KR101000785B1

KR101000785B1 - 세포 보존액

Info

Publication number: KR101000785B1
Application number: KR1020100060445A
Authority: KR
Inventors: 전하나
Original assignee: 전하나
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2010-12-15

Abstract

본 발명은 세포 보존액에 관한 것으로, 좀더 상세히는 암 세포 검사시 신체에서 암 세포를 채취하여 암의 진행단계를 진단 또는 검사하기 위해, 암 검사기기로 이동 및 보관하는 동안 채취한 암 세포가 변질되는 것을 방지하도록, 세포의 부식을 방지하는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol)과 에탄올(Ethanol)을 혼합한 제1혼합물와, 세포의 살균 소독용 포르말린(Formalin)원액과 멸균정류수를 혼합한 포르말린용액과, 미생물 번식을 방지하는 소듐 아자이드(Sodium azide)분말과, 삼투압 충격을 막는 기능과 이온농도를 유지하도록 멸균정류수에 PBS를 혼합한 피비에스버퍼(pbs buffer)와, 암 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키는 역활을 하는 에탄올(Ethanol), 이소프로판올(Isopropanol), 메탄올(Methanol)을 혼합한 알콜혼합물을 혼합하여 암 세포 수용시 암 세포의 부식과 보존을 용이하게 함과 동시에 미생물 번식을 방지하고 충격을 막고 이온농도를 유지시키고 암 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키게 하여 세포의 중첩을 최소화하여 단층 세포를 제작할 수 있는 이점과 세포수축 등으로 발생하는 부적절한 상피세포의 변화가 전혀 없는 이점과 80%이상 버려지던 진단세포를 모두 보존할 수 있어 진단에 용이한 이점과 외국산 수입 보존액을 사용하지 않으므로 검사 원가를 절감할 수 있는 이점과 보존액에 남아있는 검체를 이용하여 HPV DNAchip과 같은 바이러스 검사나 분자생물학 검사 등을 추가로 할 수 있는 이점이 있는 것이다.

Description

세포 보존액{Preservation liquid of cell}

본 발명은 세포 보존액에 관한 것으로, 좀더 상세히는 암 세포 검사시 신체에서 세포를 채취하여 암의 진행단계를 진단 또는 검사하기 위해, 암 검사기기로 이동 및 보관하는 동안 채취한 세포가 변질되는 것을 방지하도록 하는 세포 보존액에 관한 것이다.

일반적으로 한국 과학기술정보 연구원의 통계에 따르면 한국인의 사망원인 1위는 암으로, 인구 10만 명당 134.5명이 사망했으며, 암 종류별로는 폐암(28.4명), 위암(22.6명), 간암(22.5명), 대장암(12.5명) 순으로 사망률이 높았다.

이러한 암 검사로는 CT나 MRI로 암 검사 시 종양의 크기는 3cm 이상 일 때는 발견율이 96%이며, 1cm 이하 일 때는 24.8%로 떨어지나 종양의 크기가 3cm 이상일 때에는 어느정도 암이 진행이 되어진 것을 의미하므로, 암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 초기 암 검사가 절대적으로 필요하게 된다.

일반적으로 자궁경부 암 세포를 검사하는 방법으로는 신체에서 세포를 브러쉬를 이용하여 채취한 세포를 보존이 용이한 세포보존액에 담아 암 세포 검사기기로 이동하여 검사하는 것으로 이때 검사기기로 이동하는 동안까지 세포보존액에 보관하여 세포의 변질을 방지하도록 하는 것이다.

종래의 액상 세포검사 보존액은 의료기관에서 수진자의 세포체취후 검사전까지 세포를 보존하기 위한 용액으로 과거 2000년 이전까지는 “papsmear”라는 재래식 자궁경부 세포검사가 있었으며 현재는 5가지의 액상 세포검사 검사방법이 있으나 “papsmear”검사에 사용하던 보존액의 대부분을 알코올을 사용하고 있어 세포의 부식을 지연하는 기능만을 했을 뿐 세포의 중첩 및 세포의 수축 등으로 발생하는 부적절한 상피세포의 변화가 생기는 등 세포를 직접관찰하여 진단을 내리는데 위진단율이 높은 단점을 가지고 있었으며 또한 현재 국내보험등재가 되어있는 5가지의 액상세포검사에 사용하는 액상세포보존제가 있으나 모두 국외에서 수입하여 사용하여 검사원가를 높게 책정되어 있었다.

또한, 일반적으로 세포를 채취하여 검사하는 방법으로는 채취용 브러쉬를 이용하여 채취하고자 하는 부위에서 검체를 채취하고, 검체가 채취된 브러쉬는 세포보존액에 담아 수용된 보존액 용기를 흔들거나 테이블에 두드려서 세포를 세포보존액 내에 부유시키고, 원심분리관에 혈청분리관을 사용하여 검체를 분주하여 원심분리하고 흡입기를 이용하여 원심분리관 바닥에 침사물을 형성시키고 상기 침사물 위에 완충액을 분주하여 침사물을 형성시키고 침사물을 원심분리관 바닥으로 부터 탈락시키고 원형 검체 분주틀에 부착된 슬라이드 위에 세포 부유액을 적하하고, 완충액을 추가로 적하하여 적하된 상태로 슬라이드를 고정하고 상기 액상세포 슬라이드를 기존의 팝 스미어 슬라이드를 염색하는 데 사용하는 염색시약을 사용하여 팝 스테인한 후 검경하는 단계로 이루어지는 것이다.

본 발명은 상술한 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 위와 같이 신체에서 세포를 채취하여 암의 진행단계를 진단하기 위해 채취한 세포를 검사하기 위해 이동 및 보관시 채취한 세포가 변질되는 것을 방지하도록 하기 위해, 세포의 부식을 방지하는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol)과 에탄올(Ethanol)을 혼합한 제1혼합물과, 세포의 살균 소독용 포르말린(Formalin)원액과 멸균정류수를 혼합한 포르말린용액과, 미생물 번식을 방지하는 소듐아자이드(Sodium azide)분말과, 삼투압 충격을 막는 기능과 이온농도를 유지하도록 멸균정류수에 PBS를 혼합한 피비에스버퍼(pbs buffer)와, 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키는 역활을 하는 에탄올(Ethanol), 이소프로판올(Isopropanol), 메탄올(Methanol)을 혼합한 알콜혼합물을 혼합하여 암 세포를 수용시 세포의 부식과 보존을 용이하게 함과 동시에 미생물 번식을 방지하고 충격을 막고 이온농도를 유지시키고 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키게 하는 세포 보존액을 발명한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 300 ~ 700ml와 에탄올 300 ~ 700ml을 혼합한 제1혼합물과; 포르말린용액 800 ~ 1200ml와; 소듐아자이드 분말 0.3 ~ 5g와, 멸균정류수 3000ml 당 피비에스분말 10 ~ 50g의 비율로 혼합한 피비에스버퍼 700ml와; 에탄올 120 ~ 200ml, 이소프로판올 15 ~ 50ml, 메탄올 15 ~ 50ml을 혼합한 알콜혼합물을 포함하여 이루어지는 것이다.

상기 포르말린용액은 포르말린원액 100 ~ 300ml와 멸균정류수 700 ~ 900ml를 혼합하는 것이다.

삭제

따라서, 본 발명은 상기한 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜과 에탄올을 혼합한 제1혼합물와, 포르말린(Formalin)원액과 멸균정류수를 혼합한 포르말린용액과, 미생물 번식을 방지하는 소듐아자이드(Sodium azide)분말과, 멸균정류수에 PBS를 혼합한 피비에스버퍼(pbs buffer)와, 에탄올, 이소프로판올, 메탄올을 혼합한 알콜혼합물을 혼합한 세포보존액으로 세포의 중첩을 최소화하여 단층 세포를 제작할 수 있는 이점과 세포수축 등으로 발생하는 부적절한 상피세포의 변화가 전혀 없는 이점과 80%이상 버려지던 진단세포를 모두 보존할 수 있어 진단에 용이한 이점과 외국산 수입 보존액을 사용하지 않으므로 검사 원가를 절감할 수 있는 이점과 보존액에 남아있는 검체를 이용하여 HPV DNAchip과 같은 바이러스 검사나 분자생물학 검사 등을 추가로 할 수 있는 이점이 있는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 세포의 부식을 방지하는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol)과 에탄올(Ethanol)을 혼합한 제1혼합물과, 세포의 살균 소독용 포르말린(Formalin)원액과 멸균정류수를 혼합한 포르말린용액과, 미생물 번식을 방지하는 소듐아자이드(Sodium azide)분말과, 삼투압 충격을 막는 기능과 이온농도를 유지하도록 멸균정류수에 PBS(Phosphate Buffered Saline 분말을 희석한 피비에스버퍼(Pbs buffer)와, 암 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키는 역활을 하는 에탄올(Ethanol), 이소프로판올(Isopropanol), 메탄올(Methanol)을 혼합한 알콜혼합물을 혼합하는 것이다.

상기 본 발명의 세포보존액을 제조하는 실시 예로는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol) 300 ~ 700ml와 에탄올(Ethanol) 300 ~ 700ml을 혼합한 제1혼합물 1000ml와; 포르말린(Formalin)원액 100 ~ 300ml와 멸균정류수(DW) 700 ~ 900ml를 혼합하여 포르말린용액 1000ml와; 소듐아자이드(Sodium azide)분말 0.3 ~ 5g와; 멸균정류수 3000ml 당 피비에스(PBS)분말 10 ~ 50g의 비율로 혼합한 피비에스버퍼(pbs buffer) 700ml와; 에탄올(Ethanol) 120 ~ 200ml, 이소프로판올(Isopropanol) 15 ~ 50ml, 메탄올(Methanol) 15 ~ 50ml을 혼합한 알콜혼합물 250ml를 혼합하는 것이다.

그리고, 본 발명의 세포보존액을 구성하는 재료를 설명하자면,

세포의 부식을 방지하기 위해 사용하는 제1혼합물을 구성하는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol)은 산화에틸렌의 중합체로 보통 무색 투명한 고체이거나 백색의 고체로 다른 화장품 성분들과 함께 광범위하게 사용되는데 제품의 원하는 모습, 점성, 녹는점을 얻기 위해 혼합되어지는 것이다.

상기 세포의 부식을 방지하기 위해 사용하는 포르말린은 무색의 자극성 기체로 융점 -92℃, 비등점 -21℃로 가연성이며 물에 녹으며, 40%수용액을 포르말린이라 하여 무색이 액체로 인화점은 메탄올 농도에 따라 달라지나 약 85℃이다. 2.5-3.5의 pH값을 갖으며 용도로는 살균제, 소독제, 방부제로 사용되는 것이다.

상기 소듐아자이드(Sodium azide)는 분말로 미생물 번식을 방지하기 위해 상기 세포보존액에 희석하는 것이다.

상기 멸균증류수는 증류수를 오토클레이브에 121℃ 멸균시킨 것으로 주로 희석할때 사용하는 것이다.

상기 PBS(인산완충식염수)는 Phosphate Buffered Saline으로 인산완충용액 + 생리식염수의 의미이며 Phosphate buffer로 완충용액이라고 하며 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이며 완충용액은 외부로부터 어느 정도의 산 또는 염기를 가해도 그것들의 영향을 받지 않고, 수소이온농도를 일정하게 유지하려고 하는 용액으로 그 사용목적으로는 이온세기를 맞추어 주는 역할로 좀더 상세히는 우리 몸은 일정농도의 이온농도를 가지고 있으며 이온농도가 너무 높거나 낮을 경우에는 우리 몸의 세포가 삼투막으로 되어있기 때문에 지나친 물의 흐름이 생겨 세포가 수축하거나(외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여(외부이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴될 위험이 있어 우리가 흔히 생리식염수라고 하는 것은 0.9%의 소금을 녹인 수용액으로 위와 같은 이온농도를 유지하기 위한 것입니다.

상기 PBS의 또 다른 목적은 단순한 식염수 이외에 완충용액으로의 작용으로 즉 인산완충용액의 기능을 더한 것이며 이러한 완충용액은 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해 주고 급격한 pH 변화는 여러 가지 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질(효소)의 기능이 이러한 pH 변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있읍니다.

따라서, 상기 피비에스버퍼(pbs buffer)는 세포가 삼투막으로 되어있기 때문에 이온농도가 너무 높거나 낮을 경우에는 세포가 수축하거나 팽창하여 세포가 파괴될 위험이 있는데 이때 삼투압 충격을 막는 기능과 이온농도를 유지하도록 하기 위해 이온 수치를 맞추도록 하는 것이다.

그리고, 상기 알콜혼합물을 구성하는 에탄올은 특유의 냄새와 맛이 있고, 상온에서는 무색의 액체로 존재하며 녹는점은 -114.5°C, 끓는점은 78.32°C이다. 물, 다른 알코올, 에테르, 케톤, 클로로폼 등에 녹을 수 있으며, 273K온도에서 0.54의 cal/g°C을 가지며 탄화수소유, 특히 휘발유와는 무수 상태에서는 완전히 섞일 수 있으나, 물이 존재할 경우에는 두 개의 층으로 나누어지며, 단백질을 응고시키므로 소독 및 살균 작용이 있고 살균력은 60%일 때 최고이고 90% 이하 또는 80% 이상에서는 약하며 살균제. 손, 피부의 소독 또는 기구의 소독에 사용한다. 분석용 시약 또는 용매로 사용하기도 한다.

그리고, 이소프로판올(Isopropanol)은 프로판올의 이성질체인 지방족 포화알코올이며 독특한 냄새가 나는 무색의 가연성 액체이며 용제와 청소용 액체로 널리 쓰이고 독특한 냄새가 나는 무색의 휘발성 액체로, 인화성이 있으며, 다른 알코올을 비롯하여 물, 에테르, 아세톤이나 탄화수소계 용매에 잘 녹으며 많은 점에서 에탄올과 비슷한 반응성을 보이나, 2차알코올로서의 특징도 보이며, 산화하면 아세톤이 되며 에테르와 함께 용제, 동결 방지제, 소독약, 방부제 등으로도 사용된다.

그리고, 메탄올(Methanol)은 CH3OH의 시성식을 갖는 가장 간단한 알코올로 메틸알코올이라고도 하며 유기합성재료, 용제, 세척제, 연료, 에탄올의 변성용으로 쓰이고 가볍고 무색의 가연성이 있는 유독한 액체이며, 에탄올과 메탄올은 알코올이라는 같은 부류의 물질이며, 성질이 비슷하고 단지, 메탄올이 에탄올에 비해 탄소와 수소를 적게 포함하고 있기 때문에 메탄올의 끓는점이 에탄올보다 낮은 것이다.

상기 알콜혼합물은 암 세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키는 역활을 하도록 에탄올(Ethanol), 이소프로판올(Isopropanol), 메탄올(Methanol)을 혼합하는 것이다.

상기와 같이 구성된 본 발명의 세포보존액은 신체에서 암 세포를 채취하여 암의 진행단계를 진단하기 위해서 검사기계 또는 검사할 수 있는 기계를 보유한 병원 및 연구원으로 장시간 이동 및 보관시에도 채취한 세포가 변질되는 것을 방지하도록 하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 세포보존액은 세포의 보존 성능이 동결 보존뿐만 아니라 냉장 보존을 가능하게 하고, 또한 보존액을 제거하기 위한 세정을 필요로 하지 않아 보존액이 존재하고 있더라도 세포의 배양 등이 가능한 세포 보존액을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 세포보존액의 또 다른 실시예로는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol)와 에탄올(Ethanol)을 1 : 1 비율로 혼합하여 폴리에틸렌 글리콜이 50% 함유된 제1혼합물 1000ml와; 포르말린(Formalin)원액과 멸균정류수(DW)를 1 : 9 비율로 혼합한 포르말린용액 1000ml와; 소듐아자이드(Sodium azide)분말 0.5g과; 멸균정류수 3000ml 당 피비에스(PBS)분말 30g의 비율로 혼합한 피비에스버퍼(pbs buffer) 700ml와; 에탄올(Ethanol) 180ml, 이소프로판올(Isopropanol) 35ml, 메탄올(Methanol) 35ml을 혼합한 알콜혼합물 250ml를 혼합하는 것이다.

상기와 같은 구성으로 혼합한 세포보존액의 구성성분을 표 1을 통하여 비교하여 보면,

참고로 중첩, 수축된 세포가 적은 것이 정상적인 상피세포가 많아 슬라이드 판독하기에는 더 용이한 것이다.

표 1에서 보는 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylrn Glycol) 100 ~ 300ml를 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수가 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있고, 300 ~ 700ml를 혼합한 경우 상피세포수가 많아 슬라이드 판독이 용이하며, 700 ~ 1000ml를 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수, 상피세포가 같은 비율로 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있는 것이다.

그리고, 제1혼합물을 구성하는 에탄올(Ethanol)은 100 ~ 300ml를 혼합한 경우 상피세포에 비해 중첩세포와 수축된 세포수가 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있고, 300 ~ 700ml를 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수에 비해 상피세포수가 많아 슬라이드 판독이 용이하며, 700 ~ 1000ml를 혼합한 경우 중첩세포, 수축된 세포수와 상피세포수가 같은 비율로 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있는 것이다.

그리고, 상기 폴리에틸렌 글리콜과 에탄올을 혼합한 제1혼합물을 100 ~ 900ml 혼합한 경우 상피세포에 비해 중첩세포와 수축된 세포수가 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있고, 1000ml를 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수에 비해 상피세포수가 많아 슬라이드 판독이 용이하며, 1100 ~ 1500ml를 혼합한 경우 중첩세포, 수축된 세포수와 상피세포수가 같은 비율로 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있는 것이다.

또한, 상기 피비에스버퍼를 구성하는 멸균정류수 3000ml 당 혼합하는 피비에스(PBS)분말을 1 ~ 10g 비율로 혼합한 경우 상피세포에 비해 중첩세포와 수축된 세포수가 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있고, 10 ~ 50g의 비율로 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수에 비해 상피세포수가 많아 슬라이드 판독이 용이하며, 50 ~ 70g의 비율로 혼합한 경우 중첩세포, 수축된 세포수와 상피세포수가 같은 비율로 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있는 것이다.

상기 소듐아자이드(Sodium azide)분말을 0.1 ~ 0.3g 혼합한 경우 상피세포에 비해 중첩세포와 수축된 세포수가 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있고, 0.3 ~ 0.5g을 혼합한 경우 중첩세포와 수축된 세포수에 비해 상피세포수가 많아 슬라이드 판독이 용이하며, 0.5 ~ 0.7g을 혼합할 경우 중첩세포, 수축된 세포수와 상피세포수가 같은 비율로 많아 슬라이드 판독이 어려움이 있는 것이다.

Claims

폴리에틸렌 글리콜 300 ~ 700ml와 에탄올 300 ~ 700ml을 혼합한 제1혼합물과; 포르말린용액 800 ~ 1200ml와; 소듐아자이드 분말 0.3 ~ 5g와, 멸균정류수 3000ml 당 피비에스분말 10 ~ 50g의 비율로 혼합한 피비에스버퍼 700ml와; 에탄올 120 ~ 200ml, 이소프로판올 15 ~ 50ml, 메탄올 15 ~ 50ml을 혼합한 알콜혼합물을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
제 1항에 있어서,
상기 포르말린용액은 포르말린원액 100 ~ 300ml와 멸균정류수 700 ~ 900ml를 혼합하는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
삭제
삭제