DE4445769C1

DE4445769C1 - Protektionsmedium zum Aufbewahren vitaler Gewebe, insbesondere von Zähnen

Info

Publication number: DE4445769C1
Application number: DE4445769A
Authority: DE
Inventors: Bernd Frenzel
Original assignee: Biochrom AG
Current assignee: Biochrom AG
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: US5786337A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein Protektionsmedium zur Auf bewahrung vitaler Gewebe, wie zum Beispiel ausgeschlagener Zähne, das in bereits vorgefertigter Form in einem Behälter ver trieben werden kann. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Protektionsmedium, welches in flüssiger Form mindestens ein Jahr haltbar ist und einen Schutz gegen unerwünschte Kontaminations keime aufweist.

Für die Transplantation von Organen des Menschen und der Tiere sind Protektionsmedien entwickelt worden. Diese Protektions-me dien sind sehr unterschiedlich zusammengesetzt, ihnen ist jedoch gemeinsam, daß sie meist eine rasche Blutarmut bei Organtempera turen von 0-10°C herbeiführen sollen. Dies Prinzip der hypother men Ischämie hat sich im Bereich der Kliniken bewährt. (J. A. Wahlberg, J. H. Southard und F. O. Belzer, Cryobiology, 23, 477-482 (1986) "Development of a cold storage solution for pancreas preservation", G. M. Collins, M. B. Bravo-Shugarman und P. I. Tera saki, Lancet, 1219-1222 (1969)).

Beispiele für solche Protektionsmedien sind die Euro-Collins-Lö sung oder die University Wisconsin (UW)-Lösung. Protektions-me dien außerhalb des klinischen Bereichs werden zum Beispiel für die Aufbewahrung eines bei einem Unfall herausgebrochenen Zahnes benötigt. Die Aufbewahrung in einem Nährmedium erweist sich als notwendig, da sonst das an der Zahnwurzeloberfläche anhaftende vitale Gewebe innerhalb kurzer Zeit austrocknet und seine Rege nerationsfähigkeit verliert. Durch die Lagerung eines Zahnes in einem speziellen Protektionsmedium ist es möglich, den Zahn auch nach 8 bis 12 Std. zu reimplantieren.

Ein solches Medium muß einen Kontaminationsschutz aufweisen, da ein ausgeschlagener Zahn in der Regel mit allerlei Bakterien und Pilzen kontaminiert ist. Ein Versuch zur Entwicklung eines sol chen Mediums ist in der EP-A2 03 53 345 beschrieben. Dabei wird in einem sehr aufwendigen Behälter das Trockenmedium getrennt vom Lösungsmittel (Wasser) aufbewahrt und bei Bedarf aufgelöst. Der Kontaminationsschutz wird durch Zugabe von Antibiotika und Fungiziden erreicht. Bei dieser Lösung kommt es aber zum Ver klumpen und Verderb des außerordentlich hygroskophischen Trockenmediums nach wenigen Wochen. Dadurch ist eine ordnungsge mäße Auflösung des Trockenmediums für den Gebrauch nicht mehr gewährleistet bzw. es kommt durch den Verderb des Mediums zur Schädigung des aufzubewahrenden Gewebes. Die für den Kontamina tionsschutz eingesetzten Antibiotika und Fungizide erlauben dar über hinaus nur eine sehr begrenzte Anwendung im Rahmen der ärztlichen Verschreibungspflicht. Ferner ist stets die Gefahr von Allergien gegen Antibiotika gegeben. Die ubiquitäre Vorrats haltung ist somit ausgeschlossen.

Natriumazid (NaN₃) wurde bereits in Zellkulturen eingesetzt und erwies sich hierbei als Inhibitor einer oxidativen Phosphorylierung (A. Minchenko et al " Lab. Invest." 71 (3), 374-379 (1994)), als Schutz gegen einen durch Acridinorange und Blaulicht induzierten Verlust der Lebensfähigkeit von Zellen (J. M. Zdolsek "APMIS" 101 (2), 127-132 (1993)) bzw. als die Showdomycinaufnahme von E. coli K-12 Zellkulturend beeinflussend (Y. Komatsu "Agr. Biol. Chem." 35 (9), 1328-1339 (1971)).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich, ein antibioti kumfreies, Nährstoffe für ein Gewebewachstum enthaltendes Pro tektionsmedium bereitzustellen, das als Kontaminationsschutz ein kein Antibiotikum darstellendes Konservierungsmittel enthält.

Aufgabe der Erfindung ist ferner, für eine möglichst lange, z. B. einjährige Haltbarkeit dieses Protektionsmediums in vorgefertig ter Form zu sorgen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein antibiotikumfreies, Nährstoffe für ein Gewebewachstum enthaltendes Protektions medium, das als Kontaminationsschutz bzw. Konservierungs mittel Natriumazid (NaN₃) in einer Menge von 5 bis 60 mg/l enthält.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen be schrieben.

Bei der Zubereitung eines erfindungsgemäßen Protektionsmediums werden die Bestandteile in einem Lösungsmittel unter keimfreien Bedingungen vermischt.

Vorgesehen ist insbesondere, das erfindungsgemäße Protektionsmedium zur Aufbewahrung von vitalem Gewe be, insbesondere Zähnen, zu verwenden.

Das erfindungsgemäße Protektionsmedium enthält im Gegensatz zu den eingangs beschriebenen Protektionsmedien eine Vielzahl not wendiger Nährstoffe, um eine Aufbewahrung des Gewebes bei Raum temperaturen, also mit Stoffwechsel, zu ermöglichen. Der für die Haltbarkeit eines solchen Nähr- und Protektionsmediums kritisch ste Inhaltsstoff ist das notwendige L-Glutamin. Es zerfällt bei Raumtemperatur in kurzer Zeit. Dabei entsteht giftiges Ammoniak. Das üblicherweise verwendete L-Glutamin wurde deshalb in dem er findungsgemäßen Protektionsmedium durch das Dipeptid N-Acetyl-L- Allanyl-L-Glutamin (ac-Ala-Gln) ersetzt. Dieses ist stabil und außerordentlich lange haltbar. Statt des hier beschriebenen Di peptids können selbstverständlich auch andere Dipeptide oder längere Peptide des L-Glutamins verwendet werden. Die Herstellung eines erfindungsgemäßen nährstoffhaltigen Protektionsmediums erfolgt beispielsweise durch Vereinigen der Bestandteile in einem Lösungsmittel, z. B. destilliertem Wasser, unter keimfreien Bedingungen. Unter dem Ausdruck "keimfreie Bedingungen" ist dabei zu verstehen, daß entweder die Ausgangsmaterialien keimfrei sind oder das Protektionsmedium nach einem Vereinigen der Bestandteile in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtration durch ein Bakterienrückhaltefilter, keimfrei gemacht wird. Dabei können die folgenden Bestandteile enthalten sein (Mengen in mg/l). Mögliche Konzentrationsbereiche sind beispielsweise in der rechten Spalte angegeben. In dem erfindungsgemäßen Protektionsmedium können jedoch einzelne Komponenten weggelassen werden.

Der besonders günstige Konzentrationsbereich für das Konservie rungsmittel Natriumazid liegt bei 20 bis 40 mg/l.

Zu allen bisher bekannten Nährmedien, die in der Zellkultur Ver wendung finden, werden Antibiotika als Kontaminationsschutz zu gegeben (R. I. Freshney, Animal Cell Culture, Oxford University Press, ISBN 0-19-963 212-8). Überraschenderweise zeigt sich, daß auch der antimikrobielle Wirkstoff Natriumazid in der Zellkultur toleriert wird. Die Zellen überleben nicht nur in Anwesenheit von Natriumazid, sie sind erstaunlicherweise sogar in der Lage, sich zu teilen und zu wachsen. Im folgenden Versuch wurden zu einer gleichen Anzahl von Hs68-Zellen zur Kontrolle das oben be schriebene Protektionsmedium ohne NaN₃ mit einem Zusatz von 10 Prozent fetalem Kälberserum gegeben. In einer anderen Versuchs reihe wurde der Konservierungsstoff Natriumazid (NaN₃) hinzuge geben. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen im Brutschrank mit 5 Prozent CO₂ wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt und das Zellwachstum durch Messung der erreichten OD-Werte im ELISA- Reader ermittelt.

Die folgenden Konzentrationen des Konservierungsmittels, die ei ne Konservierung gestatten, wurden verwendet:

Verdünnungsstufen
Natriumazid mg/l
0
40,00
1 : 2	20,00
1 : 3	13,33
1 : 4	10,00
1 : 5	8,00
1 : 6	6,67
1 : 7	5,71
1 : 8	5,00

Das Versuchsergebnis zeigt, daß Natriumazid überraschenderweise ein Wachstum der Zellen gestattet (vgl. Abbildung 1).

Die Haltbarkeit eines solchen Nährmediums wurde mittels der Zellkultur überprüft. Die zellerhaltenden wachstumsfördernden Eigenschaften wurden gegenüber einer Kontrolle festgelegt und der Versuch nach einer Lagerung von 18 Monaten bei Raumtempera tur wiederholt. Dabei zeigte sich, daß die zellerhaltenden und wachstumsfördernden Eigenschaften des Mediums auch nach 18 Mona ten unverändert gut waren.

Claims

1. Antibiotikumfreies, Nährstoffe für ein Gewebewachstum ent haltendes Protektionsmedium, das als Kontaminationsschutz bzw. Konservierungsmittel Natriumazid (NaN₃) in einer Menge von 5 bis 60 mg/l enthält.

2. Protektionsmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das NaN₃ in einer Menge von 20 bis 40 mg/l und vorzugs weise in einer Menge von 30 mg/l vorhanden ist.

3. Protektionsmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es stabiles L-Glutamin in Form eines Peptids, insbes. N-Acetyl-L-Alanyl-C-Glutamin ent hält.

4. Protektionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Aufbewahrung von vitalem Gewebe, insbesondere von Restgewebe an Zähnen, geeignet ist.