DE69127888T2

DE69127888T2 - Konservierungslösung für Zellen

Info

Publication number: DE69127888T2
Application number: DE69127888T
Authority: DE
Inventors: Anne A Hurley; Daniel C Lapen; Peter S Oud
Original assignee: Cytyc Corp
Current assignee: Cytyc Corp
Priority date: 1991-05-01
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 1998-05-07
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: DE69127888D1; EP0772972B1; JP2003153688A; ATE158918T1; JP3723494B2; EP0511430B1; DK0772972T3; JPH0523179A; JP3294299B2; DE69133125D1; US5256571A; DE69133125T2; EP0511430A3; JP2002168858A; EP0772972A1; EP0511430A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lösung und ein Verfahren zur in vitro-Konservierung von Zellen bei Umgebungstemperaturen. Die Lösung und das Verfahren ermöglichen eine schnelle Fixierung lebender Zellen für eine anschließende Analyse.
Es ist im klinischen Bereich und im Bereich der Forschung bekannt, daß eine Konservierung von Zellproben für eine anschließende Analyse wünschenswert ist. Aus diagnostischer Sicht ist eine Probe am wertvollsten, wenn sie frisch ist. Je mehr Zeit zwischen der Gewinnung einer Probe und ihrer Fixierung auf einem Objektträger oder auf einer anderen Matrix verstreicht, desto weniger bleibt die Unversehrtheit bzw. Integrität der Probe erhalten. Wenn man Zellen die physiologischen Bedingungen ihres Donors für längere Zeiträume, d.h. Minuten, entzieht, ermöglicht dies, daß eine Autolyse beginnt.
Das Dokument EP-A 0 049 478 offenbart Zubereitungen zur Erhaltung der physischen Integrität von Blutkörperchen für einen kurzen Zeitraum vor und während des Testverfahrens, wie beispielsweise Messungen der Zahl roter Blutkörperchen (RBC), des Hämatokrits (HCT), des Hämoglobin-Werts (HGB), des mittleren Volumens der Blutkörperchen (MCV), des mittleren Hämoglobin-Gehaltes der Blutkörperchen (MCH) und der mittleren Hämoglobin-Konzentration im Blutkörperchen (MCHC) und zum Ersetzen des schädlichen bakteriostatischen Mittels Natriumazid durch ein harmloseres Mittel (d.h. Phenylethanol).
Die Komponenten sind von denen, die in den vorliegenden Lösungen verwendet werden, verschieden. Eine Langzeit-Konservierung von Zellen kann nicht erhalten werden.
Bei einer klinischen Status-Bestimmung ist es oft erforderlich, Proben von einem Patienten zu nehmen, z.B. Vaginalzellen oder Muskelzellen, die später für eine histologische Analyse gefärbt werden. Derartige histochemische Färbungen haben unzweifelhaft einen Wert bei der Interpretation und Untersuchung der Physiologie und Pathologie von Zellen. Jedoch kann das Anfärben üblicherweise nicht gleichzeitig mit der Probenentnahme durchgeführt werden. Es ist oft wünschenswert, zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Biopsie an einem Patienten durchzuführen und die cytologische oder histologische Analyse der ge wonnenen Zellen oder des gewonnenen Gewebes zu einem anderen Zeitpunkt durchzuführen. In der Zwischenzeit verlieren Zellen oft ihre Integrität, wodurch der Wert der nachfolgenden Analyse verringert wird.
Zur Konservierung von Zellproben in der Zwischenzeit zwischen Zellentnahme und Fixierung und/oder Analyse sind einige Arten von Kochsalz-Lösungen oder ausgewogenen Salzlösungen im Handel erhältlich. Einige dieser Lösungen schließen die ausgewogene Salzlösung nach Hanks, ein minimale essentielle Komponenten enthaltendes Gewebekulturmedium (minimal essential (MEM) tissue culture medium), Polisal und normale Kochsalz-Lösung ein. Die hohen Kosten für einige der genannten Medien, z.B. für die Salzlösung nach Hanks und für das MEM-Medium, verhindern deren Anwendung im Routine- Bereich.
Das Produkt Polisal , das von der Firma Cutter Biologicals, Emeryville, California, USA, erhältlich ist, ist eine ausgewogene polyionische Elektrolyt-Lösung, die Natriumchlorid, Calcium und Magnesium in einer Konzentration enthält, die physiologisch equivalent zu der von normalem menschlichem Blutplasma ist. Obwohl diese Lösung eine passende Salzlösung für eine Lagerung für relativ kurze Zeit ist, inhibiert sie bakterielles Wachstum nicht und ermöglicht auch keine ausgedelinte Lagerung bei Umgebungsbedingungen.
Die ausgewogene Salzlösung nach Hanks ist eine modifizierte Ringer-Lösung. Sie ist so aufgebaut, daß sie den osmotischen Druck innerhalb physiologischer Grenzen hält, den optimalen pH-Wert-Bereich durch Einschluß eines Puffer-Systems aufrecht erhält und eine adäquate Konzentration anorganischer Ionen für den normalen Zell-Stoffwechsel (Metabolismus) bereitstellt. Diese Lösung schließt Glucose als Energiequelle ein. Jedoch verlieren Zellen ihre Lebensfähigkeit nach Aufenthalt von über 20 Minuten in dieser Lösung, was eine cytopathologische Analyse beeinträchtigt.
Viele Arten klinisch relevanter Gewebe und Zellproben enthalten Fremdproteine, die eine anschließende Färbung und Analyse stören. Das Einlagern von Proben bestimmter Zellen in eine Kochsalz-Lösung berücksichtigt derartige Randprobleme bei der Integrität solcher Proben nicht.
Eine sich über eine längere Zeit erstreckende Konservierung von Proben führt oft zum Wachstum von Bakterien, das auch durch die zusätzlichen Komponenten von normalen oder mit ergänzenden Komponenten versehenen Kochsalz-Lösungen des Standes der Technik genährt wird.
Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Lösung zur Konservierung und zum Fixieren von Zellen sowie ein Verfahren zu schaffen, mit dem/denen Zellen und Gewebe für eine anschließende cytologische oder histologische Analyse konserviert werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Lösung und ein Verfahren für eine in vitro-Konservierung von Säuger-Zellen und -Gewebe bei Umgebungstemperaturen. Die Lösung ist eine alkoholische Puffer-Lösung für eine in vitro-Konservierung von Säuger- Zellen bei Umgebungstemperaturen im Anschluß an eine Biopsie und vor einem Färben oder anderen Formen der Analyse. In einer Ausfülrrungsform schafft die Konservierungs- Lösung ein Medium für eine Konservierung bei Umgebungsbedingungen für eine relativ lange Zeit.
Genauer gesagt, umfaßt die wäßrige Alkohol-Puffer-Lösung für die in vitro-Konservierung bei Umgebungsbedingungen gemäß der Erfindung einen mit Wasser mischbaren Alkohol in Kombination mit einem gegen die Klumpenbildung gerichteten Mittel und einem puffernden Mittel. Die Alkohol-Komponente ist in einer Menge enthalten, die zur Fixierung der Säuger-Zellen oder des Säuger-Gewebes ausreichend ist, während das gegen die Klumpenbildung gerichtete Mittel in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um zu verhindern, daß die Zellen in der Lösung zusammenklumpen. Das puffernde Mittel ist ein Mittel, das den pH-Wert der Lösung mit den Zellen für die Dauer der Konservierung in einem Bereich zwischen 4 und 7 hält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Alkohol ein Alkohol aus der aus Ethanol, Isopropanol und Methanol bestehenden Gruppe. Das gegen die Klumpenbildung gerichtete Mittel ist vorzugsweise ein chelatisierendes Mittel, vorzugsweise ein Mittel aus der aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder ihren Salzen wie z.B. dem Dinatriumsalz, dem Trikaliumsalz und dem Tetranatriumsalz von EDTA bestehenden Gruppe. Das puffernde Mittel ist gewählt aus PBS (phosphatgepufferte Kochsalz-Lösung), Tris-Puffer, Natriumacetat, EDTA und ihren Salzen und Citronensäure und ihren Salzen. EDTA und ihre Salze können auch als puffernde Mittel verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Lösung Methanol, EDTA und Natriumacetat.
In dieser Ausführungsform besteht die Lösung aus etwa 45 bis 55 % Methanol; die EDTA in Form der freien Säure macht 2 bis 4 % aus; und der Natriumacetat-Puffer macht 6 bis 8 % aus.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Alkohol Methanol und das gegen die Klumpenbildung gerichtete Mittel ist vorzugsweise eine Kombination aus dem Natriumsalz und dem Kaliumsalz von EDTA; das puffernde Mittel ist ein Acetat-Puffer. Der Alkohol macht etwa 20 % der Lösung aus.
Bei einer veranschaulichenden praktischen Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird eine Probe aus Säuger-Zellen bereitgestellt. Innerhalb eines vorbestimmten oder speziell angegebenen Zeitrahmens im Anschluß an die Biopsie werden die Zellen in einer Konservierungs-Lösung des oben beschriebenen Typs suspendiert. In einer Ausführungsform der Erfindung können die suspendierten Zellen bei Umgebungstemperatur im Bereich von etwa 4 ºC bis etwa 38 ºC flir eine Zeit von wenigstens etwa 3 Wochen konserviert werden. Während dieser Zeit behalten die Zellen eine Struktur, die ausreichend dafür ist, ein Färben ohne einen signifikanten Verlust der Integrität zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine wäßrige Alkohol-Puffer-Lösung für die in vitro-Konservierung von Säuger-Zellen in Suspension bei Umgebungstemperatur. Die Lösung verbessert die Kernstruktur der Zellen, indem sie die Zellenmembranen für ein anschließendes cytologisches Färben intakt hält. Die Lösung zerstört auch wirksam mikrobielle Pathogene in einer Probe von Säuger-Zellen und inhlbiert eine Aktivität von Retroviren.
Noch genauer gesagt, schließt die Zell-Konservierungs-Lösung der vorliegenden Erfindung eine Kombination aus einem mit Wasser mischbaren Alkohol, einem gegen die Klumpenbildung gerichteten Mittel und einem Puffer ein, die die Lösung bei einem pH-Wert für die Dauer der Konservierung der Zellen zwischen etwa 4 und 7 hält.
In einer Ausführungsform ist die Konservierungszeit für Zellen in der vorliegenden Lösung bei Umgebungstemperatur (etwa 37 ºC) etwa drei Wochen. Diese Zeitdauer kann geändert werden sowohl durch das Lagerungsalter der Lösung vor dem Suspendieren der Zellen bei Umgebungsbedingungen als auch durch die Zeitdauer zwischen dem Gewinnen der Zellen und dem Suspendieren der Zellen als auch durch den Alkoholgehalt. Wenn beispielsweise die Lösung über eine signifikante Zeitdauer gelagert wurde, und zwar entweder in gefrorenem Zustand oder im Zustand bei Umgebungsbedingungen, kann das verbliebene Vermögen der Lösung zum Konservieren von Zellen begrenzt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der mit Wasser mischbare Alkohol Methanol. Andere Alkohole, die verwendet werden können, schließen neben anderen Isopropanol und Ethanol ein. Diese Alkohol-Komponente hält die Zell-DNA-Integrität aufrecht und erhält die Einzelheiten des Zellkerns für eine anschließende cytologische Anfärbung und Analyse.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der mit Wasser mischbare Alkohol in einer Menge von etwa 45 bis 55 %, bezogen auf die Lösung, zugegen. Lösungen, die 60 % oder darüber an Alkohol-Komponente enthalten, neigen dazu, ein Klumpen bzw. eine Koagulation zu zeigen, was die anschließende Möglichkeit, die Zellen der Probe effektiv zu färben, stört. Wenn dagegen die Alkohol-Konzentration in dieser Ausführungsform bei 40 % oder darunter liegt, werden die Zellen nicht ausreichend für eine über relativ lange Zeit gehende Konservierung fixiert, was dazu führt, daß die Zellen mit der Zeit abgebaut werden. Für diese Ausführungsform enthält die Lösung etwa 50 % Methanol, bezogen auf die Lösung.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Alkohol in einer Menge von etwa 20 % zugegen, bezogen auf die Lösung. Zwar ermöglicht diese Alkohol-Konzentration - wie oben angemerkt - nicht eine über lange Zeitdauer gehende Konservierung (d.h. über 2 Tage); sie fixiert jedoch Zellen in ausreichender Weise für eine anschließende Analyse. Alternativ dazu können die Zellen aus dieser Lösung der Ausführungsform mit 20 % Alkohol-Konzentration in eine Lösung einer Ausführungsform mit 50 % Alkohol- Konzentration für eine sich über lange Zeit erstreckende Konservierung vor einer Analyse überführt werden.
Die Lösung gemäß der Erfindung enthält auch ein gegen die Klumpenbildung gerichtetes Mittel in einer Menge, die ausreichend ist, die Bildung von Zellklumpen zu verhindern. In einer Ausführungsform ist das gegen die Klumpenbildung gerichtete Mittel das chelatisierende Mittel Ethylendiamintetraacetat (EDTA), wobei die bevorzugte Form diejenige des Dinatriumsalzes von EDTA ist. Andere chelatisierende Mittel, die als nützlich gegen die Klumpenbildung gerichtetes Mittel gelten, schließen Cuminin, Heparin, Streptokinase und solche Mittel ein, wie sie in lysierenden oder gegen die Koagulation wirkenden Zubereitungen gefunden werden.
Der in der Lösung gemäß der Erfindung verwendete Puffer hat einen großen Puffer-Bereich, um sich an die Änderung des pH-Werts anzupassen, die von autolytischen Neben produkten aus den Zellen der Probe stammt, die in der Lösung suspendiert sind. Beispielsweise setzen Cervix-Zellen, wenn sie altern, autolytische Nebenprodukte frei, die das pH- Wert-Gleichgewicht der Suspensions-Lösung verändern. Außerdem kann die Konservierung verschiedener Zell-Typen Lösungen unterschiedlicher Acidität und unterschiedlicher pH-Wert-Bereiche erfordern. Dementsprechend kann eine Lösung mit einem breiten Pufferungsbereich für einen weiten Bereich von Zell-Typen verwendet werden und ist optimal als Lösung gemäß der Erfindung. Beispielhaft zu nennende Zellen, für die diese Lösung verwendet werden können, schließen u.a. Cervix-Zellen, weiße Blutzellen, Bronchialzellen und Sputum ein.
Demgemäß ist ein bevorzugter Puffer ein Acetat-Puffer wie z.B. Natriumacetat, Magnesiumacetat, Calciumacetat und Kombinationen daraus. Zwar können auch andere Puffer, wie beispielsweise Phosphatpuffer oder Tris-Puffer in der Lösung gemaß der vorliegenden Erfindung verwendet werden; der wirksame Pufferungsbereich dieser Puffer gilt jedoch nicht als so breit wie der von Acetat-Puffer bei dem gewünschten pH-Wert.
Zusätzlich zu der Tatsache, daß sie eine Zell-Konservierungs-Lösung ist, tötet die Lösung gemäß der Erfindung gleichzeitig auch ausgewählte Pathogene ab. Beispielsweise tötet die Lösung in Testproben wirksam die folgenden Mikroorganismen: Candida albicans, Aspergillus niger, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcos aureus.
Diese Aktivität der Lösung wird weiter im einzelnen in dem nachfolgenden Beispiel 1 gezeigt.
Bei der praktischen Durchführung der Verfahrensweise gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zellprobe von einem Patienten oder einer anderen Quelle für Säuger-Zellen erhalten. Eine Konservierungs-Lösung des oben beschriebenen Typs wird entweder in ein Röhrchen oder auf einen mit Vertiefungen versehenen Objektträger oder auf eine geeignete Membran gegeben. Die gewonnenen Zellen werden dann in die Lösung gegeben, vorzugsweise innerhalb einer Minute im Anschluß an die Gewinnung. Je früher die gewonnenen Zellen in die Konservierungs-Lösung gegeben werden, desto länger können die Zellen bei Umgebungstemperatur konserviert und in der Lösung suspendiert werden, da das Trauma für die Zellen minimiert wird.
Im Anschluß an die Konservierung und/oder eine Entfernung von Protein kann dann, wenn die Zellen gefärbt oder anderweitig analysiert werden sollen, eine Vorrichtung zum Entfernen suspendierter Zellen zusammen mit dem die Suspension konservierenden Medium und zum Aufgeben der Zellen auf einen Objektträger oder auf eine andere geeignete Fläche zur weiteren Verarbeitung verwendet werden.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben:

Beispiel 1

Eine Zubereitnng der Konservierungs-Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung besteht aus 50 % Methanol in Acetat-Puffer. Die spezielle Formulierung, wie sie in diesem Beispiel verwendet wird (Lösung A) ist die folgende:
3,2 ml Eisessig (CH&sub3;COOH)
7,2 ml 5 N NaOH
89,6 ml destilliertes H&sub2;O
100 ml Methanol (MeOH).
Eine Lösung aus phosphatgepufferter Kochsalz-Lösung (PBS) in 20 %igem Ethanol wurde als Kontroll-Lösung verwendet (Lösung B).
Eine dritte Lösung (Lösung C) bestand aus Phosphatpuffer ohne die Kochsalz-Lösung (NaCl) in Mischung mit 50 % der Ethanol-Lösung B. Der pH-Wert der Phosphatpuffer- Lösung war anfänglich 7,85. Im Anschluß an die Zugabe von 50 % Methanol stieg der pH-Wert auf 9,02 an. Mononatriumhydrogenphosphat-Monohydrat (NaH&sub2;PO&sub4;) wurde zugegeben (2,8 g), was zu einer Senkung des pH-Werts auf 6,52 führte. Die Lösung wurde mit 50 %iger Methanol-Lösung erneut auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht.
Cervix-Zellproben wurden abgenommen und über Nacht bei 4 ºC in PBC gelagert. Die Proben wurden gepoolt und zwei Proben von je 13 ml wurden in 50 ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert (Proben A bzw. B), und eine Probe von 15 ml wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen pipettiert (Probe C). Alle drei Proben wurden 10 min bei maximaler Einstellung zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde verworfen. Aliquote der Lösungen A und B (je 40 ml) wurden den verbliebenen Pellets der Proben A bzw. B zugegeben, während ein 50 ml-Aliquot der Lösung C dem Pellet von Probe C zugegeben wurde. Die folgende Verfahrensweise wurde am Tag 0, und anschließend einmal pro Woche für weitere drei Wochen bei jeder Probe durchgeführt.
Die Proben wurden leicht durchgemischt um die Pellets zu dispergieren. Aliquote (Teilmengen) von je 10 ml wurden von jedem Probenröhrchen abgenommen und in einen Rotor-Zylinder gegeben. Die Proben wurden 15 s lang bei 8 V (482 Upm/V) im Rotor zentrifugiert. Zwei Objektträger mit einer 5 ml-Probe pro Objektträger wurden hergestellt und in 95 %igem Ethanol 30 min lang fixiert. Einer der beiden Objektträger wurde unmittelbar danach unter Verwendung einer üblicherweise verwendeten PAP-Färbung gefärbt. Den zweiten Objektträger ließ man im Anschluß an die Fixierung in einer abgedeckten Schale trocknen; er wurde am Ende der Untersuchung im Batch-Verfahren gefärbt, um die Belastung der Färbung für die Lebensfähigkeit zu reduzieren.
Es wurden die folgenden qualitativen Ergebnisse beobachtet:
Diese Testergebnisse zeigen, daß optimale Ergebnisse bei Verwendung von Lösung A erhalten werden. Dies ergibt sich daraus, daß in der Lösung Zellen bis zu drei Wochen gut konserviert bleiben. Eine gewisse Degeneration, die an abnormalen Zellen beobachtet wurde, kann biologischer Natur sein.

Beispiel 2

Das obige Experiment (Beispiel 1) wurde an Cervix-Zellproben durchgeführt, von denen bekannt war, daß sie abnormale Zellen enthalten. Derartige Zellen schlossen Zellen mit seltener squamöser Atypie (ASM), Zellen mit milder Dysplasie (LG), Zellen mit koilacytotischer Atypie (HPV) und Endocervikalzellen (EC) ein. Die Ergebnisse waren die folgenden:
Während der Untersuchung blieb die Morphologie in überlegener Weise erhalten. Abnormale cytologische Einzelheiten wurden bei allen Temperaturen über den gesamten dreiwöchigen Zeitraum aufrecht erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, daß Lösung A optimal für die Gewinnung und den Transport von Zeliproben ist.

Beispiel 3

Eine allgemeine Formulierung für eine alternative Ausführungsform der Konservierungs- Lösung gemäß der Erfindung ist die folgende:
N/2 Liter entionisiertes H&sub2;O
N x 1,116 g Na&sub2;EDTA 2 H&sub2;O
N x 0,35 ml Eisessig
(45 bis 55 %) Methanol
worin N für die Endgröße des Ansatzes der Lösung steht. Methanol wird in einer Menge bis zu N innerhalb des gewünschten Bereichs der Prozentmenge zugesetzt.

Claims

1. Wäßrige Alkohol-Puffer-Lösung für eine im wesentlichen bei Umgebungstemperatur stattfindende in vitro-Konservierung von Säuger-Zellen flir eine gewählte Dauer, wobei die Lösung umfaßt:

A. einen mit Wasser mischbaren Alkohol in einer Menge, die ausreichend zur Fixierung der Säuger-Zellen ist;

B. ein gegen die Klumpenbildung gerichtetes Mittel in einer Menge, die ausreichend ist, um zu verhindern, daß die Zellen in der Lösung verklumpen; und

C. ein pufferndes Mittel, das die Lösung mit den Zellen für die Dauer bei einem pH Wert im Bereich zwischen etwa 2 und etwa 7 hält.

2. Lösung nach Anspruch 1, worin der Alkohol gewählt ist aus der aus Ethanol, Isopropanol und Methanol bestehenden Gruppe.

3. Lösung nach den Ansprüchen 1 und 2, worin das gegen die Klumpenbildung gerichtete Mittel ein chelatisierendes Mittel ist, das aus der aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und deren Salzen bestehenden Gruppe gewählt ist.

4. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Alkohol 45 bis 55 %, vorzugsweise 50 %, der Lösung ausmacht.

5. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Alkohol etwa 20 % der Lösung ausmacht.

6. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das puffernde Mittel gewählt ist aus der aus PBS, Tris-Puffer, Natriumacetat, EDTA und ihren Salzen und Citronensäure und ihren Salzen bestehenden Gruppe.

7. Verfahren der in vitro-Konservierung von Säuger-Gewebezellen über lange Zeit bei Umgebungsbedingungen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man

A. eine Probe von Säuger-Gewebezellen bereitstellt; und

B. innerhalb einer Zeit von dem Schritt des Bereitstellens der Probe die Zellen in emer Konservierungs-Lösung suspendiert, die umfaßt:

(i) einen mit Wasser mischbaren Alkohol in einer Menge, die ausreichend zur Fixierung der Zellen ohne Koagulation ist;

(ii) ein gegen die Klumpenbildung gerichtetes Mittel in einer Menge, die ausreichend ist, um zu verhindern, daß die Zellen zusammenklumpen; und

(iii) ein pufferndes Mittel, das die Lösung mit den Zellen bei einem pH-Wert im Bereich zwischen etwa 4 und etwa 7 hält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, welches außerdem den Schritt umfaßt, daß man die Zellsuspension bei einer Temperatur im Bereich von etwa 40 C bis etwa 38º C hält.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin gleichzeitig mit der in-vitro-Konservierung der Säuger-Zellen in der Zellsuspension Pathogene zerstört werden, die in der Lage sind, sich in Proben zu vermehren, die die Säuger-Zellen enthalten.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Pathogene gewählt sind aus der aus C. albicans, A. niger, P. aeruginosa und S. aureus bestehenden Gruppe.