JP3723494B2 - 細胞保存溶液 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、室温で細胞を保存するための溶液並びに方法に関し、更に詳しくは、分析を効果的に行うために生細胞を迅速に固定するための溶液並びに方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床並びに研究の分野で効果的な分析を行うためには、細胞検体を保存することが、必要不可欠である。診断面からいっても、検体が新しければそれだけ価値が高いことになる。検体採取と検体のスライド等のマトリックスへの固定との間に時間が経過すればするほど、分析が不正確になる。供与体のおかれている生理学的条件から引き離された場合、細胞は、数分後には自己分解を始める。臨床の現場では、患者から鞘細胞、筋細胞等の検体を取り出し、これを組織学的に分析するために染色する、という操作が日常的に行われる。このような組織化学的染色は、細胞生理学並びに病理学の解釈・研究上、非常に有益であるが、多くの場合、検体採取と染色を同時に行うことはできない。通常、患者の生検を行った後、時間をおいてから、採取された細胞、組織等の細胞学的あるいは組織学的分析が行われる。が、この間に、細胞は次第に弱っていき、分析結果は信頼性のおけないものとなる。
【０００３】
細胞の採取から固定及び／あるいは分析にいたるまでの間、細胞検体を保存する、ための溶液として、数種類の塩溶液、塩類溶液が市販されている。これには、ハンクス細胞培養用塩類溶液、最小必須組織培養媒体(MEM)、 Polysal、 標準塩溶液等が含まれるが、ハンクス溶液、MEM 等の媒体は高価であり、ルーチンには用いられていない。
【０００４】
カリフォルニア州エメリヴィルのCutter Biologicalsが販売しているPolysalは、正常なヒト血漿と生理学的に等濃度の塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムを含む、ポリイオン性電解溶液である。この塩溶液は、比較的短時間の細胞保存には適しているが、バクテリアの成長を阻止することができず、室温での長期間に渡る保存には使用できない。
【０００５】
ハンクスBSS 溶液は、リンガー溶液を改良したものであり、浸透圧を生理学的限界内に維持し、緩衝系を含むことにより最適のpH範囲を保持し、且つ、正常な細胞代謝に適した無機イオン濃度を与えるように、調製されている。この溶液には、グルコースエネルギー源が含まれている。しかし、この溶液で２０分以上細胞を生存させておくことは難しく、長時間細胞を保存した場合には、細胞病理学的分析結果に悪影響を与える。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
臨床組織並びに細胞検体の多くは、染色並びに分析を妨害する、生体外タンパク質を含んでいる。が、検体細胞を塩類溶液の中に保存する場合、このような副次的問題には、ほとんど考慮が払われていない。
【０００７】
検体を長時間保存した場合、バクテリアが成長する可能性が高いが、従来の標準あるいは添加塩類溶液は、このバクテリアの成長を促進させてしまう。
【０００８】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、細胞学的並びに組織学的分析のために細胞及び組織を保存する、細胞定着溶液並びに方法を提供することを目的とする。
【０００９】
具体的には、本発明は、細胞を、長期間、室温、インビトロ（生体外）で保存する、保存媒体を提供することを目的とする。
【００１０】
更に、本発明は、検体溶液から不用のタンパク質を移動させ、これを除去する、保存媒体を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下を提供する。
【００１２】
１． 所定期間、哺乳類細胞を室温、インビトロ（生体外）で保存するための、アルコール緩衝水溶液であり、検体細胞を定着するために充分な量の、水と混和可能なアルコールと、溶液内での前記細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、前記細胞を含む溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝剤と、を含むことを特徴とする細胞保存溶液。
【００１３】
２． 生検後、細胞を染色、分析するまでの間、哺乳類細胞を室温、インビトロ（生体外）で保存するための、アルコール緩衝水溶液であり、４５ないし５５％のメタノールと、２ないし４％の酢酸と、６ないし８％の酢酸ナトリウム緩衝液と、を含むことを特徴とする細胞保存溶液。
【００１４】
３． 哺乳類組織・細胞を、長期間、室温、インビトロ（生体外）で保存するための方法であり、前記組織・細胞検体を作成し、前記細胞検体の作成後、所定期間、前記細胞を保存溶液に懸濁させる工程を含み、前記保存溶液が、検体細胞を定着するために充分な量の、水と混和可能なアルコールと、溶液内での前記細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、前記細胞を含む溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝剤と、を含む、ことを特徴とする細胞保存方法。
【００１５】
４． 細胞検体中の病原菌カンジダ・アルビカンス、クロカビ、大腸菌、緑膿菌、あるいは、黄色ブドウ球菌を破壊する抗菌性溶液であり、検体細胞を定着するために充分な量の、水と混和可能なアルコールと、溶液内での前記細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、前記細胞を含む溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝剤と、を含む、ことを特徴とする抗菌性溶液。
【００１６】
本発明の細胞保存溶液は、生検後、染色等の分析までの間、室温、インビトロ（生体外）で、哺乳類細胞及び組織を保存するための、アルコール緩衝溶液であり、検体細胞あるいは組織を定着するために充分な量の、水と混和可能なアルコールと、溶液内での細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝剤とを含む、ことを主な特徴とする。
【００１７】
本発明の保存溶液中に懸濁させた場合、室温（約３７度）で、約三週間、細胞を保存することができる。この細胞保存期間は、保存溶液の新しさ（調製後細胞懸濁液作成までの溶液貯蔵期間）、細胞採取から細胞懸濁までに経過した時間、並びに、アルコール含量により左右される。調製後冷蔵庫あるいは室温でかなり長期間貯蔵されていた溶液を用いた場合、細胞保存能力は低下する。
【００１８】
アルコールとしては、エタノール、メタノール、イソプロパノール等を用いることができ、特に、メタノールが望ましい。アルコール成分は、細胞のDNA を維持し、細胞学的染色並びに分析に適した状態に、細胞核の細部を保持する。溶液中のアルコール成分の含量は、４５ないし５５％、更に望ましくは５０％である。溶液が６０％以上のアルコール成分を含む場合、細胞の凝集が起こり、検体細胞を効果的に染色することが難しくなる。逆に、アルコール含量が４０％以下の場合、細胞を長期保存することができず、時間と共に細胞の質が低下する。
【００１９】
但し、長期保存用（二日以上）ではなく、染色、分析までの間、短期に細胞を定着・保存する目的の場合には、アルコール含量を約２０％としてもよい。細胞を最初２０％アルコール含量の溶液で定着させた後、５０％含量の溶液に移して、長期保存を図ることもできる。
【００２０】
抗凝集剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）あるいはその二ナトリウム塩、三カリウム塩、四ナトリウム塩等の、キレ−ト剤が用いられ、特に、EDTAの二ナトリウム塩が好ましく用いられる。あるいは、クミジン、ヘパリン、ストレプトキナーゼ、及びその他溶解あるいは抗凝集性組成を有するキレ−ト剤を用いてもよい。
【００２１】
本発明の溶液に用いられる緩衝剤は、大きな緩衝能力を有し、溶液中に懸濁されている検体細胞から自己分解副産物が生じる結果起こるpHの変化を収容、調整できるものであればよい。例えば、古くなった頚部細胞は、自己分解副産物を放出し、懸濁溶液のpHを変化させる。また、細胞種毎に、保存の際要求される酸性度並びにpH範囲が異なる。従って、溶液が広い緩衝範囲を有していれば、様々な種類の細胞種の保存に用いることができる。本発明の溶液が対象とする細胞には、例えば、頚部細胞、白血球、気管枝細胞、唾液等が含まれる。
【００２２】
従って、緩衝剤として好ましく用いられるものは、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム、あるいはその複数が組合せられた酢酸緩衝液である。他にも、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸、クエン酸塩等を用いることもできるが、有効な緩衝範囲は、酢酸緩衝液ほど広くはない。また、EDTAあるいはその塩を緩衝剤として用いることもできる。
【００２３】
本発明の細胞保存溶液は、例えば、４５ないし５５％（特に望ましくは５０％）のメタノールと、２ないし４％の酢酸（特に望ましくは氷酢酸の形で３％）と、６ないし８％（特に望ましくは７％）の酢酸ナトリウム緩衝液とを含む（％はすべて容量％である）。
【００２４】
また、メタノール、抗凝集剤としてEDTAのナトリウム及びカリウムの混合塩、更に、緩衝剤として酢酸緩衝液を含む、構成でもよい。あるいは、約２０％のメタノール、１mM酢酸マグネシウム、２mM酢酸カルシウム、１０mM塩化カリウム、及び、０．１％塩化ナトリウムを含む溶液を保存溶液として調製してもよい。
【００２５】
本発明の溶液は、細胞保存に用いることができるばかりでなく、ある種の病原体を殺す役割も果たす。即ち、生検後、所定期間、哺乳類細胞検体を本発明の保存溶液中に懸濁させることにより、細胞検体から不用のタンパク質、微生物を除去することができる。例えば、カンジダ・アルビカンス、クロカビ、大腸菌、緑膿菌、あるいは、黄色ブドウ球菌等の微生物を殺すことができる。この作用に関しては、実施例１に詳述する。
【００２６】
また、タンパク質除去後の検体を新しい保存溶液中に移し、保存することもできる。
【００２７】
本発明の細胞保存方法は、生検後、所定期間、哺乳類細胞検体を上述の保存溶液に懸濁させる、ことを主な特徴とする。本発明の方法は、懸濁された細胞を、少なくとも３週間、４度から３８度の範囲の室温で、保存することを可能にする。この期間中、細胞構造は保持されており、望ましい状態で染色される。
【００２８】
上述の細胞保存溶液を、孔のあいたスライド、あるいは、適当な膜を備えたバイアル中にいれ、そこに、患者等から採取した細胞検体を入れる。この場合、細胞採取から保存溶液への収容までの時間は短ければ短いほどよい（１分以内が望ましい）。この間隔が短ければ、細胞の損傷が少なくなり、室温での長時間保存が可能になる。
【００２９】
上述の保存及び／あるいはタンパク質除去後、細胞を染色し、あるいは、分析する場合には、周知の器具を用いて、保存溶液と共に懸濁細胞を取り出し、スライド等に移せばよい。
【００３０】
（作用）
本発明の細胞保存溶液は、アルコール、抗凝固剤、並びに、細胞の保存中溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝液を含む、アルコール緩衝溶液である。
【００３１】
採取された哺乳類細胞を本発明のアルコール緩衝溶液に懸濁させることにより、細胞の核構造を維持し、且つ、細胞膜をそのままに保った状態で、染色等の分析が行われるまでの所定期間、細胞を室温で保存することができる。また、本発明の溶液は、検体中の微生物病原体を破壊し、レトロウィルス活性を阻害し、検体から不用のタンパク質を除去する役割も果たす。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明の実施例を実験結果と共に説明するが、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、その精神または主要な特徴から逸脱することなく、他のいろいろな形態で実施することができる。
【００３３】
（実施例１）
以下の組成を有する細胞保存溶液約２０mlと、試験対象となる微生物の一部を、殺菌した遠心分離チューブに移した。検体は、すべて、レシン寒天培地で培養されたものを用いた。
【００３４】

溶液のpHを約５．８に調節した後、次のATCC微生物の生存率を調べた。

下記に試験結果を示す。

従来の細胞保存溶液の多くは、検体中に存在する微生物を殺すどころか、むしろ増殖させ、目的細胞の分析、研究を阻害する結果となっていた。これに対して、以上の実験から明かなように、本発明の細胞保存溶液には、上記のような微生物を効果的に殺す働きがある。即ち、上述の組成を持つ本実施例の溶液は、細胞保存効果に加えて、抗菌効果も有する。
【００３５】
（実施例２）
下記の組成を有する、５０％メタノール酢酸緩衝液を、溶液Ａとして調製した。

更に、リン酸緩衝塩（PBS)の２０％エタノール溶液を、対照溶液Ｂとして、また、塩（NaCl）を抜いた５０％メタノールリン酸緩衝液を溶液Ｃとして、調製した。リン酸緩衝液のpHは最初7.85であり、メタノール50mlを加えたことにより、9.02に上昇した。そこにリン酸二水素ナトリウム（NaH₂PO₄）を2.8g加え、pHを6
.52 とした後、残りのメタノール50mlを加え、pHを7.5 に調節した。
【００３６】
頚部細胞検体を採取し、４℃の温度条件下、ＰＢＣ内で一晩保存した。細胞検体１３ｍｌずつを、二本の５０ｍｌ遠心分離チューブに計り取り（検体Ａ及び検体Ｂ）、検体１５ｍｌを５０ｍｌ遠心分離チューブに計り取った（検体Ｃ）。３本の検体を最高速度で１０分間遠心分離した後、上澄みを取り除く。検体Ａの残渣に溶液Ａを４０ｍｌ、検体Ｂの残渣に溶液Ｂを４０ｍｌ、溶液Ｃの残渣に溶液Ｃを５０ｍｌ、各々加えた。各検体について、以下の操作を０日目に行い、その後、１週間に一度ずつ、３週間、同様の操作を行った。
【００３７】
検体を軽く撹拌し、残渣を分散させた。各検体チューブから１０ｍｌずつ取り出し、ローター・シリンダーに移した。検体を８Ｖ（４８２ｒｐｍ／Ｖ）で１５秒間回転させた後、二枚のスライドにそれぞれ５ｍｌずつ検体を載せ、９５％エタノールで３０分間定着させた。二枚のスライドの内一枚を、直ちに、ルーチンに用いられるパパニコロー染色法で染色した。二枚目のスライドは、蓋をした容器内で、定着後、乾燥させ、染色生存度の偏りを少なくするため、試験の最後にまとめて染色した。
【００３８】
以上の操作により、以下の定性的な観察結果が得られた。

以上の比較より、溶液Ａの結果が最も良好であることがわかる。溶液Ａ中では、細胞は３週間という長期にわたり、非常によく保存されている。異常細胞中にいくらかの変性が見られるが、これは生物学上存在するものであると、考えられる。
【００３９】
（実施例３）
上記と同様の実験（実施例２）を、異型鱗状細胞（ＡＳＭ）、弱異形細胞（ＬＧ）、異型匙状細胞（ＨＰＶ）、子宮頚内細胞（ＥＣ）等の異常細胞を含む頚部細胞検体を対象として行った。結果を以下に示す。

非常に良好な状態が、試験期間中を通して、維持された。何れの温度においても、異常な細胞学的特性が３週間以上保持された。即ち、これらの結果からも、溶液Ａが細胞検体の採取及び移送に適していることがわかる。
【００４０】
（実施例４）
細胞保存溶液を以下のような組成で調製する。
脱イオン水 N/2 liter
Na₂EDTA・2H₂O N×1.116g
氷酢酸 N×0.35ml
メタノール (45-55%)
ここで、Ｎは、最終的な溶液の量を示す。メタノールが上記の所望のパーセント範囲になるように、メタノールを加え、全量をＮにする。
【００４１】
（実施例５）
細胞保存溶液を以下のような組成で調製する。
1mM 酢酸マグネシウム
2mM 酢酸カルシウム
10mM 塩化カリウム
0.1% 塩化ナトリウム
20% メタノール
本実施例の溶液組成中、カルシウム及びマグネシウムイオンは、細胞学的に重要な細胞の核形態を保存する役割を果たす。酢酸は、緩衝剤として作用し、溶液のpHを安定させると共に、カルシウム及びマグネシウムの析出を防ぐ。一方、リン酸緩衝液を用いた場合には、カルシウム、マグネシウムの析出が起こる。また、ナトリウム及びカリウム塩は、細胞を安定化させ、ヘモグロビン等の血清タンパク質の沈澱並びに凝集を防ぐ。更に、メタノールは、赤血球の分解を助け、バクテリアの成長を阻害し、細胞学的に重要な細胞を保持する。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述したように、採取された細胞を本発明のアルコール緩衝溶液に懸濁させることにより、細胞の核構造を維持し、且つ、細胞膜をそのままに保った状態で、染色等の分析が行われるまでの所定期間、細胞を室温で保存することができる。また、本発明の溶液は、検体中の微生物病原体を破壊し、レトロウィルス活性を阻害し、検体から不用のタンパク質を除去する役割も果たす。

Claims (13)

1. 細胞を含む試料中の哺乳動物細胞の核形態を、インビトロ（生体外）で保存するための、アルコール緩衝水溶液であって、該溶液が、以下： 水と混和可能なアルコールであって、該アルコールは、エタノールと、イソプロパノールと、メタノールとからなる群から選択され、ここで、該アルコールは、該溶液の２０％〜６０％以下を構成する、アルコールと、
   該試料中の哺乳動物細胞の核形態を保存するに十分な量の、マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンと、
   該溶液のｐＨを４から７の範囲に保つ緩衝剤と、
   を含む、溶液。
2. 前記アルコールが、前記溶液の２０％を構成する、請求項１に記載の溶液。
3. 前記緩衝剤が酢酸緩衝剤である、請求項１または２のいずれか１項に記載の溶液。
4. 前記マグネシウムイオンおよびカルシウムイオン、ならびに前記緩衝剤を提供するために、酢酸マグネシウムおよび酢酸カルシウムを含む、請求項１または３のいずれか１項に記載の溶液。
5. ２ｍＭの酢酸カルシウムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶液。
6. １ｍＭの酢酸マグネシウムを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の溶液。
7. 前記試料中にヘモグロビンが存在する場合に、該ヘモグロビンの沈殿または凝集を減らすために十分な量のカリウムイオンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の溶液。
8. 前記試料中にヘモグロビンが存在する場合に、該ヘモグロビンの沈殿または凝集を減らすために十分な量のナトリウムイオンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の溶液。
9. 前記水と混和可能なアルコールとして、メタノールを含み、そして前記カリウムイオンおよびナトリウムイオンを提供するために、塩化ナト リウムおよび塩化カリウムを含む、請求項７または８に記載の溶液。
10. ０．１％の塩化ナトリウムを含む、請求項９に記載の溶液。
11. １０ｍＭの塩化カリウムを含む、請求項９または１０に記載の溶液。
12. インビトロ（生体外）で哺乳動物細胞の核形態を保存するための方法であって、該方法は、該細胞を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の溶液と混合する工程を包含する、方法。
13. 前記細胞を含む溶液を、４℃〜３８℃の範囲の温度に保つ工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。