CN108785653A - Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

Apelin‑13在制备治疗脑外伤药物中的应用，通过Apelin‑13促进脑损伤后神经细胞增殖并在PTEN/Akt/FoxO3a/BNIP3信号通路抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬水平，为制备脑外伤后神经细胞的修复药物和脑外伤的治疗药物提供了新的途径。

Description

Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用。

背景技术

1998年Tatemoto等用和发现促泌乳释放肽hGR3同样的方法从牛胃的分泌物中提取出并纯化出APJ的天然配体，并命名为Apelin，并且他又发现在Apelin-13、Apelin-36、Apelin-17三个亚型中，Apelin-13具有最高的受体亲和性。由于Apelin在体内的广泛分布，它在心血管、免疫、神经内分泌等诸多方面均有重要作用。Apelin-13有着很好的保护大脑局灶性缺血再灌注损伤的作用，可以明显减轻其脑水肿和脑缺血面积的作用，但其具体机制不详。2007年Simpkin等人证实，Apelin-13无论在在体还是离体心肌缺血再灌注实验模型中均起到了很好的保护作用，但迄今为止，多数研究都局限于它在心血管系统中的作用和意义，其具体的作用机制并未完全清楚。

自噬性细胞死亡(autophagic cell death)是细胞死亡的一种重要的方式，TBI(Traumatic brain injuries，外伤性脑损伤)为临床上伤病致死的首位原因，与缺血性中风一样，兴奋性毒性、自由基、caspase激活、炎症反应等均参与了TBI引发的神经元损伤。传统上，TBI引起的神经元死亡被认为是一种坏死，主要特征是胞浆内有大量的空泡形成，后来的研究又发现TBI引起的神经元死亡也具有细胞凋亡的特征，继而又发现TBI可以引起自噬性细胞死亡和程序性坏死(necropoptosis)，后者可以被Nec-1阻断，由此可见多种死亡方式参与了脑损伤后的神经元丢失过程。无创修复和药物联合治疗是国内外治疗TBI病人的总体趋势，保护神经元并恢复其功能是治疗TBI的根本目的，在所有细胞死亡方式及通路的上游寻找治疗靶点无疑是防止TBI后神经元死亡丢失的最好方式。因此，Apelin-13对脑外伤后神经细胞的保护作用和修复机制的研究对治疗TBI病人将有十分重要的意义。

发明内容

发明人经过大量实验研究发现，Apelin-13可促进脑损伤后神经细胞增殖并可通过PTEN/Akt/FoxO3a/BNIP3信号通路抑制凝血酶损伤后的细胞线粒体自噬水平，可为制备脑外伤后神经细胞的修复和脑外伤的治疗药物提供新的途径。

本发明的技术方案如下：

Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用。

进一步的，所述治疗脑外伤药物为抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬药物。

进一步的，所述治疗脑外伤药物为促进脑损伤后神经细胞增殖和/或通过PTEN、Akt、FoxO3a和/或BNIP3信号通路抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬药物。

进一步的，所述治疗脑外伤药物由Apelin-13和药学上可接受的载体组成。

进一步的，所述治疗脑外伤药物的剂型为片剂、胶囊剂、水针剂、粉针剂、口服制剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明的Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用，通过Apelin-13在神经细胞信号通路上抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬水平，为制备脑外伤后神经细胞的修复和脑外伤的治疗药物提供了新的途径。

附图说明

图1为本发明实施例4中Thrombin和Apelin-13药物处理后HT-22和PC-12细胞后相关蛋白表达情况，其中，C为对照组，T为Thrombin组，T+A为Thrombin+Apelin-13组，A、C、E、G、I是PC-12细胞，B、D、F、H、J是HT-22细胞，n＝3，*P＜0.05vs.C，#P＜0.05vs.T；

图2为本发明实施例5中Thrombin和Apelin-13药物处理后HT-22和PC-12细胞FoxO3a的蛋白亚细胞表达情况，其中A-TRITC所示为FoxO3a在HT-22细胞的表达，A-DAPI所示为细胞核；A-Merge为A-TRITC与A-DAPI的叠加；B-FITC为FoxO3a在PC-12细胞的表达，B-DAPI为细胞核；B-Merge为B-FITC与B-DAPI的叠加，C为对照组，T为Thrombin组，T+A为Thrombin+Apelin-13组，A、C是HT-22细胞，B、D是PC-12细胞，*P＜0.05vs.C；#P＜0.05vs.T；

图3为本发明实施例5中Thrombin和Apelin-13药物处理HT-22和PC-12细胞后Bnip3蛋白的亚细胞表达，其中，TRITC为Bnip3在HT-22细胞的表达，DAPI为细胞核；Merge为TRITC与DAPI的叠加，对照组T为Thrombin组，T+A为Thrombin+Apelin-13组，A、C是HT-22细胞，B、D是PC-12细胞，*P＜0.05vs.C；#P＜0.05vs.T；

图4为本发明实施例6中检测的慢病毒感染细胞后FoxO3a敲除效率，其中，A是HT-22细胞，B是PC-12细胞；

图5为本发明实施例6中干扰FoxO3a后HT-22和PC-12细胞的增殖能力，其中，NC是空载体转染组，NC+T是空载体转染加Thrombin组；

图6为本发明实施例6中沉默FoxO3a后LC3及BNIP3蛋白的表达情况，其中，A、C、E是HT-22细胞，B、D、F是PC-12细胞，*P＜0.05vs.NC；#P＜0.05vs.NC+T；ΔP＜0.05vs.NC+T+A。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1细胞培养试剂配制

1.1高糖DMEM细胞培养基

高糖DMEM细胞培养基(粉剂)13.4g、3.7g NaHCO₃、双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)溶于1L双蒸水中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，调节pH至7.1～7.2。用0.22μm孔径滤膜正压过滤除菌，分装在消毒过的100mL玻璃瓶中，20℃冰箱内保存。抽样并置于37℃恒温培养箱内培养做无菌试验。

1.2RPMI 1640细胞培养基

取一包RPMI 1640培养基(粉剂)和2g NaHCO₃溶于1L双蒸水中，其余步骤同高糖DMEM培养基的配置。

1.3胰蛋白酶工作液(0.25％)

2.5g胰蛋白酶、EDTA 0.2g，溶于PBS溶液中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，调节pH7.8～8.0，定容至1L。微孔滤膜(0.22μm)过滤后分装，-20℃冰箱内保存。

1.4细胞冻存液

按胎牛血清：DMSO＝9：1配制，冻存细胞前配制。

实施例2试剂配制

2.1药物配制

1)NGF储备液：将冻干粉中加入含0.1％牛血清白蛋白的无菌PBS 1mL，配置成100μg/mL原液，分装10管，每管100μL，放入-80℃保存。将每管用无菌PBS进一步稀释，使其终浓度为10μg/mL，总量为1mL。使用时用培养基稀释，使其工作液浓度为50ng/mL。

2)凝血酶储备液：将每瓶冻干粉中加入含0.1％牛血清白蛋白的无菌PBS 10mL，混匀后过滤，使其储备液浓度为100U/mL，-20℃保存。用前将其稀释为25U/mL(PC-12细胞)和75U/mL(HT-22细胞)的工作液浓度。

3)Apelin-13储备液：取Apelin-13 5mg，加入1mL PBS配制成5μg/μL。依据其分子量为1550.8，计算原液的摩尔浓度，使其储备液浓度为32mmol/L。使用时用培养基稀释至工作液浓度0.8μmol/L(PC-12细胞)和1μmol/L(HT-22细胞)。

4)Rapamycin储备液：50mg的粉末高速离心后，加入1mL无水乙醇配置成50mg/mL，依据其分子量计算原液的摩尔浓度，使其储备液浓度为54694nmol/L。使用时用培养基稀释至工作液浓度为50nmol/L。

2.2生化试剂

1)Tris-HCl缓冲液(1.5mol/L，pH 8.9)：称取36.3g Tris加双蒸水溶解定容至200ml，调pH至8.9，溶解后4℃保存。

2)Tris-HCl缓冲液(0.5mol/L，pH 6.8)：称取1.514g Tris加双蒸水溶解定容至25ml，调pH至6.8，溶解后4℃保存。

3)Acr-Bis液的配制：称取Acr 29.2g，Bis 0.8g分别溶解，否则容易结块，定容至100ml滤去不溶物质，4℃可保存1月，使用时恢复至室温，摇匀无沉淀。

注：Acr和Bis要分别溶解，否则容易结块，双蒸水定容至100mL，滤去不溶物质，4℃避光可保存1月，使用时恢复至常温，无沉淀。

4)10％SDS：SDS 2.5g加双蒸水至25ml，50℃水浴中溶解，室温保存，室温过低会出现结晶，水浴加热完全溶解后仍可使用。

5)40％蔗糖：蔗糖10g加双蒸水至25ml，溶解后4℃保存。

6)10％AP：AP 0.1g加双蒸水至1ml，避光，溶解后4℃保存，时间1周。

7)SDS-PAGE电泳缓冲液(1000ml，pH 8.3～8.8)

8)电转移缓冲液(Transfer buffer)(800ml，pH 8.3～8.8)

9)AP substrate buffer(100ml、pH 9.0、4℃保存、用时复温)

10)Washing buffer(1000ml、pH 7.5、4℃保存、用时复温)

11)封闭液(Block buffer)(20ml、pH 7.5、4℃保存、用时复温)

12)聚丙烯酰胺凝胶

13)配样品缓冲液(蛋白处理液)：4×200ml(1ml分装，-20℃保存)

14)一抗及二抗工作液:用1％-5％BSA稀释至所需浓度。

实施例3实验方法

3.1细胞培养

小鼠海马神经元HT-22细胞于RPIM-1640培养基，10％FBS(杭州四季青)，37℃，5％CO₂条件下培养。

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞于高糖DMEM培养基，10％FBS(杭州四季青)，37℃，5％CO₂条件下培养，需加入50ng/mL的NGF，诱导细胞向神经元分化。

3.1.1细胞复苏

1)从液氮中取出装有HT-22或PC-12细胞的冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化(1min左右)。

2)在室温下，用RPIM-1640或DMEM基础培养基将冻存细胞液稀释至3ml。

3)以1000rpm的速度离心5min。

4)弃上清，用RPIM-1640或DMEM完全培养基重悬细胞，移入细胞培养皿中，37℃，5％CO₂培养。

3.1.2细胞冻存

(1)取对数生长期细胞用0.25％胰酶溶液消化。

(2)加入RPIM-1640或DMEM完全培养液终止消化，将细胞悬液收集于离心管，1000rpm离心5min。

(3)弃去上清，加入配制好的细胞冻存液吹打混匀，置于4℃冰箱，30min；-20℃冰箱，1h；-80℃冰箱，过夜；液氮长期保存。

3.1.3细胞传代

1)准备：紫外线照射超净工作台面30min，培养基、PBS和胰酶的瓶子置于37℃水浴锅内预热30min。

2)在倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞生长融合度达80％以上时，用0.25％胰酶消化。倒置显微镜下观察细胞，若胞质回缩成圆形，细胞间隙增宽，表明此时细胞消化适度，大约20s。

3)离心弃去胰酶，加入2mL完全培养液。用吸管将贴壁细胞吹打成细胞悬液，。

4)分别传到2-3个培养皿中，或调整实验所需的细胞数用于实验铺板。

3.1.4细胞计数

1)用0.25％胰酶溶液消化细胞，制成单细胞悬液。

2)吸管吸5滴细胞悬液至1.5ml EP管中，并加入5滴台盼蓝染液(0.4％)混匀。

3)抽取细胞悬液8-15μl小心加入细胞计数板。用显微镜×10物镜观察，用细胞计数器计数四个大方格中的细胞数，按下式计算细胞密度：

细胞数/ml细胞悬液＝(四大方格细胞总数之和/4)×稀释倍数×10⁴

3.2细胞增殖实验

1)制备单细胞悬液：取对数生长期的HT-22和PC-12细胞，用胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0×10⁴/ml。

2)按每孔100μl接种细胞悬液至96孔板，每组设6-10个复孔(为确保每孔细胞数均匀，每快速加完3孔，则要重新吹打混匀一次细胞悬液)，放入37℃，CO₂培养箱中培养。

3)测OD值：37℃，CO₂培养箱继续培养。分别于细胞加药后0h、4h、9h、后取出培养板，吸弃每孔的培养基，将培养基和CCK-8按10:1的比例预先混匀，每孔加入100μl，另设一个空白对照孔，无细胞生长孔，只加100μl混合液，在37℃孵育2h，用酶标仪测450nm处吸光度值(OD值)。试验重复3次。

3.3CYTO-ID自噬检测试剂盒染色实验

CYTO-ID自噬检测试剂盒采用申请专利的荧光染料，可以特异性地检测细胞内的自噬泡，包括前自噬体、自噬体和自噬溶酶体。试剂盒组分中包括Rapamycin和自噬诱导剂，可以作为阳性对照。

取对数生长期细胞以每孔5×10⁵/mL的细胞密度接种于覆有细胞爬片的12孔板内,每孔加入1ml细胞悬液，于37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞贴壁生长后，吸弃培养液，加入含有处理试剂的混合培养液1mL，分别继续培养4h(PC-12细胞)、9h(HT-22细胞)取出细胞爬片。阳性对照细胞用500nmol/L的Rapamycin预处理16h，阴性对照不做处理。

1)PBS洗3min×2次；

2)滴加配好的CYTO-ID绿色染液(1ml培养基加入2μl CYTO-ID绿色染料和1μlHoechst 33342核染料)；

3)避光37℃孵育30min，PBS洗3min×2次；

4)4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3min×2次；

5)吸掉细胞爬片上的水分，将细胞面倒置放在载玻片上，甘油封片；

6)在正置显微镜下观察并拍照，避光进行。

7)结果判定：自噬染色后的标本，细胞胞浆中出现绿色荧光斑点为阳性。40×镜下观察，随机选取3个高倍视野，计算荧光密度。

3.4细胞免疫荧光实验

1)细胞准备：取对数生长期细胞以每孔5×10⁵/mL的细胞密度接种于将细胞接种到预先放置有细胞爬片的12孔培养板中，每孔加入1ml细胞悬液，于37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞贴壁生长后，吸弃培养液，加入含有凝血酶和A-pelin-13的混合培养液1mL，分别继续培养4h(PC-12细胞)、9h(HT-22细胞)后取出细胞爬片。待细胞长到50-60％后取出细胞爬片，PBS洗两次。以下步骤均在冰上操作

2)固定：采用4％的多聚甲醛固定15-20min。PBS洗涤3×5min。

3)通透：滴加0.1％TritonX-100增加细胞膜通透性15min，PBS洗5min×3次；

4)封闭：使用10％正常羊血清对细胞进行室温封闭，时间一般为1h。

5)一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBS漂洗3×5min。

6)二抗结合：使用FITC和TRITC二抗。室温避光孵育1h。PBS漂洗3×5min。

7)DAPI复染核。使用DAPI室温孵育5min。PBST漂洗3×5min。再用蒸馏水漂洗一次。

8)封片及检测：滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜观察随机取6个视野拍照。试验重复3次。

3.5Western blot检测相关蛋白的表达

3.5.1提取细胞总蛋白

1)倒上清，用预冷的PBS冲洗2次，弃PBS，吸尽残液。

2)100μl裂解液中加入1μl PMSF混匀，加入培养瓶中，裂解30min。

3)用细胞刮匙迅速刮下细胞，置于1.5ml EP管内。

4)低温高速离心机离心：4℃，12000r/min，5min。

5)取上清即为细胞总蛋白，-20℃保存。(以上步骤均于冰上进行)

3.5.2BCA法蛋白测定

1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀，BCA工作液室温24h内稳定。

2)完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释到100μl，使终浓度为0.5mg/ml(PBS稀释标准品)。

3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样品不足20μl，加标准品稀释液补足到20μl。注意记录样品体积。

5)每孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

6)用酶标仪测定562nm的波长吸光度。

7)根据标准蛋白曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

3.5.3Western blot

1)蛋白样品处理：用PBS配平各管蛋白样品，按照每4μL蛋白样品加入1μL蛋白上样缓冲液(5×Loading Buffer for SDS-PAGE)的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液，100℃加热煮沸10min，以充分变性蛋白；

2)SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：按说明书安装好蛋白凝胶电泳装置，配10％分离胶后，立即用Eppendorf枪，沿玻璃板壁缓缓加入，使胶均匀缓慢流下，避免形成气泡，在其表面加无水乙醇覆盖，凝胶时间控制在15～20min，完全聚合后吸去无水乙醇，同样方法立即将浓缩胶加于分离胶上，迅速插上样梳，避免形成气泡，待浓缩胶凝固后，两手同时拿住梳子轻轻拔出；

3)加样与蛋白电泳：用微量加样器，分别缓慢加入Marker及15～30μL上清液，避免样品外溢，盖上电泳槽盖子，插上电极。恒压120V至溴酚兰到达分离胶底部，然后关闭电源。

4)转膜：根据转膜面积(cm²)计算转膜电流(mA)，电流＝膜的面积×2.5×转膜张数；电压不超过25V(一般为24V)；根据分子量计算转膜时间(分钟)：小于60KD的蛋白，转膜时间＝分子量+10；大于60KD的蛋白，转膜时间＝分子量；设定好仪器后进行转印，将蛋白转移至PVDF膜上；

5)漂洗封闭：转膜结束后，关闭电源，取出PVDF膜，将PVDF膜胶面向上放于装有Washing buffer培养皿中，在摇床上洗1～2min，洗去PVDF膜上的转移液，倒掉Washingbuffer，直接加入封闭液，摇床上平缓慢速摇动，室温封闭2h；

6)将PVDF膜分别放进配制好的稀释一抗，摇床上平缓摇动30min后，4℃过夜；

7)次日回收一抗，用Washing buffer洗膜5min×3次；

8)加入相应稀释后的二抗，室温摇床上摇动2h；

9)洗涤：用Washing buffer洗膜5min×3次；

10)条带曝光：采用ECL法进行曝光，胶片压片适当时间后取出进行显影定影操作；

11)取出PVDF膜晾干，将胶片扫描保存；

12)采用Image J图像分析系统对Western印迹结果进行分析，测出各组灰度值。

3.6慢病毒感染细胞

3.6.1靶细胞侵染试验

第一天

1)靶细胞铺板：将HT-22和PC-12细胞分别接种到24孔板，计数细胞调整细胞总数为0.5×10⁵个/孔，0.5ml完全培养液，37℃、5％CO₂过夜；

第二天

2)十倍稀释病毒：稀释液RPMI-1640+10％FBS+终浓度5ug/ml Polybrene和DMEM+10％FBS+终浓度5ug/ml Polybrene，将慢病毒(5～10ul)十倍稀释3～5个梯度；

3)移去细胞培养液，加入2)稀释后的病毒液0.5ml，同时建立对照(mock、negative)，37℃、5％CO₂过夜；

第三天

4)移去细胞培养液，加入1ml完全培液，37℃、5％CO₂过夜；

第四天

5)根据细胞状态和类型，如果细胞长满分出1/3～1/5，加入1ml完全培养液，继续培养24～48h；

第六天

6)采用适当的荧光显微镜观察细胞感染效率，Western blot分析转入基因的表达或调控。

3.6.2稳定转染细胞株的筛选

1)筛选浓度的确定：将HT-22和PC-12细胞分别接种到24孔板，计数细胞调整细胞总数为3×10⁴个/孔，分别加入含Puromycin的RPMI-1640培养基和含Puromycin的DMEM进行筛选，每孔终浓度分别为0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml，8μg/ml，10μg/ml，每个稀释度用3孔细胞，另有3个孔加入不含Puromycin的培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天观察细胞，每3天换液一次，以3孔细胞培养至第10天全部死亡的最小Puromycin浓度(2μg/ml)作为筛选浓度。此浓度由本实验室提供。

2)感染后shFoxO3a细胞的稳定筛选：HT-22和PC-12细胞转染如上所示，转染后，继续培养48h，然后加入Puromycin，终浓度为2μg/ml，继续培养21d后再次采用Western blot检测FoxO3a干扰效果。后期培养过程中要加入1μg/ml Puromycin维持培养。经Westernblot鉴定转染效果后，稳定转染细胞株即为FoxO3a干扰细胞株，NC组的筛选同上。

实施例4Western blot检测PTEN/Akt/FoxO3a/Bnip3信号通路相关蛋白表达

检测结果如图1所示，与对照组相比，Thrombin组中PTEN及FoxO3a蛋白表达减少，p-Akt及Bnip3表达增多；与Thrombin组相比，加入Apelin-13后，PTEN与FoxO3a蛋白表达增加，p-Akt及Bnip3表达下调。表明Apelin-13可以调节PTEN/Akt/FoxO3a/Bnip3信号通路。

实施例5细胞免疫荧光检测FoxO3a和Bnip3的亚细胞表达及细胞内定位

5.1FoxO3a免疫荧光检测结果

实验结果如图2所示，与对照组相比Thrombin组和Thrombin+Apelin-13组细胞内FoxO3a荧光强度减少，且以核内减少较为显著；与Thrombin组相比，加入Apelin-13后，细胞内FoxO3a的荧光信号增强，主要为核内增多，差异有统计学意义(P<0.05)。表明Apelin-13可促进FoxO3a从胞浆进入细胞核。

5.2Bnip3表达免疫荧光检测结果

实验结果如图3所示，与对照组相比Thrombin组和Thrombin+Apelin-13组细胞内Bnip3荧光信号增多。荧光信号主要位于细胞质，表现为围绕细胞核周围的点片状荧光斑点；与Thrombin组相比，加入Apelin-13后，细胞核周围Bnip3的荧光斑点减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明Bnip3的细胞内定位主要位于细胞质且围绕细胞核分布，而Apelin-13处理可使Bnip3表达降低。

实施例6慢病毒干扰FoxO3a后检测细胞活性及相关蛋白表达

FoxO3a是Fox(forkhead box protein)家族转录因子的一个重要成员，其在新陈代谢、细胞增殖、细胞存活以及自噬等生物进程中起重要作用。研究表明FoxO3a主要通过进入细胞核与相应的DNA、蛋白质、蛋白激酶及转录因子结合，调控下游因子而发挥作用。之前的实验结果已经表明Apelin-13作用于凝血酶损伤后的细胞可引起细胞内FoxO3a蛋白表达量增加，且免疫荧光结果显示加入Apelin-13后，FoxO3a发生了核转位。因此推测Apelin-13可能通过促进FoxO3a入核调节下游自噬相关蛋白的表达从而发挥抑制自噬的作用。使用慢病毒感染技术干扰FoxO3a的表达来构建体外细胞模型，并利用该细胞模型进一步研究其与自噬的具体关系。

6.1通过慢病毒感染HT-22和PC-12细胞构建FoxO3a干扰细胞株

通过慢病毒感染将特异性针对FoxO3a的shRNA及相应的空载序列导入细胞中，从而干扰FoxO3a蛋白的表达。Western Blot结果如图4所示，显示出在HT-22和PC-12两种细胞中，shFoxO3a组细胞中FoxO3a蛋白的表达水平均显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.01)。

6.2慢病毒干扰FoxO3a后检测细胞增殖活性

干扰FoxO3a后通过CCK-8实验检测了细胞的增殖活性，结果如图5所示，可以看出，与NC组相比，NC+T组中细胞的增殖活性下降，若同时加入Apelin-13则会使细胞恢复增殖能力。而与NC+T+A组相比，shFoxO3a+T+A组细胞的增殖活性又会显著下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)。这一结果说明Apelin-13可以增强凝血酶损伤细胞的增殖活性，且该作用与FoxO3a的表达水平相关。

6.3慢病毒干扰FoxO3a后检测LC3和Bnip3的表达水平

Western Blot结果如图6所示，显示出，与NC+T+A组相比，shFoxO3a+T+A组中Bnip3蛋白的表达增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，且差异有统计学意义(P<0.05)。表明Apelin-13可以通过上调FoxO3a的蛋白表达水平，降低其下游LC3和Bnip3的表达，进而使得细胞自噬减少，增殖活性增加，对细胞起到保护作用。

Claims (5)

1.Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用，其特征在于，所述治疗脑外伤药物为促进脑损伤后神经细胞增殖和/或抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬药物。

3.根据权利要求2所述的Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用，其特征在于，所述抑制神经细胞自噬药物为通过PTEN、Akt、FoxO3a和/或BNIP3信号通路抑制凝血酶损伤后的神经细胞线粒体自噬药物。

4.根据权利要求2所述的Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用，其特征在于，所述治疗脑外伤药物由Apelin-13和药学上可接受的载体组成。

5.根据权利要求4所述的Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用，其特征在于，所述治疗脑外伤药物的剂型为片剂、胶囊剂、水针剂、粉针剂、口服制剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。