CN113957041A - 人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法。本发明所制备的脂肪干细胞生长因子冻干粉以透明质酸钠和甘露醇作为保护剂,除菌过滤,经冻干机低温冷冻干燥得到。与常规的生长因子冻干粉相比,透明质酸钠在冻干过程中起到了很好的支撑作用。可以在常温下保存和运输,从而延长了液体脂肪干细胞的活性。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪干细胞领域,尤其涉及人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新,高度增殖和多向分化能力的的细胞群体,根据个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞,胚胎干细胞可以分化为特定功能的干细胞,如皮肤干细胞可分化为多种皮肤细胞,造血干细胞分化为红细胞、白细胞和血小板等。成体干细胞是一种从已经分化组织中提取的未分化的干细胞,这种细胞可以自我更新,在一定条件下可以分化为该类组织的细胞。它们主要用于维持细胞功能的稳态。随着研究的逐步深入,发现干细胞存在的组织类型越来越广泛,包括骨髓、外周血、皮肤和脂肪等。成体干细胞与胚胎干细胞相比其增殖能力有限。就分化潜能而言,胚胎干细胞具有多能性,可形成多种细胞,而成体干细胞只能分化为某种特定的细胞类型。但研究结果证实干细胞具有可塑性,可分化为其他中细胞类型的潜能。
目前,多潜能干细胞在组织工程及基因治疗领域具有巨大的潜力,一般分为胚胎干细胞和成体干细胞,但成体干细胞从性质上与胚胎干细胞相比,不存在免疫排斥及一些论理学问题。
ADSCs来源于脂肪组织的成体干细胞,是一种处于静止状态,未分化的干细胞,其体外扩增和自我增殖能力很强。对组织细胞具有修复功能,可以促进细胞的再生。由于脂肪组织易获得,患者痛苦小、供应充足,可反复取材,无论理道德上的争议。因此脂肪干细胞在临床治疗上具有巨大的潜能。
脂肪干细胞在治疗中能够分泌大量的生长因子:
(1)表皮生长因子(EGF)能促进皮肤创面组织修复过程中DNA、RNA和羟脯氨酸的合成,诱导分化成熟的表皮细胞逆转化为表皮干细胞,加速创面肉芽组织的生成和上皮细胞的增殖,从而缩短创面的愈合时间,提高创面修复质量。
(2)血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用,从而使创口快速愈合。
(3)肝细胞生长因子(HGF)可促进组织细胞的发生、生存和再生,抑制细胞凋亡,调节胶原纤维的合成和炎性反应,在促进创伤愈合与防治组织纤维化中起重要的作用。
(4)成纤维细胞生长因子(FGF)促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖,不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成,修复损害的内皮细胞。
(5)胰岛素样生长因子(IGF)介导生长激素的刺激、调节组织生长和发育,对肌肉体积及力量、身体成分的维持及营养代谢的调节起着重要的作用。
(6)角质细胞生长因子(KGF)能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程,包括细胞的再生、分化和迁移等.
这些生长因子能够促进细胞的生长、修复并补充营养。细胞生长因子是一种多功能强力细胞因子,对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。细胞生长因子能促进皮肤组织的生长繁殖,它通过与细胞表面特异受体结合,调控皮肤上皮,内皮和基质细胞的分裂、繁殖和生长分化,促进细胞代谢,增强氧化作用;能促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖,并调节细胞间基质的合成、分泌及分解;能促进角质层细胞的再生,加速皮肤角质层和基质层的修复,促进人体皮肤细胞的生长;能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢,具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用,使皮肤光滑丰润。
由于生长因子在液体状态下在常温下不容易保存,需采用冻干技术,从而方便保存和运输。
脂肪干细胞的生长因子冻干粉的制备方法包括:脂肪干细胞的分离,脂肪干细胞生长因子上清液的培养,脂肪干细胞生长因子的冻干粉的制备。
发明内容
本发明实施例提供一种人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法,以解决脂肪干细胞生长因子液体状态保存时间短,活性降低、不方便运输的缺陷。
一方面,本发明实施例提供了一种人脂肪干细胞生长因子冻干粉,包括人脂肪干细胞生长因子以及冻干制剂。
另一方面,本发明实施例提供了上述人脂肪干细胞生长因子冻干粉的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)人脂肪干细胞的分离和培养;
(2)人脂肪干细胞生长因子的纯化;
(3)制备人脂肪干细胞生长因子的冻干粉。
本发明的优点:
(1)本发明的人脂肪干细胞培养所提供的培养基中不添加蛋白质类物质,维持干细胞的生长并分泌更多的生长因子。不影响分泌的生长因子之间的浓度和种类。
(2)样本来源单一,产品经过ELISA试剂盒检测各种因子的浓度,从而保证每批产品的均一性。
(3)采用冻干技术得到的冻干粉中不添加人血清白蛋白,添加了低分子量透明质酸钠作为冻干保护剂,透明质酸钠在冻干过程中起到了很好的支撑作用。可以在常温下保存和运输,从而延长了液体脂肪干细胞的活性。
(4)冷冻干燥的技术,在低温条件下进行干燥,在体积不变的情况下,形成完整的蛋糕状,不会发生坍塌、缺损、浓缩。
(5)冷冻干燥过程在在极限真空下进行,氧气含量极少,冻干粉中的成分不容易氧化。
(6)在干燥中能排出95-98%以上的水份,从而使冻干粉能长期保存而不变质。
(7)细胞的生长因子固体含量很少,因此需要加入透明质酸钠、甘露醇作为支撑结构,使冻干粉形成完整的蛋糕状。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例细胞生长因子冻干粉的制备方法流程图;
图2为本发明实施例脂肪干细胞在零蛋白培养基上低氧的条件下第1天生长状况的图片;
图3为本发明实施例脂肪干细胞在零蛋白培养基上低氧的条件下第4天生长状况的图片;
图4为本发明实施例2名志愿者经本发明的冻干粉水光针治疗后的皮肤改善情况对比照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一方面,本发明实施例提供了一种人脂肪干细胞生长因子冻干粉,包括人脂肪干细胞生长因子冻干粉以及冻干制剂。
优选地:所述冻干制剂的成分包括:透明质酸钠、甘露醇、甘氨酸、氯化钠。
优选地:所述冻干粉中人脂肪干细胞生长因子、透明质酸钠、甘露醇、甘氨酸、氯化钠的质量浓度比为:10-80:0.5-1:3-10:0.5-1:0.5-1.0。
优选地:所述的冻干粉的冻干方法在真空度0.2mbar,-30℃的温度下冻干30-48H,得到所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉。
另一方面,本发明实施例提供了上述人脂肪干细胞生长因子冻干粉的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)人脂肪干细胞的分离和培养;
(2)人脂肪干细胞生长因子的纯化;
(3)制备人脂肪干细胞生长因子的冻干粉。
优选地:所述人脂肪干细胞的分离和培养,具体步骤是:
从人脂肪组织中提取脂肪干细胞,在MEM培养基中培养,在汇合率为70-95%的时候,用生理盐水洗1-4次,胰酶消化传代,在第4-6代,更换为零蛋白添加的培养基,低氧条件下培养,收集培养基上清液。
优选地:所述人脂肪干细胞生长因子的纯化,具体步骤是:
(1)取脂肪细胞培养基上清液在1200rpm离心10min,收集上清液,弃沉淀;
(2)将(1)中收集的上清液2000rpm离心20min,收集上清液,弃沉淀;
(3)将(2)中收集的上清液10000rpm离心30min,收集上清液,弃沉淀;
(4)将(2)中收集的上清液-20℃冷冻保存。
以下举例说明:
实例1:
如图1所示,为本发明实施例细胞生长因子冻干粉的制备方法流程图,包括如下步骤:
一、人脂肪干细胞的分离:
(1)将盛有20ml脂肪组织的容器消毒后,用生理盐水清洗脂肪组织,静置分层后移除上层,反复清洗至底层液体清亮为止,得到洁净的脂肪组织以备用。
(2)将5ml的0.25%胶原酶加入人体脂肪中37℃,400r/h,消化30min。
(3)然后加入含血清的MEM培养基终止消化,1800pm离心10min,收集下层细胞。用5ml 10%胎牛血清的MEM培养基吹打细胞,使其分散均匀,然后过70μm的细胞筛,将得到原代脂肪干细胞沉淀物。
二、人脂肪干细胞的培养:
(1)将原代脂肪组织干细胞加入到10%胎牛血清的MEM培养基接种于T150培养瓶中,放入培养箱中,37℃,5%二氧化碳湿润环境中培养4d。
(2)在汇合率为90%的时候,用3ml0.1%的胰酶消化3min,1200rpm离心5min,传代获得第5代脂肪干细胞。将纯化后的脂肪干细胞液氮保存为种子细胞。
三、脂肪干细胞生长因子上清液的培养
(1)取出冻存的脂肪干细胞,37℃水浴复苏细胞,加入10ml生理盐水中,1200rpm离心5min,去除上清,收集下层细胞,再用15ml 10%胎牛血清的MEM培养基吹打细胞,传代到T150的培养瓶中,37℃,5%二氧化碳湿润环境中培养72h,至汇合率为95%。
(2)倒掉培养瓶中的培养基,用生理盐水清洗瓶3次。
(3)将零蛋白的DMEM/F12培养基加入培养瓶中,37℃,低氧环境中培养96h,得到含有细胞生长因子的混合物。
(4)将细胞与培养基分离即得到含生长因子的上清液。
四、人脂肪干细胞生长因子的纯化,具体步骤是:
(1)取脂肪细胞培养基上清液在1200rpm离心10min,收集上清液,弃沉淀(除去细胞)。
(2)将(1)中收集的上清液2000rpm离心20min,收集上清液,弃沉淀(除去细胞碎片)。
(3)将(2)中收集的上清液10000rpm离心30min,收集上清液,弃沉淀(除去大囊泡和凋亡小体)。
(4)将脂肪干细胞生长因子上清液用0.22μm滤器过滤除菌;用ELISA试剂盒检测生长因子浓度:HGF代指肝细胞生长因子;PDGF指血小板来源生长因子;EGF表皮生长因子;TGF-β指转化生长因子β;bFGF碱性成纤维细胞生长因子;I DO指吲哚胺2,3-双加氧酶;IL-10指白细胞介素;KGF角质细胞生长因子;VEGF血管内皮细胞生长因子;IGF-1胰岛素样生长因子的浓度,检测合格后冻存与-20℃冷冻保存。
(5)将(2)中收集的上清液-20℃冷冻保存。脂肪干细胞生长因子上清液的培养将混合物离心分离,去除细胞及细胞碎片,即得到含生长因子的上清液。
实例2:
脂肪干细胞生长因子的冻干粉的制备:
将脂肪干细胞生长因子上清液中加入透明质酸钠、甘露醇、甘氨酸和氯化钠的冻干保护剂,按1ml/支分装到无菌无热源的西林瓶中,在真空度0.2mbar,-30℃的温度下冻干35h,得到脂肪干细胞生长因子的冻干粉。
(1)所述透明质酸钠的终质量浓度为0.7%。
(2)所述甘露醇的终质量浓度为5%。
(3)所述甘氨酸的终质量浓度为0.8%。
(4)所述氯化钠的终质量浓度为1.0%。
实例3:
冻干粉对人面部皮肤的改善。
图4为本发明实施例2名志愿者经本发明的冻干粉水光针治疗后的皮肤改善情况对比照片。
采用水光微针疗法,用2ml溶媒溶解一支冻干粉的比例得到注射液,直接导入表皮深层和真皮层。步骤如下,皮肤经过消毒后,使用麻醉药膏敷在皮肤上一个小时,洗掉麻醉药膏,然后用微针导入溶解好的冻干粉。人面部皮肤得到了很大的改善。从图4中可以看出使用本发明制备的人脂肪干细胞生长因子冻干粉,面部皱纹得到了很大的改善。
应该明白,公开的过程中的步骤的特定顺序或层次是示例性方法的实例。基于设计偏好,应该理解,过程中的步骤的特定顺序或层次可以在不脱离本公开的保护范围的情况下得到重新安排。所附的方法权利要求以示例性的顺序给出了各种步骤的要素,并且不是要限于所述的特定顺序或层次。
在上述的详细描述中,各种特征一起组合在单个的实施方案中,以简化本公开。不应该将这种公开方法解释为反映了这样的意图,即,所要求保护的主题的实施方案需要比清楚地在每个权利要求中所陈述的特征更多的特征。相反,如所附的权利要求书所反映的那样,本发明处于比所公开的单个实施方案的全部特征少的状态。因此,所附的权利要求书特此清楚地被并入详细描述中,其中每项权利要求独自作为本发明单独的优选实施方案。
为使本领域内的任何技术人员能够实现或者使用本发明,上面对所公开实施例进行了描述。对于本领域技术人员来说;这些实施例的各种修改方式都是显而易见的,并且本文定义的一般原理也可以在不脱离本公开的精神和保护范围的基础上适用于其它实施例。因此,本公开并不限于本文给出的实施例,而是与本申请公开的原理和新颖性特征的最广范围相一致。
上文的描述包括一个或多个实施例的举例。当然,为了描述上述实施例而描述部件或方法的所有可能的结合是不可能的,但是本领域普通技术人员应该认识到,各个实施例可以做进一步的组合和排列。因此,本文中描述的实施例旨在涵盖落入所附权利要求书的保护范围内的所有这样的改变、修改和变型。此外,就说明书或权利要求书中使用的术语“包含”,该词的涵盖方式类似于术语“包括”,就如同“包括,”在权利要求中用作衔接词所解释的那样。此外,使用在权利要求书的说明书中的任何一个术语“或者”是要表示“非排它性的或者”。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种人脂肪干细胞生长因子冻干粉,其特征在于:包括人脂肪干细胞生长因子以及冻干制剂用辅料。
2.如权利要求1所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉,其特征在于:所述冻干制剂用辅料包括:透明质酸钠、甘露醇、甘氨酸、氯化钠。
3.如权利要求1或2所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉,其特征在于:所述冻干粉中人脂肪干细胞生长因子、透明质酸钠、甘露醇、甘氨酸、氯化钠的质量浓度比为:10-80:0.5-1:3-10:0.5-1:0.5-1.0。
4.如权利1所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉,其特征在于:所述的冻干粉是按照以下冻干方法得到的:
向含有人脂肪干细胞生长因子的溶液中加入冻干制剂用辅料,在真空度0.2mbar,-30℃的温度下冻干30-48H,得到所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉。
5.如权利要求1所述人脂肪干细胞生长因子冻干粉的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)人脂肪干细胞的分离和培养;
(2)人脂肪干细胞生长因子的纯化,得到含有人脂肪干细胞生长因子的提取液;
(3)向含有人脂肪干细胞生长因子的提取液中加入冻干制剂用辅料,冻干,制备人脂肪干细胞生长因子的冻干粉。
6.如权利要求5所述制备方法,其特征在于:所述人脂肪干细胞的分离和培养,具体步骤是:
从离体人脂肪组织中提取脂肪干细胞,在MEM培养基中培养,在汇合率为70-95%的时候,用生理盐水洗1-4次,胰酶消化传代,在第4-6代,更换为零蛋白添加的培养基,5%二氧化碳低氧条件下培养,收集培养基上清液。
7.如权利要求5所述制备方法,其特征在于:所述人脂肪干细胞生长因子的纯化,具体步骤是:
(1)取脂肪细胞培养基上清液在1200rpm离心10min,收集上清液,弃沉淀;
(2)将(1)中收集的上清液2000rpm离心20min,收集上清液,弃沉淀;
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