CN114225009B - 一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂及其应用 - Google Patents

一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

一种重组人成纤维细胞生长因子‑9蛋白药物冻干制剂及其应用。本发明提供了一种冻干重组人FGF‑9蛋白药物制剂，能够有效保护蛋白的稳定性并治疗肝损伤，尤其是能够修复和保护急性肝损伤。具有广阔的应用前景。

Description

一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂及其 应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，更为具体的，本发明涉及一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂及其应用。
背景技术
急性肝损伤主要是短期内由多种原因包括病毒感染、药物滥用、食物中毒、酒精摄入过量以及放射线损伤等引起的肝功能突发性异常疾病，是包括肝硬化、肝癌等肝脏疾病的始动因素，临床发病呈逐年增加趋势。但目前临床尚缺乏能够有效刺激肝功能，保护和修复受损肝细胞的治疗性手段和药物，使肝病成为全球死亡率最高的疾病。
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)信号在调节多种细胞功能包括细胞增殖、存活、分化和迁移中发挥着重要的作用。FGF-9作为成纤维细胞生长因子家族成员之一，最初发现于人类神经胶质瘤细胞系，作为胶质细胞激活因子(Glia-activating factor,GAF)以自分泌或旁分泌的方式促进胶质细胞和神经元的分化和存活，并在许多生理过程中起至关重要的作用。文献报道，FGF-9在胚胎发育、组织修复、骨骼发育、神经再生、毛发再生等方面扮演着重要的角色，是一具有多种生物学功能细胞因子(Pierre M et al.Developmental Biology,2006,293(1):77-89；Zhenlong Zheng etal.Sep-Oct,2014,22(5):660-665；YU Liyun et al.Chinese Medical Journa,2007,120(6):491-495；Takashi Kanda et al.Brain Research,2000,876(1-2):22-30；Denise Gayet al.Nat Med,2013,19(7):916-923.)。
前期发明人的研究表明，FGF-9在正常人肝细胞的氧化损伤模型中具有良好的抗凋亡和保护作用。另外在小鼠急性肝损伤模型中给予FGF-9，可显著减弱氧化损伤和炎症反应，从而降低小鼠的死亡率。其作用机制与目前认为的急性肝损伤主要作用机制kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关蛋白(Nrf2)调节及阻断NF-κB的核转位，从而抑制其下游调控的促炎症细胞因子表达水平的通路相符。
然而FGF-9氨基酸序列中含有大量碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸等)，大量负电荷的氨基酸集聚、相互排斥，导致肽键不稳定易断裂。因此很难将其制备为生物药剂使用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种可行的人FGF-9蛋白冻干制剂，使其在冻干和长期储存过程中能够对人FGF9蛋白起到良好的保护作用。为了实现上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一方面，提供一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂，所述制剂的活性成分为成纤维细胞生长因子9(FGF-9)蛋白，优选的，所述FGF-9为去除N端信号肽的人天然FGF-9。
在一种实施方案中，所述重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂包括药用辅料，所述药用辅料在制剂中起赋形剂、保护剂、抗氧化剂的作用。优选的，所述赋形剂为多元醇或糖类或二者的复合；所述蛋白保护剂为糖类或聚合物或二者的复合。最为优选的，所述重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂每支包括如下组分：1～10mg重组人FGF-9蛋白、10～100mg甘露醇/10～100mg蔗糖、10～100mg海藻糖/5～50mg聚乙二醇、0.1～1mg组氨酸/1～10mg精氨酸/1～10mg谷氨酸钠及10～50mM柠檬酸盐缓冲体系，制剂的pH范围为5.0～6.6。
本发明的第二方面，提供一种重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂的应用，更为具体的，所述应用为将所述冻干制剂制备为用于治疗肝损伤的药物中的应用，优选的，所述应用为将所述冻干制剂制备为用于保护和修复急性肝脏损伤的药物中的应用。
在一种实施方式中，所述冻干制剂的给药方式为注射给药。
本发明可获得如下突出的技术效果：
1.通过筛选缓冲体系和适宜的pH值，并通过添加赋形剂、保护剂等辅料，制成冻干制剂，能长期有效保护成药中的蛋白稳定性，发挥其生物学功能；
2.本冻干制剂可通过注射治疗肝脏损伤，通过减轻炎症、保护肝细胞的凋亡及抗氧化能力等相关作用机制，保护和改善肝脏损伤导致的功能下降，尤其是能够修复和保护急性肝损伤。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白不同冻干制剂组方保存12个月非还原型SDS-PAGE凝胶电泳实验结果；
图2重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白冻干制剂以蛋白纯度为评价标准进行长期稳定性实验结果；
图3重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白冻干制剂以生物学活性为评价标准进行长期稳定性实验结果；
图4肝脏组织HE染色及血清生化指标发现，给予FGF-9蛋白冻干制剂的小鼠肝脏组织损伤程度明显低于LPS/D-Gal模型组，小鼠血清ALT、AST和T-BIL水平明显低于LPS/D-Gal模型组(n＝8)。*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LPS/D-Gal模型组比较。
图5氧化损伤相关指标检测发现，给予FGF-9蛋白冻干制剂的小鼠肝脏组织氧化损伤程度明显低于LPS/D-Gal模型组。与模型组相比FGF-9给药组肝脏中MDA水平明显降低；CAT和GPX活性显著升高；GSH水平接近于正常小鼠；明显上调细胞核NRF2表达，如GCLC、NQO1、HO-1蛋白表达水平上调(n＝8)。*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LPS/D-Gal模型组比较。
图6炎症反应相关指标检测发现，给予FGF-9蛋白冻干制剂的小鼠肝脏中炎症反应程度明显低于LPS/D-Gal模型组。与模型组相比FGF-9给药组血清中TNF-α、IL-6水平明显降低，肝组织中MPO活性也明显降低。进一步通过相关通路实验，提示FGF-9可显著增强IκB的稳定性，阻断NF-κB的核转位，从而抑制其下游调控的促炎症细胞因子表达水平(n＝8)。*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LPS/D-Gal模型组比较。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂的制备方法不同配比的冻干制剂溶液配制及灌装方法：
1)蛋白溶液配制：将纯化的FGF9蛋白在25mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中透析并超滤浓缩至蛋白浓度为6.5mg/ml，用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤后待用。以上操作均在2-8℃条件下进行；
2)辅料溶液配制：根据下表1中设计的各组组方精密称取各组分，并用25mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)充分溶解，调节pH至6.0，并用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤后，放置2-8℃预冷待用；
3)将蛋白溶液与辅料溶液1：1(v/v)混合，使蛋白浓度为3.25mg/ml，制得冻干制剂溶液；
4)精密量取2ml冻干制剂溶液，分装至干热灭菌的5ml西林瓶中，半加塞后置于预冷的冻干机中进行冻干。
冻干过程操作及保存：
1)预冻：以1℃/min的速率降温，预冻温度为-40℃，保持2h；
2)一次干燥：真空度300～100mTorr，温度-40～-20℃，干燥32h。以每上升5℃为一个节点(即-35、-30、-25、-20℃)，隔板温度上升速率为0.25℃/min，每个温度节点维持8h。
3)二次干燥：真空度50～30mTorr，温度-20～20℃。隔板温度上升速率为1℃/min，到达20℃后维持4h。
4)二次干燥完成后，在一定真空条件下压塞，最后西林瓶用铝盖进行密封后2-8℃冷藏保存。
表1
组分\组方 组方1 组方2 组方3 组方4 组方5
重组人FGF-9蛋白 6.5mg 6.5mg 6.5mg 6.5mg 6.5mg
甘露醇 60mg 60mg 60mg 60mg 60mg
蔗糖 20mg 20mg 20mg 20mg
海藻糖 40mg 40mg 40mg 40mg 40mg
聚乙二醇 20mg 20mg 20mg
组氨酸 1.6mg 1.6mg 1.6mg 1.6mg 1.6mg
精氨酸 5.2mg 5.2mg
谷氨酸钠 3.4mg
柠檬酸盐缓冲体系 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM
pH值 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0
实施例2：以非还原型SDS-PAGE凝胶电泳检测各组方重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂稳定性
通过非还原型SDS-PAGE凝胶电泳检测不同组方在5±3℃、RH 65％保存条件下第0、3、6、9、12个月时的蛋白纯度。具体操作如下：
1)电泳蛋白样品制备：将保存的FGF9蛋白冻干制剂在各时间点用注射用水溶解，并稀释至1mg/ml。精密吸取60μl加入20μl 4×非还原样品处理液充分混匀后，100℃煮沸10min，13000rpm离心10min。
2)电泳凝胶制备：根据药典通则中SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法配制12％分离胶，加水封顶并在室温条件下聚合。待分离胶聚合后，去掉水层并用滤纸吸去残余水份，再灌入5％浓缩胶溶液，插入样品梳，注意避免气泡出现。
3)样品加入凝胶：待浓缩胶聚合后拔出样品梳，将配置好的电极缓冲液加满内槽和外槽，在加样孔中加入15μl处理好的FGF9蛋白电泳样品和6μl蛋白分子量标准品。
4)电泳操作：设置初始电压为80V，待样品进入分离胶层后调节电压至120V恒压电泳至样品的溴酚蓝至分离胶底部，结束电泳。
5)固定与染色：电泳完毕后取出胶片，用纯化水冲洗后置固定液中30min。取出胶片浸入考马斯亮蓝R250染色液中染色2h。
6)脱色：将胶片从染色液中取出并用纯化水进行冲洗，浸入脱色液并在摇床上震荡脱色，更换脱色液至凝胶背景透明后放入保存液中保存。
7)纯度分析：将脱色后的凝胶放入Bio-Rad凝胶成像仪中，在白光条件下扫描，用Quantity one软件进行进行灰度分析，计算纯度。
通过凝胶电泳检测不同组方在5±3℃、RH 65％保存条件下第0、3、6、9、12个月时的蛋白纯度，结果如图1、2所示，组方5的冻干制剂中FGF9蛋白最为稳定。
实施例3：以细胞增殖法/MTT比色法检测各组方重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂稳定性
以NIH/3T3细胞为检测细胞株，通过细胞增殖法/MTT比色法测定不同组方在5±3℃、RH 65％保存条件下第0、3、6、9、12个月时的生物学活性。具体操作如下：
1)标准溶液的制备：取中检所购买的成纤维细胞生长因子标准品1支，用1ml维持培养液溶解分装至40IU/ml。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，每个稀释度做2个孔。以上操作均在无菌条件下进行。
2)供试品溶液的制备：将FGF9蛋白用维持培养液稀释至每1ml约含40IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共做8个稀释度，每个稀释度做2个孔。以上操作均在无菌条件下进行。
3)生物学活性测定：NIH3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％CO2培养条件下培养，控制细胞浓度为2×105个细胞/ml。弃去培养瓶中的培养液，用0.25％胰酶-EDTA消化并收集细胞，用完全培养液将细胞浓度调至6×104个细胞/ml细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养。24h后更换维持培养液每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下继续培养24h。弃去96孔板中的维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养48h。每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育4h。弃去96孔板中的液体后，向每孔加入二甲基亚砜100μl，振荡混匀3-5min。放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数方程计算法进行处理，计算结果。
通过生物学活性检测不同组方在5±3℃、RH 65％保存条件下第0、3、6、9、12个月时的蛋白活性，结果如图3所示，组方5的冻干制剂其生物学活性最为稳定。
实施例4：重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂对急性肝损伤小鼠模型的治疗作用
以C57BL/6J雄性小鼠为实验动物，腹腔注射脂多糖(LPS)+D-半乳糖胺(D-Gal)药物造成急性肝损伤模型，通过FGF9给药组与阴性、阳性药物对照组比较，考察FGF9蛋白对急性肝损伤的作用。具体操作如下：
1)受试药物：按照组方5配制的重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白冻干制剂，规格为6.5mg/支。使用时用生理盐水配制成325μg/ml，现用现配。
阳性对照药：水飞蓟素，使用时配制成20mg/ml混悬液，现用现配。
阴性对照药：0.9％生理盐水。
2)实验动物：C57BL/6J雄性小鼠，SPF级，体重在20-22g。购买后SPF级动物房适应饲养三天后造模。
3)实验分组及给药：随机分成六组(每组8只)，即对照组(不进行药物损伤，小鼠腹腔注射生理盐水)、单加药组[不进行药物损伤，小鼠腹腔注射FGF9(1.5mg/kg)]、模型组[腹腔注射5μg/kg脂多糖(LPS)+500mg/kg D-半乳糖胺(D-Gal)，造模前1h和造模后1h，腹腔注射生理盐水]、FGF-9低剂量组[腹腔注射5μg/kg脂多糖(LPS)+500mg/kg D-半乳糖胺(D-Gal)，造模前1h和造模后1h，腹腔注射FGF9(0.5mg/kg)]、FGF-9高剂量组[腹腔注射5μg/kg脂多糖(LPS)+500mg/kg D-半乳糖胺(D-Gal)，造模前1h和造模后1h，腹腔注射FGF9(1.5mg/kg)]、阳性药物对照组[腹腔注射5μg/kg脂多糖(LPS)+500mg/kg D-半乳糖胺(D-Gal)，造模前1h和造模后1h，腹腔注射水飞蓟素(100mg/kg)]。所用制剂均按照等体积(200μl)不等浓度的要求制备。
4)观测指标：造模后6h，小鼠眼眶取血，同时分离小鼠肝脏组织。小鼠全血室温静置2h后，5000r/min离心15min，取血清进行肝功能酶学检测。小鼠肝左外叶用4％多聚甲醛固定后，进行组织病理学检测，剩余肝组织保存于-80℃冰箱，用于氧化相关蛋白、炎症相关蛋白表达水平检测。
结果如图4所示，肝组织HE染色结果显示，FGF-9冻干制剂组(0.5,1.5mg/kg)预处理组小鼠的组织损伤程度明显低于LPS/D-Gal模型组，表现为肝实质坏死减轻、形态规则、肝细胞和肝窦清晰可见、炎症细胞浸润较少。用试剂盒检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性以及总胆红素(T-BIL)含量测定。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，给予FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)可明显抑制上述指标的增加。表明给予FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)，可显著改善药物对肝脏的损伤。
如图5所示，将肝脏组织匀浆，用试剂盒检测过氧化产物和抗氧化物的含量测定。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)的小鼠肝脏中MDA水平明显降低，抗氧化酶CAT和GPX活性显著提高。核因子红系相关因子2(NRF2)是一个对氧化应激产生适应性反应的关键调节因子，分别提取肝脏组织胞浆、胞核及全蛋白，Westernblotting法分析。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)可显著提升与NRF2基因相关GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达的表达水平。表明FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)对肝脏损伤的保护和修复与其抗氧化作用相关。
如图6所示，用ELISA法检测小鼠血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)的小鼠血清中上述指标显著降低。称取肝脏组织匀浆后，用试剂盒检测肝组织中髓性过氧化物酶(MPO)活性。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，给予FGF-9(0.5,1.5mg/kg)的小鼠肝脏组织中MPO的活性也明显降低。NF-κB是一类重要的转录调节因子，调控免疫反应和炎症反应中多种蛋白的基因转录。分别提取肝脏组织全蛋白、胞浆及胞核，Western blotting法分析IκBα及其磷酸化水平以及NF-κB p65的相对表达水平。结果表明，与LPS/D-Gal模型组相比，FGF-9蛋白冻干制剂(0.5,1.5mg/kg)的小鼠肝脏组织中IκBα磷酸化水平降低，IκBα和NF-κB p65保留在胞浆内，细胞核内几乎未见NF-κB p65信号。提示FGF-9可显著增强IκB的稳定性，阻断NF-κB的核转位，从而抑制其下游调控的促炎症细胞因子表达水平。
实验结果，重组人成纤维细胞生长因子-9冻干制剂可显著改善药物对肝脏的损伤，并在一定范围呈现剂量依赖性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种用于治疗肝脏损伤的重组人成纤维细胞生长因子-9蛋白药物冻干制剂，其特征在于，所述制剂的活性成分为成纤维细胞生长因子9（FGF-9）蛋白，所述冻干制剂的组分如下：
重组人FGF-9蛋白6.5 mg、甘露醇60 mg、蔗糖20 mg、海藻糖40 mg、聚乙二醇20 mg、组氨酸1.6 mg、精氨酸5.2 mg、谷氨酸钠3.4 mg、柠檬酸盐缓冲体系25mM，制剂的pH值为6.0。
2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述FGF-9为去除N端信号肽的人天然FGF-9。
3.如权利要求1-2任一所述的冻干制剂在制备用于治疗肝损伤的药物中的应用。
4.如权利要求1-2任一所述的冻干制剂在制备用于保护和修复急性肝脏损伤的药物中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述冻干制剂的给药方式为注射给药。
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