CN104586778B - 一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂。该外用冻干剂的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子27000~33000IU、蛋白保护剂5.5~6mg和稀释剂85~95mg。其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白和聚乙二醇的组合物，稀释剂为甘露醇和乳糖醇的组合物。本品能够保证冻干制剂的质量，延长有效期。
Description
技术领域
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂。
背景技术
皮肤是机体避免遭受感染和脱水的重要屏障，严重创伤、烧烫伤以及某些疾病例如糖尿病引起的皮肤溃疡会给患者带来身体和精神上的巨大影响。因此，对皮肤创面的修复是医药领域十分关注的问题。
自上世纪末开始，已对创伤后的组织修复过程、发生机制和治疗等进行了多种研究，其中，分子生物学的迅速发展以及各学科之间的相互交叉影响，使创伤修复与组织再生等水平得到不断提升。目前，已构建了多种促进肉芽组织生长、血管化和再上皮化的基因，例如表皮细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子等。
碱性成纤维细胞生长因子（Basicfibroblastgrowthfactor，简写为bFGF）对来源于中胚层和外胚层的细胞（如上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等）具有促进修复和再生作用。本品能促进毛细血管再生，改善局部血液循环，加速创面的愈合。同时直接刺激成纤维细胞和细胞外基质的蛋白合成，以形成胶原纤维，增加创面的抗张力强度，并促进真皮细胞的移行、分裂、分化，以完成皮肤的修复过程，并能促进皮肤软骨组织、骨组织和神经组织损伤修复和肢体再生。大量基础研究和临床试验证实，bFGF对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用，并且安全、有效、无不良反应。
重组牛碱性成纤维细胞生长因子（Recombinantbovinebasicfibroblastgrowthfactor，简写为rb-bFGF）是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后得到的活性因子。rb-bFGF可促进创面愈合，用于烧伤创面（包括浅II度、深II度、肉芽创面）、慢性创面（包括体表慢性溃疡等）和新鲜创面（包括外伤、供皮区创面、手术伤等）。
专利2011103424562公开了一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子的冻干制剂。其中的真空度、升温速率、降温速率、通入气体和干燥时长、温度没有进行限定，不能充分发挥rb-bFGF的功效，伤口愈合初期的愈合速率较低。同时，产品只能储存于2-8度，如长期室温条件下储存，则无法保证冻干制剂的溶解性和质量。
发明内容
一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂，所述外用冻干剂的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子27000~33000IU、蛋白保护剂5.5~6mg和稀释剂85~95mg。其中，所述重组牛碱性成纤维细胞生长因子优选为31000IU；所述蛋白保护剂优选为6mg；所述稀释剂优选为90mg。
所述的蛋白保护剂为人血白蛋白和聚乙二醇的组合物，体积比为3:1。
所述的蛋白保护剂为人血白蛋白、聚乙二醇和维生素E的组合物，体积比为87:29:4。
所述的稀释剂为甘露醇和乳糖醇的组合物，体积比为2:1。
所述的稀释剂为甘露醇、乳糖醇和缩二脲的组合物，体积比为118:59:3。
所述的冻干制剂制备方法，包括以下步骤：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入气体，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，在-30℃~-38℃预冻3~4.5小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，开始升温升华，完毕后0～20℃干燥2h，优选20℃，然后以30℃继续干燥4.5-6小时。
所述冻干机在使用过程中充入的气体经0.22μm聚四氟乙烯滤芯过滤，洁净度级别为A级，所述气体为空气或氮气。
所述冻干机的真空度维持在8.5-9.5pa。
所述降温在室温降至0℃阶段，降温速率在3℃/min以上。
所述升温升华的速率为6-6.5℃/h。
本发明安全有效，可用于治疗各种烧伤创面、慢性创面和新鲜创面。限定的蛋白保护剂和稀释剂能够均匀溶解rb-bFGF，对其进行长期稳定的保护。制得的冻干制剂效果显著，能明显加速创面愈合过程。尤其在创口愈合初期，显著的加速创口愈合，防止创口感染。同时，本发明的制备工艺简单、操作性强，适合大规模工业化生产。冻干机充入空气和真空度的设定，能够保证制备过程的效率和质量达到最好。发明中的升温速率适宜，能够更好的保留产品的活性。
具体实施方式
实施例1
冻干前溶液处方：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子31000IU
人血白蛋白4.35mg；
聚乙二醇1.45mg；
维生素E0.2mg；
甘露醇59mg；
乳糖醇29.5mg；
缩二脲1.5mg
注射用水适量。
制备方法为：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入A级氮气，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，降温速率为4℃/min，在-38℃预冻3小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，冻干机的真空度维持在8.5pa，开始升温升华，速率为6.5℃/h，完毕后20℃干燥2h，然后以30℃继续干燥4.5小时。
实施例2
冻干前溶液处方：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子27000IU
人血白蛋白4.5mg；
聚乙二醇1mg；
甘露醇45mg；
乳糖醇40mg；
注射用水适量。
制备方法为：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入A级空气，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，降温速率为3℃/min，在-30℃预冻4.5小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，冻干机的真空度维持在9.5pa，开始升温升华，速率为6℃/h，完毕后0℃干燥2h，然后以30℃继续干燥6小时。
实施例3
冻干前溶液处方：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子33000IU
人血白蛋白5.8mg；
聚乙二醇3mg；
甘露醇50mg；
乳糖醇45mg；
注射用水适量。
制备方法为：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入A级氮气，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，降温速率为3.5℃/min，在-35℃预冻4小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，冻干机的真空度维持在9pa，开始升温升华，速率为6℃/h，完毕后10℃干燥2h，然后以30℃继续干燥5小时。
实施例4
冻干前溶液处方：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子31000IU
人血白蛋白4.5mg；
聚乙二醇1.5mg；
甘露醇60mg；
乳糖醇30mg；
注射用水适量。
制备方法为：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入普通氮气，装盘后送入冻干机中，先将样品降温，降温速率为1℃/min，在-38℃预冻3小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，冻干机的真空度维持在6.5pa，开始升温升华，速率为10℃/h，完毕后40℃持续干燥8小时。
实施例5
冻干前溶液处方：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子31000IU
人血白蛋白2mg；
聚乙二醇3.5mg；
甘露醇85mg；
注射用水适量。
制备方法为：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，分装于西林瓶中，向冻干机中充入A级氮气，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，降温速率为4℃/min，在-38℃预冻3小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，冻干机的真空度维持在8.5pa，开始升温升华，速率为6.5℃/h，完毕后20℃干燥2h，然后以30℃继续干燥4.5小时。
试验例1：
rb-bFGF外用冻干粉末促进表皮细胞生长及烧伤创面愈合的实验研究
大鼠烧伤创面模型：实验动物100只SD大鼠，采用恒温恒压烫伤仪，致伤温度85℃，致伤压力为烫伤棒自重0.5kg，烫头面积5cm2。致伤部位为大鼠后肢股骨上端为中心点，每侧各制作一个烧伤创面，左右对称。致伤时间3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s，每时相点10只。
本发明组向清创后的创面涂抹实施例1、实施例2、实施例4和实施例5的外用冻干剂溶解于8ml生理盐水后的溶液，以专利2011103424562实施例1为对照组。每天换药一次，共用药10天。复溶速率如表1：
表1
| 实施例1 | 实施例5 | 对照组 | |
| 溶解速度 min | 1 | 2 | 4 |
由表1可知，实施例1的复溶速率最大，明显大于实施例5和对照组。由此可知，蛋白保护剂和稀释剂的组分和配比对溶解性的影响很大。
涂抹样品后不同时间的创面面积（cm2）如表2：
表2
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例4 | 对照组 | |
| 第0天 | 4.95 | 4.94 | 4.96 | 4.96 |
| 第2天 | 4.05 | 4.12 | 4.19 | 4.33 |
| 第4天 | 3.05 | 3.14 | 3.28 | 3.51 |
| 第6天 | 2.11 | 2.26 | 2.41 | 2.72 |
| 第8天 | 0.17 | 0.18 | 0.21 | 0.26 |
| 第10天 | 0.05 | 0.08 | 0.10 | 0.14 |
由表2可知，涂抹药品2天后，本发明的实施例1和实施例2的创面面积明显小于对照组。表明本发明可在创口愈合初期，显著的加速创口愈合，防止创口感染。其后的第4、6、8、10天后，本发明创口愈合速度快，效果依然优于对照组。而实施例4由于真空度、升温速率、降温速率、通入气体和干燥时长温度的设定不佳，愈合速度显著慢于实施例1和实施例2。以上结果表明本发明制得的药品效果好，创面愈合快。
试验例2：
将本发明实施例1和对照组制得的样品贮存于60℃，相对湿度75%的环境下，取贮存30天时的样品，检测稳定性，结果如表3：
表3
| 本发明实施例1 | 对照组 | |
| 含量 | 99.80% | 99.32% |
| 外观 | 白色疏松体 | 白色疏松体 |
| 复溶后外观 | 无色澄清 | 无色澄清 |
| 无菌检查 | 符合规定 | 符合规定 |
由表3可知，本发明的制剂在长期的高温高湿条件下，制剂性质稳定，结果表明，本发明的制剂耐高温高湿，便于长期贮存。
将本发明实施例1和对照组制得的样品贮存于2~8℃,持续18个月，检测稳定性以及生物学活性，结果如表4和表5：
表4
| 本发明实施例1 | 对照组 | |
| 含量 | 99.86% | 99.42% |
| 外观 | 白色疏松体 | 白色疏松体 |
| 复溶后外观 | 无色澄清 | 无色澄清 |
| 无菌检查 | 符合规定 | 符合规定 |
表5
| 标准规格/组别 | 标准规定 | 本发明实施例1 | 对照组 |
| 18个月检测结果 | 标示量的70%～200% | 184% | 158% |
由表4和表5可知，本发明在长期2~8℃贮存的情况下，性质稳定，生物学活性保持良好，明显优于对照组。结果表明，本发明的制剂适于长期贮存。
将本发明实施例1和对照组制得的样品贮存于室温20℃,持续18个月，检测稳定性，结果如表6
表6
| 本发明实施例1 | 对照组 | |
| 含量 | 97.58% | 90.42% |
| 外观 | 白色疏松体 | 类白色疏松体 |
| 复溶后外观 | 无色澄清 | 无色澄清 |
| 无菌检查 | 符合规定 | 符合规定 |
由表6可知，本发明在室温阴凉条件下长期储存，相关质量指标仍符合要求，而对照组含量则有显著下降，已经无法满足用药需求，而室温储存可以大大降低产品冷链运输以及仓储的成本，应用范围更广，具有重要的经济意义和社会价值。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂，其特征在于，由以下组分制成，重组牛碱性成纤维细胞生长因子31000IU、蛋白保护剂6mg和稀释剂90mg；
所述的蛋白保护剂为人血白蛋白、聚乙二醇和维生素E的组合物，重量比为87:29:4；
所述的稀释剂为甘露醇、乳糖醇和缩二脲的组合物，重量比为118:59:3。
2.如权利要求1所述的冻干制剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组牛碱性成纤维细胞生长因子、蛋白保护剂和稀释剂用注射用水溶解后，用0.22μm的滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，向冻干机中充入气体，将样品装盘后送入冻干机中，先将样品降温，在-30℃~-38℃预冻3~4.5小时，然后开启冷凝器，开启真空系统，开始升温升华，完毕后0～20℃干燥2h，然后以30℃继续干燥4.5-6小时。
3.如权利要求2所述的冻干制剂制备方法，其特征在于，所述冻干机在使用过程中充入的气体经0.22μm聚四氟乙烯滤芯过滤，气体洁净度级别为A级，所述气体为空气或氮气。
4.如权利要求2所述的冻干制剂制备方法，其特征在于，所述冻干机的真空度维持在8.5-9.5pa。
5.如权利要求2所述的冻干制剂制备方法，其特征在于，所述降温在室温降至0℃阶段，降温速率在3℃/min以上。
6.如权利要求2所述的冻干制剂制备方法，其特征在于，所述升温升华的速率为6-6.5℃/h。
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