ES2246546T3 - Valoracion de enfermedades relacionadas con el virus de papiloma humano. - Google Patents
Valoracion de enfermedades relacionadas con el virus de papiloma humano.Info
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Abstract
Un procedimiento para la detección de transformación celular inducida por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de: - medida de al menos dos niveles de ARNm expresados de VPH a partir de una muestra recogida de dicho paciente, en la que dichos ARNm comprenden un primer ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E6 y ARNm de E7 y un segundo ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E2 y ARNm de L1; - determinación del nivel de expresión de E6 y/o E7 y nivel de expresión de E2 y/o L1 de modo que se determina una relación de E6 y/o E7 a L1 y/o E2, en el que una relación superior a 2 es indicativo de transformación celular inducida por VPH y riesgo de neoplasia.
Description
Valoración de enfermedades relacionadas con el
virus de papiloma humano.
La presente invención se refiere en general al
campo de los ensayos citológicos y moleculares y de forma específica
al área de ensayos para la valoración de enfermedades que usan un
ensayo sensible para la diagnosis y pronóstico de carcinoma inducido
por VPH.
La detección y diagnosis de enfermedad es de
obvia importancia para el tratamiento de enfermedades. Se han
identificado numerosas características de enfermedades y se usaron
muchas para la diagnosis de enfermedades. Muchas enfermedades van
precedidas, y se caracterizan por, cambios en el estado de las
células afectadas. Los cambios pueden incluir la expresión de genes
virales en células infectadas, cambios en los modelos de expresión
de genes en células afectadas, y cambios en la morfología celular. A
la diagnosis por detección, y al seguimiento de enfermedades puede
ayudar la valoración de tales estados celulares.
Un aspecto de la presente invención se refiere al
virus de papiloma humano (VPH), que induce proliferaciones
epiteliales benignas de la piel y mucosa en humanos y está asociado
con neoplasias anogenitales y carcinomas. El ADN intacto del VPH
está superarrollado y se asemeja por tanto a un lazo sinfín del
cordón del auricular telefónico helicoidal. Dentro de esta
envoltura el ADN viral está empaquetado en y en torno a proteínas
del núcleo celular, histonas y péptidos asociados, dentro de una
estructura que se asemeja a la cromatina celular (Turek, (1994)).
Los virus de papiloma humano caracterizados hasta la fecha están
asociados con lesiones confinadas en las capas del epitelio de la
piel, o mucosa oral, faringelar, respiratoria, y, lo más
importante, anogenital. Los tipos de virus de papiloma humano
específicos, incluyendo VPH 6 y 11, provocan frecuentemente lesiones
mucosales benignas, mientras que otros tipos, VPH 16, 18 y un
huésped de otras cepas, se encuentran predominantemente en lesiones
de alto grado y cáncer. Todos los virus de papiloma humano y animal
parecen disponer de una organización genética similar, aunque hay
diferencias en las funciones de los genes virales individuales y en
su regulación. El tipo de VPH genital más común asociado con el
carcinoma cervical, el VPH 16, se ha estudiado más
extensivamente.
Todos los marcos de lectura abiertos de gran
tamaño (ORF) en el VPH se encuentran sobre una hebra de ADN. Los
ARNm del virus de papiloma parecer ser transcritos únicamente a
partir de una hebra simple en células infectadas. El genoma viral
se puede dividir en tres regiones, la región regulatoria aguas
arriba (URR), o la región controladora larga (LCR), que contienen
secuencias de control para la replicación del VPH y expresión de
genes, la región de genes precoces virales, que codifica, entre
otros, los genes E2, E6 y E7, y la región tardía, que codifica los
genes L 1 y L2 (Turek, (1994)).
La expresión de genes del VPH en enfermedades
premalignas de alto grado o cáncer parece restringirse a los genes
precoces, posiblemente debido a la parada en la diferenciación
celular inducida por los genes E6 y E7 virales. En comparación con
la infección por VPH activa, el control de genes E6 y E7 en cáncer
está desordenado por mutaciones en la URR viral y, en fragmentos
virales integrados, por la interrupción del gen E2 viral,
estabilización de ARNm de E6 y E7, e influencias en lugar de
integración celular.
Debido a que el gen E2 está interrumpido o
inactivado en fragmentos de VPH integrados en carcinomas cervicales
invasivos (Cullen, (1991); Dürst, (1985); Matsukura (1989);
Schneider-Gädicke, (1986); Schwarz, (1985);
Wilczynski, (1988)), se ha predicho que la pérdida de E2 confiere
una ventaja de crecimiento selectivo a la célula infectada debido a
la expresión de E6 y E7 no controlada
(Schneider-Gädicke, (1986); Schwarz, (1985)).
Incluso las células cervicales que contienen genomas de VPH
replicantes segregan rápidamente y son generadas en cultivo por
células que contienen genomas virales integrados (Jeon (1995)), pero
el(los) mecanismo(s) subyacente(s) no
ha(n) permanecido claro(s) hasta recientemente. Los
productos del gen E2 del VPH 16 de longitud completa son activadores
transcripcionales fuertes comparables al E2 del VPH I en algunos
virales así como también en promotores sintéticos simples (Demeret
(1994): Ushikai (1994)).
Se considera que los genes E6 y E7 tienen
actividad oncogénica. Las proteínas codificadas interactúan con e
interrumpen las funciones fisiológicas de proteínas celulares que
están involucradas en el control del ciclo celular. Las proteínas
E6/E7 del VPH 16, 18 o tipos relacionados son las más eficientes a
este respecto. Algunas de estas actividades llevan a la
inestabilidad genética de la célula humana infectada
persistentemente. Esto mejora la probabilidad de mutaciones en
proto-oncogenes celulares y genes supresores de
tumor y por tanto contribuye por tanto a la progresión del tumor.
Las mutaciones en genes celulares enfocados a la vigilancia
intracelular de infecciones con VPH, integración de ADN viral y
deleciones o mutaciones de secuencias de control de transcripción
viral llevan a una expresión significativamente mayor de los genes
E6/E7, que es una característica consistente de la neoplasia
intraepitelial de alto grado y cánceres. La inestabilidad genética
provocada por oncoproteínas virales y el aumento autocatalítico en
la expresión de la oncoproteína provocada por mutaciones en el
genoma viral y celular identifican el virus como una fuerza motriz
principal de la progresión del carcinoma.
El documento WO 91/08312 describe un
procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN específico y/o
transcritos de ARN de genes E6 y/o E7 de VPH que proporciona un
indicador de pronóstico de neoplasia cervical grave y cáncer.
Se han implicado tipos individuales de virus de
papiloma humano (VPH) que infectan las superficies de la mucosa como
los agentes causantes de carcinomas del cérvix, ano, pene, laringe
y la cavidad bucal, carcinomas perilinguales ocasionales, así como
también de verrugas anogenitales benignas. La identificación de
tipos de VPH particulares se usa para la identificación de
pacientes con lesiones premalignas que están en riesgo de
progresión a malignidad. Aunque estén presentes lesiones
anogenitales visibles en algunas personas infectadas con virus de
papiloma humano, la mayoría de los individuos con infección del
tracto genital con VPH no presentan enfermedad clínicamente
aparente, pero el análisis de los rasgos citomorfológicos presentes
en secreciones cervicales se puede usar para detectar la infección
por VPH. Los ensayos de detección viral convencionales, incluyendo
ensayos serológicos y crecimiento en cultivo celular, no se
encuentran comercialmente disponibles y/o no son adecuados para la
diagnosis y rastreo de infección por VPH. Los ensayos de
Papanicolaou son una herramienta de seguimiento valiosa, pero fallan
en una gran proporción de personas infectadas con VPH.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la valoración de la fase de
enfermedad basada en VPH.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un ensayo que se puede combinar con otros ensayos para
mejorar la exactitud y fiabilidad de valoraciones de pronóstico y
diagnóstico de enfermedad basada en VPH.
Es un objeto más de la presente invención
proporcionar un procedimiento para valorar el riesgo de un paciente
infectado con VPH de desarrollar enfermedad basada en VPH.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para estratificar pacientes que están
en la actualidad infectados con VPH pero sin enfermedad basada en
VPH detectable en aquellos en riesgo de progresar hasta enfermedad y
aquellos sin riesgo de progresar hasta enfermedad.
Es también un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la identificación de regímenes
de tratamiento para pacientes que tienen enfermedad basada en
VPH.
Aún otro objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para el seguimiento de la efectividad
del tratamiento de enfermedad basada en VPH.
Un objeto más de la presente invención es
proporcionar kits para la valoración de la fase de enfermedad
basada en VPH.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar operación, análisis y gestión de datos de los datos del
ensayo basado en computador para valorar la fase de enfermedad
basada en VPH.
Una realización de la presente invención
involucra la medida de los niveles de expresión de genes
involucrados en un estado celular, y comparación de su expresión
unos con otros o con genes de referencia en una relación específica,
como una indicación del estado de una enfermedad en la muestra
celular. La presente invención se puede usar para valorar la fase o
riesgo de una enfermedad según indica el estado de las células.
Esto se puede usar también para guiar o valorar la efectividad de
una terapia para una enfermedad mediante la identificación de la
terapia apropiada basada en el estado celular indicado o mediante
indicación de algún cambio en el estado de las células sometidas a
la terapia.
En una forma de la presente invención, se valora
la fase y pronóstico de una infección por virus de papiloma humano
(VPH) o enfermedad basada en VPH. Esta realización involucra la
medida del nivel de expresión de dos o más genes de VPH. Son genes
para este fin los genes E6, E7, L1 y E2 del VPH, aunque también se
pueden usar otros genes de VPH tales como E1, E4, E5 y L2. Se ha
descubierto que el nivel de expresión de estos genes, la relación de
expresión de estos genes unos con otros o con genes de referencia,
o ambos, son indicativos de la fase de enfermedad basada en VPH.
Se usaron niveles de expresión de genes de
acuerdo con esta invención para valorar la progresión de la
infección por VPH desde crecimiento benigno a maligno. La infección
por VPH progresa desde CIN I a CIN III y finalmente hasta cáncer
maligno. Estas fases se pueden identificar por la relación de genes
de VPH. En particular, la transición de CIN I a CIN II/III, es
decir, una transición hasta pre-malignidad, se
puede predecir cuando la relación de la presente invención es
superior a uno. Una razón mayor de 3 en la presente invención indica
una transición desde pre-malignidad hasta cáncer
maligno. Por tanto, una razón por debajo de 1 indica un bajo nivel
de CIN en una célula infectada con VPH. Una relación entre uno y
aproximadamente tres indica una CIN de alto grado (es decir, CIN
III) o afección pre-maligna. Y una relación por
encima de aproximadamente tres es un indicativo de una malignidad
inducida por
VPH.
VPH.
La figura 1 es un gráfico de detección de ARNm de
E6/E7 mostrado como el número de células/pocillo frente al número de
ARNm de E6/E7/pocillo.
La figura 2 es un gráfico de la sensibilidad de
un ensayo de L1 de VPH mostrado como el número de moléculas de
ARN/pocillo frente a la relación señal-ruido menos
1.
La figura 3 es la secuencia de sonda para L2 de
VPH 16 (ID SEQ Nº: 2).
La figura 4 es la secuencia de sonda para L1 de
VPH 16 (ID SEQ Nº: 2).
La figura 5 es la secuencia de sonda para E6/E7
de VPH 16 (ID SEQ Nº: 3).
La figura 6 es la secuencia de sonda para E2 de
VPH 16 (ID SEQ Nº: 4).
La figura 7 es la secuencia de sonda para E4 de
VPH 16 (ID SEQ Nº: 5).
La presente invención se refiere a la
identificación y seguimiento de células enfermas. Un procedimiento
involucra la medida de niveles de expresión de genes involucrados en
un estado de enfermedad, y comparar su expresión unos con otros o
con genes de referencia, como una indicación del estado de las
células. Tales medidas se pueden combinar con otros ensayos para
aumentar la exactitud y fiabilidad de la valoración del estado de
enfermedad. Se puede usar un procedimiento de la presente invención
para valorar la fase de una enfermedad según indica el estado de las
células. Este procedimiento se puede usar también para guiar o
valorar la efectividad de una terapia para una enfermedad mediante
la identificación de la terapia apropiada basada en el estado de
enfermedad indicado o mediante la indicación de cualquier cambio en
el estado de células sometidas a la terapia.
Muchas enfermedades se caracterizan por fenotipos
celulares específicos y modelos de expresión de genes. Por ejemplo,
las células neoplásticas y cancerosas muestran por lo general
ciertas morfologías distintivas y características de crecimiento.
Las características moleculares, tales como mutaciones de genes y
modelos de expresión de genes son también un buen indicador de la
progresión de la enfermedad. Las células viralmente infectadas
pueden mostrar diferentes morfologías y modelos de expresión de
genes, incluyendo expresión de genes virales. Usando la presente
invención, se pueden determinar características del estado celular,
tales como cambios en la morfología celular o expresión de genes de
una muestra del paciente.
Las características que se han de detectar son en
general específicas del estado celular de interés y de la enfermedad
que se sospecha está presente en la muestra celular. Tales
características se pueden dividir por lo general en dos tipos,
características citológicas y características moleculares. Tal como
se usa en esta invención, las características citológicas con
características tales como, por ejemplo, forma y apariencia celular
global. La identificación y clasificación primaria de muchas
células neoplásticas y cancerosas se ha conseguido tradicionalmente
usando características citológicas. La identificación de las
características citológicas es por lo general lenta, requiere un
nivel de adiestramiento relativamente elevado, y por lo general no
se puede automatizar fácilmente. Tal como se usa en esta invención,
las características moleculares son la presencia y estado de
especies moleculares determinadas, tales como proteínas, ácidos
nucleicos y metabolitos. Tales características moleculares se
identifican por lo general mediante la detección y medida de
moléculas determinadas de interés.
Las características analizadas pueden incluir
características de marcadores adicionales o sustitutas que no son
una causa directa o resultado de la enfermedad pero que están
relacionadas con ciertas enfermedades y estados celulares. Ejemplos
de tales marcadores adicionales incluyen marcadores polimórficos,
antígenos de leucocito humano (HLA) tales como B7 que predisponen
las mujeres para carcinomas cervicales, oncogenes, mutaciones p53,
otros marcadores de cáncer, oncosupresores, citoquinas, receptores
de factor de crecimiento y hormonas. Tales marcadores pueden estar
presentes en, o ausentes de, por ejemplo, células que muestran
características de estado o específicas de enfermedad, y tal
presencia o ausencia puede ser indicativo de, por ejemplo, un
estado de enfermedad más grave o menos grave. Estos marcadores se
pueden usar junto con el procedimiento descrito para inferir bien
mayor o menor riesgo de enfermedad neoplástica dependiendo del
número de grados calificaciones anormales o de la magnitud de cambio
en marcadores cuantitativos.
Ejemplos de estados de enfermedad para valoración
usando la presente invención incluyen, pero sin limitarse a estos,
neoplasias y cáncer. Estados de enfermedad de interés son
enfermedades basadas en VPH -incluyendo infección por VPH, neoplasia
intraepitelial cervical (CIN), y cáncer, células escamosas atípicas
de importancia no indeterminada (ASCUS), verrugas, condilomata,
epidermodisplasia verruciforme y otras enfermedades de la piel,
papiloma de la laringe, papiloma oral y papiloma del tejido
conjuntivo.
Una realización de la presente invención es la
detección y medida de los niveles de expresión de ciertos genes de
VPH. Se ha acumulado una cantidad impresionante de datos durante la
pasada década, que muestran que el carcinoma del cérvix está
asociado con infección de ciertos tipos de VPH. Si bien la
presencia de ADN de VPH en una lesión precancerosa es indicativa de
un riesgo relativo mayor de displasia cervical y carcinoma
invasivo, aún es difícil predecir el comportamiento clínico de
lesiones cervicales percutáneas. Los tumores se producen debido a la
acumulación de alteraciones genéticas que pueden activar los
oncogenes y/o genes supresores de tumor inactivados y/o genes
involucrados en el reconocimiento y reparación de daño en ADN.
Los niveles de expresión de las oncoproteínas de
E6 y E7 codificadas por tipos de VPH de alto riesgo son una medida
más sensible y exacta del riesgo potencial de que una infección por
VPH se desarrolle en una lesión cancerosa. La presente invención
mide las cantidades relativas de niveles de expresión de E6 y/o E7 y
E2 y/o L 1 en una lesión infectada con VPH para determinar la
relación de E6 y/o E7 a L 1 y/o E2, donde esta relación es una
medida directa del riesgo, y de la susceptibilidad de desarrollo de
una lesión cancerosa. La expresión de VPH se puede medir mediante
ARNm o niveles de proteína en la célula.
En un aspecto de la invención, se valora la fase
y pronóstico de una infección por virus de papiloma humano (VPH) o
enfermedad basada en VPH. La realización de la presente invención
involucra la medida del nivel de expresión de uno o más genes de VPH
que se descubrió están relacionados con la fase y naturaleza de la
enfermedad basada en VPH. Genes útiles para este fin incluyen los
genes E6, E7, L1 y L2 del VPH. Se ha descubierto que el nivel de
expresión de estos genes, la relación de expresión de estos genes
unos con otros o con uno o más de otros genes, o ambos, son
indicativos de la fase de enfermedad basada en VPH. El nivel de
expresión es relativo a otros genes de VPH, o el nivel de expresión
relativo a un gen no de VPH, denominado en esta invención como un
gen de referencia. Tales genes de referencia pueden ser cualquier
gen apropiado (no codificado por VPH), y son, por ejemplo, genes de
mantenimiento u otros genes expresados de forma constitutiva.
Ejemplos de genes de referencia incluyen genes de actina, genes del
citoesqueleto, genes de histona, genes de tubulina, genes del
receptor del factor de crecimiento epidérmico, el gen p53 normal,
el gen pRB normal, genes de ciclina, genes de
\beta-globina, y genes de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La
expresión de genes de referencia se puede medir en la misma célula
ya que se mide el nivel de genes de VPH o en células vecinas en la
misma muestra celular. En tal caso el gen de referencia es un
control interno para la expresión de genes.
La interrelación del nivel relativo de expresión
de estos genes con el estado de las células infectadas con VPH se
ilustra en general en la tabla 1 siguiente.
| Carácter | Estado de | E6, E7, | E2 | L1 |
| médico | enfermedad | E6+E7 | ||
| basada en VPH | ||||
| Benigno | Tejido normal | Bajo | Bajo a alto | Bajo a |
| infectado con VPH | indetectable | |||
| Benigno | CIN de bajo grado, | Bajo a medio | Bajo a alto | Medio a alto |
| es decir, CIN I | ||||
| Neoplástico | CIN de alto grado, | Medio a alto | Bajo a | Bajo a |
| es decir CIN II/III | indetectable | indetectable | ||
| Neoplástico | Cáncer | Medio a alto | Bajo a | Bajo a |
| indetectable | indetectable |
La CIN de alto grado basada en VPH referenciada
en la tabla es la fase premaligna que lleva a cáncer y la CIN de
bajo grado es una infección viral productiva que tiene un poco
potencial maligno pero es un problema de salud público en cuanto a
la extensión de infección por VPH. Tejido normal se refiere a tejido
citológicamente normal que está infectado con VPH. Aunque no se
limite a esta norma, una norma para establecer este límite inferior
de expresión es un nivel por debajo del detectable usando el ensayo
de captura de híbrido descrito en el documento WO 93/10263 de
Digene. Tal como se usa en esta invención, E6/E7 se refiere a E6, E7
o E6 + E7. La adición de genes, como con "E6+E7", por ejemplo,
se refiere a la expresión combinada de los genes adicionados.
Como se puede discernir fácilmente, cada estado
de enfermedad principal se representa por un único modelo de
expresión de estos tres conjuntos de genes. Ambas afecciones están
consideradas como problemáticas médicas graves. Se pueden usar
también otras interrelaciones que involucran el nivel de expresión
relativo de otros genes de VPH (tales como E1, E4, E5 y L2), y otros
genes no de VPH, para valorar el estado celular. Por ejemplo, L2 y
E4 se asocian frecuentemente con enfermedades de producción viral
benignas, y E1 es similar en perfil a E2 y se deleciona
frecuentemente en enfermedades malignas. Pueden existir otras
interrelaciones de expresión para estas proteínas del VPH para otras
enfermedades basadas en VPH, y se puede usar el procedimiento
descrito para valorar el estado de estas otras enfermedades usando
los niveles y relaciones apropiados para esa enfermedad.
Usando información acerca de los niveles y
relaciones de genes de VPH en diferentes estados celulares, se puede
valorar la fase de la enfermedad de diferentes formas. En algunos
casos, la presencia o ausencia de expresión detectable es indicativa
del estado de enfermedad en las células infectadas. Por ejemplo, una
falta de expresión de E2 (cuando el VPH está presente) es
indicativo de CIN de alto grado o cáncer. En otros casos, un cambio
o diferencia en la expresión de un producto génico de VPH puede ser
indicativo del cambio que ocurre en el estado de la célula
infectada. Por ejemplo, un nivel mayor de expresión de E6 y E7-
respecto a, por ejemplo, una muestra previa o una muestra de
referencia- puede ser indicativo de CIN de alto grado o cáncer. Se
usa un cambio en la relación de expresión de E6/E7 a expresión de E2
para identificar CIN de bajo grado o un desplazamiento de las
células normales a CIN de bajo grado. También son posibles otras
muchas combinaciones de comparaciones, y se pueden derivar otras
combinaciones de la información de la tabla 1 para uso en el
procedimiento de la presente invención.
Un modo en el que pueden estar relacionadas las
relaciones de genes de VPH con estados de enfermedad basada en VPH
es mediante referencia a grupos de genes de VPH. Para este fin, los
genes o conjuntos de genes del grupo I incluyen E6, E7, y E6 + E7.
Los genes o conjuntos de genes del grupo 2 incluyen L1, L2, E4 y
cualquier combinación. Los genes o conjuntos de genes del grupo 3
incluyen E1, E2, E5 y cualquier combinación. Relaciones de
expresión útiles incluyen relaciones de miembros del grupo 1 con
miembros del grupo 2 o del grupo 3. Ejemplos de estas relaciones son
(E6+E7)/(L1+L2), E6/L1, E7/L1, E6/L2, E7/L2, (E6+E7)/L1,
(E6+E7)/L2), E6/(L1+L2) y E7/(L1+L2). Para tales relaciones un valor
inferior a dos es indicativo de infección por virus de papiloma
humano benigna o neoplasia intraepitelial de bajo grado. Este tipo
de infección se clasifica también como CIN I. Infecciones con VPH
que progresan más allá de CIN I indican que ha tenido lugar la
transformación celular y que ha comenzado el crecimiento canceroso.
Estas infecciones tardías (CIN II/III) presentan relaciones
superiores a 2. Una relación de expresión superior a dos es
indicativa de neoplasia intra-epitelial de alto
grado o cáncer pre-maligno. Una relación de
expresión mucho mayor de dos (es decir, supera 4 y hasta el
infinito) es indicativa de cáncer. Relaciones preferidas para uso
en esta invención son (E6+E7)/L1, (E6+E7)/(L1+L2),
(E6+E7+E2+E4)/(L1+L2), (E6+E7)/(E2+E4), (E6+E7)/E2,
(E6+E7+E2-E4)/(L1+L2).
Estas son distintas formas en las que se pueden
comparar y categorizar niveles de expresión de genes de VPH medidos.
Por ejemplo, cuando la presencia o ausencia de expresión sea
indicativo del estado de la célula, se analiza la expresión del gen
de VPH sin referencia al nivel de expresión de otros genes. Cuando
el nivel de expresión de un gen de VPH relativo es indicativo del
estado de la célula, el nivel de expresión medido se compara, por
ejemplo, con el nivel de expresión del mismo tipo de gen de VPH en
una muestra celular diferente (tal como una muestra celular previa
de la misma fuente o células de referencia que portan VPH), con el
nivel de expresión de un tipo diferente de gen de VPH en la misma o
una muestra celular diferente, con el nivel de expresión de un gen
de referencia no de VPH en la misma muestra celular, o con el nivel
de expresión de un gen de referencia no de VPH en células de
referencia.
En una realización de la presente invención, se
comparan niveles y relaciones de expresión de genes de VPH con los
niveles de los mismos genes en una línea celular que contiene VPH
(tal como HeLa o CaSki). Tales líneas celulares proporcionan un
patrón frente al cual se comparan niveles de expresión de genes de
VPH en muestras celulares. Tales comparaciones se usan para valorar
y comparar los niveles absolutos de expresión de estas proteínas de
VPH con aquellos de una línea celular patrón o comparativa. Otras
líneas celulares útiles para este fin son líneas celulares no
cancerosas infectadas con VPH 16 (tal como W12) o VPH 31 (tal como
CIN-612; Meyers (1992)).
Los niveles y relaciones de expresión de genes de
VPH se comparan también con genes de referencia, tales como genes de
mantenimiento u otros genes expresados de forma constitutiva, en las
mismas células o en células de referencia, tal como una línea
celular. Por ejemplo, se mide el nivel de expresión del gen de VPH
y del gen de referencia en la misma muestra celular. Tales medidas
proporcionan un control interno del nivel de expresión global en
una muestra celular y se usan para calcular un nivel de expresión
corregido para el gen de VPH para permitir comparaciones más exactas
del nivel de expresión entre diferentes muestras celulares. Una
forma de corrección se designa como normalización. Por tanto, se
puede medir el nivel de expresión de uno o más genes de VPH en dos o
más muestras celulares junto con el nivel de expresión del mismo gen
de referencia en cada una de las muestras celulares. El nivel de
expresión de los genes de VPH se normaliza luego con cada uno de los
otros basado en diferencias, si las hay, entre el nivel de
expresión medido del gen de referencia en cada una de las
muestras.
En algunas fases de la enfermedad basada en VPH,
la expresión de un gen de VPH particular es baja o indetectable. Tal
falta de expresión detectable se usa en esta invención para
identificar modelos de expresión que sirven como indicadores de
pronóstico o diagnóstico. Se valora la expresión de otros genes de
VPH en paralelo o en el mismo ensayo para proporcionar un control
para la falta de expresión de uno o más de los genes que se van a
valorar. Esto se consigue mediante medida de la expresión de los
distintos genes de VPH conjuntamente o en paralelo. Por ejemplo, la
medida del nivel de expresión de los genes E6, E7, L1, E4 y E2 de
VPH en paralelo es útil ya que al menos uno de estos genes se
expresa en todas las fases de enfermedad basada en VPH. En una
realización preferida de la presente invención, una relación de
E6/E7 a L1/L2 proporciona un indicador de la probabilidad de
desarrollo de cáncer a partir de infección por VPH. De este modo se
recoge información indicativa así mismo proporciona también un
control interno. La presencia de L1, L2 y E4 en combinación es
también indicativa de enfermedad benigna mientras que la ausencia
de E1 y/o E2 es indicativa de potencial neoplástico.
Los tipos de comparación descritos anteriormente
se pueden usar también con otros genes y otros estados de
enfermedad. Esto es, el nivel de expresión medido de un gen de
interés se puede comparar, por ejemplo, con el nivel de expresión
del mismo tipo de gen en una muestra celular diferente (tal como una
muestra celular precoz de la misma fuente o células de referencia
apropiadas), con el nivel de expresión de un tipo diferente de gen
en la misma o una muestra celular diferente, con el nivel de
expresión de un gen de referencia en la misma muestra celular, o con
el nivel de expresión de un gen de referencia en células de
referencia.
Se puede valorar la expresión de genes de
interés, tales como los genes E6, E7, L1, E4 y E2 de HPV usando
cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se puede detectar ARN
usando técnicas de hibridización, amplificación o secuenciación, y
se puede detectar la proteína usando anticuerpos específicos. Se
conocen muchas técnicas para la detección específica de la
expresión del gen, mediante detección de productos de expresión, y
se pueden usar con el procedimiento descrito. Una técnica para la
detección y medida del nivel de expresión de genes de interés es la
detección de ARN transcrito a partir de genes de interés. Para las
comparaciones más fiables, se deberían medir los niveles de
expresión que se van a comparar usando la misma técnica y se
llevarían a cabo de la misma forma.
Para la detección por hibridización de ácidos
nucleicos de VPH, se puede usar una mezcla de sondas específicas
para estas secuencias de diferentes tipos de VPH. Esto asegura que
el procedimiento detectará la expresión independientemente del tipo
de VPH involucrado. Para algunos fines puede ser deseable usar
sondas diseñadas para la secuencia de un cierto tipo de VPH, o una
mezcla de sondas para sólo algunos tipos de VPH. Tales sondas puede
o no pueden ser de tipo específico dependiendo de las diferencias
entre las secuencias de los ácidos nucleicos del VPH que se van a
detectar. Una mezcla útil para este fin incluiría sondas para tipos
de VPH asociados más estrechamente con una progresión a cáncer. Los
tipos de VPH asociados más comúnmente con cáncer cervical son los
tipos 16 y 18.
Técnicas útiles para la medida del nivel de
expresión de un gen de interés en una muestra celular incluyen la
técnica de captura de híbrido descrita en el documento WO 93/10263
de Digene, hibridización in situ por PCR descrita por (Nuovo,
1997), ensayos de ADN ramificado (Chernoff 1997), amplificación
mediada por transcripción (TMA), Stoflet (1988), y reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa
(LCR), replicación de secuencia auto-sostenida
(3SR), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA),
amplificación de desplazamiento de hebra (SDA), y amplificación con
replicasa Q\beta (Birkenmeyer y Mushahwar (1991); Landegren,
(1993)).
Se conocen numerosos ensayos para la detección y
medida de productos de expresión de gen y se pueden adaptar para la
determinación del nivel de expresión de genes de interés en el
ensayo descrito. Por ejemplo, se pueden adaptar también muchas de
las técnicas para la detección de VPH en general o expresión de
otros genes de VPH descritas más adelante para uso en el ensayo
descrito para la detección de expresión de genes E6, E7, L1, E4 y E2
de VPH.
Son conocidos muchos ensayos de detección y
caracterización de VPH, que se pueden usar en el procedimiento
descrito, incluyendo ensayos que involucran Southern blots, ensayos
a la gota, hibridización in situ, reacción en cadena de la
polimerasa, e hibridización en solución. Mant (1997) describe
ensayos de PCR usados para identificar ADN de tipos de VPH
específicos. Cope (1997) describe un ensayo basado en PCR que usa un
cebador consensual y un ensayo de captura de híbrido (HCA) de
detección de tipos de VPH. El ensayo de captura de híbrido se
describe también en el documento WO 93/10263 de Digene. El ensayo de
captura de híbrido es un procedimiento útil para la detección de VPH
y para la determinación del tipo de VPH en combinación con el
ensayo descrito.
Swan (1997) describe un ensayo de detección de
VPH que explota la actividad 5' a 3' exonucleolítica de la Taq ADN
polimerasa para aumentar la señal de tintes fluorescentes mediante
la liberación de estos desde sondas específicas del genotipo
durante la PCR. Lizardi (1997) describe un procedimiento de
detección de VPH usando hibridización in situ con sondas no
radioactivas y visualización en campo brillante o microscopía de
fluorescencia convencional, o microscopía confocal de barrido de
láser. Zehbe [1] (1997), describe una versión modificada de
hibridización in situ para detección de VPH que involucra
amplificación de señal. Leiserowitz (1997) describe el uso de
reacción en cadena de la transcriptasa-polimerasa
inversa para detectar VPH. Zehbe [2] (1997), describe un ensayo de
hibridización por captura tipo sandwich basada en ensayo de
inmunoabsorbente ligado a enzima, no isotópico para la detección de
VPH.
En una realización de la presente invención se
analizó ARN directamente mediante procedimientos basados en
solución. Las células se lisaron en primer lugar mediante adición
de un enzima proteolítico a las células contenidas en pocillos de
una placa de microtítulos. Ejemplos no limitativos de enzimas para
uso en la presente invención incluyen proteinasa K o pronasa. Las
células se pueden someter también a lisis con detergente o lisis por
ósmosis o a una prensa francesa. Tras incubación se añadieron
sondas de ADN biotiniladas a cada pocillo. Se capturaron los
híbridos ARN:ADN sobre una fase sólida mediante transferencia a
microplacas recubiertas de estreptavidina. Se añadieron anticuerpos
conjugados con fosfatasa alcalinos a los híbridos ARN:ADN en cada
pocillo en la microplaca de hibridización y se generaron señales
mediante adición de un reactivo de quimioluminiscencia tal como
CDP-Star® con Emerald II (Tropix) a cada pocillo. Se
leyó la señal de la microplaca. Se llevó a cabo el análisis de ADN
basado en solución de forma similar al análisis de ARN excepto en
que las placas de microtítulos se recubrieron con anticuerpos de
híbridos anti-ARN:ADN y las sondas eran sondas de
ARN.
Otros procedimientos para la detección y
valoración de infecciones con VPH que se pueden usar en el
procedimiento descrito se describen en las patentes de Estados
Unidos números 5.415.995, 4.777.239, 5.484.699, 4.983.728,
5.527.898, 5.364.758, 5.639.871, 5.501.947, 5.665.533, 4.748.109,
5.623.932, 5.665.571 y 5.648.459. Estos son ejemplos de detección de
VPH y ensayos de clasificación que se pueden usar en combinación con
el ensayo molecular descrito. Muchas de las técnicas descritas
anteriormente se pueden adaptar también para uso en el ensayo
descrito para la detección de expresión de genes de VPH.
El ensayo descrito y otros ensayos se pueden
combinar también de forma secuencial. Esto es, se puede llevar a
cabo en primer lugar un tipo de ensayo, y luego, dependiendo de los
resultados, se puede llevar a cabo otro ensayo. Por ejemplo, se
puede llevar a cabo en primer lugar un ensayo para detectar VPH (o
tipo de VPH), luego, si está presente el VPH, se puede llevar a cabo
el ensayo molecular descrito. Como otro ejemplo, se puede llevar a
cabo en primer lugar el ensayo molecular descrito, y si los
resultados de este ensayo fueran indicativos de una CIN de alto
grado o cáncer, se puede llevar a cabo un ensayo citológico o
biopsia. Tales combinaciones secuenciales son particularmente útiles
para limitar de forma más extensiva el ensayo en pacientes y
muestras que están identificados como de riesgo alto.
Órdenes secuenciales usuales de los ensayos son
(1) un ensayo de VPH, seguido de un ensayo de uno o más marcadores
distintos, seguido de un ensayo citológico o histológico, (2) un
ensayo citológico o histológico, seguido de un ensayo de VPH o un
ensayo de uno o más marcadores distintos, seguido de un ensayo de
VPH o un ensayo de uno o más marcadores distintos (siempre y cuando
no se haya llevado a cabo en primer lugar); (3) un ensayo citológico
o histológico, seguido de un ensayo de VPH y marcador combinado o
simultáneo; (4) un ensayo de VPH y marcador combinado o simultáneo,
seguido de un ensayo citológico o histológico, y (5) detección de
VPH, detección del tipo de VPH, un ensayo de VPH, y un ensayo
citológico o histológico. Cada combinación de ensayos es seguida de
una valoración, usando los resultados del ensayo combinado del
estado de la célula, estado de enfermedad, estatus del paciente,
pronóstico del paciente u otras valoraciones como se describen en
esta invención.
Cuando los resultados de ensayos iniciales son
equívocos o sugieren una fase de enfermedad más grave, son útiles
más ensayos para clarificar y confirmar los resultados iniciales.
Por ejemplo, cuando una muestra celular es un mosaico con algunas
células infectadas de forma benigna con VPH y otras muestran
neoplasia en alto grado o cáncer, un ensayo de medida de expresión
de genes de VPH puede dar resultados equívocos. Continuando con un
ensayo morfológico se puede establecer la presencia de células
neoplásticas de alto grado o cancerosas. En este caso, la ventaja
del procedimiento descrito es que sólo se necesita ensayar
adicionalmente algunas de las muestras celulares analizadas
(aquellas con resultados equívocos o graves).
El procedimiento descrito se puede combinar
también con regímenes de tratamiento. Por ejemplo, los resultados en
el ensayo o procedimiento descrito indicativos de CIN de alto grado
o cáncer sugieren que la terapia antiviral será inefectiva ya que
estas fases de enfermedad van acompañadas frecuentemente de
integración de VPH dentro del genoma. Por otro lado, resultados de
ensayo o procedimiento indicativos de fases de enfermedad normales o
de bajo grado sugieren tratamientos antivirales ya que el VPH no se
integra por lo general en estas fases. Los tratamientos antivirales
incluyen, por ejemplo, fármacos o vacunas terapéuticas. Cuando los
resultados del procedimiento descrito indican un estado celular
benigno, se puede evitar totalmente el tratamiento. La capacidad
para hacer tales valoraciones de forma fiable y exacta es una
ventaja significativa del ensayo descrito.
El procedimiento descrito puede incluir la
combinación de un ensayo molecular como se describió anteriormente
con cualquier otro ensayo para la valoración de una enfermedad o
estado de células en una muestra celular. Por ejemplo, se puede
combinar un ensayo molecular que mide el nivel o relación de
expresión de genes de VPH con ensayos citológicos, ensayos
histológicos, determinación del tipo de VPH presente, determinación
del nivel de VPH presente, ensayos que detectan otros marcadores
celulares tales como oncoproteínas o supresores de tumor, o
combinaciones de estos ensayos. Tales ensayos son conocidos y se
usan para la diagnosis de infección por VPH o enfermedad basada en
VPH y valoración de la fase de enfermedad. Los resultados de un
ensayo molecular y uno o más ensayos adicionales se pueden combinar
para aumentar la fiabilidad de cualquier valoración, pronóstico,
diagnosis, o seguimiento de la enfermedad basada en VPH. Esta
posibilidad de combinación es un aspecto particularmente útil del
procedimiento descrito debido a que los ensayos moleculares de VPH
descritos anteriormente proporcionan información acerca de la
enfermedad basada en VPH, esto es distinto de otros ensayos. Cuando
múltiples ensayos apuntan a la misma dirección de pronóstico o
diagnóstico, la fiabilidad de la valoración se ve aumentada.
Combinaciones útiles incluyen un ensayo citológico y el ensayo
molecular descrito, un ensayo para la determinación del tipo de VPH
y el ensayo molecular descrito, y una combinación de un ensayo
citológico, un ensayo de clasificación, un ensayo de detección de
marcadores de cáncer, y el ensayo molecular descrito. Se pueden
llevar a cabo ensayos combinados en cualquier orden y en cualquier
interrelación temporal. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo
distintos ensayos en paralelo o de forma simultánea. Tales ensayos
se pueden llevar a cabo de cualquier forma tal como sobre el mismo
aparato por la misma persona, con diferente aparato, o en la misma o
diferentes localizaciones.
Se conocen ensayos citológicos para uso en la
valoración de la fase de enfermedad basada en VPH y se pueden usar
en el procedimiento descrito. Los frotis de Pap y tinciones
hematoxilina & eosina (H&E) bien conocidos son ejemplos
preferidos. El uso y análisis por frotis de Pap y tinciones H&E
son bien conocidos en la técnica.
Una muestra celular como término que se usa en
esta invención es en principio una colección de células de un
paciente. Un procedimiento de obtención de células es mediante
medios no invasivos, que se define en esta invención por la
obtención sin la punción de un paciente. Ejemplos de medios no
invasivos son, por ejemplo, muestras celulares obtenidas a partir de
orina o una raspadura superficial nasal, epitelial, cervical u
otras células. Las células del paciente también se pueden obtener
por otros medios incluyendo, por ejemplo, biopsia con aguja o
biopsia de tejido.
Se puede conservar la muestra celular en un medio
de recogida lo que permite una combinación de dos o más ensayos de
características diferentes respecto a un estado celular de interés.
Tal como se usa en esta invención, el ensayo o ensayos se refieren
a la detección o medida de características específicas, cuyos
resultados se pueden combinar con otras medidas tales de otras
características para dar una valoración global de una célula
sospechosa de estar infectada con una o más enfermedades. Estos
ensayos pueden incluir, por ejemplo, una combinación de análisis
morfológicos y cuantificación de un ARN o ADN o proteína
determinados cuyos niveles proporcionan una indicación específica de
la presencia o progresión de una enfermedad. De forma alternativa,
por ejemplo, el medio de recogida se puede usar para combinar un
ensayo que identifica la morfología de células en una muestra
celular con uno o más ensayos que identifican el tipo de VPH
involucrado, y, por ejemplo, identifican si el tipo de VPH
identificado es un tipo de VPH de riesgo elevado o de riesgo bajo
para el desarrollo de transformación celular inducida por VPH y
cáncer.
Por ejemplo, fuentes de muestras celulares para
la valoración de enfermedades basadas en VPH incluyen cérvix,
vagina, vulva, ano, pene, laringe, cavidad bucal, nódulos
linfáticos, depósitos malignos en cualquier parte del cuerpo
humano, y epidermis; todos ellos son lugares conocidos de infección
por VPH y patología.
Se pueden recoger muestras celulares para uso en
la presente invención y almacenar en medio líquido. Ejemplos de
medios de recogida de células útiles son STM (Digene), PreservCyt®
(Cytyc), y CytoRich^{TM} (Autocyte). Estos medios (PreservCyt® y
CytoRich^{TM}) se desarrollaron para la recogida de muestras
citológicas pero se pueden adaptar para uso con ensayos
moleculares.
Se pueden fijar o procesar muestras celulares
para uso en el procedimiento de la presente invención de cualquier
forma consistente con los ensayos que se van a llevar a cabo. Por
ejemplo, se pueden llevar a cabo tanto ensayos citológicos como
moleculares usando células fijadas en un sustrato sólido tal como,
por ejemplo, un porta. Los requerimientos de los ensayos que se van
a desarrollar identificarán en general el procesamiento de la
muestra que se va a usar.
La presente invención se puede llevar a cabo de
forma conveniente usando kits que incluyen uno o más de los
materiales necesarios por el procedimiento, tal como reactivos y
materiales de toma y manipulación de muestras. Por ejemplo, los kits
pueden incluir medio de recogida de células, reactivos de
conservación de muestras, reactivos para detección específica de
ADN y/o productos de expresión (ARN o proteínas) de uno o más de los
genes E2, E4, E5, E6, E7, L1 o L2, y recipientes para manipulación
de muestra. Reactivos útiles para la detección de expresión de los
genes de VPH son sondas de ácido nucleico para estos genes. Un kit
puede contener también muestras o reactivos de control, o reactivos
y materiales para llevar a cabo otros ensayos que se van a combinar
con el ensayo descrito. Además los kits pueden contener reactivos
para la separación de ARN y/o ADN de otros componentes
celulares.
La presente invención se puede llevar a cabo
usando dispositivos adaptados al procedimiento. Se conocen numerosos
dispositivos para llevar a cabo ensayos similares y están en uso y
se pueden adaptar para uso con los ensayos y procedimiento
descritos. Por ejemplo, se conocen dispositivos para automatización
de toda o una parte de los ensayos de muestra y manipulación de
muestra en ensayos.
Todo o parte del procedimiento descrito se puede
controlar o gestionar usando programas informáticos específicos. Se
pueden compilar, analizar y explotar en distintas formas y para
distintos fines los datos recogidos del procedimiento descrito, y
los datos de cualquier otro ensayo usado en combinación, usando
programas informáticos específicos. Tales programas se pueden usar
con, o combinar en, otros programas informáticos de gestión de
pacientes o datos. La inutilidad de un programa de este tipo
aumenta con el número de medidas o valoraciones que se van a
combinar, y la importancia relativa de cada tipo de medida en la
valoración global. Se pueden usar programas informáticos para uso
con el procedimiento descrito en ordenadores convencionales, o se
pueden incorporar en ordenadores especiales o dispositivos
computerizados para el control del procedimiento descrito,
manipulación y análisis de datos del procedimiento descrito o
ambos.
Se entiende que los ejemplos de esta invención
ejemplifican los distintos aspectos para realizar la invención y no
se pretende que limiten la invención en modo alguno.
El ensayo para ácidos nucleicos sigue en general
el procedimiento para la detección de ARN de VIH mediante el ensayo
para VIH por captura de híbrido de Digene, descrito en el documento
WO 93/10263 de Digene. Brevemente, tras la lisis, se añadió a cada
pocillo 50 \mul de mezcla de sonda (que contiene sonda
biotinilada de ADN). Se selló la placa y se incubó a 65ºC durante 2
horas para que tenga lugar la hibridización. Después de la
hibridización se transfirieron las muestras a una microplaca
recubierta de estrepavidina, y se añadió 25 \mul de anticuerpo
antihíbrido a cada pocillo. Se agitó la placa a 1100 rpm, durante 1
hora a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos 6 veces con
tampón de lavado a 65ºC, seguido de un lavado usando agua destilada.
Se añadió 100 \mul de un sustrato quimioluminiscente a cada
pocillo y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se leyó luego la placa en el luminómetro DML 2000. Se
expresaron luego los datos como señal-ruido. Usando
una curva de calibración se convirtió la señal quimioluminiscente
generada por cada especimen en copias de ARNm por célula. El ensayo
descrito anteriormente se puede realizar bien sobre células lisadas
completas o ácido nucleico separado de otros componentes
celulares.
Este ejemplo ilustra la medida de expresión de
E6/E7 de VPH para uso en el procedimiento descrito. Se ha
desarrollado un procedimiento para detección y cuantificación de
ARNm de VPH, que incluye E6/E7 y ARNm. Este ejemplo mide la
expresión en células CaSki, pero el procedimiento es aplicable en
general a otras líneas celulares y especímenes clínicos. Las
células CaSki contienen un genoma de VPH-16 de alto
riesgo integrado (aproximadamente 600 copias/célula). Se mantuvieron
las células CaSki en subconfluencia en medio RMPI 1640 que contiene
FBS (suero bovino fetal) al 10% y piruvato de sodio 10 mM. Para este
ejemplo, se cultivaron células CaSki hasta confluencia y se
retiraron de las concavidades mediante tratamiento con tripsina al
0,1% - EDTA 0,5 mM. Usando azul de triptano, se contaron las
células viables en microscopio. Se sembraron células, en volúmenes
de 10 \mul, a concentraciones finales de 10, 10^{2}, 10^{3},
10^{4}, y 10^{5} células/pocillo en una placa de 96 pocillos,
tratada con cultivo de tejido, de poliestireno. Se llevó a cabo
cada dilución y se sembró por triplicado.
Se lisaron las células con proteinasa K (30
unidades) en un medio SDS tamponado con tris-EDTA.
Se sellaron las soluciones de la placa (Tris 20 mM pH 7,4, EDTA 20
mM y 0,5', se agitó durante 30 segundos a 1100 rpm y se incubó a 37º
C durante 30 minutos. El ensayo para ARNm de VPH sigue en general el
procedimiento para la detección de ARN de VIH mediante el ensayo
para VIH de captura de híbrido de Digene, descrito en el documento
WO 93/10263 de Digene. Brevemente, después de la lisis, se añadió 50
\mul de mezcla de sonda (que contiene sonda biotinilada de ADN de
E6/E7) a cada pocillo. Se selló la placa y se incubó a 65ºC durante
1,5 horas para que tenga lugar la hibridización. Después de la
hibridización, se transfirieron las muestras a una microplaca
recubierta con estrepavidina, y se añadió 25 \mul de anticuerpo de
antihíbrido a cada pocillo. Se agitó la placa a 1100 rpm, durante 1
hora, a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos 6 veces con
tampón de lavado a 65ºC, seguido de un lavado usando agua destilada.
Se añadió 100 \mul de un sustrato de quimioluminiscencia a cada
pocillo y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se leyó luego la placa en el luminómetro DML 2000. Se
expresaron luego los datos como señal-ruido. Usando
una curva de calibración se convirtió la señal quimioluminiscente
generada por cada especimen en copias de ARNm por célula. Los datos
para la detección directa de ARNm de VPH a partir de células CaSki
se muestran en la figura 1. Este procedimiento se ejemplifica
mediante la detección y cuantificación de ARNm de E6/E7, pero se ha
aplicado para cuantificar otras moléculas de ARNm (por ejemplo,
ARNm de L1 de VPH) a partir de células CaSki (figura 2).
Se tripsinizó la línea celular CaSki mediante
incubación con tripsina-EDTA al 0,25% durante 5
minutos a 37ºC. Se agregaron las células de la suspensión mediante
centrifugación a 800 rpm durante 3 minutos en centrífuga Sorvall RT
6000. Se resuspendió el agregado celular en 500 \mul de PBS una
vez y se recuenta en solución de azul de triptano al microscopio. Se
diluyeron células hasta 50 y 500 células/\mul en PBS una vez. Se
doparon 10 \mul de cada concentración de células, incluyendo el
punto cero (10 \mul de PBS una vez) en 3 ml de reactivo
PreservCyt. Se añadieron 100 \mul de tampón de conversión de
muestra en cada tubo para ayudar a visualizar el agregado celular.
Se mezclaron bien todas las muestras y se centrifugaron a 3800 rpm
durante 15 minutos en centrífuga Sorvall RT 6000. Se descargaron los
sobrenadantes y se drenaron los tubos mediante inversión en el
Kimtowels durante 2 a 5 minutos en la mezcla. Todos los agregados se
resuspendieron con 50 \mul del reactivo de lisis (50 unidades de
proteinasa K) y se transfirió la mezcla a la placa recubierta con
estreptavidina. Se cubrió la placa con el sellador de placa y se
incubó a 37ºC durante 30 minutos (bloque de calor) con agitación
cada 15 minutos.
Se cargaron 50 \mul de cada calibración de ARN
de E6/E7 en pocillos designados a 0, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5},
10^{6}, 10^{7} y 10^{8} moléculas/pocillo para construir la
curva de calibración para ARNm en el especimen. Se añadió 50 \mul
de la mezcla de sonda en cada pocillo. Se cubrió la placa con el
sellador de placa y se agitó durante 1 minuto a 1100 minuto en el
agitador de mesa. Se incubaron las muestras a 65ºC durante 1,5 horas
(reacción de hibridización) en el bloque de calor. Se transfirió la
placa al agitador de mesa y se incubó durante 1 hora con agitación a
1100 rpm a temperatura ambiente (reacción de captura), se añadió 25
\mul de reactivo de detección 1 en cada pocillo y se incubó la
placa sin agitación durante 1 horas a temperatura ambiente.
Se descargaron los contenidos de la placa y se
lavó la placa vigorosamente seis veces con tampón de lavado a 65ºC y
una vez con agua desionizada a temperatura ambiente. Se drenó la
placa en Kimtowels y se añadió 100 \mul del reactivo de detección
2 en cada pocillo. Se incubó la placa durante 30 minutos a
temperatura ambiente protegida de la luz. Al final del tiempo de
incubación se leyó la placa en el luminómetro DML 2000 de Digene y
se expresaron los datos como señal-ruido.
Se examinaron las líneas celulares siguientes de
acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.
HaCaT: una línea celular de queratinocito humana
inmortalizada (1988))
SiHa: una línea celular de cáncer humana (Friedl.
(1970))
W12: una línea celular de queratinocito cervical
humana no tumorigénica (Stanley, (1989))
Se infectaron células HaCaT con VPH 16 mediante
el procedimiento de White y col. (White (1998) para producir una
infección por VPH episomal (no-integrada, secuencia
total, no empalmada). Había presente aproximadamente 1 copia de VPH
16 por cada 40 células. Estas células se consideran una
representación de la infección en fase precoz o CIN I (neoplasia
intraepitelial cervical). Las células W12 contienen aproximadamente
100 copias de ADN de VPH 16 episomal y representan células
inmortalizadas pre-malignas o CIN II o CIN III. Las
células SiHa contienen 1 a 2 copias de VPH 16 integrado dentro del
genoma. Estas células se considera que representan cáncer.
Se realizó el análisis de ARN de acuerdo con el
ejemplo 1 o el siguiente procedimiento. Se prepararon sondas de ADN
biotiniladas, de hebra simple, que contienen las secuencias de gen
de VPH 16 específicas. Para las líneas celulares HaCaT y SiHa, se
cultivaron células hasta confluencia, se cosecharon las células, y
se purificó ARN total usando el kit RNeasy (Qiagen Inc., Santa
Clarita, CA). Para W12, se usaron células completas para análisis.
Se prepararon calibradores ARN que contienen el genoma de VPH
completo mediante transcripción de ARN en sentido (+) a partir de un
plásmido que contiene el genoma de VPH 16 completo con T7 ARN
polimerasa. Se diluyó luego el ARN a 10^{3}, 10^{4}, 10^{5},
10^{6} y 10^{7} copias por 50 \mul. Se diluyeron alícuotas de
ARN celular hasta 50 \mul y luego se añadió 50 \mul de mezcla
de sonda (que contiene la sonda de ADN de hebra simple, biotinilada)
y se hibridizaron los especímenes de ARN durante 2 horas a 65ºC. Se
transfirieron las reacciones de hibridización a una microplaca
recubierta de estreptavidina y se añadió 25 \mul de reactivo de
detección 1 a cada pocillo. (El reactivo de detección 1 contiene el
conjugado de anticuerpo monoclonal fosfatasa -
anti-ARN:ADN alcalino). Durante una incubación de 1
hora con agitación, se capturaron híbridos ARN:ADN sobre la placa
recubierta de estreptavidina y se hicieron reaccionar de forma
simultánea con el conjugado de anticuerpo
anti-híbrido. Después de varias etapas de lavado, se
añadió un sustrato quimioluminiscente (Tropix
CDP-star con Emerald) a los pocillos, y se midió la
emisión de luz en un luminómetro de microplaca después de 30
minutos de incubación a temperatura ambiente.
Se llevó a cabo la cuantificación de ARNm de VPH
como sigue. Se usaron los resultados de los calibradores de ARN para
construir curvas patrón. Se calculó la ecuación de regresión a
partir del logaritmo de las copias frente al logaritmo de
señal-ruido menos uno [(S/N)-1]. Se
usaron luego ecuaciones de regresión para calcular el número de
copias de ARNm en las muestras de ARN celular.
Se calcularon las relaciones de E6, E7, E2, E4,
L1 y L2 de VPH 16 para cada tipo de célula. Los resultados se
muestran en la tabla 2. Estos resultados demuestran que en la
infección de fase precoz episomal la relación de (E6 + E7)/L1 es
aproximadamente 0,7. En la línea celular inmortalizada
pre-maligna la relación es aproximadamente 4 y en
la línea celular cancerosa la relación alcanza infinito.
| HaCaT | W12 | SiHa | |
| Estatus de VPH | Episomal | Episomal | Integrado |
| Estatus celular | Infección en fase | Pre-maligno, | Maligno |
| precoz | inmortalizada | ||
| (E6+E7)/L 1 | 0,68 | 4,00 | \infty* |
| (E6+E7)/(L1+L2) | No detectado | 3,47 | 59,9 |
| (E6+E7+E2+E4)/(L1+L2) | No detectado | 6,96 | 70,6 |
| (E6+E7)/(E2+E4) | No detectado | 1,00 | 5,60 |
| (E6+E7)/E2 | No detectado | 4,40 | 12,00 |
| (E6+E7+E2-E4)/(L1+L2) | No detectado | 1,58 | 59,10 |
| * \begin{minipage}[t]{140mm} los transcriptos del gen L 1 eran indetectables en células SiHa. Por lo tanto las relaciones de otros transcriptos respecto a transcripción de gen L 1 son infinitamente grandes. \end{minipage} |
Las publicaciones citadas en esta invención y el
material para el que se citan se incorporan de forma específica
como referencia.
Los especialistas en la técnica reconocerán, o
serán capaces de descubrir sin usar más que experimentación
rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la
invención descrita en este documento. Se pretende que tales
equivalentes estén comprendidas por las siguientes
reivindicaciones.
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Boukamp, y col., J. Cell Biol.
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Claims (8)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Un procedimiento para la detección de transformación celular inducida por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de:- -
- medida de al menos dos niveles de ARNm expresados de VPH a partir de una muestra recogida de dicho paciente, en la que dichos ARNm comprenden un primer ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E6 y ARNm de E7 y un segundo ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E2 y ARNm de L1;
- -
- determinación del nivel de expresión de E6 y/o E7 y nivel de expresión de E2 y/o L1 de modo que se determina una relación de E6 y/o E7 a L1 y/o E2, en el que una relación superior a 2 es indicativo de transformación celular inducida por VPH y riesgo de neoplasia.
- 2. Un procedimiento de predicción del comienzo de cáncer inducido por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de:
- -
- medida de un ARNm de VPH del grupo 1 y de un grupo 2 y/o de un grupo 3 a partir de una muestra recogida de dicho paciente;
- -
- determinación de la relación de nivel de ARNm del grupo 1 a nivel de ARNm del grupo 2 y/o del grupo 3, en el que una relación superior a un valor de 2 es indicativo del comienzo de la neoplasia; en el que dicho grupo 1 son genes o conjuntos de genes que incluyen E6, E7 y E6+E7; dicho grupo 2 son genes o conjuntos de genes que incluyen L1, L2, E4 y cualquier combinación de los mismos; y dicho grupo 3 son genes o conjuntos de genes que incluyen E1, E2, E5 o cualquier combinación de los mismos.
- 3. Un procedimiento de seguimiento de la fase de enfermedad inducida por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de:
- -
- medida de niveles de ARNm expresados en VPH de una muestra recogida de dicho paciente;
- -
- determinación del nivel de expresión de E6 y/o E7 y del nivel de expresión de E2 y/o L1; y
- -
- determinación de una relación del nivel de expresión de E6 y/o E7 al nivel de expresión de L1 y/o E2, en el que una relación superior a 2 es indicativo de cambio neoplástico.
- 4. Un procedimiento de detección de cáncer inducido por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de:
- -
- medida de al menos dos niveles de ARNm expresados de VPH a partir de una muestra recogida de dicho paciente, en el que dichos ARNm comprenden un primer ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E6 y ARNm de E7 y un segundo ARN seleccionado del grupo constituido por ARNm de E2 y ARNm de L1;
- -
- determinación del nivel de expresión de E6 y/o E7 y del nivel de expresión de E2 y/o L1 de modo que se determina una relación de E6 y/o E7 a L1 y/o E2, en el que una relación superior a 4 es indicativo de cáncer inducido por VPH.
- 5. Un procedimiento de predicción del riesgo de comienzo de cáncer inducido por VPH en un paciente infectado con VPH que comprende las etapas de:
- -
- medida de un ARNm de VPH del grupo 1 y de un grupo 2 y/o de un grupo 3 a partir de una muestra recogida de dicho paciente;
- -
- determinación de la relación de nivel de ARNm del grupo 1 a nivel de ARNm del grupo 2 y/o del grupo 3, en el que una relación superior a un valor de 4 es indicativo del comienzo de cáncer inducido por VPH; en el que dicho grupo 1 son genes o conjuntos de genes que incluyen E6, E7 y E6+E7; dicho grupo 2 son genes o conjuntos de genes que incluyen L1, L2, E4 y cualquier combinación de los mismos; y dicho grupo 3 son genes o conjuntos de genes que incluyen E1, E2, E5 y cualquier combinación de los mismos.
- 6. Un kit que comprende al menos dos sondas diferentes capaces de detectar ácido nucleico de VPH, en el que una primera sonda es capaz de detección específica de ADN y/o ARN o proteínas seleccionadas del grupo constituido por: E2, E4, E6 y E7, y una segunda sonda es capaz de detección específica de ADN y/o ARN o proteínas seleccionadas del grupo constituido por: L1, L2, E1, E2, E4 y E5.
- 7. El kit de acuerdo con la reivindicación 6, en el que al menos una sonda es una sonda de ADN.
- 8. El kit de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha segunda sonda se selecciona del grupo constituido por: L1, L2, E1 y E5.
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