NO300782B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve Download PDF

Info

Publication number
NO300782B1
NO300782B1 NO893583A NO893583A NO300782B1 NO 300782 B1 NO300782 B1 NO 300782B1 NO 893583 A NO893583 A NO 893583A NO 893583 A NO893583 A NO 893583A NO 300782 B1 NO300782 B1 NO 300782B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nucleic acid
primer
promoter
sequence
detected
Prior art date
Application number
NO893583A
Other languages
English (en)
Other versions
NO893583D0 (no
NO893583L (no
Inventor
Harvey I Miller
Sean A Johnston
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22517472&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO300782(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of NO893583D0 publication Critical patent/NO893583D0/no
Publication of NO893583L publication Critical patent/NO893583L/no
Publication of NO300782B1 publication Critical patent/NO300782B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter en promoter operabelt koblet til en sekvens som skal bli detektert og en fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve inneholdende nukleinsyre.
Utviklingen innenfor det generelle området molekylær biologi har muliggjort påvisning av spesifikke nukleinsyresekvenser som er av klinisk og kommersiell viktighet. Analyser av nukleinsyresekvenser fra forskjellige humane gener har for eksempel vist unike sekvensendringer som er assosiert med spesifikke sykdommer. Sekvenser innenfor genomet til forskjellige patogener som på en unik måte karakteriserer hver organisme og sjeldner disse fra til og med nært beslektede arter, er på lignende måte identifisert. Tilgjen-geligheten av slik sekvensinformasjon har gjort det mulig å diagnostisere sykdommer på genetisk nivå.
Den mest vanlige metode for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens er hybridisasjon. Denne metoden drar nytte av evnen som en nukleinsyresekvens har til å danne et stabilt ikke-kovalent kompleks med en komplementær nukleinsyresekvens. For å bestemme om en spesifikk nukleinsyresekvens er tilstede i en testprøve, blir en komplementær nuklein-syreprobe preparert, merket med en påvisbar kjemisk modifikasjon og deretter satt til testprøven. Hvis sekvensen som skal bli påvist er tilstede, vil den merkede proben bli hybridisert til denne, og den påvisbare markøren tilveiebringer en måte for bestemming på en kjent måte om hybridisasjonen har oppstått og i hvilken grad den har oppstått.
En hovedbegrensning ved anvendelse av foreliggende hybridisa-sjonsfremgangsmåte for bestemming av en nukleinsyre i en testprøve, er at de ikke er følsomme nok og derfor krever en relativt stor mengde prøve for å kunne verifisere tilstedeværelsen av en spesifikk nukleinsyresekvens nøyaktig. Denne begrensningen fører til betraktelig praktiske vanskeligheter i et klinisk oppsett på grunn av den begrensende mengde prøve som vanligvis er tilgjengelig for analyse. Det er derfor blitt fokusert på utvikling av metoder for forbedring av følsomheten til hybridisasjonsmetoder for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve, og dermed utvide anvendelsen derav innen det diagnostiske området.
En generell tilnærming for å forbedre følsomheten til hybridisasjonsmetoden har vært å øke signalet som blir dannet av hybridisasjonsproben. Metoder er for eksempel blitt beskrevet for preparering av nukleinsyreprober merket med høy spesifikk aktivitet med radioaktive markører, enten ved nick-translasjon (Rigby et al., 1977, J. Mol. Biol. 113:237) eller ved SP6 transkripsjon (Melton et al., 1984, Nuc. Åcids Res. 12:7035).
Schneider et al., PCT patentpublikasjon W0 87/03622, beskriver anvendelse av multiple signaldannende sekundære prober hvori hver kan bli bundet til en primær probe som har hybridisert til en DNA eller RNA-sekvens av interesse, for en måte for amplifisering av signalet dannet ved hybridisasjonen.
Chu et al., PCT patentpublikasjon WO 87/06270, beskriver anvendelse av "replikativt RNA", alene eller sammen med et affinitetsmolekyl, som en nukleinsyrehybridisasjonsprobe og anvendelse av en RNA-avhengig RNA-polymerase for å replikere og dermed øke signalet dannet av bundet probe-RNA.
Rodland et al., US-patentpublikasjon nr. 4.647.529, lærer anvendelse av tionukleotider som når de er inkorporert inn i en hybridisasjonsprobe, øker mengden av bindingen mellom proben og nukleinsyresekvensen som skal bli påvist.
I kontrast til de vesentlige forsøkene som er blitt utført for å øke følsomheten til probepåvisningsmetoder, er det utført relativ liten forskning på metoder for å amplifisere nukleinsyresekvensen som skal bli påvist i en testprøve slik at den blir produsert i tilstrekkelig mengder som kan bli påvist ved for tiden tilgjengelige hybridisasjonsmetoder.
Mullis et al., US-patent nr. 4.683.195, lærer en fremgangsmåte for amplifisering av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve ved anvendelse av to oligonukleotid-primere og syntese av primer-ekstensjonsprodukter. Ekstensjonsproduktet til en primer blir, når det blir hybridisert til den andre primeren, et templat for produksjon av den ønskede spesifikke nukleinsyresekvensen og vise versa, og denne fremgangsmåten blir gjentatt så ofte som det er nødvendig for å produsere den ønskede mengden av den spesifikke sekvensen.
Mullis, et. al. lærer også anvendelse av denne amplifika-sjonsmetoden for å fremstille store mengder av en rekombinant nukleinsyre ved anvendelse av primere hvorpå en ikke-komplementær sekvens er ligert. Mullis et al. beskriver ligering av en nukleotidsekvens for en promoter, linker eller kodende sekvens til en eller begge primere, hvorpå den ikke-komplementære sekvensen blir amplifisert sammen med test-prøve-nukleinsekvensen. På denne måten blir en stor mengde av en rekombinant nukleinsyre produsert bestående av en eksisterende testprøve-nukleinsyresekvens ligert til en valgt eksogen nukleinsyresekvens.
Essensen i fremgangsmåten til Mullis et al. er derfor amplifikasjonen til en ønsket nukleinsyresekvens i form av komplementære primer-ekstensjonsprodukter. På grunn av at hvert primer-ekstensjonsprodukt som blir dannet, virker som templat for syntese av enda et annet primer-ekstensjonsprodukt, skal multiple repitisjoner av Mullis et al. primer-ekstensjonprosedyre teoretisk resultere i akkumulasjon av den ønskede sekvensen i en eksponensiell hastighet relativt til antallet reaksjonscykluser. Biprodukter som blir dannet ved primer-hybridisasjonene som er forskjellige fra de som ventes, er derimot ikke selv-katalytiske og bør dermed akkumulere i en lineær hastighet.
Spesifisiteten og nøyaktigheten av prosessen til Mullis et al. er derfor svært avhengig av den vesentlig økte syn-tesehastigheten til den ønskede nukleotidsekvensen relativt til biproduktene. I praksis blir det derimot observert at akkumulasjon av biproduktene kan forløpe i en mye høyere hastighet enn det som antas ved teoretiske beregninger. Mullis et al. beskriver for eksempel anvendelse av deres fremgangsmåte for å amplifisere en del av det humane beta-hemoglobingenet som er tilstede i en prøve inneholdende humant genomisk DNA, og finner på grunn av ampi ifikasjon av andre sekvenser innenfor genomet bare 1% av den endelige resulterende populasjonen av amplifiserte sekvenser som korresponderer med den ønskede sekvensen.
I den grad fremgangsmåten til Mullis et al. resulterer i amplifikasjon av nukleinsyresekvenser bortsett fra den som er ønsket, analyserer metoden en større mengde av den ønskede nukleinsyresekvensen enn det som er tilstede i testprøven og produserer falske positive resultater. Det er derfor en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for spesifikk og kvantitativ amplifisering av en ønsket nukleinsyresekvens i en testprøve og dermed forbedre følsomheten til påvisningen av den ønskede sekvensen, mens problemene med falske positive unngås og også andre unøyaktige resultater som oppstår innenfor eksisterende teknologi.
Fremgangsmåten til Mullis et al. betrakter derfor multiple cykluser av primer-hybridisasjon og primer-ekstensjonssyn-teser som resulterer i mye arbeid eller dyre automatiserings-kostnader. Automatisering av prosessen til Mullis et al. nødvendiggjør ikke bare anvendelse av spesialisert utstyr men også anvendelse av et spesialisert reagens, en varme-stabil DNA-polymerase og reaksjonsbetingelser som er skreddersydd til hvert analytt-testsystem for at primer-hybridisasjonen og primer-ekstensjonssyntesetrinnene kan bli utført kontinuerlig. Det er derfor en ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve som er hurtig å lett å utføre uten dyre, mange repeterende reaksjonstrinn, spesialisert utstyrt og reagenser eller omfattende forandring av reaksjonsbetingelser for hver forskjellige testprøve.
Hensikten med oppfinnelsen blir tilveiebragt ved en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art som omfatter å: (a) tilveiebringe en oligonukleotidpromoter-primer; (b) kontakte nevnte promoter-primer med en nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal bli detektert under betingelser som muliggjør hybridisering av promoter-primeren til nukleinsyresekvensen som skal bli detektert; (c) syntetisering av et ekstensjonsprodukt fra 3'-enden av promoter-primeren, i det ekstensjonsproduktet er komplementært med nukleinsyresekvensen som skal bli detektert; (d) kontakte produktet ifølge trinn (c) med et middel som
har 3'-5' eksonukleaseaktivitet og
(e) syntetisering av et ekstensjonsprodukt fra 3'-enden av sekvensen som skal bli detektert, i det ekstensj onsproduktet er komplementært med promoteren til promoter-primereren, hvori promoter-primeren ifølge trinn (a) er den eneste primeren som blir anvendt.
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot forbedrede frem-gangsmåter for bestemming av tilstedeværelse av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve.
Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre en fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve inneholdende nukleinsyre, kjennetegnet ved at man syntetiserer flerfoldige RNA-transkripter fra en dobbelt-trådet nukleinsyre fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, hvori hvert RNA-transkript omfatter en RNA-sekvens som korresponderer med den spesifikke nukleinsyresekvensen som skal påvises, og bestemmer tilstedeværelsen av nevnte RNA-sekvens.
Fordelen tilveiebragt ved amplifikasjon i form av RNA-transkripter i steden for DNA-primer-ekstensjonsprodukter er at syntese av RNA-transkripter, i nærvær av et enzym for polymerisasjon og ribonukleosidtrifosfåter, oppstår kontinuerlig, og produserer dermed et hvilket som helst ønsket nivå av amplifikasjon av nukleinsyresekvensen som skal påvises uten å måtte ty til repeterende cykluser av krevende og ofte feilaktige primer-hybridisasjonsreaksjoner. Fig.l Illustrerer hybridisasjon av en oligonukleotid-promoter-primer til en spesifikk sekvens som skal påvises innenfor en enkelt-trådet nukleinsyre, syntese av en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og promoteren til promoter-primer, og syntese av mangfoldige RNA-transkripter fra dobbelt-trådet nukleinsyre, under kontroll av promoteren. Fig.2 illustrerer en utførelsesform av oppfinnelsen hvori en oligonukleotidpromoter-primer blir anvendt sammen med en oligonukleotidsekundær primer for å produsere en dobbelt-trådet nukleinsyre inneholdende sekvensen som skal påvises og promoteren til promoter-primeren. Promoter-primeren blir hybridisert til sekvensen som skal påvises innenfor en enkelt-trådet nukleinsyre og den sekundære primeren blir hybridisert til en sekvens innenfor promoter-primer-ekstensjonsproduktet som er komplementær til sekvensen som skal påvises. Det resulterende produktet er en dobbelt-trådet nukleinsyre, hvori en tråd omfatter et oligonukleotid-promoter-primerekstensjonsprodukt, og den andre tråden omfatter et oligonukleotidsekundært primer-ekstensjonsprodukt og RNA-transkriptene blir syntetisert fra denne under kontroll av promoteren.
Fig. 3 Illustrerer en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen hvori en oligonukleotid-promoter-primer blir anvendt sammen med en oligonukleotidsekundær primer. I dette tilfellet blir oligonukleotidsekundær-primeren hybridisert til sekvensen som skal påvises innenfor en enkelt-trådet nukleotidsyre og oligonukleotidpromoter-primeren blir hybridisert til en sekvens innenfor det sekundære primer-ekstensjonsproduktet som er komplementært til sekvensen som skal påvises.
Betegnelsen "promoter" som anvendt heri betegner en nukleinsyresekvens hvorpå RNA-polymeraseenzymet blir bundet og initierer syntese av RNA-transkriptet. Promoteren er fortrinnsvis en dedikert promoter, og RNA-polymerase er fortrinnsvis en dedikert RNA-polymerase. Betegnelsen "dedikert" refererer til evnen som promoteren har til å bli gjenkjent vesentlig bare av en RNA polymerase i forhold til den som vanligvis er tilstede i testprøven som skal bli analysert. Dedikert RNA-polymerase vil bare bindes til, eller fortrinnsvis til, den dedikerte promoteren i forhold til andre promotere som er tilstede i testprøven, og syntetisere RNA-transkripter av en hvilken som helst nukleinsyresekvens beliggende nedstrøms fra promoteren. Kombinasjonen av en dedikert promoter og en dedikert RNA-polymerase resulterer i en uvanlig spesifikk promoter RNA-polymerase interaksjon .
Dedikert promoter og dedikert RNA-polymerase tilveiebringes fra samme kilde som for eksempel bakteriofag T7 eller bakteriofag SP6. Når det gjelder både T7 og SP6, initierer fagkodet RNA polymerase effektivt syntesen av RNA-transkripter bare ved beslektet fagpromoter. RNA transkripter som er et resultat av initiering ved andre prokaryote eller eukaryote promotere, observeres sjeldent. Transkripsjonsreak-sjonen, bestående av en enkelt saltbuffer, dobbelt-trådet nuklelnsyretemplat, ribonukleosidtrifosfater og fag RNA polymerase, resulterer i hurtig syntese av store mengder RNA. Promoteren blir valgt etter ønske eller nukleotidsekvensen derav modifisert i forhold til den native sekvensen for å minske ytterligere hybridisasjon til eventuelle kjente sekvenser i testprøve-DNA-et.
Betegnelsen "primer" som anvendt heri, referer til en oligonukleotidsekvens enten den oppstår naturlig eller blir produsert syntetisk, som i vesentlig grad er komplementær eller homolog til hele eller deler av en nukleotidsekvens som skal påvises. Primeren må være tilstrekkelig lang for å hybridisere med en templat nukleinsyre inneholdende sekvensen som skal påvises eller komplementet derav, og for å påbegynne syntesen av et ekstensjonsprodukt i nærvær av et middel for polymerisasjon. Den nøyaktige lengden på primeren avhenger av mange faktorer, omfattende hybridisasjon og primer-eksten-sjons-syntesereaksjonsbetingelser, og sammensetningen av den spesifikke nukleinsyresekvensen som skal påvises. Primeren inneholder vanligvis 10-25 nukleotider til tross for at den også kan inneholde færre nukleotider. Det er derimot ikke nødvendig at primeren reflekterer den nøyaktige sekvensen til nukleinsyresekvensen som skal påvises eller komplimentet derav. For eksempel kan ikke-komplementærbare baser bli flettet inn i primeren, eller så kan komplementære baser bli deletert fra primeren, forutsatt at primeren kan hybridisere spesifikt med nukleinsyresekvensen som skal påvises, eller komplimentet derav, under de valgte betingelsene.
Betegnelsen "promoter-primer" som anvendt heri, referer til et oligonukleotid enten det oppstår naturlig eller blir produsert syntetisk som omfatter promoter bundet til 5'-enden av en primer. Under egnede betingelser, og i nærvær av et middel for polymerisasjon, kan promoter-primeren virke som et initieringspunkt til et promoter-primer-ekstensjonsprodukt som omfatter nukleinsyresekvensen som skal påvises, eller den komplementære sekvensen derav, og promoteren til promoter-primeren. Promoter-primeren er fortrinnsvis enkelt-trådet for maksimal effektivitet ved hybridisasjon, men kan alternativt være dobbet-trådet. Hvis den er dobbelt-trådet, blir promoter-primeren først behandlet for å separere trådene før den blir anvendt for å fremstille ekstensjonsproduktene.
Betegnelsen "sekundær primer" som anvendt heri, betegner et oligonukleotid uansett om det oppstår naturlig eller blir produsert syntetisk, som under egnede betingelser og i nærvær av et middel for polymerisasjon, kan virke som et initieringspunkt for et sekundært primer-ekstensjonsprodukt som omfatter nukleinsyresekvensen som skal påvises eller komplimentet derav. Den sekundære primeren er fortrinnsvis enkelt-trådet for maksimal hybridisasjonseffektivitet, men kan alternativt være dobbelt-trådet. Hvis den er dobbelt-trådet, blir den sekundære primeren først behandlet for å separere trådene før den blir anvendt for å preparere ekstensjonsproduktene. Den sekundære primeren kan bestå av en hvilken som helst nukleotidsekvens som er vesentlig komplementær eller homolog til hele eller en del av en nukleinsyresekvens som skal påvises, men den blir fortrinnsvis valgt slik at den ikke er komplementær til promoter-primeren.
Betegnelsen "probe" som anvendt heri, referer til et oligonukleotid som enten oppstår naturlig eller som blir produsert syntetisk, som enten er homolog eller komplementær til hele eller en del av en nukleinsyresekvens som skal påvises. Proben blir fortrinnsvis valgt slik at den under hensiktsmessige betingelser kan hybridiseres spesifikt til RNA-transkripter av nukleinsyresekvensen som skal påvises.
Betegnelsen "oligonukleotid" som anvendt heri referer til primere og prober og er definert som et nukleinsyremolekyl omfattende to eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider. Et ønsket oligonukleotid kan bli fremstilt ved en hvilken som helst egnet metode, så som rensing fra en naturlig forekommende nukleinsyre eller de novo-syntese. Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen, for eksempel for syntese av oligonukleotider fra nukleosid-derivater, ved anvendelse av forskjellige teknikker innenfor organisk kjemi. En type organisk syntese er fosfotriestermetoden, hvori fosfotriesternukleosider blir bundet sammen for å danne et nukleotid med en ønsket sekvens (Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90). Andre metoder innen organisk syntese som er blitt beskrevet, omfatter anvendelse av fosfodiester-nukleosider (Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109), eller fosforamidatnukleosider (Caruthers et al., 1985, Meth. Enzymol. 154:287). Oligonukleotider syntetisert ved en hvilken som helst av disse metodene kan deretter bli bundet sammen for å danne et enkelt oligonukleotid med en hvilken som helst nødvendig lengde og sekvens. Alternativt blir oligonukleotidene produsert ved in vitro transkripsjonen amplifikasjon, ved kloning i vertsceller eller ved utvinning fra naturlige kilder ved anvendelse av hensiktsmessige restriksjonsenzymer.
Betegnelsen "RNA transkript" som anvendt heri, refererer til et ribonukleinsyremolekyl syntetisert av et RNA-polymerase-enzym under kontroll av promoteren til promoter-primeren. RNA-transkriptet til en spesifikk nukleinsyresekvens som skal påvises, er enten homolog eller komplementær til den sekvensen, avhengig av beskaffenheten til promoter-primeren.
Betegnelsen "ekstensjonsprodukt" som anvendt heri, refererer til et nukleinsyremolekyl, idet syntesen derav blir initiert ved den 3'-OH-terminale enden til en primer ved anvendelse av et templat for syntese av nukleinsyremolekylet som primeren er hybridisert til.
Betegnelsen "middel for polymerisasjon" som anvendt heri, referer til et hvilket som helst enzym som katalyserer syntese av et nukleinsyremolekyl fra deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, ved anvendelse av en eksisterende nukleinsyre som et templat.
En hvilken som helst nukleinsyrekilde, i renset eller ikke-renset form, kan bli anvendt som testprøve. For eksempel kan testprøven være en matvare eller et jordbruksprodukt, eller et humant eller veterinærklinisk emne. Testprøven er vanligvis en biologisk væske så som urin, blod, plasma, serum, spytt eller lignende. Nukleinsyren som skal påvises i testprøven er DNA eller ENA, omfattende messenger-RNA, fra en hvilken som helst kilde omfattende bakterier, gjær, virus og celler eller vev fra høyere organismer så som planter eller dyr. Metoder for ekstraksjon og/eller rensing av slike nukleinsyrer er blitt beskrevet for eksempel av Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Earbor Laboratory, 1982).
Nukleinsyresekvensen som skal påvises i testprøven, kan opprinnelig være tilstede som et diskret molekyl, slik at sekvensen som skal påvises utgjør hele nukleinsyren eller bare være en komponent av et større molekyl. Det er ikke nødvendig at nukleinsyresekvensen som skal påvises opprinnelig er tilstede i en ren form. Testprøven kan inneholde en omfattende blanding av nukleinsyrer, hvor nukleinsyresekvensen som skal påvises omfatter en mindre fraksjon. For eksempel kan nukleinsyresekvensen som skal påvises kor-respondere med et onkogen innbefattet i totalt humant genomisk DNA, eller en del av nukleinsyresekvensen til en patogen organisme hvor organismen er en mindre komponent av en klinisk prøve.
En hvilken som helst nukleinsyresekvens kan bli påvist i foreliggende oppfinnelse. Det er bare nødvendig at et tilstrekkelig antall nukleotider av sekvensen er kjent, slik at minst én eller fortrinnsvis to primere kan bli preparert og som kan hybridisere med nukleinsyresekvensen som skal påvises eller komplementet derav. Nukleinsyresekvensen som skal påvises kan bli bekreftet ved en hvilken som helst kjent metode for nukleinsyresekvensering for eksempel, eller kan bli forutsatt basert på bestemming av proteinsekvensen. Desto større kunnskapen angående nukleinsyresekvensen som skal påvises er, desto større kan spesifisiteten til de valgte primerne være og dermed blir oppfinnelsen mere nøyaktig.
Tilstrekkelig sekvensinformasjon bør være tilgjengelig for eksempel for å muliggjøre seleksjon av en promoter-primer som spesifikt vil hybridisere med nukleinsyresekvensen som skal påvises eller komplementet derav, men ingen annen sekvens i testprøven under de valgte hybridisasjonsbetingelsene. Hvis både en promoter-primer og en sekundær-primer skal bli anvendt, er det ønskelig at nukleisyresekvensen som skal påvises er kjent i en slik grad at primerne kan velges slik at de ikke er komplementære til hverandre.
Ved referanse til metodene illustrert i figurene 1-3, har hver som begynnende trinn, fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og en promoter. Separering av denne dobbelt-trådede nukleinsyren omfatter generelt syntese av et promoter-primer-ekstensjonsprodukt og eventuelt et sekundært primer-ekstensjonsprodukt ved anvendelse som et templat en enkelt-trådet nukleinsyre som primeren har hybridisert til. Avhengig av om en prometer-primer blir anvendt alene eller i kombinasjon med en sekundær primer vil templatet derfor omfatte en testprøvenukleinsyre som inneholder sekvensen som skal påvises eller et tidligere syntetisert primer-ekstensjonsprodukt som inneholder komplementet til nukleinsyresekvensen som skal bli påvist.
Hvis templatet opprinnelig er innbefattet i den dobbelt-trådede nukleinsyren, er det nødvendig å separere trådene til nukleinsyren før eller samtidig med syntesen av et primer-ekstensjonsprodukt. Separasjon av trådene blir helst utført ved varmedenaturering, hvori testprøven blir oppvarmet til omtrent 90-100°C i tidspunkter varierende fra 1-10 minutter, til tross for at andre fysiske, kjemiske eller enzymatiske denatureringsprosedyrer kan bli anvendt.
Primer-hybridisasjon blir vanligvis utført i en buffret vandig oppløsning, hvori betingelsene så som temperatur, saltkonsentrasjoner og pH blir valgt for å tilveiebringe tilstrekkelig stringens slik at primeren vil hybridiseres spesifikt til nukleinsyresekvensen som skal påvises eller komplementet derav, men ikke til en hvilken som helst annen sekvens. Generelt vil effektiviteten til hybridisasjon mellom primer og templat bli forbedret under betingelser hvor mengden av primer som blir tilsatt er i molart overskudd i forhold til templatet, fortrinnsvis 1000 til IO<6> molart overskudd. Det er derimot innlysende at mengden av templat i testprøven ikke behøver å være kjent, slik at mengden av primer relativt til templat ikke med sikkerhet kan bli bestemt.
Fig. 1A-G illustrerer en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori en promoter-primer blir anvendt for å fremstille en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal bli bestemt og en promoter.
I fig. IA er primer c til promoter-primer c d vist hybridiserende med nukleinsyresekvensen som skal påvise b som del av nukleinsyre a, gjennom ikke-kovalent baseparring e av komplementære nukleotidsekvenser. Promoter d til promoter-primeren, fortrinnsvis valgt slik at den ikke er komplementær til en hvilken som helst kjent nukleinsyresekvens i test-prøven, forblir uhybridisert.
Påfølgende tilsetning av en polynukleotidpolymerase f, i nærvær av nukleosidtrifosfater, resulterer (fig. 1B-C) i syntese av et promoter-primer-ekstensjonsprodukt g, initierende ved 3'-enden av primeren og fortsetter i 5'-retningen langs det enkelt-trådede templatet, idet templatet består av testprøvenukleinsyresekvens a flankerende på 5'-siden av sekvens b hvori primeren opprinnelig er hybridisert til. Primer-ekstensjonsproduktet er dermed komplementær til nukleinsyresekvensen som skal påvises og 5'-flankerende testprøve nukleinsyresekvensen, hvis noen, som danner et dobbelt-trådet molekyl.
I nærvær av et middel med 3'-5'-eksonukleaseaktivitet h, blir den enkelt-trådede sekvensen ved 3'-enden til testprøve-nukleinsyren, hvis noen, spaltet ut som vist i fig. ID, og erstattet med en ny nukleinsyre (fig. 1E-G), idet syntesen derav blir initiert av en polynukleotid-polymerase f ved 3'-enden av testprøve-nukleinsyren ved anvendelse av promoteren som templat for promoter-primer.
Fremgangsmåten angitt i fig. 1A-G for dannelsen av et dobbelt-trådet molekyl som omfatter sekvensen som skal påvises og en promoter avhenger av hybridisasjon av en promoter-primer til nukleinsyresekvensen som skal påvises og påfølgende trinn for promoter-primer-ekstensjonssyntese, nukleinsyreuttagning og erstatningssyntese. Til tross for at uttagningsreaksjonen kan bli utført ved hjelp av et middel h som er forskjellig fra det som ble anvendt for promoter-primer-ekstensjonssyntesen og erstatningssyntesen f, er det ønskelig å anvende et enkelt middel slik at syntese av det dobbelt-trådede produktet kan bli utført kontinuerlig etter promoter-primer-hybridisasjon. Polynukleotidpolymerasen er dermed fortrinnsvis slik at den både har 5'-3'-polymerase-aktivitet og 3'-5'-eksonukleaseaktivitet, så som for eksempel E. coli DNA polymerase I, Klenow-fragment til E. coli DNA polymerase I og T4 DNA polymerase. På grunn av at disse enzymene krever et DNA-templat for primer-ekstensjonssyntese, er det innlysende at anvendelse derav ifølge metoden angitt i fig. IB og 1F vil være hensiktsmessig i de tilfellene hvor nukleinsyresekvensen som skal påvises er DNA.
Dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og en promoter, tjener som kilden til et mangfold av
RNA-transkripter av sekvensen som skal påvises. Som angitt i fig. 1H-I, resulterer tilsetting av en egnet RNA-polymerase aa til testprøveresultater ved binding av RNA-polymerase til promoteren til det dobbelttrådede produktet, og i nærvær av ribonukleosid i trifosfater, påfølgende syntese av RNA-transkripter bb av nukleinsyresekvensen beliggende nedstrøms fra promoteren, inkludert nukleinsyresekvensen som skal påvises.
Under egnede reaksjonsbetingelser, inkludert tilstedeværelse av de nødvendige rreagenser, vil syntese av RNA-transkripter foregå kontinuerlig og i proporsjon med mengden av nukleinsyresekvensen som skal påvises, som opprinnelig var tilstede i testprøven. Ytterligere reagenser kan bli tilsatt hvis det er nødvendig for å fremstille den ønskede mengden RNA-transkriptet. Syntesen av RNA-transkripter vil fortrinnsvis bli utført i nærvær av en ribonukleasehemmer som for eksempel vanadyl-ribonukleosidkomplekser eller human placental ribonukleasehemmer, for om mulig å unngå nedbrytning av transkriptene ved den ytterligere ribonukleaseforurenser. Berger, 1987, Met. Enzymol. 152:227; de Martynoff et al., 1980, Biochem. Biophys. Res. Commun. 93:645; Sheel et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. 76:4898. Etter at hensiktsmessig tidslengde har passert for å produsere den ønskede mengden RNA-transkripter, kan reaksjonen bli stanset ved inaktivering av RNA-polymerase på kjent måte, eller separering av komponentene ifølge reaksjonen.
Bestemming av de spesifikke RNA-transkriptene som blir produsert, blir tilveiebragt ved en hvilken som helst egnet metode som for eksempel ved merking av RNA-transkriptene med en påvisbar del i løpet av eller etter at de blir syntetisert eller ved anvendelse av en merket probe som kan hybridiseres spesifikt med RNA-transkriptene til nukleinsyresekvensen som skal påvises.
RNA-transkripter kan for eksempel bli merket ved tilveie-bringing av ribonukleosidtrifosfater som i seg selv er merket med en påvisbar del, og som blir anvendt som et substrat av RNA-polymerase og dermed inkorporert inn i RNA-transkripter. Den påvisbare delen kan være en hvilken som helst som kan produsere, enten direkte eller indirekte, et påvisbart signal. I en utførelsesform kan den påvisbare delen for eksempel være en radioisotop, så som <3>^p> 3^ l^ c, 125i og <35>S. I en ytterligere utførelsesform kan den påvisbare delen være en ikke-radioaktiv kjemisk modifikasjon som kan produsere et påvisbart signal ved intraksjon med en eller flere hensiktsmessige midler. Den påvisbare delen kan dermed være biotin, og det påvisbare signalet produsert ved dannelsen av et kompleks mellom biotindelen og et protein som spesifikt kan bli bundet til biotin, som for eksempel avidin, streptavidin eller antibiotin-antistoff, hvori bindingspro-teinet er konjugert med et påvisbart molekyl, så som fluorescent eller med et enzym som reagerer med et egnet substrat for å danne et fluorescens, luminescent eller farvet produkt. Langer et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. 78:6633; Bayer ogWilchek, 1980, Meth. Biochem. Anal. 26:1.
I en ytterligere utførelsesform kan det spesifikke RNA-transkriptet som blir produsert bestemmes ved anvendelse av en nukleinsyrehybridisasjonsprobe. Falkow et al., US-patent nr. 4.358.535; Goodson et al., europeisk publikasjon nr. 0 238 332. Proben blir valgt slik at den hybridiserer innenfor sekvensen av RNA-transkriptet som enten er komplementær eller homolog med nukleinsyresekvensen som skal påvises. Hybridsasjonsmetoden kan bli utført ved en hvilken som helst egnet metode, inkludert flytende hybridisasjonsmetode beskrevet i Europa-patenten publ. nr. 70.685 og 70.687, og de flytende-faste hybridisasjonsmetodene beskrevet i US-patent nr. 4.358.535 (Falkow) og 4.647.529 (Rodland), europeisk patentpublikasjon nr. 0 238 332 (Goodson) og Ranki et al., 1983, Gene 21:77. Når det gjelder f lytende-f ast hybridisasjon kan enten probemolekylene eller RNA-transkriptene bli immobil isert på den faste bæreren.
En hvilken som helst egnet metode kan bli anvendt for kor-relering av mengden av RNA-transkripter med mengden av nukleinsyresekvens som skal påvises i testprøven, for eksempel inkludert bestemming av en fastsatt mengde av en standard nukleinsyre hvori standard nukleinsyren inneholder sekvensen som skal påvises eller en annen kjent sekvens, simultant eller parallelt med bestemming med sekvensen som skal påvises i testprøven. Ranki et al., UK-patentpublikasjon nr. 2 187 283 A.
I ytterligere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen blir syntese av en dobbelt-trådet nukleinsyre inneholdende sekvensen som skal påvises og en promoter tilveiebragt ved anvendelse av en promoter-primer sammen med en sekundær primer for å initiere syntesen av to forskjellige primer-ekstensjonsprodukter som kan hybridisere til hverandre.
Fig. 2A-F illustrerer fremgangsmåten hvori syntese av promoter-primer-ekstensjonsproduktet blir først utført, og blir etterfulgt av det sekundære primer-ekstensjonsproduktet. I fig. 2A blir primer c til promoter-primer c d vist å hybridisere med 3'-enden av nukleotidsekvensen som skal bli påvist b, gjennom ikke-kovalent baseparring e med komplementære nukleotidsekvenser. Ved tilsetting av et middel for polymerisasjon f, og i nærvær av nukleosidfosfater, blir et ekstensjonsprodukt g syntetisert initierende ved 3'-enden av promoter-primeren og som fortsetter i 5'-retningen langs det enkelt-trådede templatet. Det resulterende produktet er dermed en dobbelt-trådet nukleinsyre hvor én tråd er test-prøve-nukleinsyren og den andre er promoter-primer-ekstensjonsprodukt g.
I det neste trinnet (fig. 2D), blir de to trådene separert ved anvendelse av en hvilken som helst av prosedyrene beskrevet ovenfor for å tilveiebringe enkelt-trådede molekyler. Etter dette trinnet med trådseparasjon blir testprøven kontaktet med sekundær primer h under egnede betingelser for hybridisasjon under den sekundære primeren til sekvensen innenfor promoter-primer-ekstensjonsproduktet som er komplementær til sekvensen som skal påvises. Det er derimot ønskelig at den sekundære primeren ikke er komplementær med promoter-primeren for å forbedre nøyaktigheten av analysen og derfor blir den sekundære primeren fortrinnsvis valgt slik at den hybridiserer ved 3'-enden til den komplementære sekvensen (fig. 2E).
Ved den fortsatte tilstedeværelsen av midlet for polymerisasjon anvendt for promoter-primer-ekstensjonssyntese f, eller ved tilsetting av et middel for polymerisasjon i, blir et sekundært primer-ekstensjonsprodukt syntetisert, initierende ved 3'-enden av den sekundære primeren og som fortsetter i en 5<*->retning langs promoter-primer-ekstensjonsprodukt-templatet (fig. 2F). Det sekundære primer-ekstensjonsproduktet vil dermed være komplementær med promoter-primer-ekstensjonsproduktet , og hybridisere med denne for å danne en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og promoteren til promoter-primeren.
Midlet for polymerisasjon som blir anvendt for å syntetisere promoter-primer-ekstensjonsproduktet, er fortrinnsvis eksonukleasemanglende T7 DNA polymerase (Tabor og Richardson, 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. 84:4767) til tross for at andre midler kan bli anvendt, omfattende revers transkriptase og andre polynukleotid-polymeraser som mangler 3'-5'-eksonukleaseaktivitet. I den grad kommersielt tilgjengelig eksonukleasemanglende T7 DNA-polymerase (Sequenase™, United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) har residual 3'-5 *-eksonukleaseaktivitet, kan anvendelsen derav i noen tilfeller være uønsket, som for eksempel når ikke-hybridisert 3'-ende av testprøvedeoksyribonukleinsyren, hvori promoter-primeren er bundet til, kan bli fjernet før trådseparasjonsenzymet, vist i fig. 2D. Dette kan ventes å oppstå i de tilfeller hvor testprøve-nukleinsyren hlir mekanisk ødelagt eller spaltet med et restriksjonsenzym som dermed reduserer lengden til testprøvenukleinsyresekvensen på 3'-siden av sekvensen som promoter-primeren er bundet til.
Syntese av det sekundære primer-ekstensjonsproduktet blir tilveiebragt ved anvendelse av et hvilket som helst middel for polymerisasjon som kan initiere syntese ved 3'-ende av den sekundære primeren og fortsette i 5'-retningen langs promoter-primer-ekstensjonsprodukttemplatet. Egnede enzymer for dette omfatter for eksempel E. coli DNA-polymerase I, Klenow-f ragmentet til E. coli DNA polymerase I, T4 DNA-polymerase, eksonukleasemanglende T7 DNA-polymerase og reverstranskriptase.
Fig. 3A-I illustrerer fremgangsmåten hvori syntese av et sekundært primer-ekstensjonsprodukt først blir utført og etterfulgt av syntese av et promoter-primer-ekstensjonsprodukt. I fig. 3A er sekundær primer c vist å hybridisere ved 3'-enden av nukleotidsekvensen som skal påvises b gjennom ikke-kovalent baseparring d med komplementære nukleotidsekvenser. Ved tilsetting av et middel for polymerisasjjon e, og i nærvær av nukleosidtrifosfater, blir et ekstensjonsprodukt f syntetisert initierende ved 3'-enden av den sekundære primeren og som fortsetter i 5'-retningen langs den enkelt-trådede templatet. Det resulterende produktet (fig. 3C) er dermed en dobbelttrådet nukleinsyre,^ hvori den ene tråden er testprøve-nukleinsyren og den andre er det sekundære primer ekstensj onsproduktet.
I det neste trinnet (fig. 3D) blir de to trådene separert ved anvendelse av en hvilken som helst av prosedyrene beskrevet ovenfor for å tilveiebringe enkelt-trådede molekyler. Etter dette tråd-separasjonstrinnet blir test-prøven kontaktet med promoter-primer g h under egnede betingelser for hybridisasjon av promoter-primeren til sekvensen innenfor det sekundære primer-ekstensjonsproduktet som er komplementær med nukleinsyresekvensen som skal påvises. På grunn av at det er ønskelig at promoter-primeren ikke er komplementær til den sekundære primeren for å forbedre nøyaktigheten av oppfinnelsen, blir primeren til promoter-primeren fortrinnsvis valgt slik at den hybridiserer ved 3'-enden av den komplementære sekvensen.
Ved fortsatt tilstedeværelse av midlet for polymerisasjon anvendt for sekundær primer-ekstensjonssyntese e, eller ved tilsetting av et middel for polymerisasjon i, blir et promoter-primer-ekstensjonsprodukt j. syntetisert initierende ved 3'-enden av promoter-primeren og som fortsetter i en 5'-retning langs det sekundære primer-ekstensjonsprodukttemplatet. Promoter-primer-ekstensjonsproduktet omfatter nukleinsyresekvensen som skal påvises, og denne sekvensen er hybridisert til komplementet derav innenfor det sekundære primer-ekstensjonsproduktet og promoteren. Det resulterende produktet er derfor en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og promoteren til promoter-primeren.
I nærvær av et middel k med 3,-5, eksonukleaseaktivitet, blir den enkelt-trådede sekvensen ved 3'-enden av promoter-primer-ekstensj onsproduktet , hvis dette eksisterer, fjernet og erstattet med en promoterkomplementær sekvens (fig. 3G-I), og syntesen av denne blir initiert med et middel for polymerisasjon i ved 3'-enden av promoter-primer-ekstensjonsproduktet ved anvendelse som et templat promoteren til promoter-primer.
Syntese av det sekundære primer ekstensjonsproduktet blir tilveiebragt ved anvendelse av et hvilket som helst middel for polymerisasjon som kan initiere syntese ved 3'-enden av den sekundære primeren og fortsette i 5'-retningen langs testprøve-nukleinsyretemplatet. Egnede enzymer for dette omfatter for eksempel E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet til E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, eksonukleasemanglende T7 DNA polymerase og revers tran-skrlptase. Syntese av promoter-primer-ekstensjonsproduktet og syntese av den komplementære promotersekvensen kan bli tilveiebragt ved anvendelse av det samme midlet eller andre midler omfattende midlet for polymerisasjon anvendt for sekundær primer-ekstensjonssyntese. For å forbedre effektiviteten til prosessen illustrert i fig. 3, er det derimot ønskelig at midlet som blir anvendt for syntese av promoter-primer-ekstensjonsproduktet også kan utføre fjerningsreak-sjonen vist i fig. 3G, hvorved en hvilken som helst ikke-hybridisert sekvens ved 3'-enden av det sekundære primer-ekstens j onsproduktet blir fjernet. Enzymer som er egnede for utføring av både syntese og fjerningsreaksjonene, omfatter de polynukleotidpolymerasene som har 3'-5'-eksonukleaseaktivitet, så som E. coli DNA-polymerase 1, Klenow-fragmentet til E. coli DNA polymerase I og T4 DNA polymerase.
Det dobbelttrådede nukleinsyreproduktet ifølge denne eller metoden nevnt ovenfor, tjener når det er dannet som en kilde for en multiplisitet av RNA-transkripter med sekvensen som skal påvises, og syntese og bestemming av denne kan bli tilveiebragt ved anvendelse av hvilke som helst av frem-gangsmåtene beskrevet ovenfor.
En fordel tilveiebragt ved anvendelse av en promoter-primer og en sekundær primer i kombinasjon for å produsere en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal påvises og en promoter, er at analysen er mere nøyaktig. Når enten promoter-primer eller den sekundære primeren ved feil hybridiserer til en sekvens som er forskjellig fra sekvensen som skal påvises eller komplementet derav, er det resulterende primer-ekstensjonsbiproduktet ikke ventet, enten ved hybridisasjon til testprøvenukleinsyren eller til et annet primer-ekstensjonsprodukt, for å produsere et dobbelt-trådet produkt som RNA-transkriptene kan bli syntetisert fra.
En annen fordel ved anvendelse av to primere i kombinasjon er at ENA-transkriptene til sekvensen som skal påvises vil være av en diskret størrelse som angitt i figurene 2 og 3, ved valg av promoter-primer og sekundær primer slik at en primer hybridiserer ved 3'-enden av sekvensen som skal påvises, og den andre primeren hybridiserer til 3'-enden av den komplementære sekvensen, kan den dobbelt-trådede regionen av nukleinsyreproduktet som RNA-transkriptene blir syntetisert fra, bli begrenset til sekvensen som skal påvises og promoteren til promoter-primeren. Den diskrete størrelsen til de resulterende RNA-transkriptene kan være fordelaktig ved påfølgende deteksjon eller isolasjon av transkriptene, som for eksempel separasjon av de ønskede RNA-transkriptene fra testprøven ved gelfiltrerings-kromatografi. I den grad at transkriptene som blir produsert er kortere enn de som blir produsert ifølge metoden angitt i fig. 1, vil syntesen derav forløpe hurtigere og kreve mindre reagenser.
Følgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere oppfinnelsen. Alle referanser beskrevet heri er inkorporert.
EKSEMPEL 1
Dette eksempel illustrerer anvendelsen av en deoksyribonuk-leotidpromoter-primer med sekvensen
5'AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTACCTCTGTATCATATGC 3'
for påvisning av env-genet til HIV (human immunsviktvirus; tidligere kalt HTLV-III/LAV). Sekvensen til denne promoter-primer blir valgt slik at 5'-enden av promoter-primeren korresponderer med sekvensen til den funksjonelle domenen til en bakteriofag T7klasse III promoter (Dunn and Studier, 1983, J. Mol. Biol. 166:477) og 3'-enden er komplementær med en del av den kodende sekvensen til env-genet til HIV, mellom nukleotidene 5981-6000 i den genome HIV-sekvensen (Muesing et al., 1985, Nature 313:450).
Nukleinsyre for analyse blir ekstrahert fra testprøvene til citratbehandlet humant blod eller virus-infiserte Hp-celler (Popovic, et al., 1984, SCience 224:497) ved anvendelse av teknikkene beskrevet av Hermann og Fischauf, 1987, Meth. Enzymol. 152:180.
Totalt 10 pg testprøvenukleinsyre blir satt til 100 pmol promoter-primer i 100 pl reaksjonsbuffer inneholdende 40 mM Tris (pH 8,0), 20 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 5 mg/ml gelatin, 10 mM vanadyl-ribonukleosidkomplekser og 10 mM av hver av de fire deoksyribonukleosid-trifosfåtene (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) og de fire ribonukleosid-trifosfåtene (ATP, UTP, GTP, CTP). Blandingen blir oppvarmet ved 100"C i ett minutt og avkjølt til 37°C. 5 enheter Klenow-fragment av E. coli DNA polymerase I og 5 enheter T7 RNA-polymerase, blir deretter satt til blandingen og reaksjonene forløper i en time ved 37'C.
Produserte RNA-transkripter blir påvist ved dot-plot-hybridisasjon ved anvendelse som en hybridisasjonsprobe et <32>P ende-merket deoksyoligonukleotid med sekvensen
5' TTGATGATCTGTAGTAGTGCTAC 3 *.
Sekvensen til denne proben ble valgt å være homolog til en del av den kodende sekvensen til HIV env-<g>enet. beliggende mellom nukleotidene 5875 og 5895 av den genome HIV-sekvensen. Aliquoter fra RNA-syntesereaksjonen blir satt til 100 pl 15X SSC buffer (IX SSC = 0,15 M natriumklorid, 0,015 M natrium-citrat, pH 7,0) og filtrert gjennom nitrocellulosefilteret på forhånd fuktet i 6X SSC. Filtrene blir deretter bakt i 1 time ved 80°C i en vakuum ovn.
Etter baking blir hvert filter kontaktet med hybridisasjons-oppløsningen, bestående av 6X SSC, 50 mM natriumfosfat (pH 6,5), 5X Denhardfs oppløsning (IX = 0,02$ polyvinylpyr-rolidon, 0,02$ Ficoll, 0,02$ bovint serumalbumin, 0,2 mM Tris HC1, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), 0,1$ natriumdodecylsulfat og 0,2$ denaturert laksesperm DNA i en time ved 42°C. Den merkede proben blir deretter satt til hybridisasjonsoppløsningen til en final konsentrasjon på 10<7> cpm/ml og inkubasjon av filtrene blir fortsatt i to timer ved 42°C.
Til slutt blir filtrene vasket i 6X SSC i en time ved 37°C med to skift av bufferen. Etter tørking blir filtrene autoradiografert eller tellet for Cerenkov radioaktivitet.
EKSEMPEL 2
Dette og det følgende eksemplet illustrerer anvendelse av en promoter-primer sammen med en sekundær primer for påvisning av env-genet til HIV. 10 jjg testprøvenukleinsyre preparert fra humant blod eller virus-infiserte H9-celler som beskrevet i eksempel 1 blir blandet med 100 pmol promoter-primer og 100 pmol sekundær primer (5'ATGAGAGTGAAGGAGAAATA 3') i 100 pl reaksjonsbuffer. Denne sekundære primeren er homolog med den aminoterminale kodende sekvensen til env-genet til HIV (nukleotidene 5803-5822). Denne spesifikke kombinasjonen av promoter-primer og sekundær primer ble valgt slik at en 225 base-par dobbelttrådet nukleinsyre vil bli dannet, inneholdende 198 basepar av sekvensen til env-<g>enet til HIV, og et 206 nukleotid RNA-transkript vil bli syntetisert under transkripsjonen kontroll av en flankerende T7-promoter.
Blandingen av de to primerne og testprøvenukleinsyren blir oppvarmet ved 100° C i et minutt og avkjølt til 37° C og 5 enheter eksonukleasemanglende T7 DNA-polymerase (Sequenase^, United States Biochemical Corp.) ble tilsatt. Etter inkubasjon ved 37°C i 5 minutter, blir reaksjonsblandingen igjen oppvarmet i 100°C i ett minutt og avkjølt ved 37°C. 5 enheter Sequenase™ og 5 enheter T7 RNA-polymerase hl ir tilsatt blandingen, og reaksjonen fortsettes ved 37°C i 30 minutter til en time. Til slutt blir reaksjonsblandingen oppvarmet ved 100°C i 5 minutter og avkjølt til 42°C.
De resulterende RNA-transkriptene blir bestemt ved revers transkripsjon som blir spesifikt primet ved hybridisasjon ved den sekundære primeren med bare RNA-transkripter. a-<32>P-dTTP (spesifikk aktivitet omtrent 3000 Ci/mmol) blir satt til testprøvereaksjonsblandingen til en final konsentrasjon på 1 pM, sammen med 5 enheter revers transkriptase, og blandingen blir deretter inkubert i 15 minutter ved 42°C.
<32>P-merket revers transkripsjonsproduktene blir kvantifisert ved bestemming av total syreuoppløselig radioaktivitet i reaksjonsblandingen. Aliquoter av reaksjonsblandingen blir satt til 500 pl 10% trikloreddiksyre (TCA) inneholdende polystyrenrør og inkubert på is i 10 minutter. Innholdet i hvert rør blir deretter filtrert gjennom et Whatman glass-fiberfilter med sug og filtervasket med iskald TCA. Etter tørking blir filtrene tellet for Cerenkov radioaktivitet.
EKSEMPEL 3
Nukleinsyre isolert fra humant blod eller HIV-infiserte H9-celler ble spaltet ved sonikering for å danne fragmenter med en gjennomsnittlig lengde på 500 nukleotider. 10 pg spaltet testprøvenukleinsyre blir deretter blandet med 100 pmol promoter-primer og 100 pmol sekundær primer i 100 pl buffer inneholdende 40 mM Tris HC1 (pH 8,0), 20 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 5 mg/ml gelatin, 10 mM vanadyl-ribonukleosidkomplekser, 10 mM av hver av de fire deoksyribonukleosid-trifosfåtene (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 500 pM ATP, 500 pM UTP, 500 pM GTP, 500 pM CTP og 1 pM a-<32>P-UTP (spesifikk aktivitet omtrent 3000 Ci/mmol). Blandingen blir oppvarmet ved 100°C i ett minutt og avkjølt til 28°C, mens 5 enheter revers transkriptase blir tilsatt. Etter inkubasjon ved 28°C i 15 minutter blir reaksjonsblandingen påny oppvarmet ved 100°C i ett minutt, og avkjølt ved 28°C. 5 enheter revers transskrip-tase og 5 enheter T7 DNA polymerase blir deretter tilsatt, og reaksjonene fortsatt i en time ved 28°C.
<32>P-merkede RNA-transkripter blir kvantifisert ved bestemming av total syreuoppløselig radioaktivitet i reaksjonsblandingen som beskrevet ovenfor. 206 nukleotidmerket RNA-transkript kan også bli bestemt ved autoradiografi av urea-polyakrylamidgeler hvor aliquoter av RNA-syntesereaksjonen blir kjørt parallelt med forskjellige mengder radioaktivt merkede standard RNA-er. Kvanitifisering av 206 nukleotid-transkript av env-gen-sekvensen blir deretter tilveiebragt ved densitometrianalyse av det fremkalte autoradiogrammet.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre som omfatter en promoter operabelt koblet til en sekvens som skal bli detektert, karakterisert ved å: (a) tilveiebringe en oligonukleotidpromoter-primer; (b) kontakte nevnte promoter-primer med en nukleinsyre som omfatter sekvensen som skal bli detektert under betingelser som muliggjør hybridisering av promoter-primeren til nukleinsyresekvensen som skal bli detektert; (c) syntetisering av et ekstensjonsprodukt fra 3'-enden av promoter-primeren, i det ekstensjonsproduktet er komplementært med nukleinsyresekvensen som skal bli detektert; (d) kontakte produktet ifølge trinn (c) med et middel som har 3'-5' eksonukleaseaktivitet og (e) syntetisering av et ekstensjonsprodukt fra 3'-enden av sekvensen som skal bli detektert, i det ekstensj onsproduktet er komplementært med promoteren til promoter-primereren, hvori promoter-primeren ifølge trinn (a) er den eneste primeren som blir anvendt.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter spaltning av nukleinsyren som omfatter sekvensen som skal bli detektert med et restriksjonsenzym.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at syntese av ekstensjonsproduktene ifølge trinnene (c) og (e) tilveiebringes ved at man anvender et enzym valgt fra gruppen bestående av E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet til E. coli DNA-polymerase I, og T4 DNA-polymerase .
4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at midlet ifølge trinn (d) er et enzym som velges fra gruppen bestående av E. coli DNA polymerase I, Klenow-fragmentet fra E. coli DN-polymerase I, og T4 DN polymerase.
5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at syntese av ekstensjonsproduktene ifølge trinn (c) og (e) tilveiebringes ved å anvende det samme midlet som ble anvendt i trinn (d).
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnene (c), (d) og (e) utføres samtidig i samme reaksjonsbeholder.
7. Fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testprøve inneholdende nukleinsyre, karakterisert ved at man syntetiserer flerfoldige RNA-transkripter fra en dobbelt-trådet nukleinsyre fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, hvori hvert RNA-transkript omfatter en RNA-sekvens som korresponderer med den spesifikke nukleinsyresekvensen som skal påvises, og bestemmer tilstedeværelsen av nevnte RNA-sekvens.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man syntetiserer de flerfoldige RNA-transkriptene ved å anvende T7 RNA-polymerase.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man syntetiserer flerfoldigheten av RNA-transkriptene ved å anvende SP6 RNA-polymerase.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at tilstedeværelsen av nevnte RNA-sekvens bestemmes ved å kontakte RNA-transkriptene under hybridiserende betingelser med en oligonukleotidprobe valgt slik at den hybridiserer med en forutbestemt sekvens innenfor RNA-transkriptene .
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at RNA-transkriptene immobiliseres på en fast bærer.
NO893583A 1988-01-21 1989-09-06 Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve NO300782B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14646288A 1988-01-21 1988-01-21
PCT/US1989/000120 WO1989006700A1 (en) 1988-01-21 1989-01-12 Amplification and detection of nucleic acid sequences

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO893583D0 NO893583D0 (no) 1989-09-06
NO893583L NO893583L (no) 1989-09-06
NO300782B1 true NO300782B1 (no) 1997-07-21

Family

ID=22517472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO893583A NO300782B1 (no) 1988-01-21 1989-09-06 Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0359789B1 (no)
JP (3) JP2846018B2 (no)
AT (1) ATE92538T1 (no)
AU (1) AU624601B2 (no)
DE (1) DE68908054T2 (no)
DK (1) DK175944B1 (no)
ES (1) ES2010094A6 (no)
NO (1) NO300782B1 (no)
NZ (1) NZ227688A (no)
WO (1) WO1989006700A1 (no)

Families Citing this family (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
DK0457824T4 (da) * 1989-02-13 2004-10-11 Geneco Pty Ltd Detektion af en nukleinsyresekvens eller en ændring deri
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
IE66597B1 (en) * 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
DE3929030A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US7049102B1 (en) * 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5629153A (en) * 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
WO1991010746A1 (en) 1990-01-10 1991-07-25 Chiron Corporation Dna-dependent rna polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
US7585512B1 (en) 1990-05-08 2009-09-08 Thomas Jefferson University Composition and method of using tumor cells
US5518900A (en) * 1993-01-15 1996-05-21 Molecular Tool, Inc. Method for generating single-stranded DNA molecules
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5169766A (en) * 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
WO1993005184A1 (en) * 1991-09-10 1993-03-18 Love Jack D Dna/rna target and signal amplification
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5256555A (en) 1991-12-20 1993-10-26 Ambion, Inc. Compositions and methods for increasing the yields of in vitro RNA transcription and other polynucleotide synthetic reactions
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5834202A (en) * 1992-08-04 1998-11-10 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5614389A (en) * 1992-08-04 1997-03-25 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US6261808B1 (en) 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
US5733733A (en) * 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
DE4238699A1 (de) * 1992-11-17 1994-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Einfaches Nukleinsäurevermehrungsverfahren
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
US5942391A (en) * 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US6593086B2 (en) 1996-05-20 2003-07-15 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Nucleic acid amplification methods
FR2724934B1 (fr) * 1994-09-26 1997-01-24 Bio Merieux Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique
US5789169A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5849879A (en) * 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5606043A (en) 1994-11-03 1997-02-25 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
JP3453745B2 (ja) * 1995-02-02 2003-10-06 横河電機株式会社 光ファイバ検査装置
US5844235A (en) * 1995-02-02 1998-12-01 Yokogawa Electric Corporation Optical frequency domain reflectometer for use as an optical fiber testing device
JP3453746B2 (ja) * 1995-02-09 2003-10-06 横河電機株式会社 光ファイバ検査装置
US5753787A (en) * 1995-04-10 1998-05-19 Yale University Nucleic acids encoding ancylostoma secreted protein
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP1736554B1 (en) 1996-05-29 2013-10-09 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6071493A (en) * 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
CA2270132A1 (en) * 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
US7138511B1 (en) 1997-01-28 2006-11-21 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6475724B1 (en) 1997-01-28 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6171788B1 (en) 1997-01-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
US6117643A (en) 1997-11-25 2000-09-12 Ut Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit
DE69835538T2 (de) 1997-12-18 2008-01-03 Monsanto Technology Llc Insekten-resistante transgene pflanzen und verfahren zur verbesserung von der aktivität von delta-endotoxine gegen insekte
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7029861B1 (en) 1998-09-15 2006-04-18 Board Of Regents, The University Of Texas System LPS-response gene compositions and methods
US6656471B1 (en) 1998-11-17 2003-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System HIV-specific T-cell induction
US6156515A (en) 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
US7037682B2 (en) 1999-03-13 2006-05-02 Government Of The Republic Of Singapore In vitro activity assay for human hepatitis B virus (HBV) DNA polymerase, and its use for screening for inhibitors of HBV DNA polymerase
WO2000066780A2 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
PT1471926E (pt) 1999-06-01 2011-03-11 Baylor College Medicine Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal
AU5882000A (en) 1999-06-22 2001-01-09 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
ES2303525T3 (es) 2000-04-21 2008-08-16 Corixa Corporation Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de infeccion por chlamydia.
JP2004513615A (ja) 2000-06-28 2004-05-13 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
AU7333701A (en) 2000-07-10 2002-01-21 Univ Texas Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors
US6858413B2 (en) 2000-12-13 2005-02-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
JP3853161B2 (ja) * 2001-02-19 2006-12-06 独立行政法人科学技術振興機構 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
WO2002089747A2 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
CA2448097A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 University Of Chicago N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase
AU2003303395A1 (en) 2001-05-22 2004-07-22 Dahl, Gary, A. Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
EP1430140B1 (en) 2001-08-01 2010-09-15 University of Utah N-terminally truncated isoforms of pde3a cyclic phosphodiesterases
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
WO2003025141A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
PT1458888E (pt) 2001-12-10 2011-06-01 Novartis Ag Métodos para tratar a psicose e a esquizofrenia baseados em polimorfismos no gene do cntf
CA2476755C (en) 2001-12-17 2014-08-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
AU2003304195B8 (en) 2002-07-15 2008-08-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
CN1754002B (zh) 2002-08-12 2010-09-08 杰能斯有限公司 涉及痘病毒和癌的组合物及制备方法
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
AU2003294447A1 (en) 2002-11-21 2004-06-18 Epicentre Technologies Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
RU2389732C2 (ru) 2003-01-06 2010-05-20 Корикса Корпорейшн Некоторые аминоалкилглюкозаминидфосфатные производные и их применение
ES2338654T5 (es) 2003-01-29 2017-12-11 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
CA2521084A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
CN1878866B (zh) 2003-07-25 2012-08-01 安比恩股份有限公司 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物
ATE489481T1 (de) 2003-09-12 2010-12-15 Univ Cincinnati Verfahren zur risikobeurteilung, überlebensvorhersage und behandlung von herzversagen und anderen leiden auf der grundlage von polymorphismen adrenerger rezeptoren
WO2005112544A2 (en) 2004-02-19 2005-12-01 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
WO2005118810A1 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
WO2006031955A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
EP1874955A4 (en) 2005-02-28 2009-05-06 Bioquest Inc METHODS FOR EXECUTING DIRECT ENZYMATIC REACTIONS USING NUCLEIC ACID MOLECULES
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
KR100977186B1 (ko) 2005-03-05 2010-08-23 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중특이성 올리고뉴클레오타이드
EP2476761A3 (en) 2005-07-07 2012-10-17 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7838646B2 (en) 2005-08-18 2010-11-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
ATE518007T1 (de) 2005-10-21 2011-08-15 Genenews Inc Verfahren und vorrichtung zur korrelierung der ebenen von biomarker-produkten mit erkrankungen
EP1940755A2 (en) 2005-10-28 2008-07-09 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries
EP1952147A2 (en) 2005-11-16 2008-08-06 Novartis AG Biomarkers for anti-nogo-a antibody treatment in spinal cord injury
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
WO2007106579A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
BR122015030334B8 (pt) 2006-05-25 2018-05-22 Monsanto Technology Llc processo para seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem asiática da soja
US8481023B2 (en) 2006-09-15 2013-07-09 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
KR100823642B1 (ko) * 2006-09-26 2008-04-21 고려대학교 산학협력단 큐티나아제 생산 균주, 그 선별 방법, 상기 균주에 의해생산된 큐티나아제 및 상기 큐티나아제를 포함하는 조성물
ATE555128T1 (de) 2006-11-30 2012-05-15 Res Dev Foundation Verbesserte immunglobulin-bibliotheken
EP2121956B1 (en) 2006-12-21 2016-08-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US7794937B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
DK2155789T3 (da) 2007-05-01 2013-10-21 Res Dev Foundation Immunoglobulin-Fc-biblioteker
EP2173872B1 (en) 2007-06-29 2014-04-02 CellScript, Inc. Copy dna and sense rna
WO2010022787A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Fibre monitoring in optical networks
CN102458446B (zh) 2009-04-22 2017-06-13 印第安那大学科技研究公司 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
US9169512B2 (en) 2009-07-01 2015-10-27 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
ES2652340T3 (es) 2009-07-17 2018-02-01 Bioatla Llc Selección y evolución simultáneas e integradas de rendimiento y expresión de proteínas humanas en huéspedes de producción
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
EP3409119B1 (en) 2009-09-14 2020-08-12 SillaJen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy
KR20110050327A (ko) 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
BR112012013664B1 (pt) 2009-12-10 2020-11-10 Turnstone Limited Partnership rabdovírus oncolítico
CN102762744B (zh) 2009-12-21 2017-07-25 Seegene株式会社 利用靶信号产生引物进行的靶检测
CA2822747A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Use of s-(6-nitro-oxi-hexahydro-furo[3,2-b]thioacetate in the treatment of cardiovascular disorders associated with oxide synthase dysfunction
KR101851117B1 (ko) 2010-01-29 2018-04-23 마이크로닉스 인코포레이티드. 샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지
US11225655B2 (en) 2010-04-16 2022-01-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
ES2711256T3 (es) 2010-04-23 2019-04-30 Univ Florida Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1)
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
CA2804746C (en) 2010-07-16 2022-01-11 Jay M. Short Novel methods of protein evolution
CA2803011C (en) 2010-07-16 2019-12-03 Tocagen Inc. Retrovirus detection
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
AU2012214643B2 (en) 2011-02-07 2016-12-15 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides
CA2828532A1 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender
WO2012120377A2 (en) 2011-03-08 2012-09-13 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP2694678A2 (en) 2011-04-04 2014-02-12 Netherland Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
KR101291668B1 (ko) 2011-04-21 2013-08-01 서울대학교산학협력단 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
EP2701736A1 (en) 2011-04-25 2014-03-05 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
WO2012177595A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Oncofactor Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013045505A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Novartis Ag Biomarkers for raas combination therapy
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
JP6285865B2 (ja) 2011-11-14 2018-02-28 アルファシグマ ソシエタ ペル アチオニ うつ病を有する対象のための処置レジメンを選択するためのアッセイ及び方法
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
CA2861387A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
JP6224067B2 (ja) 2012-03-29 2017-11-01 ノバルティス アーゲー 診断用薬
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CA2868398A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
EP2740805B1 (en) 2012-12-07 2019-02-20 SuppreMol GmbH Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura
EP2935908B1 (en) 2012-12-21 2019-08-14 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Fluidic circuits and related manufacturing methods
WO2014100743A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Micronics, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
WO2014100725A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Micronics, Inc. Portable fluorescence detection system and microassay cartridge
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
WO2014127478A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Vaccine composition
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
WO2014182847A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
WO2014182844A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
US20160186263A1 (en) 2013-05-09 2016-06-30 Trustees Of Boston University Using plexin-a4 as a biomarker and therapeutic target for alzheimer's disease
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20150098940A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity, and Intensity and Flare
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
CA2935577C (en) 2014-01-07 2023-04-04 Bioatla, Llc Proteins targeting orthologs
US20170113221A1 (en) 2014-06-11 2017-04-27 Micronics, Inc. Microfluidic cartridges and apparatus with integrated assay controls for analysis of nucleic acids
WO2016086227A2 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
CA2970143A1 (en) 2014-12-08 2016-06-16 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
US10457737B2 (en) 2015-02-09 2019-10-29 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation
CN108026575B (zh) 2015-07-17 2022-08-19 哈佛学院董事及会员团体 扩增核酸序列的方法
US9789087B2 (en) 2015-08-03 2017-10-17 Thomas Jefferson University PAR4 inhibitor therapy for patients with PAR4 polymorphism
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2018-04-05 전남대학교기술지주회사(주) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
JP7042755B2 (ja) 2016-06-05 2022-03-28 バーグ エルエルシー 患者層別化及び潜在的バイオマーカー同定のためのシステム及び方法
KR102402712B1 (ko) 2016-12-29 2022-05-26 주식회사 씨젠 프라이머 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 방법
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
CN110462062A (zh) 2017-01-26 2019-11-15 俄克拉荷马医学研究基金会 系统性红斑狼疮疾病活动性、强度和急性发作的生物标志物
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
CN116585308A (zh) 2018-05-25 2023-08-15 Arca生物制药有限公司 涉及布新洛尔治疗心房颤动的方法和组合物
JP2022509018A (ja) 2018-10-31 2022-01-20 アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティー オブ アリゾナ 放射線誘発肺障害のためのバイオマーカー及び使用方法
SG11202111824UA (en) 2019-04-30 2021-11-29 Larimar Therapeutics Inc Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
WO2020251306A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Seegene, Inc. Computer-implemented method for collaborative development of reagents for detection of target nucleic acids
KR20230007464A (ko) 2020-06-05 2023-01-12 주식회사 씨젠 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법
CN115989415A (zh) 2020-06-30 2023-04-18 健肺生命人工智能公司 用于检测肺癌的方法
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
IL307528A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
IL307531A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Protein markers for estrogen receptor (ER)-like and estrogen receptor (ER)-negative breast cancer
CA3214819A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Guisong WANG Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer
KR20240035874A (ko) 2021-07-21 2024-03-18 주식회사 씨젠 검수 수집 장치 및 검체 수집 방법
CA3232702A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Geert Meersseman Nucleic acid detection
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
US4819269A (en) * 1987-07-21 1989-04-04 Hughes Aircraft Company Extended imaging split mode loudspeaker system
CA1340843C (en) * 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
AU618965B2 (en) * 1987-07-31 1992-01-16 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences

Also Published As

Publication number Publication date
NO893583D0 (no) 1989-09-06
ES2010094A6 (es) 1989-10-16
ATE92538T1 (de) 1993-08-15
AU3058589A (en) 1989-08-11
DK463089D0 (da) 1989-09-20
JPH026724A (ja) 1990-01-10
JPH1189600A (ja) 1999-04-06
NO893583L (no) 1989-09-06
DE68908054D1 (de) 1993-09-09
EP0359789A1 (en) 1990-03-28
WO1989006700A1 (en) 1989-07-27
NZ227688A (en) 1991-03-26
DK175944B1 (da) 2005-08-01
JP2846018B2 (ja) 1999-01-13
AU624601B2 (en) 1992-06-18
JPH02503054A (ja) 1990-09-27
EP0359789B1 (en) 1993-08-04
DK463089A (da) 1989-09-20
DE68908054T2 (de) 1994-03-10
JP3514630B2 (ja) 2004-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO300782B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av en dobbelt-trådet nukleinsyre og fremgangsmåte nyttig for påvisning av en spesifikk nukleinsyresekvens i en testpröve
US5106727A (en) Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequences as primers
US5043272A (en) Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
USRE39007E1 (en) Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5215899A (en) Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US6001558A (en) Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2
EP0427074A2 (en) Nucleic acid amplification employing transcribable hairpin probe
HU218095B (hu) Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban
JPH022934A (ja) テンプレート−依存性核酸プロ−ブ再構成を用いたアッセイ
EP0682716A1 (en) Rna assays using rna binary probes and ribozyme ligase
AU710326B2 (en) Method for the detection of telomerase activity
JP2547517B2 (ja) 鳥型結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌に対するプローブ
JPH0714359B2 (ja) 修飾核酸の製造方法
US20100009412A1 (en) Novel Oligonucleotide Primers and Methods for DNA Replication
US5985544A (en) Primers and probes for the detection of HIV
JPH06327500A (ja) 核酸配列の増幅方法および検出方法
IL99663A (en) A method for the specific identification of nucleic acids
JPH0576400A (ja) 核酸増幅の使用による細菌の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired