JPH05130869A - ランダム配列オリゴヌクレオチドをプライマーとする核酸配列の増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試料中に存在する鋳型核酸を実質的に増幅す
る方法であって、該増幅は特異的配列の前知識なしに実
施できる方法の提供。 【構成】 ランダムにプライミングされた、そして鋳型
に依存した様式の核酸の増幅からなる、試料中の鋳型核
酸配列を実質的に増幅させる方法であって、そのランダ
ムにプライミングされた増幅が、（１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及
びＧの群から選ばれる正確に３個の塩基、及び、（２）
要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかったＡ、Ｔ、
Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［ここで、塩
基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみなす］を有す
るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドか
らなるランダムオリゴヌクレオチドプライマーによって
起こり、それにより、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧから選ばれ
る塩基を含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の塩基類似体を
含まないランダムオリゴヌクレオチドプライマーの場合
に観察される水準に比較して、デ・ノボ増幅が低下す
る、方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組み替えＤＮＡ技術の分
野に属する。この発明は、核酸配列のランダムプライミ
ング増幅の方法を目的とする。本出願は１９８９年４月
２７日出願の米国特許出願第０７／３４４６７４号の継
続出願である。

【０００２】

【従来の技術】試料中に存在する核酸配列の量の増加
(増幅)は多くの目的のために望ましい。特定のゲノムま
たは核酸標的の検出及びクローニングは、充分な出発物
質または大量の標的配列を取得する能力によって制限を
受ける。特定の核酸配列の検出は、多くの分野、とりわ
け臨床診断、法医学、環境及び食物の監視並びに生物学
的研究において重要である。mＲＮＡからのcＤＮＡの合
成のために逆転写酵素をランダムな非特異的方法でプラ
イミングすることは知られている［ノーマン・Ｋ．Ｅ．
等、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎucl．Ａcids
Ｒes．）第１６巻１０３６６頁（１９８８）］。ノー
マン等は、mＲＮＡの逆転写を、所望とされる標的のポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（下記）と結びつけ
たmＲＮＡ表現型解析の方法を開示している。この逆転
写酵素反応は、配列の複雑さ、mＲＮＡの二次構造及び
ポリＡ尾の長さが異なる事の影響を最小限にすべく、よ
り普通に用いられるオリゴdＴプライマーではなくラン
ダムなヘキサデオキシリボヌクレオチドによりプライミ
ングされた。しかしながら、逆転写酵素はランダム配列
のプライマーを用いて一次転写物を合成できたものの、
さらなる分析をするために、目的とする特定のcＤＮＡ
産物をＰＣＲで増幅する必要が尚あった。

【０００３】さらに、他の核酸配列の検出に使用するた
めの、標識されたまたは誘導されたＤＮＡプローブの合
成のために、ランダムな非特異的方法でＤＮＡポリメラ
ーゼをオリゴヌクレオチドでプライミングすることも知
られている［ファインバーグ・Ａ．Ｐ．等、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａnal．Ｂiochem．）第１
３２巻６−１３頁（１９８３）；リャン・Ｗ等、ヌクレ
イック・アシズ・リサーチ（Ｎucl．Ａcids Ｒes．）
第１６巻３５７９頁（１９８８）］。この技術によれ
ば、まず、二本鎖ＤＮＡが一本鎖になるようＤＮＡを熱
変性させ、次いでデオキシヌクレオシド三燐酸、緩衝
液、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウフラグメン
ト、及び放射活性デオキシヌクレオシド三燐酸と共にラ
ンダムなヘキサヌクレオチドプライマーを加え、室温で
３ないし４時間インキュベートする。存在するＤＮＡ鋳
型に相補的であり、かつランダムなオリゴヌクレオチド
をプライマーとして利用する新たなＤＮＡ鎖は合成され
るものの、この技術によるランダムプライマーＤＮＡの
標識化は、存在しているＤＮＡを実質的に増幅させはし
ない。ファインバーグ等（上記）により提示されたデー
タに基づく計算は、何時間もの反応の間に最大１コピー
のＤＮＡ合成しか起こらないことを示している。

【０００４】ＰＣＲは核酸増幅技術として広く使用され
るようになった［ミュリス・Ｋ等、コールド・スプリン
グ・ハーバー・シンポジア・オン・クォンティタティブ
・バイオロジー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp．Ｑ
uant．Ｂiol．）第５１巻２６３−２７３頁（１９８
６）；アーリッヒ・Ｈ．等、欧州特許第５０４２４号；
欧州特許第８４７９６号；欧州特許第２５８０１７号；
欧州特許第２３７３６２号；ミュリス・Ｋ、欧州特許第
２０１１８４号；ミュリス・Ｋ等、米国第４６８３２０
２号；アーリッヒ・Ｈ．、米国第４５８２７８８号；お
よびサイキ・Ｒ．等、米国第４６８３１９４号］。ＰＣ
Ｒは非分画試料中の特定の核酸領域の増幅を達成する方
法を提供するが、この方法には幾つかの不都合がある。
第一に、ＰＣＲは、増幅すべき各配列に対し共に高度に
特異的でなければならない２個の異なるオリゴヌクレオ
チドプローブを同定し使用する必要がある。配列特異性
オリゴヌクレオチドプローブは、通常化学的方法により
合成しなければならないため、またこれは、増幅方法の
効率を最大にするために、各反応において比較的大量に
使用されるため、かなり費用がかさむ。第二に、ＰＣＲ
は通常、精巧なプログラム可能な装置を用いて実施され
る。ＰＣＲにおける各伸長反応産物は、普通熱変性によ
ってその鋳型の鎖から分離する。多数の（例えば３０−
７０）サイクルの、加熱、再ハイブリダイゼーション及
びプライマーの伸長は、手動で行なうこともできるが、
より一般には、プログラム可能な温度管理装置が使用さ
れる。第三に、ＰＣＲ反応は通常、熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼと共に実施される。合成オリゴヌクレオチドプ
ライマー、精巧な装置、そして普通でないＤＮＡポリメ
ラーゼの組合せは、ＰＣＲが強力ではあるが高価である
ということを意味する。

【０００５】これらの問題の幾つかに部分的に取り組ん
でいるに過ぎないが、ＰＣＲ技術の変法が報告されてい
る。例えば、ロー等、サイエンス（Ｓcience）第２４３
巻２１７−２２０頁（１９８８）は、標的の一方の末端
だけが既知である配列を必要とするＰＣＲ技術を開示し
ている。多くの場合、標的のクローンは取得可能であっ
てもその標的についての配列情報は知られていない。ま
た幾つかの場合においては、配列は非常に可変的なの
で、標的特異性オリゴヌクレオチドプローブを同定する
ことは不可能ではないにしても困難である。したがっ
て、標的特異性オリゴヌクレオチドの配列情報または同
定の利用可能性に依存しない、核酸配列レベルの増幅を
可能にする方法の必要性が存在する。さらに、このよう
な方法は複雑な試料の加工装置または増幅中の専門的操
作を要しないことが望ましい。さらに、その方法が低い
バックグラウンドレベルを有する、即ちポリヌクレオチ
ド標的の不在下では殆どまたは全く重合しないことが望
ましい。

【０００６】

【発明の構成】本発明は、核酸合成を目的とし、鋳型の
オリゴヌクレオチドプライミングを利用する方法に対す
る、単純ではあるが基本的な修飾を表わすものであり、
これは、試料中に存在する核酸が短時間のうちに実質的
に増幅されるという重要な結果を伴う。本発明は、実施
が簡単且つ安価であり、特別な装置を必要とせず、そし
て少しの修飾を施せばＤＮＡ配列と同様ＲＮＡ配列の増
幅にも適用することができる。本発明、ランダムプライ
ミング増幅（ＲＰＡ）に従って、試料中に存在する鋳型
の核酸配列の増幅のための方法を記載するが、ここでは
核酸配列の知識は必要とされない。とりわけ本発明は、
試料中の核酸鋳型の増幅のための方法を提供するもので
あって、この方法は、ランダムにプライミングされた、
しかし鋳型に依存した様式の核酸配列の合成からなる。
この方法は、一本鎖の鋳型核酸の鎖を過剰のランダムオ
リゴヌクレオチドプライマーでプライミングし、そして
この一本鎖鋳型核酸の鎖及び過剰のランダムオリゴヌク
レオチドプライマーを過量の誘導剤、鎖置換剤、及びヌ
クレオシド三燐酸基質の存在下でインキュベートして、
核酸の鎖をランダムに増幅させる工程を含む。

【０００７】

【詳細な記述】本発明は、「試料」中の核酸重合体を増
幅する方法を提供する。この「試料」は、細菌またはウ
イルス調製物から誘導される試料を含むヒトまたは他の
動物源から導かれる生物学的試料（例えば、血液、糞
便、血清、尿、唾液、涙液、生検試料、組織学上の組織
試料、ＰＡＰ塗沫標本、ほくろ、いぼ等）ならびに他の
試料（例えば、農産物、廃水または飲料水、牛乳または
他の加工食品、空気など）を包含し得る。鋳型の核酸分
子は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであってよく、ま
た、元の核酸に対しホモローガスもしくはヘテロローガ
スのいずれかまたはその両方であってよい。例えば、ウ
イルスに感染した人間の組織試料の増幅は、結果として
ウイルス及びヒトの両方の配列の増幅をもたらし得る。
二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ以外の核酸、例えば一
本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはmＲＮＡを含む高分子
物質は、本発明方法によって増幅することができる。例
えば、あるウイルスのＲＮＡゲノムは逆転写酵素との反
応によりＤＮＡに変換され得る［マニアティス・Ｔ．
等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・
マニュアル)（Ｍolecular Ｃloning（Ａ Ｌaboratory
Ｍanual）)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、１９８２；ノーマン・Ｋ．Ｆ．等、ヌクレイッ
ク・アシズ・リサーチ（Ｎucl．Ａcids Ｒes．）第１
６巻１０３６６頁（１９８８）］。次いでこの逆転写酵
素の反応産物を、本発明に従って増幅することができ
る。

【０００８】本明細書中で使用される「鋳型」とは、相
補的核酸鎖の合成のための基質としての役割をし得る、
例えばＤＮＡまたはＲＮＡといったような核酸重合体を
意味する。核酸鋳型は二本鎖または一本鎖型であってよ
い。しかしながら、もしその核酸が増幅反応の開始時に
二本鎖であるならば、これはまず二本鎖を一本鎖に、ま
たは部分的一本鎖の形に変性させる処理をすることがで
きる。例えば加熱、好ましくは約９０−１００℃に１な
いし１０分間加熱、または例えばpＨ１２以上のような
アルカリ処理といったような、二本鎖核酸を一本鎖、ま
たは部分的一本鎖の形にする方法が知られている。本発
明のＲＰＡ法のためには、鋳型の核酸は、プライマーに
対し機能的に並列することができ、且つ鎖置換剤の存在
に応じて鎖の置換を受けることのできる配置にあること
が必要である。「機能的に並列」とは、プライマー及び
鋳型のペアリングが、プライミングされた且つ鋳型に依
存した様式でＤＮＡ合成のためにＤＮＡポリメラーゼに
より利用され得る構造物を産むような並列を意味する。
「鋳型に依存した様式」による核酸合成とは、新たに合
成される核酸の鎖が、鋳型の核酸鎖の配列に対し相補的
な塩基のペアリングによって支配されるような合成を意
味する。本発明方法において使用される「増幅」とは、
増加した配列が、既存の核酸鋳型と同一または相補的で
ある、核酸配列の量の増加をさす。本発明の目的のた
め、「実質的な増幅」を、約３倍以上の鋳型配列の増幅
と定義する。例えば、最初の量１００pgの鋳型から、鋳
型と同一または相補的なＤＮＡ配列３００pgを生成する
増幅反応は、実質的な増幅である。「過剰」のプライマ
ー、誘導剤、鎖置換剤、及びヌクレオシド三燐酸基質と
は、実質的な増幅がその構成因子の濃度により制限され
ないような、鋳型核酸の増幅を支持するに充分な各構成
因子の量を意味する。本明細書中で用いられる「誘導
剤」は、ヌクレオチドの核酸重合体への重合を鋳型指向
的様式で促進することのできる、化学的、物理的、また
は生物学的物質を指す。ＤＮＡポリメラーゼは本発明に
よる誘導剤である。ＤＮＡポリメラーゼは、既存のＤＮ
Ａ鎖を鋳型として使用して、既存のＲＮＡまたはＤＮＡ
プライマーの３'末端のヒドロキシ基にヌクレオチドを
付加することによる、新たな核酸鎖の合成を開始する。
好ましい誘導剤は、一般にクレナウポリメラーゼとして
知られる細菌大腸菌（Ｅ．coli）のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大型蛋白分解フラグメントである。大腸菌（Ｅ．co
li）のＤＮＡポリメラーゼＩ、及びバクテリオファージ
Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのような他のＤＮＡポリメラ
ーゼもまたＲＮＡの実施に使用できる。

【０００９】検定混合物には、Ｍg⁺⁺のような補因子の
必要量、及び本明細書中「三燐酸基質」と呼ばれるdＡ
ＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、
ＧＴＰ、ＵＴＰまたは他のヌクレオシド三燐酸を、所望
の増幅程度を支持するに充分な量で供給する必要があ
る。クレナウポリメラーゼを用いたＲＰＡによる実質的
ＤＮＡ増幅に要するデオキシリボヌクレオチド三燐酸基
質の量は、典型的には、約５０μＭないし約２mＭの範
囲、好ましくは増幅開始時において最初４００μＭの濃
度であろう。上に特定したものをヌクレオシド三燐酸類
似体で置換、またはこの類似体を付加することもできる
が、但し、塩基のペアリング、ポリメラーゼ、及び鎖置
換の機能が、増幅が所望の程度まで進まないという点ま
で、有害に影響してはならない。本明細書中用いられる
「鎖の置換」とは、化学的、物理的、または生物学的物
質、例えばＤＮＡポリメラーゼが、鋳型指向性核酸合成
に関連して、且つこれときわめて近接して、塩基対形成
した核酸を５'から３'の方向へその相補的鎖から解離さ
せる現象を指す。鎖の置換は、塩基対形成した核酸配列
の５'末端で始まり、核酸合成の結果として直ちに５'か
ら置換部位にまで進行する。新たに合成された核酸及び
置換された核酸は共に同じ塩基配列を有し、これは鋳型
の核酸鎖に対し相補的である。鎖置換活性は、核酸合成
及び特にＤＮＡ合成のような別の活性を持つ同じ分子に
存在するか、または、別個の且つ独立した活性であり得
る。大腸菌（Ｅ．coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレナウフラグメント、バクテリオフ
ァージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファー
ジＴ５ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼ
は、ポリメラーゼ活性及び鎖置換活性の両方を有する酵
素である。鎖置換の効果、即ち、同じ配列の核酸鎖の合
成と結びついた核酸鎖の置換を導くために、ヘリカーゼ
のような物質を、鎖を置換しない誘導剤と組み合わせて
使用することができる。鎖置換の議論に関しては、コー
ンバーグ・Ａ．、ＤＮＡレプリケーション（ＤＮＡ Ｒ
eplication）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・Ｃo．、
サンフランシスコ、ＣＡ、１９８０を参照されたい。

【００１０】本明細書中使用される「プライミング」ま
たは「プライミングする」は、オリゴヌクレオチドまた
は核酸の鋳型核酸に対する並列を指し、これにより該並
列は、誘導剤が、ヌクレオチドを鋳型核酸に対し相補的
な核酸に重合させることを可能にする。本明細書中使用
される語「プライマー」は、ランダムな配列のオリゴヌ
クレオチド、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドを
指す。「ランダムな配列」は、増幅されるべき核酸試料
中の特定の配列を意図して設計されていない配列を意味
する。本発明によれば、プライマーは遊離の３'−ＯＨ
基を有するが、これは核酸鋳型と並列した場合、該鋳型
の５'末端に対して隠れており、従ってヌクレオチド及
びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下、適当な
温度及びpＨの下で、鋳型の鎖に対しその配列が相補的
な核酸重合体の合成または重合の開始サイトとして働く
ことができる。プライマーは、好ましくは最大効率の増
幅のために一本鎖であるが、そうでなく二本鎖であって
もよい。二本鎖であるときは、例えばこのプライマー
を、伸長産物の調製に使用する前に、まず鎖を分離する
に充分な温度、好ましくは約９０−１００℃で１ないし
１０分間加熱処理することができる［例えばヌクレイッ
ク・アシド・ハイブリダイゼーション、ア・プラクティ
カル・アプローチ（Ｎucleic Ａcid Ｈybridizatio
n，Ａ Ｐractical Ａpproach）、Ｂ．Ｄ．ハメス及び
Ｓ．Ｊ．ヒギンズ編、ＩＲＬプレス、ワシントン、１９
８５］。「ランダム」な配列のプライマーとは、核酸鋳
型に対するプライマーの並列の位置が、本発明方法に使
用される反応条件の下で、鋳型の核酸配列に関して実質
上不定であることを意味する。一個のオリゴヌクレオチ
ドが核酸重合体中に現われる頻度の評価のための方法
は、ボリニア・Ｓ．等、コンピューター・アプリケーシ
ョンズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（Ｃomp．Ａp
p．Ｂiosci．）第５巻３３−４０頁（１９８９）に記載
されている。ランダムなプライマーの配列は数学的意味
においてランダムではないかも知れないということが理
解できる。化学合成されたランダムなプライマーは、合
成操作の物理的及び化学的効率が許す程度までランダム
となるであろう。天然の供給源から誘導されるランダム
なプライマーは、供給源の生物における塩基の並び方の
傾向の故に、よりランダムでない。増幅が望まれるホモ
ローガスな核酸重合体から導かれたランダムなプライマ
ーは、やはりランダムの定義内にあり得る。明確となっ
た配列を有するオリゴヌクレオチドは、それらの使用条
件によって鋳型に対するそれらの並列の位置が不定とな
るならば、ランダムの定義を満足させることができる。
これら全てのプライマーの型の例は、プライミングされ
た伸長の起こる鋳型核酸鎖に沿った位置が充分に不定で
ある限り、ランダムであると定義される。

【００１１】増幅の度合はプライミングサイトの数に比
例するため、プライマーがランダム配列のものでない場
合は、その配列は、鋳型核酸配列の多数の部位でプライ
ミングするに充分な多様性を持っていなければならな
い。幾つかのプライマーを核酸鋳型上の多くの部位で非
特異的またはランダムに並列させる非緊縮条件が使用可
能であり、さもなければ緊縮ハイブリダイゼーション条
件下でこれらのプライマーは特異的部位とのみハイブリ
ダイズするであろう［例えばヌクレイック・アシド・ハ
イブリダイゼーション、ア・プラクティカル・アプロー
チ（Ｎucleic Ａcid Ｈybridization，Ａ Ｐractica
l Ａpproach）、Ｂ．Ｄ．ハメス及びＳ．Ｊ．ヒギンズ
編、ＩＲＬプレス、ワシントン、１９８５を参照された
い］。鋳型に対するプライマーの並列は、このプライマ
ーと同一の配列の部位である必要はない。もし、適合し
ていないプライマー−鋳型構造体が尚、鋳型に相補的な
プライマーの伸長産物を酵素的に合成する部位を提供で
きるならば、幾らかの不適合部分を有する鋳型に並列す
るプライマーは本発明の範囲内にある。当業者は、過度
の実験をすることなく、本発明方法の範囲内で、緊縮
（プライマー及び鋳型間の完全な相補的配列の組合せの
みを許す）及び非緊縮（プライマー−鋳型のペアリング
における幾らかの不適合を許す）の両方の、多くの反応
条件を設計することができるであろう［ヌクレイック・
アシド・ハイブリダイゼーション、ア・プラクティカル
・アプローチ（Ｎucleic Ａcid Ｈybridization，Ａ
Ｐractical Ａpproach）、Ｂ．Ｄ．ハメス及びＳ．
Ｊ．ヒギンズ編、ＩＲＬプレス、ワシントン、１９８
５］。８塩基の長さのランダムオリゴデオキシリボヌク
レオチドが、本明細書に記載した条件の使用に好まし
い。しかしながら８塩基長以外のオリゴリボヌクレオチ
ド、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば四
量体、五量体、六量体、七量体、九量体、十量体、及び
５０塩基までのものもまた使用できる。プライマーは、
誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするの
に充分な長さのものでなければならない。プライマーの
最適な長さは、使用される誘導剤、及び増幅の目的を包
含する多くの因子に依存する。大腸菌（Ｅ．coli）ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレナウフラグメントを用いる、診
断への適用のためには、約８ヌクレオチドのプライマー
が好ましい。

【００１２】プライマーの配列は、１もしくはそれ以上
のデオキシリボヌクレオシドＤＮＡ塩基dＡ、dＴ、d
Ｃ、またはdＧ；または１もしくはそれ以上のリボヌク
レオシドＲＮＡ塩基Ａ、Ｕ、Ｃ、またはＧ；または１も
しくはそれ以上の上記塩基の類似体、例えばＩ、dＩ、
またはdＵ（イノシン、デオキシイノシン、またはデオ
キシウリジン）を含むことができる。本発明の目的のた
めには、重合化剤が、使用されるヌクレオチドを含むプ
ライマーを使用できる限り、デオキシウリジン及びチミ
ジンは等価と考えられ、リボチミジン及びウリジンは等
価と考えられる。プライマーは、その働きを最高にする
ため、または増幅産物の性質決定を容易にするため、化
学的基をもって誘導体とすることができる。例えば、ビ
オチンで置換されたプライマーを、既知の技術により合
成することができる［ムラサギ・Ａ．等、ＤＮＡ第３巻
２６９頁（１９８４）；クック・Ａ．Ｆ．等、ヌクレイ
ック・アシズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒes．）
第１６巻４０７７頁（１９８８）］が、これは増幅産物
の定量化に望ましいであろう。さらにプライマーは、酵
素のための反応サイト、例えば制限エンドヌクレアーゼ
のための開裂サイトまたはＲＮＡポリメラーゼのための
プロモーターサイトをも含み得る。このようなサイト
が、例えば増幅産物のクローニングまたは増幅産物の転
写を可能にする。プライマーは、例えばオリゴヌクレオ
チド・シンセシス、ア・プラクティカル・アプローチ
（Ｏligonucleotide Ｓynthesis, Ａ Ｐractical
Ａpproach）、Ｍ．Ｊ．ゲイト編、ＩＲＬプレス、ワシ
ントン、１９８４に記載のように合成によって作られ、
またはプライマーは天然供給源の核酸の開裂または減成
によって作られ得る。天然に存在する核酸から製造した
このようなランダムプライマーは、本明細書に記載され
るＲＰＡ法にも有用であり、また、ＤＮＡ合成の最初の
一巡のための初めの鋳型として働く、核酸供給源に対し
てホモローガスまたはヘテロローガスのいずれかであっ
た天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡから製造できる。
天然ＤＮＡまたはＲＮＡからのプライマーは、ＤＮＡを
小さなフラグメント、好ましくは５−５０塩基または塩
基対のフラグメントに減成することにより製造できる。
天然ＤＮＡまたはＲＮＡは、様々な方法、例えばＤＮア
ーゼまたはＲＮアーゼによる酵素的方法によって減成す
ることができる。プライマーは市販品を購入することも
でき、例えば、ランダムプライマーはＰ−Ｌバイオケミ
カルズまたはファルマシアによって供給され、またはリ
ンカー配列は一般にクローニングの目的のために販売さ
れている。インビボにおいては、ＤＮＡ複製工程中、Ｒ
ＮＡからなるプライマーはＲＮＡポリメラーゼまたはＤ
ＮＡポリメラーゼにより使用されるためのＤＮＡ鋳型上
のプライマーゼにより合成される。特に、部分的に変性
したＤＮＡ鋳型を使用すると、ＲＰＡは、例えば、その
増幅反応に使用されるプライマーの合成がＲＰＡ検定内
で調和して起こるような条件下で、ＲＮＡポリメラーゼ
またはプライマーゼ及び４種のリボヌクレオシド三燐酸
を添加することにより、必要なプライマーが反応管自身
の中で合成されるような反応においても起こり得る。こ
の態様においては、プライミング事象のランダム性は、
鋳型に結合するＲＮＡポリメラーゼまたはプライマーゼ
の性質によって決定される。上記方法に従って、試料の
変性した一本鎖核酸配列を、プライミング、ＤＮＡポリ
メライゼーション、及び鎖置換の行なわれる条件下で、
プライマー、誘導剤、鎖置換剤、ヌクレオシド三燐酸、
及び上に論じた補因子の存在下でインキュベートする。
二本鎖構造及びヘアピン構造のような他の二次構造が試
料中に最少限となるのを確実とするために、増幅すべき
試料中の核酸配列の変性は、ＲＰＡ合成の最初の一巡目
が推奨される。鋳型ＤＮＡに対するプライマーの並列
は、隠れた３'−ヒドロキシ末端を有する二本鎖分子を
生成し、従ってＤＮＡポリメラーゼのための基質を作り
出すであろう。このように、反応混合物が誘導剤、鎖置
換剤、デオキシリボヌクレオチド及びその他の必要な補
因子を含んでいるため、試料中の並列したプライマーの
鋳型指向性伸長が起こる。このプライマー伸長産物は、
標的配列に対し相補的な核酸配列を有するであろう。プ
ライミング、プライマー伸長、もしくは鎖の置換の速度
または程度を増加させる条件または試薬は、ＲＰＡによ
り得られる増幅の程度を増加させることができる。例え
ば、ヘリカーゼまたは一本鎖核酸結合蛋白の添加は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの鎖置換速度を増加させ、または通常
実質的な増幅をもたらさないＤＮＡポリメラーゼのＲＰ
Ａにおける使用を可能にする。

【００１４】別の態様においては、ＲＰＡを核酸鋳型上
で反復して実施する。例えば、ＲＰＡにより増幅された
配列を精製し（例えば、ゲル電気泳動、カラムクロマト
グラフィー、親和クロマトグラフィー、またはハイブリ
ダイゼーションにより）、精製産物を含有する画分を、
ＲＰＡによるさらなる増幅に付す。ＲＰＡのための試料
中に存在するＤＮＡの全てが鋳型指向性ＤＮＡ合成から
生ずるわけではない。大腸菌（Ｅ．coli）のＤＮＡポリ
メラーゼＩおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウフラ
グメントのようなＤＮＡポリメラーゼが、鋳型ＤＮＡを
加えなくとも、プライマー及びデオキシヌクレオシド三
燐酸を利用してＤＮＡ配列、即ち比較的大きな、実質的
に二本鎖のＤＮＡ構造さえ、合成できることが知られて
いる［シャッハマン・Ｈ．Ｋ．等、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．）
第２３５巻３２４２頁（１９６０）；セットロー・Ｐ．
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．）第２４７巻２２４頁（１９７
２）］。この、鋳型独立性「デ・ノボ」合成は、本発明
のＲＰＡ法と同時に試料中で起こり得る。本発明のＲＰ
Ａ法に加えられた投入鋳型ＤＮＡの量にもよるが、反応
終了時に合成されて見いだされるＤＮＡの殆どは、実際
には「デ・ノボ」合成の結果であり得る。標準的ＲＰＡ
反応（？？？μl中プライマー１５μg、ｄＮＴＰ２５μ
g、大腸菌（Ｅ．coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナ
ウフラグメント２０単位。３７℃で２時間）において、
デ・ノボＤＮＡ産物１０−１２μgが合成され、これ
は、ポリマー中に取り込まれたdＮＴＰの容量に基づく
と、約半分のＲＰＡ反応合成能力を表わす。デ・ノボＤ
ＮＡ合成の存在にもかかわらず、本発明のＲＰＡ法は、
加えられた鋳型ＤＮＡの実質的な増幅を与えるよう進行
する。

【００１５】デ・ノボ合成は、特別なランダムプライマ
ーを使用することにより減らすことができる。このラン
ダムオリゴヌクレオチドプライマーは、４種の標準塩
基：Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧから選ばれる３個の塩基を有す
るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドか
らなる。これらのプライマーは、さらに非標準塩基、即
ちＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧではない塩基をも有する。（本
発明の目的の場合、塩基Ｕおよび塩基Ｔは等価と考える
ことに留意されたい。故に、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群か
ら３個の塩基を選択することができ、またはＡ、Ｕ、
Ｃ、及びＧの群から３個の塩基を選択することができ
る。）これら特別のプライマーを用いることによって、
デ・ノボ増幅を、標準塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧからな
るランダムプライマーで観察されるレベルに比較して減
少させることができる。本明細書中に例示の通り、デ・
ノボ合成は、塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、およびＩ（即ち、
非標準塩基がＩ（即ち、非標準ヌクレオシドがデオキシ
イノシン、ｄＩであった）である）を有するデオキシリ
ボヌクレオチドからなるランダムオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用することにより減少した。換言すれば、
ランダム八量体であるこれらのプライマーにおいて、デ
オキシグアノシン（dＧ）を置換してdＩとした。dＩ
は、２個の水素結合を介して多数の異なる塩基と弱い塩
基対を作ることができる。これは３個ではなく２個のみ
の水素結合を形成し、プライマー−プライマー相互作用
から起こるデ・ノボ合成は、弱められまたは除かれる。
全ての非標準塩基がデ・ノボ合成を減少させるわけでは
ないが、Ｉ以外の塩基も過度の実験をすることなく試験
することができ、試みることのできる他の塩基またはヌ
クレオシドは、ヒポキサンチン、ブロモデオキシウリジ
ン（ＢrdＵ）などである。

【００１６】ＲＰＡは、任意の所望の核酸分子の存在の
同定または検出において使用できるように適合させるこ
とができる。これらの性質は、本発明に係る検定を、医
学的診断、農業、環境及び食品の監視、または特定の低
濃度のＤＮＡまたはＲＮＡの検出が要求される他の任意
の用途への適用に好適なものとする。本発明に係る検定
は、疫学、食品科学及び廃棄物管理の分野で実質的な有
用性がある。例えば、病原菌（例えばＳ．ティフォサ
（Ｓ．typhosa）、Ｍ．ツバキュローシ（Ｍ．tuberculo
si）等）、酵母、原生動物、線虫（例えば心糸状虫症、
旋毛虫症、マラリア等の原因生物）またはウイルス（例
えば肝炎、インフルエンザ、輸送熱などの原因となるも
の）の存在を評価及び同定するために、空気、水または
食品（例えば牛乳、乳製品、肉、家禽の肉等）の試料を
本発明方法に従ってインキュベートすることができる。
試料中の核酸は、疑われている病原体の特徴的配列に対
し相補的なプローブ配列が、試料中におけるそれらの存
在の検出に対して高度な確実性を持って使用できる点ま
で増幅することができる。ＲＰＡの実施に先立ち、試料
に鋳型核酸を添加することを目的とする精製計画を実行
するのが望ましい。精製技術はよく知られており、且
つ、手動または自動核酸精製のための任意の技術を含
む。例えば、マニアティス・Ｔ等、モレキュラー・クロ
ーニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍolecul
ar Ｃloning（Ａ Ｌaboratory Ｍanual））、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８２；
およびランデグレン・Ｕ．等、サイエンス（Ｓcience）
第２４２巻２２９−２３７頁（１９８８）を参照された
い。

【００１７】本発明のＲＰＡ検定は、その構成因子が特
に他の構成因子と共に使用されるべく適合させてある
「キット」の使用により、特に容易となり、且つ促進さ
れる。このようなキットは、典型的には、ランダムプラ
イマー、誘導剤、鎖分離剤、及びデオキシヌクレオチド
の入った一連の容器がその中にきっちり詰め込まれるよ
う区分化された担体、ならびに特定の検定を遂行するの
に必要な緩衝剤および塩を供給する。したがって例えば
乳頭腫ウイルスの検出用に設計された「キット」は、上
に列挙した試薬の外に、乳頭腫ウイルスを検出するため
のプローブを含む。同様に、そのためのプローブが入手
可能なウイルスまたは細菌の存在、とりわけ例えばＨＩ
Ｖ、食品の細菌汚染、及び酵母の感染などを検出するた
めの、類似のキットを製造することができる。さらに本
発明はこのような増幅された分子の特性決定を意図する
ものである。本発明の実施により得られる増幅された分
子は、これらの配列または性質をさらに決定するため
に、周知の様々な方法のいずれかを用いて分析できる。
例えば、このような増幅された分子を、配列決定、制限
消化、電気泳動、クローニング、または対照核酸分子に
対してハイブリダイズすることができる。かかる情報
は、診断、及びその他の用途に使用できる。本発明方法
によって増幅された配列は、溶液中で、または固体支持
体に結合させた後に、ＰＣＲ、オリゴマー制限［サイキ
・Ｒ．Ｋ．等、バイオ／テクノロジー（Ｂio／Ｔechnol
ogy）第３巻１００８−１０１２頁（１９８５）］、対
立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ
分析［コナー・Ｂ．Ｊ．等、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）第８０巻２７
８頁（１９８３）］、オリゴヌクレオチドライゲーショ
ン検定（ＯＬＡs）［ランデグレン・Ｕ．等、サイエン
ス（Ｓcience）第２４１巻１０７７頁（１９８８）］等
のような、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用される任
意の方法により、さらに評価、検出、クローニング、配
列決定などをすることができる。ＤＮＡ分析のための分
子技術が最近論評されている［ランデグレン・Ｕ．等、
サイエンス（Ｓcience）第２４２巻２２９−２３７頁
（１９８８）］。

【００１８】本発明方法の利点は、複雑な操作もしくは
自動操作または分析を行なう技術者の反復介入を要しな
い系において、事前にそれらの配列の知識がなくとも核
酸の増幅ができることを含む。ＰＣＲ分析で必要とされ
るような、二本鎖核酸の変性のため、及びプライマーを
鋳型に対して再アニーリングさせるための、様々な温度
での加熱の反復サイクルは必要ない。本発明方法は、転
移しがちな核酸の領域、または変異頻度が高いため極め
て可変性である核酸領域の増幅に、特に有用である。こ
のような領域は、免疫グロブリン遺伝子、レセプター遺
伝子、及び高度に可変性のウイルス外殻配列をコードす
る遺伝子を包含する。したがって、本発明方法によれ
ば、ゲノム中にランダムに統合されている、または別の
状態で細胞に存在し、高い変異確率を持つ傾向のある、
ウイルスの配列を、さらなる研究のために増幅すること
ができる。好ましい態様において、プローブ及び鋳型は
共に溶液中にある。別の態様においては、本発明に係る
増幅方法は、プライマーが、その結合がＤＮＡ合成をプ
ライミングする能力を妨害しないように固相に結合して
いる状態で実施することができる。この態様の利点は、
増幅産物がすべて固相の支持体に共有結合することであ
り、よってこれらの単離、特性決定、及び、例えば診断
上の検定における使用が簡単となる。

【００１９】固相へのプライマーの結合は、そのプライ
マーを固相の基幹から分離し、これにより並列工程にお
けるプライマーの立体的柔軟性を促す、非核酸リンカー
の使用によって起こり得る。さらに、独自の制限エンド
ヌクレアーゼサイトまたは他の酵素認識サイトを含むプ
ライマーの使用は、例えば増幅産物が別の環境にクロー
ニングまたは移動されることが望ましいような条件にお
いて、増幅核酸産物の除去を促進するであろう。プロテ
アーゼの認識サイトを含む蛋白性リンカーの使用もま
た、結合した物質を解放する。この態様のもう一つの利
点は、他のリンカーと二本鎖型を形成するリンカーの傾
向、とりわけパリンドローム配列であるリンカーの該傾
向が最小限となることである。さらに、本発明方法は、
試料の核酸鋳型が固相に結合しており、プライマーが溶
液中にある態様に適用される。この態様の利点は、本発
明に係る増幅操作のための臨床用のセッティングにおい
て、しばしば組織学的分析に採用されるような固定パラ
フィン組織試料を使用できることを含む。本発明を一般
的に記載してきたが、本発明は、本明細書に含まれる個
別的実施例を参照することによってより容易に理解さ
れ、これらは例示のみを目的としており、別途記載のな
い限り、限定を意図するものではない。

【００２０】

【実施例】 実施例１ エンドヌクレアーゼＥcoＲＩを用いて、ヒト乳頭腫ウイ
ルス（ＨＰＶ）タイプ１８ＤＮＡの８キロベース配列
を、プラスミドベクターから切り取った。緩衝液中に希
釈後、ＲＰＡ緩衝液［２００mＭ ＨＥＰＥＳ／ＮaＯＨ
pＨ６.８、５０mＭ トリス／ＨＣl pＨ６.８、１０
mＭ ２−メルカプトエタノール、５mＭ塩化マグネシウ
ム、４００μg／ml牛血清アルブミン（全て最終濃
度）］、デオキシヌクレオチド［dＡＴＰ、dＣＴＰ、d
ＧＴＰ、及びdＴＴＰ（全て最終濃度４００μＭ）］、
及びランダム六量体、七量体、八量体、九量体、または
十量体オリゴデオキシヌクレオチド（シンセティク・ジ
ェネティクス、Ｉnc．）を含有する５０μlの個別反応
液に、ＤＮＡ１００pgを加えた。反応液に加えた各プラ
イマーの量は、それぞれの反応液中に３'末端が当モル
量供給されるように、そのプライマーの分子量について
標準化した。故に、六量体１５μg、七量体１７.６μ
g、八量体２０.１μg、九量体２２.６μg、または十量
体２５.１μgを適当な反応液に加えた。ランダムプライ
マーを含み乳頭腫ウイルスＤＮＡを添加しない平行反応
もまた準備した。全ての反応液は沸騰水浴に１０分間入
れて、ヒト乳頭腫ウイルス１８ＤＮＡを変性させ、次い
で氷上で速やかに５分間冷却した。クレナウＤＮＡポリ
メラーゼ１０単位（１.６μl）を全部の管に加え、管を
水浴中３７℃または４５℃のいずれかでインキュベート
した。２時間後、さらに１０単位のクレナウポリメラー
ゼを全反応液に添加した。４時間後、各反応液の等分試
料、及び既知量の投入ＥcoＲＩ切断ＨＰＶ１８ＤＮＡ
（標準として）を、０.５Ｍ水酸化ナトリウム中に希釈
し、バイオダインＢナイロン膜（ポール・コーポレーシ
ョン）上で濾過した。ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１８に
特異的な³²Ｐ−ＲＮＡプローブを用いてこの膜を探査
し、増幅の達成度を測定した。標準のスポットの強度と
種々の増幅産物により生成されたスポットの強度とを比
較し、既知の希釈係数と結びつけることにより、増幅の
度合が評価できた。「ドットブロット」分析により、六
量体または七量体のランダムプライマーが用いられた場
合は３７℃で最適の増幅が得られ、より大きなランダム
プライマーが用いられた場合は４５℃で最適の増幅が得
られることが示された。３７℃で４時間後に達成された
増幅は、六量体および七量体についてそれぞれ約２５０
０倍及び７５００倍であった。４５℃では４時間後に、
八量体、九量体、及び十量体プライマーは、それぞれ約
１５０００倍、５０００倍及び３０００倍の増幅を生み
出した。これらの値は、反応産物及びＤＮＡ標準の両者
の希釈のため、Ｘ線フィルム上の暗い領域の強度の比較
から導いているため、約２倍以内までの精度しかないと
いうことを考慮すべきである。ＨＰＶ１８ＤＮＡを削除
した反応液は、ドットブロット上にいかなる信号も与え
なかった。

【００２１】実施例２ 増幅反応の時間的推移及び特異性を調べた。上記のよう
な、ＲＰＡ緩衝液、ヌクレオチド、及びランダム八量体
を含有し、線状ＨＰＶ１８ＤＮＡ１００pgを含有するま
たは鋳型ＤＮＡを含まない反応液５０μlを煮沸し、冷
却し、そして上記のようなクレナウポリメラーゼ１０単
位と共に４５℃でインキュベートした。１時間、２時
間、４時間、８時間、または一夜（およそ１６時間）の
時点で各々の反応液を凍結した。その時間の経過後に、
各反応液から３個の等分試料を取った。等分試料の一組
を、０.９％アガロース、２μg／mlエチジウムブロミ
ド、トリス酢酸塩／ＥＤＴＡゲルに適用［マニアティス
・Ｔ等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ
ー・マニュアル）（Ｍolecular Ｃloning（Ａ Ｌabor
atory Ｍanual））、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、１９８２］し、電気泳動し撮影した。
第二の等分試料の組は、存在するＤＮＡの量について検
定した。等分試料に蛍光染料ホーシュット３３２５８
０.１μg／mlを含有する緩衝液を加え、ＤＮＡ蛍光計
（ホーファー・サイエンティフィック、サンフランシス
コ、ＣＡ）を用いて各希釈液の蛍光を測定し、標準ＤＮ
Ａの蛍光と比較した。第三の等分試料の組は、０.５Ｎ
ＮaＯＨ中に希釈し、バイオダインＢナイロン膜上で
濾過し、³²Ｐ−ＨＰＶ１８ＲＮＡをもって探査した。ド
ットブロット分析は、１時間、２時間、４時間、８時
間、及び一夜の時点において、それぞれおよそ５００
倍、１０００倍、５０００倍、及び８０００倍の増幅の
時間的推移を示した。アガロースゲル分析は、１時間に
おける検出下限に近い量から、２時間で容易に見えるＤ
ＮＡ、そして４時間、８時間、および一夜の時点におけ
る大量の合成へと、ＤＮＡ合成が時間と共に増加してい
くことを示した。５００塩基対以下に相当する大きさの
目に見えるＤＮＡの大部分はゲル上を移動した。肉眼で
は、ＨＰＶ１８鋳型ＤＮＡ１００pgを含有する反応液
と、添加された鋳型ＤＮＡを含有しない反応液との間
に、合成されたＤＮＡ量の相違はなかった。コーンバー
グ及び他の者［シャッハマン・Ｈ．Ｋ．等、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂiol．
Ｃhem．）第２３５巻３２４２頁（１９６０）；バード
・Ｊ．Ｆ．等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ．Ｍol．Ｂiol．）第５３巻４３５頁（１
９７０）］により観察された「デ・ノボ」反応（上記）
は、恐らく、何か非常套的方法でランダム八量体の中に
あるオリゴヌクレオチドを利用して、ずっと大きなＤＮ
Ａを合成することができるのであろう。１時間の時点に
おいて、ＨＰＶ１８試料及び鋳型なしの反応液の両方
が、その反応液につき合成された総ＤＮＡ約０.２５μg
に相当する、蛍光検定の下限付近の量のＤＮＡを含有し
ていた。２時間、４時間、８時間、及び一夜の時点にお
いては、投入ＨＰＶ１８ＤＮＡの入っている反応液は
２.２５、１１.２５、１３.２５、及び１８.７５μgの
ＤＮＡを含有し、一方、投入鋳型ＤＮＡを入れなかった
反応液は約１.５、８.２５、１０.２５、及び１４.２５
μgのＤＮＡを含有していた（２個の反応液の平均）。

【００２２】実施例３ ヒトの血清から精製した肝炎Ｂ ＤＮＡでＲＰＡ法を実
証した。サブタイプadwＤＮＡのクローニングされたゲ
ノムを含む線状プラスミドＤＮＡ５００ng［ハートレイ
・Ｊ．等、ジーン（Ｇene）第４９巻２９５頁（１９８
６）］をヒトの血清７８μlに加え、次いで、血清に含
まれるビリオンからＨＢＶ ＤＮＡを精製するために示
された方法により抽出した（同書）。回収したＤＮＡの
等分試料を、０.５ＮＮaＯＨ中に直接希釈するか、また
は希釈し、ＲＰＡ緩衝液に入れ、煮沸し、冷却し、上記
のごとく増幅し、そしてＮaＯＨ中に希釈した。この水
酸化ナトリウム希釈液をバイオダインＢ膜で濾過し、Ｈ
ＢＶ³²Ｐ ＲＮＡプローブをもって探査した。既知の希
釈係数から、血清より回収されたＨＢＶ ＤＮＡは、標
準的２時間、４５℃のＲＰＡ増幅法において約１０００
倍に増幅された。増幅条件はＲＰＡを促進させるために
変えることができる。例えば、反応緩衝液のpＨを７.１
に上げ、ＨＥＰＥＳ／ＮaＯＨを割愛し、そして１０単
位ではなく３０単位のクレナウポリメラーゼを添加する
ことにより、４５℃、２時間後の増幅は１０００倍とな
った（これ以上にはならない）。

【００２３】実施例４ ＲＰＡ法を、ランダムプライマー、誘導剤、鎖分離剤、
及びデオキシヌクレオチドの入った容器並びに緩衝液及
び塩及び乳頭腫ウイルスの検出のため特に設計されたプ
ローブを用いるキット形式で適用した。線状のクローニ
ングされたＨＰＶ１６ＤＮＡ（０ないし１０００fg）
（検出すべき試料）を、容器Ｎo.１からの変性緩衝液
（１Ｍ塩酸グアニジン、１０mＭトリスＨＣlpＨ８.０、
１mＭ ＥＤＴＡ、０.０５％アジドナトリウム）１００
μlに加え、容器Ｎo.２からの０.５ＭＮaＯＨ２０μlの
添加により変性させた。ＮaＯＨを、容器Ｎo.３からの
中和緩衝液（６％ポリアクリル酸、７５０mＭクエン酸
ナトリウム、２５０mＭクエン酸、１Ｍ燐酸カリウム、
５mＭＥＤＴＡ、０.３％トゥイーン２０、０.０５％ア
ジドナトリウム）６０μlの添加により中和した。ＨＰ
Ｖ１６捕捉オリゴヌクレオチド（表Ｉに示した）２０fm
olがその３'末端を介して結合させてある、直径およそ
４ミクロンの常磁性ビーズ（ダイナル）からなる容器Ｎ
o.４からの捕捉ビーズ（１９μl）を加えた。 表Ｉ ＨＰＶ捕捉オリゴヌクレオチド配列 5'-ACGTTTTTTG CGTTTAGCAG TTGTAGAGGT AGATGAGGTG- -GTGGGTGTAG CTTTTCGTTT TCCTAATGTA AATTTTGGTT-3' このビーズを反応液中６５℃で３０分間インキュベート
してＨＰＶ標的の一本の鎖を捕捉した。磁性分離を用い
てビーズを洗浄し、次いでＲＰＡ反応混合物（容器Ｎo.
６からのランダム八量体１５μｇを含有する容器Ｎo.５
からのＲＰＡ緩衝液、および容器Ｎo.７からのクレナウ
ポリメラーゼ１０単位）５０μlをビーズに加えた。こ
の混合物を４５℃で２時間インキュベートし、次いで容
器Ｎo.８からの５ＭＮaＯＨ１０μlを加えてＲＰＡ産物
を変性させた。室温で２分後に、容器Ｎo.３からの中和
緩衝液（上記）３０μlを加えた。変性したＲＰＡ産物
を、容器Ｎo.９からの水５μl中のＨＰＶ１６ＲＮＡ１
０ngに、６５℃で１時間ハイブリダイズさせた。過剰の
ハイブリダイズしていないＲＮＡは、容器Ｎo.１１から
の洗浄緩衝液（１００mＭトリスＨＣlpＨ７.５、６００
mＭＮaＣl、０.２５％トゥイーン２０）に入れた容器Ｎ
o.１０からの１０μg／mlＲＮアーゼＡ２００μlの添加
により消化した。容器Ｎo.１２からのＲＮＡ：ＤＮＡハ
イブリッドに特異的な抗体［ボグスラフスキ・Ｓ．Ｊ．
等、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ
（Ｊ．Ｉmmunol．Ｍethods）第８９巻１２３頁（１９８
６）］で覆った磁性ビーズ（上記）上に、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａハイブリッドを捕捉した。このビーズを洗浄緩衝液
（容器Ｎo.１１）で２回、容器Ｎo．１３からの１００m
ＭトリスＨＣlpＨ７.５、０.１５ＭＮaＣl、０.２５％
トゥイーン２０で１回洗浄し、次いで容器Ｎo.１４から
のＲＮアーゼＩＩＩ（４０mＭトリスＨＣlpＨ７.５、４
mＭＭgＣl₂中１０μg／ml）５０μlを加え、室温で１５
分間インキュベートして、捕捉された二本鎖ＲＮＡを減
成させた。次に、捕捉されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッ
ドを、容器Ｎo.１５からのアルカリホスファターゼに結
合させた抗ＲＮＡ：ＤＮＡ抗体と反応させ、次いで洗浄
緩衝液（容器Ｎo.１１）で６回洗浄し、アルカリホスフ
ァターゼ活性を「ＥＬＩＳＡ増幅系」（ＢＲＬカタログ
番号９５８９ＳＡ、ライフ・テクノロジーズ・Ｉnc．、
ガイザースバーグ、ＭＤ）によって検出した。表ＩＩに
結果を示す。ＨＰＶ１６ＤＮＡ１０フェムトグラム（f
g）が検出できた。上の実施例に定義されたキットの構
成成分を全て準備する必要はない。例えばＮaＯＨ、Ｒ
Ｎアーゼ及び洗浄緩衝液といったような多くの試薬及び
緩衝液は、当業者の研究室で普通に入手できる。 表ＩＩ 投入ＨＰＶ１６ＤＮＡ 光学密度（４９０ｎｍ） １０００ｆｇ ７．８； ８．０ １００ｆｇ ５．８； ４．７ ２５ｆｇ １．５８； １．６６ １０ｆｇ ０．９６； １．０５ １ｆｇ ０．５９９； ０．７０７ ０ｆｇ ０．４７５； ０．５２１

【００２４】実施例５ ＲＰＡ法の能力を、異なる濃度の三燐酸塩基質で測定し
た。１００pgの量の線状ＨＰＶタイプ１８プラスミドＤ
ＮＡ（上記）を、ＲＰＡ緩衝液、ランダム八量体、及び
以下の濃度のヌクレオシド三燐酸：a）dＡＴＰ、dＧＴ
Ｐ、dＴＴＰおよびdＣＴＰ各々４００μＭ；b）dＡＴ
Ｐ、dＧＴＰ、dＴＴＰおよびdＣＴＰ各々１５０μＭ；
c）dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰおよびdＣＴＰ各々５０
μＭ；またはd）ファインバーグ及びボーゲルシュタイ
ンのプローブ合成法（上記参照）において推奨される三
燐酸塩濃度、即ち、dＡＴＰ、dＧＴＰ、及びdＴＴＰ各
々２０μＭ、及びdＣＴＰ０.５μＭ、と混合した。反応
液を上記のごとく煮沸し冷却した。クレナウポリメラー
ゼ１０単位を加え、反応液を４５℃で２時間インキュベ
ートした。この反応液をドットブロット法により分析し
た。このドットブロットのオートラジオグラフは、反応
液a）で約８００倍；反応液b）で３００倍；反応液c）
で５０倍の増幅を示し；そして反応液d）では検出可能
な増幅を示さなかった。これらの結果は、ヌクレオチド
濃度が、ＲＰＡ法で得られる増幅に著しい影響を及ぼす
ことを証明している。

【００２５】実施例６ ＲＰＡ法におけるランダム八量体の濃度の影響を研究し
た。１００pg量の線状ＨＰＶタイプ１８プラスミドＤＮ
Ａを、ＲＰＡ緩衝液、ヌクレオシド三燐酸４００μＭ、
及び５０μlの反応容量につきa）３０μg、b）１５μ
g、c）７．５μg、d）３.７μg、またはe）１.９μｇの
量のランダム八量体プライマーと混合した。煮沸及び冷
却後、クレナウポリメラーゼ３０単位を各反応液に加
え、各反応液を４５℃で２時間インキュベートした。各
反応液の等分試料をドットブロット分析により分析し
た。オートラジオグラフは、a）で約２０００倍、b）で
２５００倍、c）で１５００倍、d）で３００倍、そして
e）で４０倍の増幅を示した。これらの結果は、合成ラ
ンダム八量体の最適な量が、反応液５０μlにつきおよ
そ１５μgであることを示している。

【００２６】実施例７ イノシンを含むプライマーがデ・ノボ合成を減少させる
能力を調べた。反応は、０.５ Ｘ ＲＰＡ緩衝液（０.
５ Ｘ ＲＰＡ緩衝液＝２５mＭトリスＨＣl、pＨ７.
１；２.５mＭＭgＣl₂；５mＭβ−メルカプトエタノー
ル；２００μg／mlアセチル化牛血清アルブミン）中５
０μlの容量で実施した。各試料は、大腸菌（Ｅ．col
i）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウフラグメント２０
単位、及び０.５ＸＲＰＡ緩衝液中で５分間煮沸するこ
とにより変性させてある線状ＨＰＶ１６プラスミドＤＮ
Ａ１pgを受容した標的試料を含有させた。３７℃または
２５℃でインキュベーションを行ない、そして反応中特
定の時間に試料を採取し、２０mＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（Ｎa₂ＥＤＴＡ）５０μl、pＨ８.０中
に希釈した。dＩを含むランダム八量体プライマーが、
標準ホスホアミダイト化学を用いてシンセセル・コーポ
レーション（ガイザースバーグ、ＭＤ）により化学合成
された。各重合サイクルの間、４種の全ヌクレオチド：
dＡ、dＩ、dＣ、およびdＴの当モル量が添加された。ラ
ンダム八量体プライマーの濃度は、最適な標的特異性Ｒ
ＰＡ生産高に基づいて選択した。特に、５μgのdＧ含有
プライマー及び３０μgのdＩ含有プライマーを各反応に
使用した。試験１及び２はそれぞれ３７℃及び２５℃で
実施した。さらに、試験１及び試験２のために異なった
ＲＰＡ緩衝液の調製品を使用した。ＲＰＡ産物を、ヘキ
スト３３２５８染料の挿入、この後蛍光測定法による検
出によって定量した。試薬は製造者の指示に従って調製
した。定量は、モデルＴＫＯ１００ＤＮＡフルオリメー
ター（ホーファー・サイエンティフィック、サンフラン
シスコ、ＣＡ）を用いて実施した。ＤＮＡ標準は、「１
ＫbＤＮＡラダー」（ＢＲＬカタログ番号５６１５Ｓ
Ａ、ライフ・テクノロジーズ、Ｉnc．、ガイザースバー
グ、ＭＤ）であった。ドット−ブロットハイブリダイゼ
ーション、次いで、既知量のＤＮＡ標的を含有する標準
を用いベータスコープ６０３ブロットアナライザー（ベ
ータジェン・Ｃorp．、ワルサム、ＭＡ）で定量するこ
とにより、標的特異性ＤＮＡ合成を測定した。表ＩＩＩ
は、標的特異性、及びデ・ノボ（総ＤＮＡ）合成の速度
論を示している。（２つの試験にはＲＰＡ緩衝液の異な
る調製品を用いた。）ランダムdＩ含有八量体プライマ
ーは、遅い速度ではあるが、より高い標的特異性ＨＰＶ
１６ＤＮＡ増幅を与える。さらに、標的特異性ＤＮＡ合
成は、dＩプライマーが用いられた場合には明らかにデ
・ノボ合成に優るが、これに対しdＧ−ランダム八量体
の場合は、標的特異性及びデ・ノボ合成は比較的緊密に
同調している。

【００２７】 表ＩＩＩ 試験１、３７℃ 時間（時間）： １.５ ３.０ １５ dＧプライマー： 全合成（μｇ）： ３.９ １０.８ １８.３ 特異的合成（ｐｇ）： １.６ ６.５ ６.５ dＩプライマー： 全合成（μｇ）： ０ １.３ １０.３ 特異的合成（ｐｇ）： ０.５６ １３.０ ４４.８ 試験２、２５℃ 時間（時間）： １.２５ ２.５ ４.０ １５ dＧプライマー： 全合成（μｇ）： ０.５３ ６.３ ９.８１ １７.４ 特異的合成（ｐｇ）： ４ ９９ １０５ １１４ dＩプライマー： 全合成（μｇ）： ０ ０ ０.４ ２２ 特異的合成（ｐｇ）： １.６ １４ ６３ １６４ デ・ノボ合成は、ＲＰＡ反応の構成因子（ヌクレオチド
及び酵素）について標的と競合し、与えられた反応にお
いて達成できる増幅の程度を低下させ得る。dgがdＩに
置き換わっているランダムプライマーは、反応構成因子
についてのこの望ましくない競合を減じて、ＲＰＡによ
るＤＮＡの増幅能力を実質的に改善する。本明細書の記
載、実施例及び態様は、例示のみの目的であり、本発明
の精神及び範囲ならびに特許請求の範囲内での、様々な
修飾が示唆されることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク・エス・バーニンガー アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ハイアリー・ウエイ12513 番

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ランダムにプライミングされた、そして
   鋳型に依存した様式の核酸の増幅からなる、試料中の鋳
   型核酸配列を実質的に増幅させる方法であって、そのラ
   ンダムにプライミングされた増幅が、 （１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群から選ばれる正確に３個
   の塩基、及び、 （２）要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかった
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［こ
   こで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみな
   す］を有するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
   レオチドからなるランダムオリゴヌクレオチドプライマ
   ーによって起こり、それにより、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ
   から選ばれる塩基を含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の塩
   基類似体を含まないランダムオリゴヌクレオチドプライ
   マーの場合に観察される水準に比較して、デ・ノボ増幅
   が低下する、方法。
2. 【請求項２】 ランダムにプライミングされた増幅が、
   塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、及びＩを有するデオキシリボヌ
   クレオチドを含むプライマーによって起こる［ここで塩
   基Ｕ及び塩基Ｔは厳密に同等であるとみなす］、請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 ランダムにプライミングされた、そして
   鋳型に依存した様式で試料中の鋳型核酸配列を実質的に
   増幅させる方法であって、 （ａ）鋳型核酸鎖を過剰のランダムオリゴヌクレオチド
   プライマーでプライミングし；そして、 （ｂ）この鋳型核酸鎖及びこの過剰のランダムオリゴヌ
   クレオチドプライマーを、過剰の誘導剤、鎖置換剤、及
   び過剰の三燐酸塩基質の存在下でインキュベートして、
   核酸鎖をランダムに増幅させる［ここでランダムオリゴ
   ヌクレオチドプライマーは、 （１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群から選ばれる正確に３個
   の塩基、及び、 （２）要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかった
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［こ
   こで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみな
   す］を有するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
   レオチドからなる］工程からなり、それにより、塩基
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧを含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の
   塩基類似体を含まないランダムプライマーの場合に観察
   される水準に比較して、デ・ノボ増幅が低下する、方
   法。
4. 【請求項４】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
   が塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、及びＩを有するデオキシリボ
   ヌクレオチド［ここで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同
   等であるとみなす］を含む、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 ランダムにプライミングされた、そして
   鋳型に依存した様式で試料中の鋳型核酸配列を実質的に
   増幅させる方法であって、 （ａ）鋳型核酸鎖を過剰のランダムオリゴヌクレオチド
   プライマー（ここで、該プライマーは６量体および１０
   量体からなる）でプライミングし；そして、 （ｂ）この鋳型核酸鎖及びこの過剰のランダムオリゴヌ
   クレオチドプライマーを、過剰のＤＮＡポリメラーゼＩ
   のクレナウフラグメント及び過剰の三燐酸塩基質の存在
   下でインキュベートして、核酸鎖をランダムに増幅させ
   る［ここでランダムオリゴヌクレオチドプライマーは、 （１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群から選ばれる正確に３個
   の塩基、及び、 （２）要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかった
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［こ
   こで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみな
   す］を有するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
   レオチドからなる］工程からなり、それにより、塩基
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧを含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の
   塩基類似体を含まないランダムプライマーの場合に観察
   される水準に比較して、デ・ノボ増幅が低下する、方
   法。
6. 【請求項６】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
   が塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、及びＩを有するデオキシリボ
   ヌクレオチド［ここで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同
   等であるとみなす］を含む、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 （ａ）実質的増幅が、ランダムにプライ
   ミングされた、且つ乳頭腫ウイルスＤＮＡの鋳型依存性
   合成からなる、試料中の乳頭腫ウイルス核酸配列の実質
   的増幅；および、 （ｂ）該乳頭腫ウイルスの検出［ここでランダムオリゴ
   ヌクレオチドプライマーは、 （１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群から選ばれる正確に３個
   の塩基、及び、 （２）要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかった
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［こ
   こで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみな
   す］を有するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
   レオチドからなる］からなり、それにより、塩基Ａ、
   Ｔ、Ｃ、及びＧを含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の塩基
   類似体を含まないランダムプライマーの場合に観察され
   る水準に比較して、デ・ノボ増幅が低下する、試料中の
   乳頭腫ウイルスの検出方法。
8. 【請求項８】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
   が塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、及びＩを有するデオキシリボ
   ヌクレオチド［ここで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同
   等であるとみなす］を含む、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 １またはそれ以上の容器［ここで、 （ａ）第一の、容器または一連の容器には、ランダムオ
   リゴヌクレオチドプライマーが入っており； （ｂ）第二の容器には誘導剤が入っており； （ｃ）第三の、容器または一連の容器には、三燐酸塩基
   質が入っており；そして、 （ｄ）第四の、容器または一連の容器には、該キットの
   構成因子を再構成または希釈するための緩衝液が入って
   いる［ここで、ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
   は、 （１）Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群から選ばれる正確に３個
   の塩基、及び、 （２）要素（ａ）の塩基の１個として選ばれなかった
   Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの群の中の塩基の塩基類似体、［こ
   こで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密に同等であるとみな
   す］を有するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
   レオチドからなり、それにより、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、及び
   Ｇを含み、群Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ中の塩基類似体を含ま
   ないランダムプライマーの場合に観察される水準に比較
   して、デ・ノボ増幅が低下する］］がその中にきっちり
   詰め込まれるよう区分化された担体からなる、試料中の
   核酸配列を、ランダムにプライミングされた、そして鋳
   型依存性の様式で実質的に増幅するためのキット。
10. 【請求項１０】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
    ーが、塩基としてＡ、Ｔ、Ｃ、及びＩを有するデオキシ
    リボヌクレオチド［ここで、塩基Ｕ及び塩基Ｔは、厳密
    に同等であるとみなす］を含む、請求項９に記載の方
    法。