CN103704200B - 一种抗菌稳化细胞组织样品成分和结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种新型无毒的生物兼容保存液的制备及其使用方法。主要通过在传统的细胞和组织的生物缓冲保护液中加入碳原子数在3-8之间的多羟基化合物，与具有抗氧化和螯合作用的小分子的配体制备成生物兼容保存液。本发明的生物保存液能够明显抑制保存液中细菌的生长和繁殖，延缓细胞和组织的代谢进程，反复冻融也不会对细胞和组织造成实质性伤害。本发明提高了诊断用的细胞和组织样品的保存质量，从而提高了诊断结论的准确性，能够很好的满足现代医学的分子、生化和病理诊断的需求，弥补了传统方法的不足。
Description
技术领域：
本发明涉及一种分子、生化和病理诊断用的细胞和组织样品的稳化方法，尤其涉及一种新型无毒的生物兼容保存液的制备及其使用方法。
背景技术：
在医学领域，作为分子、生化和病理诊断用的细胞和组织样品的质量极为重要，它关系到各种诊断结论的准确性。细胞和组织样品，从人体采集以后会发生各种变化，要确保诊断结论的正确性，最好在采集以后立即进行诊断。不能立即进行诊断时，需要采取相应的方法以稳化固定细胞和组织样品，以保证样品的有效性。
传统的细胞和组织样品保存、稳化和固定方法，难以满足现代医学的分子、生化和病理诊断要求。方法之一是把采集到的细胞和组织样品，放入磷酸缓冲液生理盐水中，用于诊断前暂存于4℃的环境中；或将细胞和组织样品在磷酸缓冲液生理盐水中寄送到外地的诊断测试中心。用磷酸缓冲液生理盐水的方法有多个缺点：1、采集的样品并非无菌，暂存和寄送过程中细菌和真菌的活动，改变细胞和组织样品的生化成分和结构，影响诊断结果。2、磷酸缓冲液生理盐水无法支持细胞和组织的正常代谢活动，造成细胞和组织代谢的紊乱，也会改变样品的生化成分和结构及诊断结果。3、速冻的方法，在没有低温保护剂的情况下，冰晶的形成会对细胞和组织造成不可逆的伤害。
发明内容：
本发明对传统的保存液进行了改进，是一种抗菌稳化细胞组织样品成分和结构的方法，通过在传统的细胞和组织的生物缓冲保存液中添加使用一种无毒的生物兼容保存液来达到抗菌和稳化生化细胞组织样品的目的。该生物兼容保存液由两种成分组成：一种是碳原子数在3-8之间的多羟基、非还原性、水溶性化合物(如甘油、糖、糖醇等)，百分含量在2％-12％(W／V)；另一种是有抗氧化和螯合作用的小分子的配体(如乙二胺四乙酸或乙二醇-双-(2-氨基乙基醚)四乙酸等)，能够防止细胞和组织在生物缓冲液中发生氧化还原反应，浓度范围在2-50mMol。
该保存液的配制方法为：取纯净水加入上述两种组分，定容后通过过滤制备无菌溶液。溶液有抑制微生物活动的功效。
该保存液的使用方法为：使用时，将采集的生物组织样品直接放入已配好的本发明保存液中。该溶液可在室温中运输和短暂保存，如果细胞样品已在其他生物缓冲液中，也可以加入本兼容保存液。
本发明有以下优点：1、本发明保存液能够明显抑制细菌的生长和繁殖，随着保存时间的延长，保存液里面的菌落数会降低，可保护样品中生化成分和组织结构免受破坏，保证样品的生物活性。2、可以延缓细胞和组织的代谢进程，能维持细胞和组织的最初的成分和结构，提高细胞和组织的分子、生化和病理诊断的精确度。3、本发明保存液通过反复冻融对细胞和组织的破坏和损伤远小于传统的保存液，可以达到长期保存细胞和组织的目的。
图例说明：
图1为猪皮在三种生物缓冲液中在不同时间段的菌落数对数值(RT：室温；纵坐标单位：每毫升保存液中菌落数的对数值)。
图2为三种猪皮在三种生物缓冲液中不同温度下的蛋白水解酶活性(RT：室温；纵坐标单位：蛋白酶水解活性)。
图3为在-80℃的磷酸缓冲液生理盐水(PBS，pH7.4)中，猪皮样品经过五天的冻存，复温融化后的样品图像。
图4为在从0℃降温到-50℃过程中，磷酸缓冲液生理盐水(PBS，pH7.4)与本发明保存液的差示扫描量热仪(DSC)结果。
具体实施方式：
为了加深对本发明的理解，下面结合实施对本发明作进一步详述。
分别配制三种溶液：①普通的磷酸缓冲液生理盐水(PBS，pH7.4)，是传统的保存液，作为空白对照组；②在PBS中，加入10％(重量百分比，下同)的甘油和50mmol的乙二胺四乙酸(EDTA)，为本发明实施例一；③在PBS中，加入15％的甘油和50mMol的EDTA，为本发明实施例二；④在PBS中，加入8％的甘油和10mmol的EDTA，为本发明实施例三。
(1)皮肤样品在常温下的稳化和保存
将三种猪皮组织样品分别放入①②③三种保存液中，测定在不同温度、不同时间段的菌落数对数值变化。
从图1中可以看出，①②③在室温和12℃环境下，保存液②③(实施例一、二)中的猪皮样品菌落数目明显的小于保存液①(空白对照)中猪皮样品的菌落数，说明本发明保存液能够明显的抑制微生物的生长。从保存时间来看，保存液①中猪皮样品的菌落数随着时间的延长而增长，在保存液②中的猪皮样品随着时间的延长其菌落数的增长情况趋于停滞，而保存液③中的猪皮样品的菌落数随着时间的延长而呈现减少的趋势。本发明保存液能够很好的抑制PBS中细菌和真菌的生长和繁殖，保护样品中生化成分和组织结构免受破坏，延长样品的保存时间。
(2)样品中蛋白水解酶活性变化
将三种猪皮组织样品分别放入①②③三种保存液中保存48小时，测定在不同温度下蛋白水解酶活性的变化。实验结果如图2所示，在室温和12℃下，保存液②③(实施例一、二)中的1号和3号猪皮样品蛋白水解酶的活性明显的低于保存液①(空白对照)中的1号和3号猪皮样品。是因为在本发明保存液样品中蛋白水解酶活性低，延缓组织中蛋白质水解的速度，能够很好地保护样品组织结构的完整和生物活性分子。
(3)皮肤样品在低温下的稳化和保存
将猪皮样品分别放入在保存液①(空白对照)和保存液④(实施例三)中，然后放入-80℃的环境中保存。经过五天的冻存，复温将样品融化。
保存液①中的猪皮样品，融化后有很多皱折，即使经过较长时间的复水，皱折也不会消失，如图3所示。说明组织结构发生了不可逆的变化。用差示扫描量热仪测定降温时冰晶形成和冰水的变化过程(如图4所示)发现，保存液①中的皮肤样品，在降温时有四个放热峰，随着温度下降，出现结冰、氯化钠水合物析出和两个磷酸盐水合物的析出。在磷酸盐水合物析出时，pH会出现较大的变化，可能导致蛋白质变性。保存液④中的样品只有结冰一个峰。本发明保存液防止冰冻时样品中pH突然变化带来的破坏。热焓值分析表明，保存液①中的皮肤样品在冻存中脱水很严重，每克样品的不结冰水含量为0.05克左右。而保存液④中的皮肤样品，冻存时每克样品的不结冰水含量高达0.20克左右。本发明保存液防止冰冻时样品的过度脱水破坏。由此可以看出，本发明保存液通过反复冻融对细胞和组织的破坏和损伤远小于传统的保存液，可以达到长期保存细胞和组织的目的。
Claims (3)
1.一种抗菌稳化细胞组织样品成分和结构的方法，其特征在于：在现有技术的细胞和组织生物缓冲保护液中添加使用兼容保存液；
所述兼容保存液的成分为：(1)重量百分比为10％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(2)重量百分比为15％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(3)重量百分比为8％的甘油和10mM的乙二胺四乙酸。
2.一种兼容保存液的配制方法，其特征在于：将兼容保存液加入纯净水配置，定容后通过过滤制备无菌溶液；所述兼容保存液的成分为：(1)重量百分比为10％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(2)重量百分比为15％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(3)重量百分比为8％的甘油和10mM的乙二胺四乙酸。
3.一种兼容保存液的使用方法，其特征在于：将采集的生物组织样品完全浸入已配好的兼容保存液中保存；所述兼容保存液的成分为：(1)重量百分比为10％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(2)重量百分比为15％的甘油和50mM的乙二胺四乙酸；或者(3)重量百分比为8％的甘油和10mM的乙二胺四乙酸。
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