JPH0576400A - 核酸増幅の使用による細菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高い特異性または感度と低いバックグラウン
ドシグナルとを組み合わせる細菌の検出方法を提供する
こと。 【構成】 試料を１種類以上の標識ヌクレオチド三リン
酸およびこのヌクレオチドを含有する標識核酸Ｂの生産
を触媒する１種類以上の酵素と反応させ、熱変性させ、
該試料を、核酸Ｂと充分に相補的であり、かつ少なくと
も１つの固定可能な基を含有する核酸プローブＣと反応
させ、形成し得る核酸ハイブリッドＤと固定可能な基を
認識および結合する固相とを接触させ、固相から液体を
除去し、細菌の存在についての尺度として固相上の標識
を測定することを特徴とする試料中の細菌の特異的な検
出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸増幅を使用する細
菌の特異的検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、核酸による臨床診断学および分子
生物学において、細菌の検出は従来の免疫学的試験に比
べてますます重要になってきた。これは、種々の供給源
由来の核酸のヌクレオチド配列の研究が進歩してきたと
いう事実に関係する。

【０００３】増幅方法の導入は、例えば鎌型赤血球貧血
症について試験する際に、核酸試験の感受性を相当増大
させた。このような方法は、例えば欧州特許出願公開Ｅ
Ｐ−Ａ−０２００３６２号公報に開示されている。増幅
効果は、主に、プライマーおよびモノヌクレオチド三リ
ン酸(mononucleotide triphosphate)の助けをかりて、
プライマーの伸長生成物が鋳型としてのいわゆる標的核
酸から形成され、この伸長生成物が検出されるか、また
はそれ自体、鋳型核酸として再度使用され得るという事
実に基づいている。この方法では、伸長生成物に検出可
能なヌクレオチドを取込むことができる。形成された伸
長生成物は電気泳動によって検出され得る。しかし、こ
の検出方法は複雑でかつ時間がかかる電気泳動工程のた
めに不便である。

【０００４】欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１８
４号公報によれば、非標識伸長生成物は検出可能に標識
された核酸プローブとのハイブリダイゼーションによっ
て検出され得る。しかし、この出願に開示されている方
法を使用する伸長生成物とプローブとのハイブリッドと
非反応プローブとの分離は、非特異的相互作用のため不
充分であるか、あるいは感度を低減させる多くの洗浄工
程を含む。

【０００５】国際公開ＷＯ８９／１１５４６号公報に
は、固相に結合した増幅核酸をプライマーおよび標識モ
ノヌクレオチドと反応させて、この方法で形成される標
識核酸を検出する方法が開示されている。この方法の欠
点は、全ての関連反応が反応速度を低下させる固相上で
進行するということである。欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ
−０３２４４７４号公報には、標識モノヌクレオチドを
取込み、これらの標識核酸を検出されるべき核酸と相補
的である固定核酸によって捕捉する方法が開示されてい
る。増幅核酸の変性方法について、またはハイブリダイ
ゼーション条件については、全く開示されていない。こ
の方法の別の欠点は、固相に有効に結合されている核酸
の製造が困難であるということである。

【０００６】欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３５７０１
１号公報には、伸長反応において、一方が検出可能に標
識され、他方が固相への結合に適切である２つのプライ
マーを使用する方法が開示されている。この方法の欠点
は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと、これ
らオリゴヌクレオチドを含有する伸長生成物とを分離す
るのがより困難であるということである。分離が行われ
ない場合、競合反応のために感度の低減が予想されるで
あろう。

【０００７】欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２９７３７
９号およびＥＰ−Ａ−０３４８５２９号の各公報には、
鋳型として標識核酸を使用して、検出可能なモノヌクレ
オチドによって固定プライマーまたは固定可能なプライ
マーを伸長して、同時に検出可能に標識される固定核酸
を形成する方法が開示されている。この方法の１つの欠
点は、とりわけ、試験の特異性があまり高くないという
ことである。固定プライマーまたは固定可能なプライマ
ーを１つだけ使用して伸長生成物を標識オリゴヌクレオ
チドと反応させるという欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０
２９７３７９号公報に開示されている方法は、オリゴヌ
クレオチドの分離が困難であるという欧州特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０３５７０１１号に開示された欠点を有す
る。

【０００８】国際公開ＷＯ−８９／０９２８１号には、
両プライマーが固定化および検出のために使用される同
一の化学基を有する方法が開示されている。これは、可
分性に乏しいという前記欠点に加える。

【０００９】プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミィ・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Ｐro
c.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、第８６巻、第６２３０〜６２３
４頁には、検出可能に標識されたプライマーを伸長する
方法が開示されている。該検出は、捕捉プローブに伸長
生成物を結合した後に行われる。この場合、追加工程な
しで検出可能に標識されたプライマーを分離することは
可能ではなく、したがって、これは検出反応を妨害す
る。

【００１０】細菌細胞の検出方法は、欧州特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０１３１０５２号公報から公知である。この
方法では、細菌核酸を、該検出されるべき核酸よりも短
い検出可能な標識核酸プローブと反応させ、次いで、形
成するハイブリッドを検出する。この方法の欠点は、比
較的鈍感であり、したがって、他の細胞成分の広範囲な
除去を必要とし、検出されるべき核酸を濃縮しなければ
ならないということである。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来技術の
方法の欠点を回避すること、特に、高い特異性または選
択性に低いバックグラウンドシグナルを兼ね合わせる細
菌の検出方法を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）試料を溶解して、細菌核酸を放出させ、 ｂ）該溶解試料を、１種類以上の標識モノヌクレオシド
三リン酸および該ヌクレオチドを含有する標識核酸Ｂの
生産を触媒する１種類以上の酵素と反応させ、 ｃ）該試料を、細菌に対して特異的であり、かつ核酸Ｂ
と充分に相補的である核酸プローブＣと反応させ、次い
で、 ｄ）標識核酸Ｂおよび核酸プローブＣから形成された核
酸ハイブリッドＤを検出する工程からなる方法であっ
て、 ｅ）該核酸プローブが少なくとも１つの固定可能な基を
含有し、 ｆ）工程ｃ）の直前に反応混合物を熱変性させ、 ｇ）核酸ハイブリッドＤを、固定可能な核酸プローブＣ
を特異的に結合することができる固相と接触させ、 ｈ）液相を該固相と分離し、 ｉ）該固相に結合した検出可能な基を検出することを特
徴とする試料中の細菌の特異的検出方法を提供するもの
である。

【００１３】本発明は、ドイツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−
３９２９０３０号公報による細菌の検出方法を包含する
ものではない。かくして、細菌核酸が、核酸鎖につき、
少なくともその１つが複製システムに対して特異的であ
るヌクレオチド配列を含有する少なくとも２つのアダプ
ターと反応して、少なくとも１つのアダプターをさらに
含有する検出されるべき核酸と実質的に相補的である核
酸の形成を除く。好ましくは、蛋白活性複製システムに
基づく検出方法を除く。

【００１４】本発明方法は、主な特徴が核酸診断学の分
野の当業者に公知の、いわゆるハイブリダイゼーション
試験を行う特定の方法である。以下に記載されない実験
細部に関する限り、その全体にわたって、「核酸ハイブ
リダイゼーション」(“Ｎucleic Ａcid Ｈybridizatio
n")［ビー・ディー・ヘイムズ(Ｂ.Ｄ.Ｈames)およびエ
ス・ジェイ・ヒギンズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)編、ＩＲＬプレ
ス、１９８６、第１章(ハイブリダイゼーションストラ
テジー)、第３章(溶液ハイブリダイゼーションの定量分
析)および第４章(定量フィルターハイブリダイゼーショ
ン)］、分子生物学における現在のプロトコール(Ｃurre
nt Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology)［エフ・エム
・アウスベル(Ｆ.Ｍ.Ａusubel)ら編、ジェイ・ウィリィ
・アンド・サン(Ｊ.Ｗiley and Ｓon)、１９８７、２.
９.１.−２.９.１０］および分子クローニング(Ｍolecu
lar Ｃloning)［ジェイ・サムブルーク(Ｊ.Ｓambrook)
ら編、ＣＳＨ、１９８９、９.４.７.−９.５.８.］を引
用する。公知の方法は、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０
３２４４７４号に開示されているような標識ヌクレオシ
ド三リン酸の製造、修飾または非修飾オリゴヌクレオチ
ドの化学合成、制限酵素による核酸の分裂、ハイブリダ
イズされるべき核酸間の相同性の程度、およびそれらの
ＧＣ含量およびそれらの長さに依存する特異性を達成し
得るハイブリダイゼーション条件の選択、ならびにポリ
メラーゼを使用し、所望によりいわゆるプライマーを使
用するヌクレオシド三リン酸による核酸の形成を含む。

【００１５】本発明の範囲内の標識は、直接または間接
的に検出可能な基Ｌからなる。直接検出可能な基の例と
しては、放射性(³²Ｐ)、着色もしくは蛍光性の基または
金属原子が挙げられる。間接的に検出可能な基の例とし
ては、抗体、抗原、ハプテンまたは酵素のような免疫的
または酵素的に活性な化合物あるいは酵素の酵素的に活
性な部分が挙げられる。これらは、次の反応または反応
シーケンスにおいて検出される。ポリメラーゼに関する
基質としてハプテンで標識されるヌクレオシド三リン酸
が一般的に非常によく使用され得、次の、ハプテンまた
はハプテン化ヌクレオシドに対する標識抗体との反応が
容易に行われ得るので、ハプテンが特に好ましい。この
ようなヌクレオシド三リン酸の例としては、ブロモヌク
レオシド三リン酸またはジゴキシゲニン、ジゴキシンま
たはフルオレセインに結合したヌクレオシド三リン酸が
挙げられる。欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３２４４７
４号公報に開示されたステロイド類およびそれらの検出
が特に適切であることが判明した。これとの関係で、そ
れらの核酸への取込みについて、欧州特許出願公開ＥＰ
−Ａ−０３２４４７４号を引用記載する。

【００１６】ヌクレオシド三リン酸(ＮＴＰ)は、リボヌ
クレオシド三リン酸(ｒＮＴＰ)またはデオキシリボヌク
レオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)である。

【００１７】標的核酸は、試験の標的および本発明方法
の出発物質である細菌核酸と解される。

【００１８】鋳型核酸Ａは、実質的にそれと相補的であ
る核酸鎖を新しく形成する核酸である。配列情報に関し
て、鋳型核酸は鋳型の役をし、反応ｂ）において核酸Ｂ
に転写される配列情報を含有する。核酸Ａは、標的核酸
またはそれらから誘導された核酸である。例えば標的核
酸の一部分であり得るか、または他の部分に加えて標的
核酸の一部分を含有し得る、例えば核酸を非常によく複
合し得る。標的核酸と相補的である鎖の一部分も含有し
得る。

【００１９】変性は、核酸二本鎖を一本鎖に分離するこ
とを意味する。多数の変形は当業者に利用可能である。

【００２０】特異的検出は、ある細菌が所望により他の
細菌の存在下でさえ選択的に検出され得る方法と解され
る。しかし、部分的に対応するかまたは同一のヌクレオ
チド配列と一緒に核酸を使用して細菌のグループを検出
するのも可能である。２本鎖核酸を検出するために２つ
の相補鎖のいずれも使用され得る。

【００２１】核酸または核酸と実質的に相補的である核
酸配列は、対応する核酸にハイブリダイズすることがで
き、かつハイブリダイズ化領域に、他の核酸と正確に相
補的であるかまたは正確に相補的な核酸とはいくつかの
塩基が異なるヌクレオチド配列を有する核酸または配列
と解される。これの特異性は、相補性の程度およびハイ
ブリダイゼーション条件に依存する。

【００２２】液相は、溶解した有機または無機成分、例
えばハイブリダイゼーション緩衝液、過剰のヌクレオチ
ド、検出されるべきでない別の細菌の核酸、蛋白などを
含有する核酸試験において通常使用される水相である。

【００２３】本発明の細菌の検出方法は、検出されるべ
き細菌に対して特異的である核酸の特異的な検出に基づ
いている。これらの核酸は、好ましくは、溶液中に存在
する。反応シーケンスは、通常、適当な試薬を用いて扱
い易い細菌核酸を作成すること、いわゆる溶菌によって
開始される。これについては、剪断応力(例えば、流体
力学的剪断応力、フレンチプレス、ホモジェナイザーに
よって実現される)、超音波(キャビティの形成)、浸透
(細胞膜に対して向けられる静水圧)、加熱、極度の温度
変化の反復(解凍／冷凍)および電離放射線の使用のよう
な物理的方法、ならびに細胞壁合成の抑制(例えば、ペ
ニシリンのような抗生物質による)、細胞壁の酵素分解
(リゾチーム、リゾスタチン、プロテアーゼのような細
胞壁構造を特異的に攻撃する酵素による)およびバクテ
リオファージ溶菌のような化学的方法を使用し得る。こ
のような方法は、例えば、微生物額における実験方法
(Ｍethods in Ｍicrobiology)［アカデミック・プレス
・インコーポレイテッド(Ａcademic Ｐress Ｉnc.)、ニ
ューヨーク、Ｖol.５ Ｂ、１９７１］および一般細菌学
のための実験方法のマニュアル(Ｍanual of Ｍethods f
or Ｇeneral Ｂacteriology)［アメリカン・ソサイエテ
ィ・フォー・マイクロバイオロジー(ＡmericanＳociety
for Ｍicrobiology)、第５章、１９８１］に開示され
ている。

【００２４】本発明の方法は、非常に敏感かつ選択的で
あるので、蛋白、細胞、細胞フラグメントのような他の
物質および検出されるべきではない核酸の存在下、少量
の核酸を検出することさえ可能である。したがって、試
料の精製は、検出されるべき核酸が使用した試薬に充分
にアクセスできることが確実であり得る場合には省略さ
れ得る。

【００２５】食品を検査する場合は、多段階工程で放出
を行うのが好ましい。最初に、検出されるべき細菌を放
出するために、検査されるべき試料を分解する。非常に
少数の細菌が生じる場合、これらは、次工程で培養にお
いて増殖される。これは、他の細菌については必要では
ない。細菌核酸は、上記の公知の方法で、この方法で得
られる細菌から溶菌によって放出される。核酸は前処理
され得る。公知の前処理は、例えばＲＮＡからｃＤＮＡ
の合成を含む。本発明の方法の長所が充分に影響するよ
うになるため、核酸が少なくとも４０ｂｐのサイズを有
することが好都合であることを判明した。

【００２６】さらに、核酸は予備の特異的または非特異
的核酸増幅の生成物であり得る。このような核酸増幅方
法は、例えば欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１８
４号、ＥＰ−Ａ−０２７２０９８号、ドイツ特許出願公
開ＤＥ−Ａ−３７２６９３４号、欧州特許出願公開ＥＰ
−Ａ−０２３７３６２号、国際公開ＷＯ８８／１０３１
５号、ＷＯ９０／０１０６９号、ＷＯ８７／０６２７０
号、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３００７９６号、Ｅ
Ｐ−Ａ−０３１０２２９号、国際公開ＷＯ８９／０９８
３５号、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３７０６９４
号、ＥＰ−Ａ−０３５６０２１号、ＥＰ−Ａ−０３７３
９６０号、ＥＰ−Ａ−０３７９３６９号、国際公開ＷＯ
８９／１２６９６号または欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−
０３６１９８３号の各公報に開示されている。

【００２７】検出されるべき(標的)核酸は、それらが選
択された酵素システムのために必要とされる条件を満た
すならば、反応ｂ）において鋳型核酸Ａとして直接使用
され得る。いくつかの酵素については、これは、核酸が
一本鎖であることを必要とし、他の酵素については、そ
れらが酵素システムに関する認識部位またはプロモータ
ーを含むことが必要である。

【００２８】これが実情でない場合、標的核酸は、反応
ｂ）の前の段階で、このような鋳型核酸Ａに転換されな
ければならない。

【００２９】Ａは、リボ核酸またはデオキシリボ核酸で
あり得る。核酸Ａとして、デオキシリボ核酸が特に好ま
しい。

【００３０】本発明の範囲内で、酵素Ｅは、モノヌクレ
オシド三リン酸から核酸の鋳型依存性合成を触媒する酵
素または酵素システムである。好ましい酵素は、モノヌ
クレオチドを結合するために作用するポリメラーゼおよ
びトランスクリプターゼである。このような酵素は当業
者に公知である。蛋白活性レプリカーゼ以外であるのが
好ましい。

【００３１】工程ｂ）において、鋳型核酸Ａから標識核
酸Ｂを製造する。原則的には、これは、核酸Ａのヌクレ
オチド配列またはそれらの一部の特異的な情報が実質的
に保存されることを条件とする如何なる方法でも行われ
得る。

【００３２】本発明の細菌検出は標的核酸としてリボ核
酸を使用するのが好ましいので、通常、反応ｂ）の前ま
たはその間にそれらを一本鎖にする必要はない。鎖分離
が望まれる場合、これは、アルカリによる処理によっ
て、または熱的に、酵素的に、またはカオトロピック塩
によって行われ得る。

【００３３】特異イニシエーターの存在に依存する反応
ｂ）の使用は特異性の増大のために特に好ましい。この
ような特異イニシエーターは、酵素がこのイニシエータ
ーを結合した核酸に作用するだけであるという効果を有
する。該イニシエーターは、いわゆる特異プライマーＰ
１またはプロモーターであるのが好ましい。

【００３４】特異プライマーＰ１は、特に、核酸Ａと特
に相補的であるヌクレオチド配列Ｓを有する修飾または
非修飾オリゴヌクレオチドである。修飾オリゴヌクレオ
チドは、例えば、核酸とプライマーとのハイブリダイゼ
ーションを実質的には損なわない基を含有し得る。この
ようなオリゴヌクレオチドは、化学的または酵素的手段
によって調製され得る。標的核酸は、鋳型核酸Ａとして
直接使用され得る。

【００３５】したがって、このようなプライマーＰ１の
使用は、核酸の配列の少なくとも一部分が知られている
ことが必要である。さらにまた、プライマーの配列は、
その末端の一方、好ましくは３'末端が核酸よりも短い
ように選択される。したがって、これは、プライマーの
３'末端を越えて伸長する一本鎖部分を有する。

【００３６】かくして、個々の細菌の公表されたヌクレ
オチド配列［サルモネラ(Ｓalmonella)：インフェクシ
ョン・アンド・イムニティ(Ｉnf.Ｉmmun.)、５８：２６
５１(１９９０)；Ｒes.Ｍicrobiol.１４０：４５５(１
９８９)；ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ(Ｊ.Ｂa
cteriol.)１７３：８６(１９９１)；リステリア・モノ
サイトゲネス(Ｌisteria monocytogenes)：Ｍol.Ｍicro
biol.４：１０９１(１９９０)；インフェクション・ア
ンド・イムニティ(Ｉnfect.Ｉmmun.)５５：３２２５(１
９８７)］に基づいてプライマー配列Ｓを選択するのが
可能である。

【００３７】反応工程ｂ）において、検出されるべき核
酸一本鎖につき、１つ以上の特異プライマーを使用し得
る。複数のプライマーの各々の場合、プライマーがハイ
ブリダイズし得る核酸上の領域は重複しないのが好まし
く、これらの領域の間に核酸Ａの一本鎖領域があるのが
特に好ましい。鋳型核酸Ａと実質的に相補的である部分
に加えて、該プライマーは、特に相補的領域に隣接する
領域を含まない核酸によってハイブリダイズすることが
できない５'末端にもう１つのヌクレオチド配列Ｓ１を
含むこともできる。

【００３８】この配列Ｓ１は、例えば、一本鎖または２
本鎖であり得、酵素に対する認識配列を含有することも
できる。これは、例えば、制限分裂部位であり得る。有
効な活性化に関して、プライマーは、例えば、ポリメラ
ーゼであるのが好ましい酵素Ｅによって認識される結合
形態の蛋白も含有し得る。

【００３９】反応ｂ）が進行し得るために、まず、核酸
ＡおよびプライマーＰ１の相補領域を、存在するかもし
れない相補鎖と分離しなければならない。この分離は、
公知の方法によって、例えば熱的にあるいは非熱的に行
われ得る。非熱的変性が好ましい。次に、ＡおよびＰ１
がお互いにハイブリダイズすることができる条件を使用
して反応ａ）を始める。

【００４０】イニシエーターとしてプライマーを使用す
る場合、プライマー依存性反応においてＡと相補的な核
酸を合成することができる試料中にも酵素Ｅを添加す
る。これらとしては、特にポリメラーゼが挙げられる。
それらの基質特異性は核酸Ａに依存する。ＡがＲＮＡで
ある場合、逆トランスクリプターゼ(例えば、ＡＭＶま
たはＭ−ＭｕＬＶ由来)のようなＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼは、特別に考慮される。ＡがＤＮＡである場
合、クレノウ酵素またはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの
ようなＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

【００４１】少なくともその１つが標識されているデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)も試料に添加
される。

【００４２】ポリメラーゼ反応の生成物は、プライマー
Ｐ１および標識デオキシリボヌクレオシド三リン酸が取
込まれる標識デオキシリボ核酸Ｂである。この核酸Ｂ
は、鋳型と同一またはそれよりも小さいサイズのもので
あるが、少なくとも一部分が鋳型と実質的に相補的であ
る領域を有する。

【００４３】次に、この核酸Ｂを、工程ｃ）において直
接使用することができる。しかし、該核酸を鋳型核酸と
して工程ｂ）と同様に反応させるのが好ましい。これに
関して、核酸Ｂの一部分と、好ましくはｄＮＴＰｓから
形成される新しい領域の一部分と実質的に相補的である
プライマーＰ２を試料に添加する。該プライマー対Ｐ１
およびＰ２は、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１
８４号公報に記載の条件を満たすのが好ましい。伸長さ
れるべきそれらの３'末端がＡまたはＢと１００％相補
的であるのが特に好ましい。Ｐ１およびＰ２は、同時
に、鋳型Ａに添加されるのが好ましい。

【００４４】さらに高い感度を達成するために、反応
を、数回、好ましくは１〜６０回、特に好ましくは２０
〜６０回行うことが可能であり、毎回、反応生成物を反
応ｂ）で再度使用する。これは、理論的には、標識核酸
の数のほとんど対数増加を生じる。この方法では両核酸
鎖が形成され、該長さは、プライマーＰ１およびＰ２の
伸長可能な末端によって決定される。欧州特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０２０１１８４号公報と同様に、反応ｂ）の
後半のサイクルにおいて、形成する核酸が最初に生産さ
れたものよりも小さいように配列が選択される、いわゆ
るネスト化プライマー(nested primers)を使用すること
も可能である。反応ｂ）の各サイクルの前に、反応ｂ）
においてＡおよびＢから形成された二本鎖を分離するの
が好都合である。これは、熱的または非熱的に行われ得
る。熱的分離が好ましい。それぞれの場合、プライマー
Ｐ１およびＰ２が再度存在しなければならない。

【００４５】イニシエーターはプロモーターでもあり得
る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識
されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列上で
これにプロモーターに続く相補的核酸鎖Ｂを合成させ
る。この方法で、非標識ＮＴＰｓに加えて、標識ＮＴＰ
は形成する核酸鎖に取込まれる。

【００４６】適当なプロモーターとしては、例えば、Ｔ
３、Ｔ７またはＳＰ６のような細菌ファージ由来のＲＮ
Ａ−ポリメラーゼ結合部位が知られている［メルトン
(Ｍelton)ら：ＮＡＲ １２、１９８４、７０３５−５
６；フェイファー・アンド・ギルバート(Ｐfeiffer ＆
Ｇilbert)：蛋白配列およびＤＮＡ分析Ｉ(Ｐrotein Ｓe
quences and ＤＮＡ Ａnalysis Ｉ)、１９８８、２６９
−２８０；ウーレンベク(Ｕhlenbeck)ら：ネイチャー
(Ｎature)３２８、１９８７、５９６−６００］。

【００４７】試験方法の好ましい具体例において、プロ
モーターは、標的核酸から鋳型核酸Ａを製造するための
特異プライマーの一部である。このプライマーは、標的
核酸の一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列Ｓ
およびＲＮＡポリメラーゼによって認識される核酸配列
Ｓ１を有し、少なくとも１つのプロモーター配列を含
む。最初の反応において、標的核酸と少なくとも部分的
に相補的であり、プロモーターを有するプライマーを含
む核酸鎖Ａ１を、該プライマーならびに標的核酸のタイ
プおよびｄＮＴＰｓに依存するＤＮＡポリメラーゼを使
用して形成する。もはやプライマーに結合されない場
合、核酸の新しく形成された部分は、別の酵素、好まし
くはリガーゼ、例えばイー・コリ(Ｅ.coli)ＤＮＡリガ
ーゼの添加によってプライマーに共有的に結合される。
該リガーゼは、熱的にも安定であり得る。Ａ１は標的核
酸よりも短いのが好ましい。この転写反応では、標的核
酸鎖と相補的な第２プライマーＰ３を使用するのが好ま
しく、両プライマー間のギャップをギャップ充填反応(g
ap filling reaction)によって詰められる。標識ｄＮＴ
Ｐｓの使用は可能であるが、このメジャーは本発明の方
法において測定シグナルのわずかな増幅を生じるだけな
ので、この場合に必要ではない。

【００４８】標的核酸がＲＮＡである場合、これは、次
工程において選択的に分解されるのが好ましい。これに
関して、例えばアルカリまたはＲＮＡａｓｅｓによる処
理のような公知の方法が適切である。次に、Ａ１と相補
的である核酸鎖Ａ２を形成する。これに関して、鎖Ａ１
の一部分、好ましくは新しく形成された部分と相補的で
あるプライマーＰ２を反応混合物に添加するのが好まし
い。プライマーＰ２は、プロモーター配列Ｓ２も含有す
るのが好ましい。これを、Ａ１について上記したように
伸長して、Ａ２を形成する。このような工程は、例え
ば、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３２９８２２号、ド
イツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−３７２６９３４号、国際公
開ＷＯ８８／１０３１５号、ＷＯ８７／０６２７０号、
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３１０２２９号およびＥ
Ｐ−Ａ−０３７３９６０号の各公報に開示されており、
全体において、これらの文献を引用記載する。

【００４９】特に、ＲＮＡの逆転写またはＤＮＡの転写
に有用かつ必要である詳述に関してこれらの文献を引用
する。

【００５０】この具体例では、試料が標的核酸と相補的
な鎖をさらに含有しており、Ｐ１およびＰ２が同時に伸
長されるのが特に好ましい。

【００５１】該具体例において、次に、本発明に従っ
て、この方法で前処理された試料にプロモーター特異性
コントロール下のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを添
加する。このようなポリメラーゼは、例えばＴ３、Ｔ７
またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。それらを使
用して、ＮＴＰｓおよび標識ＮＴＰから標識核酸Ｂを形
成する。この場合、二本鎖核酸Ａ１／Ａ２は、好ましく
は数回、鋳型核酸としての役をする。

【００５２】好ましいＮＴＰｓはリボヌクレオチド三リ
ン酸である。この反応ｂ）の変形において、一本鎖核酸
Ｂが形成されるので、変性は可能であるが該鎖を分離す
るのに絶対に必要というわけではない。

【００５３】しかし、本発明を行う好ましい方法は、検
出可能に標識されたリボヌクレオチド三リン酸を使用す
るドイツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−４０１０４６５号公報
による方法である。

【００５４】工程ｂ）の最後のサイクルの後、本発明の
方法において、反応混合物を熱変性させる(反応ｆ))。
工程ｂ）を数回行う場合でさえ、熱変性は、工程ｃ）の
直前に行われる。この方法では、特に、核酸２本鎖が互
いに分離される。熱変性は、特に、約５０〜９５℃、好
ましくは８５〜９５℃の温度範囲における変性を意味す
る。該変性は１〜１５分間行われるのが好ましい。

【００５５】熱変性の長所は、水酸化ナトリウム溶液の
ような追加試料を使用する必要がないことである。かく
して、ピペッティング工程を省略することができ、該方
法は簡素化され、試験の再現性は増大する。

【００５６】次の反応工程ｃ）において、核酸Ｂとプロ
ーブＣは、一緒に核酸ハイブリッドＤを形成するような
方法で反応させられる。

【００５７】核酸プローブＣとして、特に、６〜５００
０、好ましくは１５〜２０００の長さを有するオリゴヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを考慮する。プロー
ブＣはプラスミド、核酸フラグメントまたはオリゴヌク
レオチドであり得る。それはＲＮＡまたはＤＮＡであり
得る。水溶液の形態であるのが好ましい反応混合物に核
酸Ｂの予想量以上の核酸プローブＣを添加する。プロー
ブＣはＢと実質的に相補的であり、Ｂに対して特異的で
あるヌクレオチド配列を有し、試料中に存在するかまた
は検出されないように新しく形成される核酸とハイブリ
ダイズしないかまたは非常に僅かの量だけハイブリダイ
ズする。特異プライマーの使用および特異プローブとの
ハイブリダイゼーションの組み合わせによって、本発明
の方法が特に選択的にされる。

【００５８】Ｃは、その１つの鎖Ｃ１がＢの一部分と相
補的である二本鎖核酸であり得る。該核酸プローブの他
方の鎖Ｃ２は、他の核酸Ｂ、特に鋳型核酸としてＢを用
いる反応ｂ）を行う場合に形成されるものと相補的であ
るのが好ましい。この場合、Ｃの変性はＢとは別々に行
われ得る。しかし、ＣがＢと一緒に変性されるのが好ま
しい。

【００５９】Ｃが一本鎖核酸プローブＣ１であり、Ｃ１
と相補的な鎖Ｃ２が添加されないのが好ましい。次に、
Ｂを変性させる前にＣ１を添加するのも可能である。一
本鎖核酸Ｃ１を含有する溶液は、例えばＳＳＣ、ホルム
アミドまたは検出されるべきではない核酸に対する遮断
薬のようなハイブリダイゼーションを促す試薬を含有す
るのも好ましい。これによって、ハイブリダイゼーショ
ン溶液の添加に関する追加ピペッティング工程が省略さ
れ得る。

【００６０】一本鎖核酸プローブＣ１は、例えばドイツ
特許出願公開ＤＥ−Ａ−３９１６８７１号公報または欧
州特許出願公開ＥＰ−Ｂ−０１８４０５６号公報によっ
て、化学的核酸合成によって生産され得る。

【００６１】プローブＣは、核酸鎖につき固定化の可能
な１または数種類の(固定可能な)グループＩを含む。

【００６２】固定化の可能な基Ｉは、例えば、例えば化
学反応または光反応によって、固相に共有的に結合され
得る化学基、あるいは基特異的相互作用を介して別の分
子もしくは分子の一部分によって結合され得るかまたは
認識され得る基もしくは分子の一部分である。したがっ
て、このような基は、例えば、ハプテン、抗原および抗
体、ヌクレオチド配列、レセプター、調節配列(regulat
ion sequence)、レクチンのような糖蛋白、またはビオ
チンまたはイミノビオチンのような結合蛋白の結合相手
である。ビタミンおよびハプテンが好ましく、ビオチ
ン、フルオレセイン、またはジゴキシゲニンもしくはジ
ゴキシンのようなステロイドが特に好ましい。各ハイブ
リッドＤにおいて、プローブの固定可能な基は核酸Ｂの
検出可能な基とは異なることが本発明に重要である。

【００６３】検出されるべき核酸が試料中に存在した場
合、核酸ハイブリッドＢを含有する混合物を、次に、核
酸プローブＣの固定可能な基を介してハイブリッドＤを
特異的に結合し得る固相と接触させる。

【００６４】固相のタイプは、固定化の可能な基Ｉに依
存する。Ｉと結合相互作用を行うことができる固定化基
Ｒを有するのが好ましい。固定可能な基が例えばハプテ
ンである場合、表面上にこのハプテンに対する抗体を有
する固相が使用され得る。固定可能な基が例えばビオチ
ンのようなビタミンである場合、固相は固定された形態
でのアビジンまたはストレプトアビジンのような結合蛋
白を含有し得る。特に好ましい基ＩとＲは、ビオチンと
ストレプトアビジンである。修飾核酸上の基を介する固
定化は、これが例えばハイブリダイゼーション反応より
も穏やかな条件下で行われ得るので、特に便利である。

【００６５】形成される核酸の固定化については、核酸
ハイブリッドＤの形成の後、表面が固定可能な基と反応
することができる容器中に、反応混合物を分配するのが
好ましい。プローブとのハイブリダイゼーション反応
は、固定化と同時に起こるのが好ましい。該容器は、例
えばキュベット、チューブまたは微量滴定プレートであ
り得る。しかし、反応混合物が適用される膜、ティッシ
ュまたはパッドのような多孔性物質形態の固相を使用す
ることも可能である。いわゆるビーズまたはラテックス
粒子を使用するのも可能である。固相は、少なくとも、
核酸ハイブリッドＤおよびかくして存在する核酸Ｂと同
じくらい多くの、プローブの固定可能な基に対する結合
部位を有するべきである。

【００６６】好ましい固相の製造は、欧州特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０３４４５７８号公報に開示されており、そ
の全体を引用する。

【００６７】固定化反応が起こるインキュベーション期
間の後、容器、多孔性物質またはペレットビーズから液
相を除去する。次に、ハイブリッドＤの固相への結合が
非常に効果があるので、固相を適切な緩衝液で洗浄する
ことができる。これに関連して、本発明の方法は、従来
技術で使用される検出可能なプローブとは違って分離が
困難なプローブを必ずしも完全に除去しなければならな
いわけではないので、特にほとんど洗浄工程を使用しな
いか、あるいはバックグラウンドシグナルを比較的低く
する。

【００６８】固相に結合した修飾核酸の量は、原則的に
は、公知の方法で測定され、行われなければならない工
程は、検出可能な基のタイプに依存する。直接検出可能
な基、例えば蛍光標識の場合、標識の量は蛍光光度測定
によって測定される。検出可能な基がハプテンである場
合、修飾核酸を欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３２４４
７４号公報に同様に開示されているようなハプテンに対
する標識抗体と反応させるのが好ましい。該標識は、β
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはペ
ルオキシダーゼのような酵素標識でもあり得る。酵素標
識の場合、核酸の量は、色素基質、化学発光基質または
蛍光基質と酵素との反応の通常の光度測定的、化学発光
測定的、または蛍光測定的モニターリングによって測定
される。しかし、標識としてレドックス酵素を使用する
場合、電気化学的に反応をモニターすること、またはp
Ｈ電極によってpＨの変化をモニターすることも可能で
ある。測定シグナルは最初に存在する標的核酸の量およ
びかくして検出されるべき細菌の量の尺度である。初め
の実験では、１〜５ゲノム当量／反応が検出され得るこ
とが判明した。

【００６９】核酸の検出は、定性的および定量的に行わ
れ得る。定量分析の場合、既知の核酸含有量の試料との
比較試験を行うのが好都合であることが判明した。検量
線を確立するのが可能であり、これを推奨する。

【００７０】ＰＣＲを使用する方法の具体例において、
プライマーＰ１およびＰ２としてオリゴヌクレオチドを
試料に添加する。この場合、Ｐ１は、標的核酸および鋳
型核酸の両方を表す核酸一本鎖Ａの一部分と相補的であ
る。Ｐ２は、これから少し離れているＡの一部分と相同
である。欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１８４号
公報の開示に従って、該混合物を処理するが、非修飾デ
オキシモノヌクレオチド三リン酸に加えて、例えばジゴ
キシゲニン標識またはフルオレセイン標識デオキシモノ
ヌクレオチド三リン酸をも使用し得る。２０〜３０増幅
サイクルを行うのが好ましい。その後、一本鎖ビオチン
標識プローブＣを添加する。該混合物を、５０〜９５
℃、好ましくは８０〜９５℃、特に好ましくは８５〜９
５℃の温度で約１〜１５分間インキュベートする。所望
によりいくつかの増幅工程の後、この段階での熱変性の
利点は、できる限り少ない試薬を添加するのが望ましい
ことである。化学的変性の場合、溶菌およびそれらの中
和のために必要な試薬によっても生じる緩衝効果を回避
するために、極端な場合、このような試薬を非常に高濃
度で添加するのが必要である。これは、次のハイブリッ
ドの壁結合における利点でもあり得る。該混合物を、好
ましくは該反応混合物を約３７℃に冷却した後、ストレ
プトアビジン被覆容器に移し、再度、インキュベートす
る。該溶液を除去し、容器を洗浄する。ジゴキシゲニン
に対する抗体と酵素とのコンジュゲート体を添加し、再
度、インキュベートする。溶液を除去し、容器を洗浄し
た後、酵素に対する色素基質と反応し、色素の形成が観
察される。予め検出可能に標識されたプローブは、従来
技術の方法において常に使用されていた。非ハイブリダ
イズプローブの完全な分離は、測定結果の精度のために
必要であったが、比較的困難であった。

【００７１】本発明の方法は、標識プローブをハイブリ
ダイズして、それらを測定する代わりに、取込まれた標
識モノヌクレオチドの存在を測定し、検出されるべき核
酸の存在または量の尺度として使用するという点でこの
欠点を回避する。取込まれていない標識モノヌクレオチ
ドの分離は、それらが核酸または表面に結合されないの
で、本発明の方法により簡単かつ完全に達成され得る。
他方、過剰の固定可能なプローブＣは、プローブＣの固
定可能な基が標識として使用されず、かくして測定結果
に寄与しないので、測定を妨害しない。特に、固定可能
なＮＴＰｓの取込みについてよりも固相の結合能力を計
算する方が簡単である。

【００７２】したがって、本発明の方法は、非常に敏感
かつ選択的であり、加えて非常に短時間で行われ得る。

【００７３】本発明の方法は、細菌種および細菌の分類
学的グループの検出に適している。該方法は、例えばサ
ルモネラ(Ｓalmonella)種、リステリア・モノサイトゲ
ネス(Ｌisteria monocytogenes)、カンピロバクター(Ｃ
ampylobacter)種、ビブリオ・パラヘモリチカス(Ｖibri
o parahaemolyticus)、ビブリオ・コレレ(Ｖibrio chol
erae)、イー・コリ(Ｅ.coli)、スタフィロコッカス・ア
ウレウス(Ｓtaphylococcus aureus)、クロストリジウム
・パーフリンジェンス(Ｃlostridium perfringens)、ク
ロストリジウム・ボツリナム(Ｃlostridium botulinu
m)、バシルス(Ｂacillus)種、エルシニア・エンテロコ
リチカ(Ｙersinia enterocolytica)のような病原体の測
定に特によく使用され得る。該試験は、好ましくは、ミ
ルク、チーズ、ケフィア、ヨーグルトのようなミルク製
品、肉、魚、海産物、野菜、レタス、ライス、シリア
ル、タマゴ、家禽類、スパイス、ハーブおよび乾燥食品
の如き食物において可能である。リボ核酸およびデオキ
シリボ核酸が検出され得る。標的核酸として、ｒＲＮＡ
のようなリボ核酸が好ましく、１６ Ｓまたは２３ Ｓ−
ｒＲＮＡが特に好ましい。

【００７４】本発明の方法において、特異的イニシエー
ターおよび核酸プローブに対する種々の特異性を選択す
ることが可能である。結果として、二重の特異性を達成
するのが可能である。

【００７５】「図１」は、プライマー伸長を使用する具
体例の経路の線図を示す(１つのプライマーＰ１だけを
使用する)。

【００７６】「図２」は、２つのプライマーと一緒にＰ
ＣＲ成分を使用して、最初に形成される核酸Ｂを再度鋳
型核酸として使用する好ましい具体例の経路の線図を示
す。

【００７７】「図３」は、実施例１に従って得た検量線
を示す。

【００７８】「図４」は、実施例１で使用したプライマ
ーおよびプローブのヌクレオチド配列を示す(ＤＮＡ；
線形；一本鎖；２０、１９または２０ｂｐ)。

【００７９】記号は以下のとおりである。 Ａ 鋳型核酸 Ａ１ Ａの対向鎖 Ｐ１ Ａと相補的なプライマー Ｅ 酵素／酵素複合体 Ｅ１ ＤＮＡポリメラーゼまたは逆トランスクリプター
ゼ Ｌ 検出可能な基(標識) Ｂ 反応ａ）の生成物 Ｃ 核酸プローブ Ｉ 固定可能な基 Ｄ ＢおよびＣの核酸ハイブリッド Ｒ 固定化基 Ｆ 固相 Ｓ１ Ａと相補的な配列 Ｓ１' Ａと相補的な別の配列 Ｓ２ プロモーター Ｓ２' プロモーター

【００８０】

【実施例】以下の実施例によって、本発明をさらに詳細
に説明する。

【００８１】実施例１ ９５℃で５分間のインキュベーションを用いて１％Ｔri
ton Ｘ−１００で細菌を溶解する。ポリメラーゼ鎖反応
において、該溶菌調製物１０マイクロリットルを使用す
る。使用したプライマーは、リステリア・モノサイトゲ
ネス(Ｌisteriamonocytogenes)の２３ Ｓ ｒＲＮＡ遺伝
子の６８９〜７０８位および２２２３〜２２４１位に結
合する(「図４」)。すなわち、１５５２ヌクレオチドの配
列が増幅される。この場合に使用される連続希釈法にお
いて、５fg〜５ngの染色体ＤＮＡが使用される。

【００８２】２００mＭの各プライマー、５０mＭ ＫＣ
l、１０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ８.５)、１.５mＭ ＭgＣl
₂、１００μg／ミリリットルのゼラチン、２００μＭ
ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、１５０μＭ ｄＴＴ
Ｐ、５０μＭ ジゴキシゲニン−１１−２'−デオキシウ
リジン−５'−ｄＵＴＰ［Ｄig−[１１]−ｄＵＴＰ、ベ
ーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)］、
２.５Ｕ サーマス・アクアティカス(Ｔhermus aquaticu
s)(Ｔaq)ＤＮＡポリメラーゼを含有する１００マイクロ
リットルの容量で３０ ＰＣＲサイクル(９４℃で１５
秒；６０℃で３０秒；７２℃で９０秒)を行う。増幅調
製物２０マイクロリットル、および上記遺伝子の１１９
１〜１２１０位に結合するビオチン標識試料ＤＮＡ４０
ng(「図４」)を、合計４０マイクリットルの容量で、９
５℃で１０分間、変性させる。次いで、ハイブリダイゼ
ーション溶液［５２.５mＭリン酸ナトリウム(pＨ６.
８)、６.２５ × ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ Ｎa
Ｃl、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および６２.５
％ホルムアミド］１６０マイクロリットルを添加し、ス
トレプトアビジン被覆微量滴定プレート中にピペットで
入れる。ゆっくりと振盪しつつ、３７℃で３時間、ハイ
ブリダイゼーション／壁結合を行う。ハイブリダイゼー
ション溶液を除去し、０.９％ＮaＣlで３回洗浄した
後、２００mＵ／ミリリットル ＜ジゴキシゲニン＞−ム
ラサキウマゴヤシペルオキシダーゼコンジュゲート体を
添加し、１０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.５)、０.９％Ｎa
Ｃl、１％ＢＳＡ、０.５％Ｐluronic Ｔ６８中、３７℃
で３０分間インキュベートする。３回洗浄した後(条件
は上記参照)、３７℃で３０分間、０.１％２,２−アジ
ノ−ジ[３−エチルベンゾチアゾール]−(ＡＢＴＳ)と一
緒にインキュベートし、４０５nmで吸光度を測定する。

【００８３】この反応の吸光度および生物標識試料との
対照反応の吸光度を「図３」に示す。

【００８４】この曲線の助けをかりて、未知の細菌濃度
の試料中に存在する核酸濃度およびかくして細菌の量を
測定するのも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プライマー伸長を使用する具体例の経路を示
す線図。

【図２】 ２つのプライマーと一緒にＰＣＲ成分を使用
して、最初に形成される核酸Ｂを再度鋳型核酸として使
用する好ましい具体例の経路を示す線図。

【図３】 実施例１に従って得た検量線を示すグラフ。

【図４】 実施例１で使用したプライマーおよびプロー
ブのヌクレオチド配列図。

【符号の説明】

Ａ 鋳型核酸 Ｐ１ Ａと相補的なプライマー Ｅ 酵素／酵素複合体 Ｌ 検出可能な基(標識) Ｂ 反応ａ）の生成物 Ｃ 核酸プローブ Ｉ 固定可能な基 Ｄ 核酸ＢおよびＣのハイブリッド Ｒ 固定化基 Ｆ 固相

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コルテイナ・カレツタ ドイツ連邦共和国デー−8000ミユンヘン− 70、ゼーハウザーシユトラーセ14番 (72)発明者 クリストフ・ケスラー ドイツ連邦共和国デー−8021ドルフエン、 シユロスベルクヴエーク11番 (72)発明者 リユーデイガー・リユーガー ドイツ連邦共和国デー−8124ゼースハオプ ト、トウーツインガー・シユトラーセ２番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）試料を溶解して、細菌核酸を放出さ
   せ、 ｂ）該溶解試料を、１種類以上の標識モノヌクレオシド
   三リン酸および該ヌクレオチドを含有する標識核酸Ｂの
   生産を触媒する１種類以上の酵素と反応させ、 ｃ）該試料を、細菌に対して特異的であり、かつ核酸Ｂ
   と充分に相補的である核酸プローブＣと反応させ、次い
   で、 ｄ）標識核酸Ｂおよび核酸プローブＣから形成された核
   酸ハイブリッドＤを検出する工程からなる方法であっ
   て、 ｅ）該核酸プローブが少なくとも１つの固定可能な基を
   含有し、 ｆ）工程ａ）の後に反応混合物を熱変性させ、 ｇ）核酸ハイブリッドＤを、固定可能な核酸プローブＣ
   を特異的に結合することができる固相と接触し、 ｈ）液相を該固相と分離し、 ｉ）該固相に結合した検出可能な基を検出し、 これにより、細菌核酸プローブが、核酸鎖につき、少な
   くともその１つが複製システムに対して特異的であるヌ
   クレオチド配列を含有する少なくとも２つのアダプター
   と反応して、少なくとも１つのアダプターをさらに含有
   する検出されるべき核酸と実質的に相補的である核酸の
   形成を除くことを特徴とする試料中の細菌の特異的検出
   方法。
2. 【請求項２】 反応ｂ）が特異的イニシエーターの存在
   下で進行する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 検出されるべき核酸が一本鎖であるか、
   またはそれを一本鎖にし、次いで、検出されるべき一本
   鎖につき、一部分が検出されるべき核酸と実質的に相補
   的であるヌクレオチド配列を含有し、かつ転写開始配列
   を含有する少なくとも１つのプライマーを試料に添加
   し、該プライマーを、検出されるべき核酸と相補的であ
   るヌクレオチド配列によって伸長し、この方法で形成し
   た核酸を反応ａ）において鋳型核酸として使用する請求
   項１または２記載の検出方法。
4. 【請求項４】 反応ｂ）を連続して複数回行い、いずれ
   の場合にも、反応生成物を反復反応の出発物質として使
   用する請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。