CN109832261A

CN109832261A - 一种细胞冻存液及其应用

Info

Publication number: CN109832261A
Application number: CN201910302514.5A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 张海天
Original assignee: Wuxi Core Super Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuxi Core Super Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-06-04

Abstract

本发明涉及一种细胞冻存液及其应用，所述细胞冻存液含有以下组分：甘油、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙、二甲基亚砜、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、精蛋白、纳他霉素、苦豆碱、金精三羧酸、氨磷汀、小牛血清和人白蛋白。还涉及细胞冻存液在保护组织细胞活性中的应用和细胞冻存液在保护血液有核细胞活性中的应用。本发明配制的细胞冻存液与细胞混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响细胞的活性，温度范围较宽，保存时间较长，为血液样本的运输提供了方便。

Description

一种细胞冻存液及其应用

技术领域

本发明属于细胞冻存复苏技术领域，特别涉及一种改进的人体细胞冻存液及其应用。

背景技术

细胞不仅是生命科学研究的重要目标和工具，而且随着研究的进展，各种细胞已广泛应用于临床。造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。造血干细胞移植可以治疗许多血液病，包括：1)血液系统恶性肿瘤，如急性白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等；2)某些血液系统非恶性肿瘤，如重型再生障碍性贫血、地中海贫血。间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。

因此，细胞制备后，为方便细胞长期保存和长距离运输，有效的冻存细胞，并且保持细胞特性不变，对于生命科学研究和细胞在临床上的应用极为重要。因此，本专利阐述了在细胞体外培养后的超低温冻存方法及细胞冻存液体的制备方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种细胞冻存液及其应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种细胞冻存液，所述细胞冻存液含有以下组分：甘油的体积浓度为15-40％，氯化钠的质量浓度为0.3-1.2％，乳酸钠的质量浓度为0.3-0.6％，氯化钾的质量浓度为0.03-0.6％，氯化钙的质量浓度为0.01-0.03％，二甲基亚砜的体积浓度为1-20％，甜菜碱的质量浓度为5-20％，抗冻蛋白的质量浓度为1-10％，葡萄糖的质量浓度为5-40％，低分子葡聚糖的质量浓度为1-20％，甘露聚糖的质量浓度0.05-5％，精蛋白的质量浓度为0.5-5％，纳他霉素的质量浓度为0.5-5％，苦豆碱的质量浓度为0.1-5％，金精三羧酸的质量浓度为0.1-2％，氨磷汀的质量浓度为0.5-10％，小牛血清的体积浓度为5-20％，人白蛋白的质量浓度为5-15％。

优选的，所述细胞冻存液含有以下组分：甘油的体积浓度为20％，氯化钠的质量浓度为0.6％，乳酸钠的质量浓度为0.3％，氯化钾的质量浓度为0.03％，氯化钙的质量浓度为0.02％，二甲基亚砜的体积浓度为3％，甜菜碱的质量浓度为5％，抗冻蛋白的质量浓度为5％，葡萄糖的质量浓度为12％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％，甘露聚糖的质量浓度为0.05％，精蛋白的质量浓度为0.5％，纳他霉素的质量浓度为0.5％，苦豆碱的质量浓度为0.3％，金精三羧酸的质量浓度为0.5％，氨磷汀的质量浓度为0.5％，小牛血清的体积浓度为10％，人白蛋白的质量浓度为10％。

其进一步的技术方案为，所述细胞冻存液的pH值为7.0-7.5。

如上任一项所述的细胞冻存液在用于保护组织细胞活性中的应用。

其进一步的技术方案为，所述细胞的冻存密度为1×10⁹/L-8×10¹¹/L。

如上任一项所述的细胞冻存液在用于保护血液有核细胞活性中的应用。

其进一步的技术方案为，所述细胞的冻存密度为1×10⁹/L～8×10¹¹/L。

在细胞冻存液组份中：

甘油：中文名是丙三醇，英文名是Glycerol，分子式为C₃H₈O₃；

氯化钠：英文名是Sodium chloride，化学式为NaCl；

乳酸钠：英文名是Sodium lactate，分子式为C₃H₅O₃Na；

甜菜碱：中文名是三甲基乙内酯，英文名是Betaine，分子式为C₅H₁₁NO2。

抗冻蛋白：英文名是Antifreeze proteins，简写为AFPs，是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。AFPs可用于人和动物的卵、精子、胚胎或肝脏等器官的超低温保存，改善其冷冻质量，其原理和提取方法为现有技术。抗冻蛋白有多种，但是各种抗冻蛋白均具有热滞效应，能非依数性的降低水溶液的冰点，而不影响其熔点，从而产生水溶液的冰点温度和熔点温度的差异。所以在组分中可以任选各种抗冻蛋白以达到本发明的技术效果。

葡萄糖：英文名是Glucose，分子式为C₆H₁₂O₆。

低分子葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接。本发明中的低分子葡聚糖是指分子量在90000以下的葡聚糖。

精蛋白系自鱼类新鲜成熟精子中提取的一种碱性蛋白质，可直接购买市售成品。

纳他霉素：英文名是Natamycin，分子式为C₃₃H₄₇NO₁₃。

苦豆碱：英文名是Aloperine，苦豆碱来源于豆科植物苦豆子Sophoraalopecuroides L.的种子以及地上部分，在现有技术中其结构式及多种合成途径已被公开，在此不再赘述。

金精三羧酸：英文名是Aurintricarboxylic acid，分子式为C₂₂H₁₄O₉。

氨磷汀：英文名是Amifostine，化学名称为2-(3-氨基丙胺基)-乙硫醇磷酸酯，分子式为C₅H₁₅N₂O₃PS。

小牛血清取自30日龄及以下的新生牛犊，可直接购买市售成品。

人血白蛋白：人血白蛋白是从人血液中提取的一种蛋白质，可直接购买市售成品。

其进一步的技术方案为，所述细胞冻存液的pH值为7.0-7.5。

一种如上任一项所述的细胞冻存液在保护组织细胞活性中的应用。

一种如上任一项所述的细胞冻存液在保护血液有核细胞活性中的应用。

其进一步的技术方案为：所述细胞的冻存密度为1×10⁹/L～8×10¹¹/L。

本发明的有益效果如下：

本发明配制的细胞冻存液与细胞混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响细胞的活性，温度范围较宽，保存时间较长，为血液样本的运输提供了方便。

本发明中的无机盐和小分子有机化合物可以渗透到细胞内，平衡细胞内外未结冰的水溶液中电解质的浓度，从而避免外部的高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤；天然防腐剂甘露聚糖、精蛋白、苦豆碱和纳他霉素抑制微生物生长，并且无毒副作用，不会对细胞的生长造成影响，也不会使病源微生物产生抗药性，可用于短时间内细胞处理和常温运输；葡萄糖和各类蛋白可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；甘油、二甲基亚砜、甜菜碱和抗冻蛋白组合能有效地防止细胞内冰晶形成，从而避免细胞损伤；氨磷汀可提高细胞对外界不良环境的耐受性、降低细胞内有毒物质的积累、提升细胞的增殖活性。通过上述成分，可有效提高细胞的抗逆性、减少冻存过程造成的细胞损伤。

本发明的优点是：对细胞保护效果明显，可有效地保护细胞的活力，并且具有高活细胞率和活性，从而提高细胞存活率和冻存的复苏率。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明的具体实施方式。

实施例1

冻存液按照表1的组成成分配置，先配置无机盐和有机化合物混合物，充分混匀，并过滤和高压灭菌，最后添加蛋白成分，最终pH值为7.0-7.5。对同一来源的淋巴细胞分别使用表1各组冻存液进行液氮冻存，复苏后按5×10⁵的细胞量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养5天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式增值率＝培养后细胞总数/(5×10⁵)进行计算，即为复苏率。表1是多个实验组中不同组份的冻存液培养后的细胞总数和复苏率。

表1

由表1可知，实验组各组的复苏率均达到90％以上，显著高于对照组各组(P<0.001)，其中实验组1的复苏率高于实验组2和实验组3。表明本发明提供的细胞冻存液可以有效降低传统方法对细胞造成的物理或化学的伤害，并可以有效保存细胞的生理活性，从而有利于后续使用。另外，添加乳酸钠、氯化钾、氯化钙、精蛋白、纳他霉素、苦豆碱和金精三羧酸能提高冻存液的保护效果，而添加小牛血清更可以使冻存液的保护效果得到显著提高。

实施例1通过保存淋巴细胞并证明了细胞冻存液可以用于保护组织细胞活性。

实施例2。

CAR-T细胞按实施例1的表1中各组冻存液进行液氮保存。从液氮罐中取出细胞冷冻保存管，立即放入37℃水浴槽中快速解冻；待冻存管中细胞混合液完全溶化后，将细胞混合液缓慢加入含有9mL无血清培养基的试管中，混合均匀；在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用。

CAR-T细胞冻存制剂复苏后，每隔2小时取样，用台盼蓝(Trypan Blue)染色后在显微镜下观察、计数。

CAR-T细胞冻存制剂复苏后，与肿瘤细胞株混合于96孔板中共培养后24小时后，加入10μL新鲜配置的5mg/mL MTT共培养4小时。弃上清后，每孔加入100μL二甲基亚砜震荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设置空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔减去空白对照孔后，用杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性。细胞杀伤率(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

表2是各个实验组的细胞复苏率和杀伤率。由表2可知,在24小时内，跟对照组相比，实验组各组细胞保持较高复苏率和杀伤率(P<0.001)，证明本发明冻存液能够使细胞保持较高的活性。

实施例2通过保存CAR-T细胞证明了细胞冻存液可以用于保护血液有核细胞活性。

表2

组别	复苏率	杀伤率
			实验组1	97.1％	96.8％
实验组2	93.3％	89.4％
			实验组3	89.7％	85.6％
对照组1	81.5％	78.1％
			对照组2	76.9％	70.3％

以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。

Claims

1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液含有以下组分：甘油的体积浓度为15-40％，氯化钠的质量浓度为0.3-1.2％，乳酸钠的质量浓度为0.3-0.6％，氯化钾的质量浓度为0.03-0.6％，氯化钙的质量浓度为0.01-0.03％，二甲基亚砜的体积浓度为1-20％，甜菜碱的质量浓度为5-20％，抗冻蛋白的质量浓度为1-10％，葡萄糖的质量浓度为5-40％，低分子葡聚糖的质量浓度为1-20％，甘露聚糖的质量浓度0.05-5％，精蛋白的质量浓度为0.5-5％，纳他霉素的质量浓度为0.5-5％，苦豆碱的质量浓度为0.1-5％，金精三羧酸的质量浓度为0.1-2％，氨磷汀的质量浓度为0.5-10％，小牛血清的体积浓度为5-20％，人白蛋白的质量浓度为5-15％。

2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液含有以下组分：甘油的体积浓度为20％，氯化钠的质量浓度为0.6％，乳酸钠的质量浓度为0.3％，氯化钾的质量浓度为0.03％，氯化钙的质量浓度为0.02％，二甲基亚砜的体积浓度为3％，甜菜碱的质量浓度为5％，抗冻蛋白的质量浓度为5％，葡萄糖的质量浓度为12％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％，甘露聚糖的质量浓度为0.05％，精蛋白的质量浓度为0.5％，纳他霉素的质量浓度为0.5％，苦豆碱的质量浓度为0.3％，金精三羧酸的质量浓度为0.5％，氨磷汀的质量浓度为0.5％，小牛血清的体积浓度为10％，人白蛋白的质量浓度为10％。

3.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液的pH值为7.0-7.5。

4.如权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液在保护组织细胞活性中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞的冻存密度为1×10⁹/L-8×10¹¹/L。

6.如权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液在保护血液有核细胞活性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述细胞的冻存密度为1×10⁹/L～8×10¹¹/L。