．前記ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅＨ，及びＲＮＡｓｅＡから成るグループか ら選ばれた請求項２０のキット。 ２２．前記ＲＮＡｓｅがＲＮＡｓｅＡである請求項２１のキット。 ２３．前記酵素認識部位が制限酵素認識部位であり、前記ＰＣＲ由来修飾増幅産 物を選択的に除去する前記手段が制限酵素である請求項１９のキット。 ２４．前記制限酵素認識部位が隔離切断制限酵素によって認識される請求項２３ のキット。 ２５．前記隔離切断制限酵素がＦｏｋＩである請求項２４のキット。 ２６．前記修飾増幅プライマーが化学的に切断可能な部位の存在によって修飾さ れた増幅プライマーであり、前記ＰＣＲ由来修飾増幅産物を除去する前記手段が 強塩基である請求項１８のキット。 ２７．前記修飾増幅プライマーがリボヌクレオチド置換を含む請求項１８のキッ ト。 ２８．前記リボヌクレオチド置換が前記修飾増幅プライマーの３′末端にある請 求項２７のキット。 ２９．（ａ）デオキシヌクレオシド三燐酸の混合物であってそのデオキシヌクレ オシド三燐酸の少なくとも一つが、得られた修飾ＰＣＲ由来増幅産物が標的配列 と区別できるようにＰＣＲ由来増幅産物に少なくとも１個の修飾を組み込むよう に修飾されているもの；及び （ｂ）前記修飾ＰＣＲ由来増幅産物を選択的に除去する手段；から成るポリメラ ーゼ連鎖反応タイプの増幅法に使用されるキット。 ３０．前記修飾デオキシヌクレオシド三燐酸が、リガンド修飾によるデオキシヌ クレオシド三燐酸、架橋結合剤修飾によるデオキシヌクレオシド三燐酸、酵素認 識部位修飾によるデオキシヌクレオシド三燐酸及び、化学的に切断可能な部位の あることによって修飾されているデオキシヌクレオシド三燐酸から成るグループ から選ばれる請求項２９のキット。 ３１．前記酵素認識部位がデオキシリボヌクレオシド三燐酸であり、前記ＰＣＲ 由来増幅産物を選択的に除去する前記手段がＲＮＡｓｅである請求項３０のキッ ト。 ３２．前記修飾デオキシヌクレオシド三燐酸がデオキシリボヌクレオシド三燐酸 であり、前記ＰＣＲ由来修飾増幅産物を選択的に除去する前記手段が強塩基であ る請求項３０のキット。 ３３．（ａ）少なくとも１個の修飾増幅プローブであって、得られた修飾ＬＣＲ 由来増幅産物が標的配列と区別できるように少なくとも１個の修飾をＬＣＲ由来 増幅産物に組み込むことができるもの；及び （ｂ）前記修飾ＬＣＲ由来増幅産物を選択的に除去する手段；から成る、リガー ゼ連鎖反応タイプの増幅法に使用されるキット。 ３４．前記修飾増幅プローブが、リガンド修飾による増幅プローブ、架橋結合剤 修飾による増幅プローブ、酵素認識部位による修飾増幅プローブ、および、化学 的に切断可能な部位のあることによって修飾されている増幅プローブから成るグ ループから選ばれる請求項３３のキット。 ３５．前記修飾増幅プローブが酵素認識部位修飾増幅プローブであり、前記ＬＣ Ｒ由来修飾増幅産物を選択的に除去する前記手段が酵素である請求項３４のキッ ト。 ３６．前記酵素認識部位がＲＮＡｓｅ認識部位であり、前記ＬＣＲ由来修飾増幅 産物を選択的に除去する前記手段がＲＮＡｓｅであるもの請求項３５のキット。 ３７．前記ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅＨ及びＲＮＡｓｅＡから成るグループから 選ばれた請求項３６のキット。 ３８．前記ＲＮＡｓｅがＲＮＡｓｅＡである請求項３７のキット。 ３９．前記酵素認識部位が制限酵素認識部位であり、前記修飾ＬＣＲ由来増幅産 物を選択的に除去する前記手段が制限酵素である請求項３５のキット。 ４０．前記制限酵素認識部位が隔離切断制限酵素によって認識される請求項３９ のキット。 ４１．前記隔離切断制限酵素がＦｏｋＩであるもの請求項４０のキット。 ４２，前記修飾増幅プローブが化学的に切断可能な部位の存在によって修飾され る増幅プローブであり、前記ＬＣＲ由来修飾増幅産物を除去する前記手段が強塩 基である請求項３４のキット。 ４３．前記修飾増幅プローブがリボヌクレオチド置換を含む請求項３４のキット 。 ４４．前記リボヌクレオチド置換が前記修飾増幅プライマーの３′末端にある請 求項４３のキット。 ４５．（ａ）増幅配列を、過剰な少なくとも２個の増幅プライマーと、過剰なデ オキシヌクレオシド三燐酸と、重合剤の存在下に、前記増幅配列に対する前記増 幅プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、接触させ、前記増 幅プライマーおよび／または前記デオキシヌクレオシド三燐酸の少なくとも一つ に、リガンド、架橋結合剤、酵素認識部位、化学的に切断可能な部位から成るグ ループから選ばれる修飾が組み込まれており、 （ｂ）修飾増幅産物を形成させ、 （ｃ）前記修飾増幅産物の前記標的配列からの分離を実行し、（ｄ）（ａ）から （ｄ）までの諸手順を繰り返し、（ｅ）前記修飾増幅産物を前記修飾増幅産物を 選択的に除去する手段に接触させること； から成る、標的増幅配列を増幅する方法。 ４６．手順（ｅ）が増幅操作の最初に行なわれる請求項４５の方法。 ４７．（ａ）増幅配列を、過剰な少なくとも２ペアの増幅プローブと、結合剤の 存在下に、前記増幅配列に対する前記増幅プローブのハイブリダイゼーションを 促進する条件下で、接触させ、前記増幅プローブの少なくとも一つに、リガンド 、架橋結合剤、酵素認識部位、化学的に切断可能な部位から成るグループから選 ばれる修飾が組み込まれており、（ｂ）修飾増幅産物を形成させ、 （ｃ）前記修飾増幅産物の前記標的配列からの分離を実行し、（ｄ）（ａ）から （ｄ）までの諸手順を繰り返し、（ｅ）前記修飾増幅産物を前記修飾増幅産物を 選択的に除去する手段に接触させること； から成る、標的増幅配列を増幅する方法。 ４８．手順（ｅ）が増幅操作の最初に行なわれる請求項４７の方法。