CN108094404A - 一种改进的间充质干细胞保护液及其用途 - Google Patents
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Classifications
-
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Abstract
本发明提供了一种改进的间充质干细胞保护液，通过渗透性保护剂平衡细胞内外未结冰的水溶液中电解质的浓度，从而避免外部的高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤；添加蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；细胞生理活动抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果；氨磷汀是一种广谱的细胞保护剂和和辐射保护剂，可提高细胞对外界不良环境的耐受性、降低细胞内有毒物质的积累、提升干细胞的增殖活性。通过上述成分组合使用，可有效提高间充质干细胞的抗逆性、减少冻存过程造成的细胞活性损失，从而提高细胞存活率和冻存的复苏率。
Description
技术领域
本发明属于人体组织冻存复苏技术领域，特别涉及一种改进的间充质干细胞保护液及其用途。
背景技术
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。因此，对间充质干细胞进行存储，可以提供重要的医学材料。传统的程序化冻存由于容易使液体产生结晶，往往会对细胞造成机械性损伤；新式的玻璃化冻存可以完全避免结晶问题，从而大大提高冻存细胞的复苏率。但是，玻璃化冻需要使用具有细胞毒性的二甲基亚砜，容易对细胞造成化学性伤害。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种改进的间充质干细胞保护液及其用途。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种改进的间充质干细胞保护液，包括如下重量份数的成分：
20～25份渗透性保护剂、15～20份蛋白组合物、0.1～0.2份细胞生理活动抑制剂以及2～5份氨磷汀；
所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油、肌醇、棉子糖、甘露醇、脯氨酸以及甜菜碱中的至少一种；
所述蛋白组合物包括牛血清白蛋白、植物源重组人血清白蛋白、γ-球蛋白、抗冻蛋白以及肌球蛋白中的至少一种；
所述细胞生理活动抑制剂包括细胞松弛素D、诺考达唑、衣霉素、几夫碱、布雷非德菌素A、奥曲肽以及阿糖胞苷中的至少一种。
渗透性保护剂可以渗透到细胞内，平衡细胞内外未结冰的水溶液中电解质的浓度，从而避免外部的高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤；蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；细胞生理活动抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果；氨磷汀是一种广谱的细胞保护剂和和辐射保护剂，可提高细胞对外界不良环境的耐受性、降低细胞内有毒物质的积累、提升干细胞的增殖活性。通过上述成分，可有效提高间充质干细胞的抗逆性、减少冻存过程造成的细胞活性损失。
进一步地，所述渗透性保护剂包括重量份数比为5:2:1～3的二甲基亚砜、棉子糖以及脯氨酸。
二甲基亚砜是最常用的冷冻保护剂，效果优异但毒性较大，因此本发明中采用上述组合，以便减少二甲基亚砜的用量、降低细胞毒性，同时不影响冷冻保护剂的效果。
进一步地，所述蛋白组合物包括重量份数比为1:2:3～5的抗冻蛋白、γ-球蛋白以及植物源重组人血清白蛋白。
目前常规的细胞保存液主要使用胎牛血清或人血清白蛋白，细胞珍贵程度越高、对营养的要求就越高，上述成分的用量也越高；植物源重组人血清白蛋白基于植物生产制造，能够提供与血清相当的营养成分，可以替代胎牛血清，从而可降低成本；为保证细胞获得充足的营养，添加γ-球蛋白可以为细胞提供近似于人体内环境的环境，以利于细胞的存活；抗冻蛋白能移植冷冻过程中冰晶的生长、降低冰晶对细胞的伤害，从而提高细胞的存活率。
进一步地，所述细胞生理活动抑制剂包括重量份数比为1:1的奥曲肽和衣霉素。
衣霉素可诱导内质网应激、抑制N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶、引起G1期阻滞，奥曲肽是一种生长激素抑制素的类似物，可抑制一些内源性肽的分泌；上述细胞生理活动抑制剂可以有效抑制细胞的生理活动，并且不会影响细胞的活性。
进一步地，所述保护液还包括重量份数为2～5份的乳酸钠林格。
乳酸钠林格为乳酸钠、氯化钠、氯化钾与氯化钙的灭菌水溶液，可用于提供接近人体的渗透压适中的环境，以利于细胞的存活。
进一步地，所述保护液还包括重量份数为0.1～0.2份的柑浓素以及1～2份的槲寄生叶提取物。
柑浓素是从柑橘皮中提取的一种天然混合物，具有极强的抗菌的作用，能抑制细菌等的生长增殖，并且无毒副作用、不会对细胞的生长造成影响，也不会使病原微生物产生抗药性；槲寄生中含有丰富的甙类和有机酸等物质，可以提高细胞的活性和抗逆性，从而提高细胞的存活率。
进一步地，所述槲寄生叶提取物的提取方法如下：
S1：将槲寄生叶洗净、进行冷冻干燥，并将干燥的槲寄生叶研磨成粉末；
S2：取所述粉末添加到试管中，每g所述粉末中加入10ml无水乙醇，超声提取30～60min，离心、将上清液转移至另一试管中；对残渣重复提取2次，并将每次提取的上清液合并；
S3：对步骤S2中得到的上清液进行减压浓缩，得到总体积小于5mL的浓缩液；
S4：将所述浓缩液用去离子水充分溶解，并定容至50mL，即得到所述槲寄生叶提取物。
由于槲寄生中绝大部分活性成分均能溶于乙醇，但有部分活性成分(如齐墩果酸、羽扇豆醇、白桦酯酸等)不能溶于水，因此先用乙醇进行提取，以便充分得到其中的多种活性成分；为避免乙醇浓度过高对细胞造成伤害，还需对乙醇提取液进行浓缩、并用去离子水对乙醇浓缩进行均匀溶解和稀释，以便在不影响活性成分的前提下提高安全性。
本发明另一方面提供了上述改进的间充质干细胞保护液在保存间充质干细胞中的应用。
进一步地，每mL所述保护液中保存的间充质干细胞的数量为0.5～2×106个。
上述范围是保存间充质干细胞的最佳比例，既可以避免细胞数量过多、竞争养分导致细胞损伤，也可以防止因细胞数量过少导致存活细胞数量过少和保护液的浪费。
进一步地，所述保护液的工作温度为20～-80℃。
上述保护液可以适应从室温到冷冻完成的全程的温度变化，在较低温度下仍能有效保护细胞。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种改进的间充质干细胞保护液，通过渗透性保护剂平衡细胞内外未结冰的水溶液中电解质的浓度，从而避免外部的高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤；添加蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；细胞生理活动抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果；氨磷汀是一种广谱的细胞保护剂和和辐射保护剂，可提高细胞对外界不良环境的耐受性、降低细胞内有毒物质的积累、提升干细胞的增殖活性。通过上述成分组合使用，可有效提高间充质干细胞的抗逆性、减少冻存过程造成的细胞活性损失，从而提高细胞存活率和冻存的复苏率，以便后续使用。
具体实施方式
实施例1
一种改进的间充质干细胞保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、20份蛋白组合物、0.1份细胞生理活动抑制剂以及5份氨磷汀；
所述渗透性保护剂包括12.5份二甲基亚砜、5份棉子糖以及2.5份脯氨酸；
所述蛋白组合物包括2.5份抗冻蛋白、5份γ-球蛋白以及12.5份植物源重组人血清白蛋白；
所述细胞生理活动抑制剂包括0.05份奥曲肽和0.05份衣霉素。
实施例2
一种改进的间充质干细胞保护液，包括如下重量份数的成分：
25份渗透性保护剂、15份蛋白组合物、0.2份细胞生理活动抑制剂以及2份氨磷汀；
所述渗透性保护剂包括12.5份二甲基亚砜、5份棉子糖以及7.5份脯氨酸；
所述蛋白组合物包括2.5份抗冻蛋白、5份γ-球蛋白以及7.5份植物源重组人血清白蛋白；
所述细胞生理活动抑制剂包括0.1份奥曲肽和0.1份衣霉素。
实施例3
一种改进的间充质干细胞保护液，包括实施例1所述的成分，还包括重量份数为2份的乳酸钠林格。
实施例4
一种改进的间充质干细胞保护液，包括实施例2所述的成分，还包括重量份数为5份的乳酸钠林格。
实施例5
一种改进的间充质干细胞保护液，包括实施例1所述的成分，还包括重量份数为0.2份的柑浓素以及1份的槲寄生叶提取物。
实施例6
一种改进的间充质干细胞保护液，包括实施例4所述的成分，还包括重量份数为0.1份的柑浓素以及2份的槲寄生叶提取物，所述槲寄生叶提取物的提取方法如下：
S1：将槲寄生叶洗净、冷冻干燥24h，并将干燥的槲寄生叶研磨成粉末；
S2：取1g所述粉末添加到试管中，加入10ml无水乙醇，60kHz、室温下超声提取60min，在4℃、3000rpm条件下离心30min，将上清液转移至另一试管中；对残渣重复提取2次，并将每次提取的上清液合并；
S3：对步骤S2中得到的上清液进行减压浓缩，得到总体积小于5mL的浓缩液；
S4：将所述浓缩液用去离子水充分溶解，并定容至50mL，即得到所述槲寄生叶提取物。
对照例1
一种改进的间充质干细胞保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、20份蛋白组合物以及5份氨磷汀；
所述渗透性保护剂包括12.5份二甲基亚砜、5份棉子糖以及2.5份脯氨酸；
所述蛋白组合物包括2.5份抗冻蛋白、5份γ-球蛋白以及12.5份植物源重组人血清白蛋白。
对照例2
一种改进的间充质干细胞保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、20份蛋白组合物以及0.1份细胞生理活动抑制剂；
所述渗透性保护剂包括12.5份二甲基亚砜、5份棉子糖以及2.5份脯氨酸；
所述蛋白组合物包括2.5份抗冻蛋白、5份γ-球蛋白以及12.5份植物源重组人血清白蛋白；
所述细胞生理活动抑制剂包括0.05份奥曲肽和0.05份衣霉素。
实验例1
复苏率实验
分别以实施例1、3、5提供的保护液作为实验组1～3，分别以常规冻存保护液、玻璃化冻存保护液、对照例1和2提供的保护液分别作为对照组1～4，对同一来源的间充质干细胞分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养5d，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据增值率＝培养后细胞总数/(3*105)计算增值率，即为复苏率。结果如表1所示。
表1各组细胞复苏情况对比
由表1可知，实验组各组的复苏率均达到90％以上，显著高于对照组各组，其中实验组2的复苏率高于实验组1、且实验组3的复苏率最高。表明本发明提供的间充质干细胞保护液可以有效降低传统方法对细胞造成的物理或化学的伤害，并可以有效保存干细胞的生理活性，从而有利于后续使用；并且添加乳酸钠格林可以提高保护液的保护效果，而添加柑浓素和槲寄生提取物更可以使保护液的保护效果得到显著提高。
实验例2
细胞表面免疫表型遗传实验
分别以实施例2、4、6提供的保护液为实验组1～3，分别以对照例1和2提供的保护液分别作为对照组1～2，对同一来源的间充质干细胞分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养48h，并对获得的细胞的表面抗原进行流式检测，同时以母细胞作为阳性对照。结果如表2所示。
表2各组细胞表面抗原检测结果
实验结果表明，实验组各组中CD14、CD31、CD34(HSPC及内皮细胞)、CD45(白细胞)、CD54(ICAM-1)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)以及HLA-DR(MHC-II类分子)等不表达造血细胞表面标志均表现为阴性，而CD29和CD44(纤维蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表达)、CD73(SH-3、4)、CD105(SH-2)、CD166(间充质细胞表达)、HLA-ABC(MHC-I类分子))和UEA-1(内皮细胞的表面标志)均为阳性，与阳性对照相同；而对照组各组均有部分指标的表达情况与阳性对照不符。由此可知经过原代培养的细胞与原间充质干细胞细胞具有相同的表面抗原，说明采用本发明提供的保存液对间充质干细胞进行保存，可以很好地再现原间充质干细胞细胞的遗传表型，遗传稳定性良好；并且乳酸钠格林、柑浓素和槲寄生提取物的添加不会对原间充质干细胞细胞的遗传稳定性造成影响。
实验例3
成骨分化性能实验
分别以实施例5、6提供的保护液为实验组1～2，以常规冻存保护液和玻璃化冻存保护液分别作为对照组1～2，对同一来源的间充质干细胞分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化，按照1×103细胞/cm 2的接种量接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。
培养1周后，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形变为多角形，细胞周边出现丝状突出，并可向周围延伸。培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，碱性磷酸酶染色呈阳性反应，并且阳性程度排序结果为对照组1＜对照组2＜实验组1＜实验组2；培养4周后，Von Kossa染色可见明显黑色钙化结节。表明采用本发明提供的保存液保存的间充质干细胞，比常规保护液保存的间充质干细胞更能保持良好的成骨分化潜能。
实验例4
成脂肪分化性能实验
分别以实施例5和6提供的方法为实验组1～2，以常规冻存保护液和玻璃化冻存保护液分别作为对照组1～2，对同一来源的间充质干细胞分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化，按照1×103细胞/cm 2的接种量接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成脂肪诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用油红染色鉴定脂肪滴。
培养3天后，细胞形态即发生改变，由纺锤形逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形；连续培养1周后，镜下可见细胞内有微小脂肪滴出现，并且脂肪滴随着培养时间的延长逐渐扩大、融合；培养2周后，可见细胞中出现融合成团的脂肪滴。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色，并且染色深浅程度排序为对照组1＜对照组2＜实验组1＜实验组2。表明采用本发明提供的保存液保存的间充质干细胞，比常规保护液保存的间充质干细胞更能保持良好的成脂肪分化潜能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，包括如下重量份数的成分：
20～25份渗透性保护剂、15～20份蛋白组合物、0.1～0.2份细胞生理活动抑制剂以及2～5份氨磷汀；
所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油、肌醇、棉子糖、甘露醇、脯氨酸以及甜菜碱中的至少一种；
所述蛋白组合物包括牛血清白蛋白、植物源重组人血清白蛋白、γ-球蛋白、抗冻蛋白以及肌球蛋白中的至少一种；
所述细胞生理活动抑制剂包括细胞松弛素D、诺考达唑、衣霉素、几夫碱、布雷非德菌素A、奥曲肽以及阿糖胞苷中的至少一种。
2.如权利要求1所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括重量份数比为5:2:1～3的二甲基亚砜、棉子糖以及脯氨酸。
3.如权利要求1所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述蛋白组合物包括重量份数比为1:2:3～5的抗冻蛋白、γ-球蛋白以及植物源重组人血清白蛋白。
4.如权利要求1所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述细胞生理活动抑制剂包括重量份数比为1:1的奥曲肽和衣霉素。
5.如权利要求1所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述保护液还包括重量份数为2～5份的乳酸钠林格。
6.如权利要求1所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述保护液还包括重量份数为0.1～0.2份的柑浓素以及1～2份的槲寄生叶提取物。
7.如权利要求6所述的改进的间充质干细胞保护液，其特征在于，所述槲寄生叶提取物的提取方法如下：
S1：将槲寄生叶洗净、进行冷冻干燥，并将干燥的槲寄生叶研磨成粉末；
S2：取所述粉末添加到试管中，每g所述粉末中加入10ml无水乙醇，超声提取30～60min，离心、将上清液转移至另一试管中；对残渣重复提取2次，并将每次提取的上清液合并；
S3：对步骤S2中得到的上清液进行减压浓缩，得到总体积小于5mL的浓缩液；
S4：将所述浓缩液用去离子水充分溶解，并定容至50mL，即得到所述槲寄生叶提取物。
8.权利要求1～7中任一项所述的改进的间充质干细胞保护液在保存间充质干细胞中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每mL所述保护液中保存的间充质干细胞的数量为0.5～2×106个。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保护液的工作温度为20～-80℃。
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