CN109846722A - 间充质干细胞冻干粉剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其包括间充质干细胞活性因子和冻干赋形剂。本发明还涉及制备上述间充质干细胞活性因子冻干粉剂的方法，以及包含间充质干细胞活性因子冻干粉剂和冻干溶媒的组合物。

Description

间充质干细胞冻干粉剂及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域。具体而言，本发明涉及间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其包含间充质干细胞活性因子和冷冻赋形剂。本发明还涉及间充质干细胞活性因子冻干粉剂的制备方法，包含间充质干细胞活性因子冻干粉剂的组合物，以及所述冻干粉剂和组合物的用途。

技术背景

冻干粉是一种药物领域的常见剂型，采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法将药液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥的冻干粉，从而实现在低温环境下抽中药液里面的水份，保留其原有的药物作用。

当前，化妆品、美容用品等领域，为了解决保存时间、有效成分活性等问题，冻干粉这一形式也开始被应用。

发明内容

在一方面，本发明涉及一种间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其包括间充质干细胞活性因子和冻干赋形剂。

在一些实施方案中，所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，和其它类型的间充质干细胞。在优选的实施方案中，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。

在间充质干细胞活性因子冻干粉剂的一些实施方案中，所述间充质干细胞活性因子来自间充质干细胞的培养上清液。在优选的实施方案中，所述间充质干细胞活性因子来自传代数为P3-P10的间充质干细胞的培养上清液。

在间充质干细胞活性因子冻干粉剂的一些实施方案中，所述冻干赋形剂包括鱼骨胶原蛋白。在一些实施方案中，所述冻干粉剂中冻干赋形剂例如鱼骨胶原蛋白在冻干前溶液中的浓度为1-20ng/ml，例如5-10ng/ml。

在另一个方面，本发明涉及一种制备间充质干细胞活性因子冻干粉剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供间充质干细胞；

b.培养和传代所述间充质干细胞；

c.收集所述间充质干细胞的培养上清液并通过过滤除菌，以获得所述培养上清液的浓缩液；

d.向步骤c中得到的浓缩液中添加冻干赋形剂，并进行冷冻干燥程序，

从而获得间充质干细胞活性因子冻干粉剂。

在上述方法的一些实施方案中，所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，和其它类型的间充质干细胞。

在一些的实施方案中，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞，并且步骤a包括从脐带获得脐带间充质干细胞。

在一些实施方案中，从脐带获得脐带间充质干细胞包括以下步骤：

a1.从脐带分离华通氏胶；

a2.将华通氏胶剪碎成小组织块，并在培养皿中培养所述组织块足够的时间段，使得间充质干细胞从组织块爬出；

a3.待所述间充质干细胞生长至60％-100％汇合，例如70％-90％汇合时移除组织块，从而获得脐带间充质干细胞。

在一些实施方案中，在步骤a2中使用补充有FBS的DMEM/F-12培养基进行所述组织块的培养。

在一些实施方案中，在步骤b中使用补充有FBS的DMEM/F-12培养基进行所述间充质干细胞的培养和传代。

在步骤a2中用于培养脐带组织块的培养和步骤b中用于培养间充质干细胞的培养基可以相同或者不同。例如，在步骤a2中和b中可以使用补充有相同浓度的FBS的DMEM/F-12培养基，或补充有不同浓度的FBS的DMEM/F-12培养基。

在本发明的方法的一些实施方案中，在步骤c中收集传代数为P3-P10的间充质干细胞的培养上清液。

在本发明的方法的一些实施方案中，在步骤d中添加的冻干赋形剂包括鱼骨胶原蛋白。在一些实施方案中，所述冻干赋形剂例如鱼骨胶原蛋白的终浓度为1-20ng/ml。在一些实施方案中，所述冻干赋形剂例如鱼骨胶原蛋白的终浓度为5-10ng/ml。

在本发明的方法的一些实施方案中，所述冷冻干燥程序包括以下步骤：预冷冻、冷阱冷冻和干燥冷冻。例如，所述冷冻干燥程序包括以下步骤：

d1.在常压和-60至-80℃的温度下进行预冷冻24小时以上，例如24小时至5天；

d2.在冷冻干燥机中在-56至-60℃的温度下进行冷阱冷冻约4小时；和

d3.在冷冻干燥机中在约1Pa的压力和-56至-60℃的温度下进行冷冻干燥约12小时。

本发明还涉及通过本发明的方法制备的间充质干细胞活性因子冻干粉剂。

在另一个方面，本发明涉及一种与本发明的间充质干细胞活性因子冻干粉剂组合使用的冻干溶媒。

在一些实施方案中，所述冻干溶媒包含至少三种不同分子量的透明质酸，例如至少一种高分子量透明质酸、至少一种中分子量透明质酸和至少一种低分子量透明质酸。

在一些实施方案中，在所述冻干溶媒中，所述高分子量透明质酸、中分子量透明质酸和低分子量透明质酸的含量比为约1：1：1。

在一些实施方案中，在所述冻干溶媒中，所述高分子量透明质酸、中分子量透明质酸和低分子量透明质酸的含量各自为0.05％-1％。

在本发明的冻干溶媒的一些实施方案中，所述冻干溶媒中包含藏红花提取液。在一些实施方案中，所述冻干溶媒中藏红花提取液的含量为约0.5％-5％。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含本发明的任何方面的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，和与所述冻干粉剂组合使用的本发明的冻干溶媒。

在另一方面，本发明涉及一种干细胞美容产品，其包含本发明的任何方面的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或本发明的组合物。

在一个方面，本发明涉及本发明的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或组合物在干细胞美容中的用途。

在另一个方面，本发明涉及本发明的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或组合物在在制备干细胞美容产品中的用途。

附图说明

图1显示了从脐带组织块排除的间充质干细胞的示例性照片。图1A显示了组织块培养72小时后的照片；图1B显示了培养5天后的照片；图1C显示了培养6天后的照片。

图2显示了培养的间充质干细胞的示例性照片。图2A显示了传代数为P2的间充质干细胞的照片；图2B显示了传代数为P6的细胞的照片。

图3显示了对间充质干细胞诱导分化后的染色结果。图3A显示了进行成骨诱导分化后，使用茜素红对细胞进行染色的结果。图3B显示了进行成脂肪诱导分化后，使用油红O对细胞进行染色的结果。

图4显示了通过流式细胞术，使用相应抗体对细胞的间充质干细胞阳性和阴性标志物进行染色的流式细胞结果。

图5显示了通过ELISA方法，对间充质干细胞活性因子浓缩液中的IL-6进行检测的结果。使用IL-6标准品建立标准曲线，以对间充质干细胞活性因子浓缩液中的IL-6进行定量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述实施例中，所用的透明质酸是一种酸性粘多糖，并以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸是一种多功能基质，其广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。

依照分子量的范围，可以将透明质酸区分为高分子量、中分子量、低分子量三类，例如其分子量范围可以分别为≥500kDa、100-400kDa、≤10kDa等。

在下述实施例中，无特殊排除的，在工业生产上，可以应用透明质酸钠作为透明质酸的替代物，或透明质酸和透明质酸钠一并使用。

在下述实施例中，藏红花提取液是从天然菊科(Comoositae)植物红花(Carthamus,tinctoriusl)的干燥花中分离提取的有效成份。红花含红花黄色素及红花苷。红花苷经水解生成葡萄糖和红花素，还含15α-20β-二羟基Δ4-娠烯-3-酮、维生素E、糖醛酸等。当添加到本发明的冻干溶媒中并与间充质干细胞活性因子冻干粉剂组合使用时，其具有多种有益效果。藏红花对肌肤起到镇敏安抚、清热凉肤等作用。藏红花中提取的精华成分，作用于肌肤，能迅速镇敏，改善过敏反应，并调理强健肌肤。例如，当将其作为美容产品应用时，其具有活化皮肤和延缓皮肤衰老的独特作用。

实施例1.间充质干细胞的获取

通过从脐带分离华通氏胶(Wharton's Jelly)，并使用组织块贴壁法获取脐带间充质干细胞。其具体步骤如下：

取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约10cm左右置于培养皿中剪成小段，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)反复冲洗，直至无明显血块；

将脐带纵向剖开，剔除血管并剥离华通氏胶。使用眼科剪将华通氏胶剪碎成组织块；

将组织块以合适的密度接种于培养皿中，置于37℃，5％CO₂的培养箱内2-3小时使其贴壁；

添加3ml补充有FBS的DMEM/F-12培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养；

培养约3-5天以后可见组织块周围出现细胞集落(图1A和图1B)，其中细胞呈长梭形，具有明显的涡旋形态，是典型的脐带间充质细胞样形态；

培养约5-15天后(图1C)细胞密度达到接近饱和，可进行传代。

实施例2.间充质干细胞培养和传代

如下进行间充质干细胞的培养和传代：

当细胞达到约70-90％汇合时，用PBS轻轻冲洗培养瓶细胞1-2次，并添加3-5ml含有0.25％胰酶的消化液；

将培养瓶于37℃放置1-3分钟，镜下观察细胞接近圆形，轻轻拍打，终止消化；

将细胞转移至离心管混匀，取样计数，按照约13000个细胞/cm²的密度接种于T75培养瓶中进行传代，该细胞记为P0代；

培养2-3天后待细胞密度达到约70-90％时，重复以上消化和传代的操作，以获得足够量的间充质干细胞和间充质干细胞培养上清。

对于间充质干细胞的培养，使用含有FBS的DMEM/F-12培养基。从P2代开始，培养基中FBS含量逐渐减少至5％-3％。图2A和图2B分别显示了传代数为P2和P6的间充质干细胞的示例性照片。

实施例3.间充质干细胞的表征

间充质干细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。本实施例中对分离的间充质干细胞进行成骨和成脂肪分化能力的检测。具体而言，待成骨诱导检测的细胞生长至50～90％汇合，成脂肪诱导检测的细胞生长至90％以上汇合时，分别加入成骨和成脂肪诱导培养基。诱导培养7天时对细胞进行检测。成骨诱导细胞使用茜素红进行染色，而成脂肪诱导细胞使用于油红O进行染色。染色结果如图3A和3B所示，从该结果可见，通过本发明的方法分离和培养的间充质干细胞具备分化潜能，能够高效分化成骨和脂肪细胞。

此外，通过流式细胞术检测间充质干细胞的标志物，来进一步表征间充质干细胞。用于间充质干细胞的流式检测标志物包括CD73、CD90和CD105表达阳性，而HLA-DR、CD11b、CD19、CD34和CD45表达阴性。本实施例中通过流式细胞术检测了CD105、CD34、CD31和CD117的表达。其结果见图4，总结如下：

CD105/CD34 99.64％/0.02％；

CD105/CD31 99.04％/0.00％；

CD105/CD117 95.53％/0.51％。

上述结果表明，本发明的通过本发明的方法分离和培养的细胞高表达间充质干细胞阳性标志物，而基本不表达间充质干细胞阴性标志物，进一步确认了其间充质干细胞的身份。

实施例4.间充质干细胞活性因子冻干粉剂的制备

一般采用传代数为P3-P10的间充质干细胞的培养上清制备冻干粉剂。具体步骤包括：

在细胞传代时，将细胞培养上清液收集于储液瓶中，并将多次收集的上清液混合后储存于-80℃冰箱中。储存液作为细胞上清原液或储存备用，在后续步骤中制备间充质干细胞活性因子冻干粉剂；

将冷冻保存的多次收集的培养上清液置于室温解冻。充分混合后，使用0.22μm滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞培养上清浓缩液，即间充质干细胞活性因子浓缩液；

向得到的间充质干细胞活性因子浓缩液中添加冻干赋形剂，并以1.5ml/支的量分装到西林瓶中。在本实施例中，使用的冻干赋形剂为5-10ng/ml的鱼骨蛋白。

按照预定的冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，压塞密封，即得到间充质干细胞活性因子冻干粉剂。

具体冷冻干燥程序如下：

预冷冻：将西林瓶置于常压下，半加塞，以-60至-80℃的温度进行预冷冻24小时至5天；

冷阱冷冻：将西林瓶置于冷冻干燥机，开启冷冻干燥剂，使冷阱温度降至-56至-60℃的范围，冷冻约4小时；

冷冻干燥：开启真空泵使气压降至约1Pa，将冷阱温度维持在-56至-60℃的范围，在此条件下继续冷冻干燥12小时；

其中添加的冻干保护剂的量为0.25-0.5％。

例如，冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉籽糖、右旋糖苷、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一种或几种的任意比例混合物。

在一些实施方案中，在获得间充质干细胞活性因子浓缩液后，可以对其中的活性因子进行检测。以IL-6为例，取间充质干细胞活性因子浓缩液1ml，根据制造商的说明使用重组人源抗体包被的酶联免疫试剂盒测定IL-6的含量。其结果如图5所示。从该结果表明，通过本发明的方法获得的间充质干细胞活性因子浓缩液中具有高浓度的活性因子。

实施例5.冻干粉剂溶媒的配制

另外，配制了与本发明的间充质干细胞冻干粉剂组合使用的冻干粉剂溶媒。在示例性的实施方案中，人间充质干细胞活性因子冻干粉剂1.5ml/支配3ml/支冻干粉溶媒直接使用，其中一支3ml冻干粉溶媒由化妆品剂的高分子量透明质酸，中分子量透明质酸和小分子量透明质酸按1:1:1的比例混合于去离子水中，三种透明质酸分别的终浓度为0.05％至1％。

此外，使用了藏红花提取液作为冻干粉溶媒的组分，其含量为0.5-5％。藏红花提取液是从天然菊科植物红花的干燥花中分离提取的有效成份。红花含红花黄色素及红花苷。红花苷经水解生成葡萄糖和红花素，还含15α-20β-二羟基Δ4-娠烯-3-酮、维生素E、糖醛酸等。当添加到本发明的冻干溶媒中并与间充质干细胞活性因子冻干粉剂组合使用时，其具有多种有益效果。藏红花对肌肤起到镇敏安抚、清热凉肤等作用。藏红花中提取的精华成分，作用于肌肤，能迅速镇敏，改善过敏反应，并调理强健肌肤。例如，当将其作为美容产品应用时，其具有活化皮肤和延缓皮肤衰老的独特作用。

冻干粉中的细胞因子加上藏红花和透明质酸，当应用时可以产生显著的有益技术效果，包括当作为美容产品应用时肌肤的淡斑、祛皱、抗过敏、消炎作用等等。

实施例6.冻干粉产品检测

对本发明的冻干粉剂的各项指标进行了检测，包括其中的细菌、真菌、支原体和内毒素等。结果表明，本发明的冻干粉剂的化品常规九项(铅、砷、汞、镉、金黄色葡萄球菌、耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、霉菌和酵母菌总数、菌落总数)全部合格。

此外，还进行了多次涂抹至敏刺激测试，结果表明本发明的冻干粉剂无刺激性。

Claims (31)

1.一种间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其包括间充质干细胞活性因子和冻干赋形剂。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求2所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述间充质干细胞活性因子来自间充质干细胞的培养上清液。

5.如权利要求4所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述间充质干细胞活性因子来自传代数为P3-P10的间充质干细胞的培养上清液。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述冻干赋形剂包括鱼骨胶原蛋白。

7.如权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述冻干赋形剂在冻干前溶液中的浓度为1-20ng/ml。

8.如权利要求7所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂，其中所述冻干赋形剂在冻干前溶液中的浓度为5-10ng/ml。

9.一种制备间充质干细胞活性因子冻干粉剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供间充质干细胞；

b.培养和传代所述间充质干细胞；

c.收集所述间充质干细胞的培养上清液并通过过滤除菌，以获得所述培养上清液的浓缩液；

d.向步骤c中得到的浓缩液中添加冻干赋形剂，并进行冷冻干燥程序，

从而获得间充质干细胞活性因子冻干粉剂。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞，并且步骤a包括从脐带获得脐带间充质干细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其中从脐带获得脐带间充质干细胞包括以下步骤：

a1.从脐带分离华通氏胶；

a2.将华通氏胶剪碎成小组织块，并在培养皿中培养所述组织块足够的时间段，使得间充质干细胞从组织块爬出；

a3.待所述间充质干细胞生长至60％-100％汇合时，移除组织块，从而获得脐带间充质干细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其中在步骤a2中使用补充有FBS的DMEM/F-12培养基进行所述组织块的培养。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中在步骤a3中在所述间充质干细胞生长至70％-90％汇合时移除组织块。

15.如权利要求9-14中任一项所述的方法，其中在步骤b中使用补充有FBS的DMEM/F-12培养基进行所述间充质干细胞的培养。

16.如权利要求9-15中任一项所述的方法，其中在步骤c中收集传代数为P3-P10的间充质干细胞的培养上清液。

17.如权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述冻干赋形剂包括鱼骨胶原蛋白。

18.如权利要求9-17中任一项所述的方法，其中在步骤d中添加的冻干赋形剂的终浓度为1-20ng/ml。

19.如权利要求18所述的方法，其中在步骤d中添加的冻干赋形剂的终浓度为5-10ng/ml。

20.如权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述冷冻干燥程序包括以下步骤：

d1.在常压和-60至-80℃的温度下进行预冷冻24小时至5天；

d2.在冷冻干燥机中在-56至-60℃的温度下进行冷阱冷冻约4小时；和

d3.在冷冻干燥机中在约1Pa的压力和-56至-60℃的温度下进行冷冻干燥约12小时。

21.通过权利要求9-20中任一项所述的方法制备的间充质干细胞活性因子冻干粉剂。

22.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-8和21中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂和与所述冻干粉剂组合使用的冻干溶媒。

23.如权利要求22所述的组合物，其中所述冻干溶媒包含至少三种不同分子量的透明质酸。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述至少三种不同分子量的透明质酸包含至少一种高分子量透明质酸、至少一种中分子量透明质酸和至少一种低分子量透明质酸。

25.如权利要求24所述的组合物，其中在所述冻干溶媒中，所述高分子量透明质酸、中分子量透明质酸和低分子量透明质酸的含量比为约1：1：1。

26.如权利要求24或25所述的组合物，其中在所述冻干溶媒中，所述高分子量透明质酸、中分子量透明质酸和低分子量透明质酸的含量各自为0.05％-1％。

27.如权利要求22-26中任一项所述的组合物，其中所述冻干溶媒中包含藏红花提取液。

28.如权利要求27所述的组合物，其中在所述冻干溶媒中，所述藏红花提取液的含量为0.5％-5％。

29.一种干细胞美容产品，所述产品包含如权利要求1-8和21中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或权利要求22-28中任一项所述的组合物。

30.如权利要求1-8和21中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或权利要求22-28中任一项所述的组合物在干细胞美容中的用途。

31.如权利要求1-8和21中任一项所述的间充质干细胞活性因子冻干粉剂或权利要求22-28中任一项所述的组合物在制备干细胞美容产品中的用途。