CN111972397A - 一种皮肤冷藏保存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皮肤冷藏保存液及其应用。所述冷藏保存液包括羟乙基淀粉、维A酸、糖醛酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、氢氧化钠和ROCK抑制剂；所述ROCK抑制剂选自Y‑27632和Y‑27632 2HCl中的一种或两种。本发明提供的冷藏保存液可用于人类的皮肤保存，使皮肤能够保持生物活性，在离体情况下，皮肤细胞能够继续存活较长时间。能够满足长时间稳定保存皮肤的要求，同时皮肤在保存后能够存活并能大量培养成纤维细胞。

Description

一种皮肤冷藏保存液及其应用
技术领域
本发明涉及皮肤保存领域，尤其涉及一种皮肤冷藏保存液及其应用。
背景技术
目前国内多采用低温冷冻保存皮肤，其主要缺陷在于，复温过程中生产的重结晶对皮肤产生有害的冰晶损伤。研究表明只有复温速度达到3.3～17℃/s时，才能避免冰晶损伤，如此快的复温速度在临床应用时难以达到。在深低温冷冻保存皮肤时常会加入二甲基亚砜作为细胞的保护剂。因其抗冻的作用，用于细胞冻存的保护，二甲基亚砜能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢的通透性。但有研究表明二甲基亚砜存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。冷冻皮肤用于临床复温时，可能对皮肤造成污染。
申请号为CN201310018817.7的中国专利公开了一种以海藻糖为原料的皮肤保存液，含海藻糖45～165g/L，含小牛血清4.5～16.5g/L。所述皮肤保存液的制备方法，包括以下步骤：取海藻糖干粉，与蒸馏水混合搅拌并使之溶解，配制成为浓度为45-165g/L海藻糖溶液；加入小牛血清，搅拌均匀；将搅拌均匀的溶液调节pH值至7.0-7.2。该发明所述皮肤保存方法为：把新鲜同种异体皮肤经无菌生理盐水清洗2-5次，甩干后放入已配制好海藻糖保存液中浸泡8小时以上。但由于小牛血清是指腹产的胎牛血液去除纤维蛋白后剩下的浅黄色澄清粘稠液体，其成分复杂多样，有部分成分不清楚，在保存皮肤后的应用中存在许多潜在安全问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种皮肤冷藏保存液及其应用，本发明能够使用无血清的配方完成皮肤的冻存，避免潜在的感染风险，并且能够保持皮肤内部成纤维细胞活性，能够得到大量的成纤维细胞，可以应用于移植修复及其他方面。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种皮肤冷藏保存液，所述冷藏保存液包括羟乙基淀粉、维A酸、糖醛酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、氢氧化钠和ROCK抑制剂；所述ROCK抑制剂选自Y-27632和Y-276322HCl中的一种或两种。
作为优选，所述冷藏保存液以无菌水为溶剂，冷藏保存液中羟乙基淀粉的含量为40-60g/L维A酸的含量为0.8-1.2g/L糖醛酸的含量为2-4g/L，磷酸二氢钾的含量为2-4g/L，硫酸镁的含量为0.8-1.2g/L，ROCK抑制剂的浓度为3-20μM及加入氢氧化钠调节pH至6.8-7.2。
作为进一步优选，所述冷藏保存液以无菌水为溶剂，冷藏保存液中羟乙基淀粉的含量为50g/L，维A酸的含量为1g/L，糖醛酸的含量为3g/L，磷酸二氢钾的含量为3g/L，硫酸镁的含量为1g/L，ROCK抑制剂的浓度为10μM及加入氢氧化钠调节pH至7.0。
本发明另一方面，还提供所述皮肤冷藏保存液在皮肤保存中的应用。
进一步地，所述皮肤冷藏保存液在使用时，利用一次性皮肤取样器取样，迅速将皮肤样品转移放置于冻藏保存液中，然后放置于2-4℃环境中保存运输。
本发明的特点如下：本发明提供的冷藏保存液中加入羟乙基淀粉作为合成的血浆代替品，一方面可以模拟皮肤所处的环境，另一方面能够稳定渗透压。维A酸可纠正或预防有害因素对真皮结缔组织生化成分及形态结构引起的异常；糖醛酸具有稳定皮肤代谢，保持皮肤水分的作用。本发明还创造性地加入ROCK抑制剂，能维持皮肤的活性，对成纤维细胞获取具有提高作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的冷藏保存液可用于人类的皮肤保存，使皮肤能够保持生物活性，在离体情况下，可适应长途运输，保存时间较长。能够满足长时间稳定保存皮肤活力的要求，同时皮肤在保存后能够存活并大量培养成纤维细胞，便于临床手术，使异体皮肤在移植手术后迅速恢复功能。
附图说明
图1为皮肤保存后观察到的成纤维细胞图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。以下实施例所采用的试剂、材料均为分析级，若无特殊说明，均可通过正规商业途径获得。本发明提供的保存液中对于各成分的浓度可以做适当调整，满足渗透压在280-340mOSM即可，其中ROCK抑制剂的浓度在3-20μM都可以作用。
实施例1
以无菌水为溶剂，按照羟乙基淀粉50g/L，维A酸1g/L，糖醛酸3g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1g/L，Y-276322HCl 10μmol/L(μM)配置溶液，然后使用氢氧化钠调节pH至7.0。
实施例2
以无菌水为溶剂，按照羟乙基淀粉45g/L，维A酸1.2g/L，糖醛酸2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁0.9g/L，Y-276322HCl 3μmol/L配置溶液，然后使用氢氧化钠调节pH至6.9。
实施例3
以无菌水为溶剂，按照羟乙基淀粉55g/L，维A酸0.8g/L，糖醛酸3.5g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸镁1.2g/L，Y-276322HCl 18μmol/L配置溶液，然后使用氢氧化钠调节pH至7.2。
实施例4
所述冷藏保存液在使用前，采用0.22μm滤膜过滤。利用一次性皮肤取样器取样，迅速将皮肤样品转移放置于灭菌后的实施例1的冻藏保存液中，冷藏保存液的使用量以刚没过皮肤样品为宜。然后放置于2-4℃环境中保存10～20天，然后在显微镜下观察，可以看到成纤维细胞，如图1所示。由图1可看出，成纤维细胞的数量及活性均较好，表明该保存液适宜长期保存离体皮肤。
另外，将实施例1制备的冷藏保存液与其他保存液进行皮肤样品保存效果比较。
保存液1的配方如下：Hyclone SH30022.01B包含Y-276322HCl。
保存液2的配方如下：磷酸二氢钾3g/L，氯化钠9.00g/L，磷酸氢二钠0.795g/1和10μmol/L的Y-27632 2HCl。
保存液3：按照维A酸1g/L，糖醛酸3g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1g/L，Y-276322HCl10μmol/L配置溶液，然后使用氢氧化钠调节pH至7.0。
保存液4：按照羟乙基淀粉50g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1g/L，Y-276322HCl 10μmol/L配置溶液，然后使用氢氧化钠调节pH至7.0。
本发明是通过保存后能长出成纤维细胞的样品数来确定皮肤样品活性，将保存后的皮肤样品接种于合有血清的培养基中，培养96h后，在显微镜下能看到皮肤成纤维细胞，若成纤维细胞能够长满3.5cm平皿，大概1×106能够收集并稳定传代，则认为组织具有活性。几种保存液保存皮肤样品的活性率评价如表1所示，
表1
Figure BDA0002578627440000041
羟乙基淀粉作为合成的血浆代替品，一方面可以模拟皮肤所处的环境，另一方面能够稳定渗透压。维A酸可纠正或预防有害因素对真皮结缔组织生化成分及形态结构引起的异常；糖醛酸具有稳定皮肤代谢，保持皮肤水分的作用。由表1可看出，从皮肤样品活性的角度考虑，羟乙基淀粉、维A酸，糖醛酸和Y27632 2HCl共同作用能提高样品的活性率。
实施例5
采用实施例2制备的保存液，以及在实施例2的基础上增加Y27632二盐酸盐的浓度，至10μmol/L、15μmol/L，然后比较三者保存皮肤样品的活性率。活性验证方法同实施例4。
表2
Figure BDA0002578627440000051
由表2可知，适当提高Y-276322HCl的浓度可以提高皮肤样品的活性率，当超过10μmol/L时，活性率差别不大。
实施例6
所述冷藏保存液选用不同ROCK抑制剂，采用保存液保存皮肤样品后，活性也存在差别，具体如表3所示。表3中ROCK抑制剂的浓度均为10μmol/L，其他成分同实施例1。
表3
Figure BDA0002578627440000052
由表3可看出，在相同浓度下，两种ROCK抑制剂都能有效提高皮肤样品的活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种皮肤冷藏保存液，其特征在于，所述冷藏保存液包括羟乙基淀粉、维A酸、糖醛酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、氢氧化钠和ROCK抑制剂；所述ROCK抑制剂选自Y-27632和Y-276322HCl中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的皮肤冷藏保存液，其特征在于，所述冷藏保存液以无菌水为溶剂，冷藏保存液中羟乙基淀粉的含量为40-60g/L，维A酸的含量为0.8-1.2g/L，糖醛酸的含量为2-4g/L，磷酸二氢钾的含量为2-4g/L，硫酸镁的含量为0.8-1.2g/L，ROCK抑制剂的浓度为3-20μM及加入氢氧化钠调节pH至6.8-7.2。
3.根据权利要求1所述的皮肤冷藏保存液，其特征在于，所述冷藏保存液以无菌水为溶剂，冷藏保存液中羟乙基淀粉的含量为50g/L，维A酸的含量为1g/L，糖醛酸的含量为3g/L，磷酸二氢钾的含量为3g/L，硫酸镁的含量为1g/L，ROCK抑制剂的浓度为10μM及加入氢氧化钠调节pH至7.0。
4.根据权利要求1～3任一所述的皮肤冷藏保存液在皮肤保存中的应用。
5.根据权利要求4所述的皮肤冷藏保存液在皮肤保存中的应用，其特征在于，利用一次性皮肤取样器取样，迅速将皮肤样品转移放置于冻藏保存液中，然后放置于2-4℃环境中保存运输。
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