CN115192587B - 一种枸杞子寡糖的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枸杞子寡糖在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。本发明发现该枸杞子寡糖可以显著促进HepG2细胞的凋亡，对HepG2细胞的抑制作用远远强于对L02细胞的抑制作用。

Description

一种枸杞子寡糖的新用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种枸杞子寡糖的新用途。
背景技术
癌症是由增殖和凋亡失衡引起的最致命的疾病之一，传统治疗手段包括手术切除、放疗和化疗，而由于放化疗存在严重的毒副作用且作用靶点较为单一，因此在传统中药中寻找高效、低毒副作用小的天然化合物用于改善临床症状、抑制肿瘤生长、延长癌症患者寿命引起了广泛关注。
中医理论认为，肝癌的发生，多因饮食内伤，情志失调，致肝脾受损，气机阻滞，肝肾两亏、津血枯竭，日久渐积而成；而枸杞子具有滋补肝肾，益精明目的作用，入肝、肾经，可用于治疗肝肾不足、劳伤虚损的临床症状。
在本发明之前，对于枸杞子寡糖的抗肿瘤活性未见有相关报道。
发明内容
基于此，本发明提供了一种枸杞子寡糖在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含枸杞子寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
进一步地，该枸杞子选自以下的一种或多种：所述枸杞子为柱筒枸杞、柔茎枸杞、黑果枸杞、截萼枸杞和/或宁夏枸杞的干燥成熟果实。
进一步地，该枸杞子的产地为宁夏、甘肃、内蒙古、新疆和/或青海。
进一步地，所述枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实。
进一步地，该枸杞子寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。
进一步地，该枸杞子寡糖由2～6个单糖单元通过糖苷键结合而成。
进一步地，该枸杞子寡糖由葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖通过糖苷键结合而成。
进一步地，该枸杞子寡糖选自以下的一种或多种：蜜二糖、棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖。
进一步地，该枸杞子寡糖为蔗果四糖、蔗果五糖和/或蔗果六糖。
进一步地，该肿瘤为肝脏良性肿瘤或肝脏恶性肿瘤。
进一步地，该肿瘤的细胞为HepG2细胞。
进一步地，该枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的凋亡而发挥作用。
进一步地，该枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的早期凋亡和晚期凋亡而发挥作用。
进一步地，该组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
进一步地，该组合物被配制成口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。
进一步地，该口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂。
进一步地，该辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。
进一步地，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。
进一步地，该附加治疗剂为抗癌药。
进一步地，该抗癌药为抗肝癌药。
进一步地，该抗肝癌药选自以下的一种或多种：索拉非尼、瑞戈菲尼、乐伐替尼、纳武单抗、卡博替尼和雷莫芦单抗。
本发明的有益效果：
本发明通过CCK-8实验检测不同浓度的枸杞子寡糖分别作用L02细胞和HepG2细胞24h、48h、72h的细胞活力并计算IC50值的结果可知，随着作用时间的增加，L02细胞和HepG2细胞活力均下降，而对HepG2细胞的抑制作用远远强于对L02细胞的抑制作用。在基本不影响L02细胞活力的浓度下，采用Hoechst 33258荧光染料对HepG2细胞进行染色，枸杞子寡糖孵育组视野中细胞数量明显减少，HepG2细胞染色体固缩呈现的亮蓝色荧光增加，出现凋亡的形态学特征，且随着枸杞子寡糖浓度的不断增加，形态变化越加明显。初步可以证实，枸杞子寡糖可以促进HepG2细胞的凋亡。采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染分析枸杞子寡糖给药组的HepG2细胞与空白组相比，早期凋亡和晚期凋亡率均明显增加，并呈现明显的量效关系，说明LBOS能显著促进HepG2细胞的凋亡，特别是晚期凋亡比例大幅度增加。此外，LBOS-20-5(峰14，蔗果四糖)、LBOS-20-6(峰20，蔗果五糖)和LBOS-20-7(峰21，蔗果六糖)相比于其它枸杞子寡糖对于HepG2细胞活力的影响更为显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为不同浓度的LBOS作用不同时间对L02细胞活力影响结果示意图。误差线代表SD，n＝6个独立实验。
图2为不同浓度LBOS作用不同时间对HepG2细胞活力影响结果示意图。误差线代表SD，n＝6个独立实验。
图3为Annexin V-FITC/PI双染分析不同浓度枸杞子寡糖诱导的HepG2细胞凋亡及凋亡百分率结果示意图。误差线代表SD，n＝3个独立实验，***P＜0.001vs.对照。其中(a)对照(CON)；(b)4mg/mL；(c)8mg/mL；(d)16mg/mL；(e)凋亡百分率。
图4为LBOS-20各纯化部位(LBOS-20-1，蔗糖；LBOS-20-2，蜜二糖；LBOS-20-3，蔗果三糖；LBOS-20-4，棉子糖；LBOS-20-5，蔗果四糖；LBOS-20-6，蔗果五糖；LBOS-20-7，蔗果六糖)不同浓度梯度(400，200，100，50，25，0μg/mL)对HepG2细胞活力影响结果示意图。***p＜0.001；**p＜0.005；*p＜0.01表示与0μg/mL组显著不同。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何物质或材料，但本文描述了优选的物质或材料。
正如背景技术部分所描述的，现有上市的抗肿瘤药物存在严重的不良反应、毒性较大、药物作用机制较为单一的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种枸杞子寡糖在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
本发明的术语“食品”、“保健品”、“食物产品”、“保健产品”、“保健组合物”或“食物组合物”的含义是期望被动物(包括人)摄入并向该动物提供营养或保健作用的产品或组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含枸杞子寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子为柱筒枸杞、柔茎枸杞、黑果枸杞、截萼枸杞和/或宁夏枸杞的干燥成熟果实。
本发明的“枸杞子”包含但不限于枸杞属植物中上述枸杞子品种的栽培品及其同属植物近似种的干燥成熟果实。枸杞子品种之间相互近似，均可适用于本发明的技术方案。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子的产地为宁夏、甘肃、内蒙古、新疆和/或青海。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖由2～6个单糖单元通过糖苷键结合而成。
在本发明中，个数、浓度或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“2～6”，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数例如2、3、4、5和6，且在上述数值范围内均能实现本发明的技术效果。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖由葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖通过糖苷键结合而成。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖选自以下的一种或多种：蜜二糖、棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖为蔗果四糖、蔗果五糖和/或蔗果六糖。
在一种优选的实施方式中，该肿瘤为肝脏良性肿瘤或肝脏恶性肿瘤。
本发明的术语“肝脏恶性肿瘤”即肝癌，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。
在一种优选的实施方式中，该肿瘤的细胞为HepG2细胞。
本发明的术语“HepG2细胞”分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。HepG2细胞广泛应用于遗传毒理学试验、外源性生物性异物的细胞毒性、乙型肝炎病毒感染机制、病毒培养等方面的研究。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的凋亡而发挥作用。
在一种优选的实施方式中，该枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的早期凋亡和晚期凋亡而发挥作用。
在一种优选的实施方式中，该组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
在一种优选的实施方式中，该组合物被配制成口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。
在一种优选的实施方式中，该口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂。
在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。
本发明所涉及的辅料包括但不限于以下所列举的这些。
举例而言，崩解剂选自羟甲基淀粉钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙甲纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮中的一种或几种；稳定剂选自聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚山梨酯80中的一种或几种；稀释剂选自淀粉、预胶化淀粉、乳糖、糊精、微晶纤维素、甘露醇、山梨糖醇、硫酸钙、硫酸氢钙中的一种或几种；粘合剂选自淀粉浆、羟甲基纤维素、聚维酮、明胶、聚乙二醇中的一种或几种；乳化剂选自卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯、阿拉伯胶中的一种或几种。
在一种优选的实施方式中，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。
在一种优选的实施方式中，该附加治疗剂为抗癌药。
在一种优选的实施方式中，该抗癌药为抗肝癌药。
在一种优选的实施方式中，该抗肝癌药选自以下的一种或多种：索拉非尼、瑞戈菲尼、乐伐替尼、纳武单抗、卡博替尼和雷莫芦单抗。
本发明所要求保护的抗肝癌药不限于上述所列举的抗肝癌药，还可包括其他类型的抗肝癌药、其他来源的生物多糖以及中药有效成分等。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述枸杞子寡糖，用于预防或治疗受试者中的肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述枸杞子寡糖的组合物，用于预防或治疗受试者中的肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的肿瘤的方法，包括向该受试者施用有效量的上述枸杞子寡糖或包含上述枸杞子寡糖的组合物。
在本发明中，术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表肿瘤模型的受试者。优选地，所述受试者是人。这样的受试者们典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述枸杞子寡糖或包含上述枸杞子寡糖的组合物来预防或治疗的病症。
本发明所用的上述枸杞子寡糖或包含上述枸杞子寡糖的组合物的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或预防效果。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、肿瘤的类型、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。“有效量”具体指的是向所治疗的受试者赋予治疗作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述枸杞子寡糖或包含上述枸杞子寡糖的组合物的量。
根据本发明的另一个方面，提供了一种枸杞子寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：称取适量的枸杞子药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，以枸杞子生药材质量计，配成50～150mg/mL水溶液，充分溶解，涡旋混匀后离心，吸取上清液，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱，先蒸馏水洗脱，除去绝大部分单糖成分和无机盐等杂质，然后用约50％甲醇溶液洗脱出寡糖类成分，约50％甲醇洗脱液水浴氮吹吹干，残余物加水溶解后离心，取上清液干燥后得到枸杞子寡糖。
在一种优选的实施方式中，该方法的步骤包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：
[1]将该枸杞子药材进行粉碎；
[2]将粉碎后的该枸杞子药材过60～100目筛，例如80目筛；
[3]该水为蒸馏水或去离子水；
[4]该温度为50℃～100℃，优选为70℃～90℃，更优选为77℃～85℃，例如约81.3℃；
[5]该加热提取的操作重复2～4次，例如2次；
[6]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为10～60倍量，更优选为15～60倍量，特别优选为20～40倍量，尤其优选为23～27倍量，例如约25倍量；
[7]该加热提取的时间为0.5～10小时，优选为1～5小时，更优选为1～1.15小时，例如约65min；
[8]该离心的条件为在6000rpm～2000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在8000rpm～15000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约12000rpm转速下离心约10分钟。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
1实验仪器与材料
1.1试剂与材料
DMEM培养基(GIBCO，美国)
RPMI 1640培养基(GIBCO，美国)
0.25％胰酶-EDTA(GIBCO，美国)
胎牛血清(GIBCO，美国)
DPBS缓冲液(GIBCO，美国)
细胞孔板(科宁，CORNING，美国)
细胞培养皿(赛默飞，Thermo Fisher Scientific，美国)
二甲基亚砜(卡迈舒，Amresco，美国)
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(上海翊圣生物科技有限公司，中国)
双抗(青霉素-链霉素，Penicillin-Streptomycin，P/S)(GIBCO，美国)
Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，中国)
Hoechst 33258(上海翊圣生物科技有限公司，中国)
1.2仪器与设备
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，中国)
台式离心机(上海菲怡尔分析仪器有限公司，中国)
冷冻干燥机(Labconco，美国)
恒温水浴锅(上海智城分析仪器有限公司，中国)
CO2细胞培养箱(艾本德，Eppendorf，美国)
超净台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)
低温高速离心机(艾本德，Eppendorf，美国)
酶标仪(美谷分子仪器，Molecular Devices，美国)
移液枪(艾本德，Eppendorf，美国)
倒置荧光显微镜(奥林巴斯，Olympus Corporation，日本)
涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司，中国)
液氮罐(上海隆拓仪器设备，中国)
MLS-3780SANYO高压灭菌锅(三洋，SANYO，日本)
2实验方法
2.1枸杞子寡糖样品制备
精密称定S5(甘肃酒泉市瓜州县布沙河乡民和村)批次枸杞子样品1g(过80目筛)，平行三份，置于圆底烧瓶中，加入纯净水25mL，81.3℃水浴加热回流65min，冷却后过滤，药渣加入25mL纯净水，81.3℃水浴加热回流65min，冷却后过滤，二次滤液合并转移至100mL容量瓶中，加纯净水定容至刻度线，摇匀，即得供试样品溶液。
CNWBOND Carbon-GCB Cartridge SPE小柱活化：取石墨化碳SPE小柱，依次用水、甲醇、水各5mL进行冲洗活化。
将上述供试品溶液，以枸杞子生药材质量计，配成100mg/mL水溶液，充分溶解，涡旋混匀后，12000rpm离心10min，小心吸取上清液1mL，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱。用5mL蒸馏水洗脱，除去绝大部分单糖成分和无机盐等杂质，然后用5mL 50％甲醇溶液洗脱寡糖类成分，甲醇洗脱液50℃水浴氮吹吹干，残余物加0.2mL超纯水溶解，12000rpm离心10min，取上清液得到枸杞子寡糖样品溶液，干燥后加入适量DPBS缓冲液，配成500mg/mL(浓度以对应生药材质量计算)母液，-20℃保存备用。加药前，以完全培养基稀释至不同浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2.2枸杞子寡糖的分离纯化
枸杞子中药材经过水提、醇沉、浓缩冻干后，得到枸杞子总寡糖，将枸杞子总寡糖首先采用活性炭-硅藻土柱层析法分离，通过不同浓度乙醇溶液洗脱将枸杞子总寡糖进行初步分级，得到3组级分分别为：LBOS-W、LBOS-20和LBOS-50。得率分别为3.17％、0.98％和0.42％，并采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，以RID示差检测器进行在线检测，进一步纯化LBOS-20，得到LBOS-20-1，蔗糖；LBOS-20-2，蜜二糖；LBOS-20-3，蔗果三糖；LBOS-20-4，棉子糖；LBOS-20-5，蔗果四糖；LBOS-20-6，蔗果五糖；LBOS-20-7，蔗果六糖。
上述所列举的枸杞子寡糖纯品还可来源于商业购买。
2.3细胞培养基本操作
细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中小心取出，并立即将其置于37℃无菌水浴锅中，轻轻摇晃，使其快速融化，75％酒精进行消毒后，在超净台上将冻存管内的细胞转移到15mL离心管中，并加入提前37℃温浴的DMEM完全培养基2mL，轻轻吹打混匀后，800rpm离心4min，将后上清液吸弃加入1mL完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取细胞液转移至放有5mL完全培养基的细胞培养皿中，十字法混匀，放入37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，并于第二日更换新的完全培养基。
细胞传代：在倒置显微镜下观察细胞生长状态，当观察到细胞生长至80％左右即可进行传代。小心吸去细胞培养皿中的培养基，加入预热30min的DPBS缓冲液2mL轻轻清洗两次，加入1mL的胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养皿底部，放入细胞培养箱中消化2min，取出，倒置显微镜下观察细胞状态变圆时，移入超净台，加入2mL完全培养基终止消化，1mL移液枪轻轻吹打使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心4min，吸弃上清液，加入3mL完全培养基将细胞轻轻吹打均匀，分别加入3个已加入5mL完全培养基的细胞培养皿中，十字法混匀，置于细胞培养箱中培养。
细胞冻存：倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞状态良好并且生长至融合比例80％左右即可进行冻存。小心吸去培养皿中的培养基，加入预热30min的DPBS缓冲液轻轻清洗两次，加入1mL的胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养皿底部，放入细胞培养箱中消化2min，取出，倒置显微镜下观察细胞状态变圆时，移入超净台，加入2mL完全培养基终止消化，1mL移液枪轻轻吹打使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心4min，吸弃上清液，加入3mL细胞冻存液重悬细胞。分装至细胞冻存管中，标记好细胞名称，代数以及日期，置于细胞梯度降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐中保存。
2.4细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测LBOS对正常肝细胞L02细胞活力影响
将生长至对数期的L02配置成6×104个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。小心吸弃培养基，给药组加入浓度为100、80、60、40、20mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)。空白对照组加入相同体积RPMI1640完全培养基，放入细胞培养箱中分别继续培养24、48、72h。每孔加入10μL CCK-8溶液，放入培养箱中孵育30min，取出于多功能酶标仪检测450nm的吸光度，以公式：细胞存活率％＝[给药组(OD)—空白组(OD)]/[对照组(OD)—空白组(OD)]×100％，计算L02细胞的细胞存活率。
2.5细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测LBOS对肝癌细胞HepG2细胞活力影响
将生长至对数期的HepG2配置成5×104个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。小心吸弃培养基，给药组加入浓度为40、20、10、5、2.5mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)。空白对照组加入相同体积DMEM完全培养基，放入细胞培养箱中分别继续培养24、48、72h。每孔加入10μL CCK-8溶液，放入培养箱中孵育30min，取出于多功能酶标仪检测450nm的吸光度，以公式：细胞存活率％＝[给药组(OD)—空白组(OD)]/[对照组(OD)—空白组(OD)]×100％，计算HepG2细胞的细胞存活率。
2.6 Hoechst 33258染色分析
①将生长至对数期的HepG2配置成2×105个细胞/mL的细胞悬液，按照每孔2mL加入6孔板中，放入细胞培养箱中培养过夜。
②小心吸弃培养基，给药组每孔加入浓度为16、8、4mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)，空白对照组加入相同体积DMEM完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养48h。
③小心吸弃培养基，缓慢加入预冷的PBS清洗两次后，加入1mL预冷的75％乙醇溶液，置于冰箱4℃固定过夜。
④小心吸弃75％乙醇溶液，缓慢加入预冷的PBS小心清洗2-3次，加入2μg/mL的Hoechst 33258染色液0.5mL，4℃避光染色10min。
⑤小心吸去染色液，用提前预冷的PBS小心洗涤2遍，加入抗荧光淬灭封片液，于荧光倒置显微镜下检测观察，拍照保存。
2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
①将生长至对数期的HepG2配置成3×105个细胞/mL的细胞悬液，按照每孔2mL加入6孔板中，放入细胞培养箱中培养过夜。
②小心吸弃培养基，给药组每孔加入浓度为16、8、4mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)，空白对照组加入相同体积DMEM完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养48h。
③小心吸弃培养基，缓慢加入1mL PBS清洗2次，洗去残余培养基后，每孔加入0.5mL不含EDTA的0.25％胰蛋白酶，置于细胞培养箱中消化至显微镜下观察细胞变圆后，加入1mL DMEM完全培养基终止消化，小心吹打收集细胞，转入15mL离心管中，800rpm离心4min，预冷的PBS轻轻重悬，清洗两次。
④小心吸去洗涤液，加入500μL预冷的binding buffer重悬细胞，加入5μLAnnexin V-FITC混匀，室温避光孵育10min后，再加入10μL PI染色液，轻轻混匀，避光孵育5min。立即用流式细胞仪检测分析，并于1h内检测完毕。
2.8 LBOS-20各纯化样品对HepG2细胞活力影响
精密称定LBOS-20各纯化样品约10mg左右，加入一定量DPBS缓冲液，配成20mg/mL母液，-20℃保存备用。加药前，以DMEM完全培养基稀释至不同浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
生长至对数期的HepG2配置成5×104个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。小心吸弃培养基，给药组加入浓度为400、200、100、50、25μg/mL的LBOS-20各纯化样品。空白对照组加入相同体积DMEM完全培养基，放入细胞培养箱中分别继续培养24、48h。每孔加入10μL CCK-8溶液，放入培养箱中孵育30min，于多功能酶标仪检测450nm的吸光度，并计算HepG2细胞的细胞存活率。
2.9统计方法
实验数据中的计量资料以均数±标准差表示，采用GraphpadPrimer 8.0中的One-way ANOVA进行统计分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
3实验结果
3.1 LBOS对正常肝细胞LO2细胞活力影响
为检测LBOS对正常肝细胞LO2细胞的活力影响，加入浓度为100、80、60、40、20mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)分别孵育24h、48h、72h。通过CCK-8实验检测得到不同浓度LBOS作用LO2细胞不同时间的细胞存活率。结果如图1所示：与空白对照组相比，LBOS对L02细胞活力有一定的抑制作用，并有一定的剂量依赖性。高浓度的LBOS随着作用时间的增加，抑制作用明显增强，随着LBOS浓度的降低，作用时间造成的L02细胞活力差异逐渐减小。通过CCK-8实验结果可知，LBOS作用L02细胞24h、48h、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为79.56、70.27、62.60mg/mL(LBOS浓度以对应生药材质量计算)。
3.2 LBOS对肝癌细胞HepG2细胞活力影响
为检测LBOS对肝癌细胞HepG2细胞活力影响，加入浓度为40、20、10、5、2.5mg/mL的LBOS溶液(LBOS浓度以对应生药材质量计算)分别孵育24h、48h、72h。通过CCK-8实验检测得到不同浓度LBOS作用HepG2细胞不同时间的细胞存活率。结果如图2所示：与空白对照组相比，LBOS对HepG2细胞活力有明显的抑制作用，并有剂量依赖性。相同浓度的LBOS作用不同时间条件下，作用48h、72h的细胞存活率明显低于作用24h的HepG2细胞存活率。通过CCK-8实验结果可知，LBOS作用HepG2细胞24h、48h、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为16.27、7.00、6.75mg/mL(LBOS浓度以对应生药材质量计算)，明显低于对正常肝细胞L02的细胞活力的影响，说明肝癌细胞HepG2对LBOS的敏感性明显强于人正常肝细胞L02。
3.3 LBOS诱导HepG2细胞凋亡的形态学影响
Hoechst 33258是一种可以穿过细胞膜，与DNA双链的小沟结合的非嵌入性蓝色荧光染料，可对正常细胞和凋亡细胞染色。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst 33258的摄取增多，并且由于细胞凋亡时染色体固缩，Hoechst 33258结合增强而产生亮蓝色荧光，正常细胞只呈现微弱的蓝色荧光，死细胞不被染色，因此常被用来检测细胞凋亡，评价细胞凋亡形态学特征。本发明中，使用Hoechst 33258荧光染料，利用倒置荧光显微镜观察不同浓度的枸杞子寡糖作用HepG2细胞48h的细胞形态变化，结果显示：与对照组相比，给药组视野中细胞数量明显减少，枸杞子寡糖导致的HepG2细胞染色体固缩呈现的亮蓝色荧光增加，出现凋亡的形态学特征，且随着枸杞子寡糖浓度的不断增加，形态变化越加明显。初步可以证实，枸杞子寡糖可以促进HepG2细胞的凋亡。
3.4流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染分析
在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS由细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红，可用来区分早期凋亡细胞和坏死或晚期凋亡细胞。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。流式细胞仪分析枸杞子寡糖作用48h的HepG2细胞的Annexin V-FITC/PI双染结果如图3所示。其中Q1、Q2、Q3、Q4象限分别代表机械死亡细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和正常细胞。与空白对照组相比，LBOS给药组的HepG2细胞早期凋亡和晚期凋亡率均明显增加，且差异有统计学意义(P＜0.001)，说明LBOS能显著促进HepG2细胞的凋亡。
3.5 LBOS-20各纯化样品对对HepG2细胞活力影响
LBOS-20各纯化部位寡糖，以相同的浓度梯度(400、200、100、50、25、0μg/mL)分别作用于HepG2细胞24h、48h，对HepG2细胞活力影响如图4所示：LBOS-20-1(峰1，蔗糖)在24h和48h均与空白组之间的差异没有统计学意义。除LBOS-20-1外，其余纯化部位在400μg/mL时均表现出良好的抑制HepG2细胞活力的作用，且相较于作用24h，作用48h的抑制作用更为明显。但在25μg/mL条件下，作用48h的抑制HepG2细胞活力作用相较于作用24h相对较弱。其中LBOS-20-5(峰14，蔗果四糖)、LBOS-20-6(峰20，蔗果五糖)和LBOS-20-7(峰21，蔗果六糖)在24h以及48h对HepG2细胞活力的抑制作用均较强，与LBOS-20-2(峰5，蜜二糖)、LBOS-20-3(峰10，蔗果三糖)和LBOS-20-4(峰11，棉子糖)组相比，在400μg/mL和200μg/mL条件下，对HepG2细胞活力的抑制作用更强，差异具有统计学意义(P＜0.001)，说明LBOS-20-5、LBOS-20-6和LBOS-20-7在200μg/mL以上条件下对HepG2细胞活力的抑制作用更为显著。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (15)

1.枸杞子寡糖在制备用于预防和/或治疗肝癌的药品中的用途，其特征在于，所述枸杞子寡糖通过包括以下步骤的制备方法进行制备：称取枸杞子药材，加入水在50℃～100℃的温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，以枸杞子生药材质量计，配成50～150mg/mL水溶液，充分溶解，涡旋混匀后离心，吸取上清液，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱，先蒸馏水洗脱，然后用50％甲醇溶液洗脱出寡糖类成分，50％甲醇洗脱液水浴氮吹吹干，残余物加水溶解后离心，取上清液干燥后得到枸杞子寡糖。
2.一种包含枸杞子寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药品中的用途，其特征在于，所述枸杞子寡糖通过包括以下步骤的制备方法进行制备：称取枸杞子药材，加入水在50℃～100℃的温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，以枸杞子生药材质量计，配成50～150mg/mL水溶液，充分溶解，涡旋混匀后离心，吸取上清液，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱，先蒸馏水洗脱，然后用50％甲醇溶液洗脱出寡糖类成分，50％甲醇洗脱液水浴氮吹吹干，残余物加水溶解后离心，取上清液干燥后得到枸杞子寡糖。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述枸杞子为柱筒枸杞、柔茎枸杞、截萼枸杞和/或宁夏枸杞的干燥成熟果实。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述枸杞子的产地为宁夏、甘肃、内蒙古、新疆和/或青海。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述肝癌的细胞为HepG2细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的凋亡而发挥作用。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述枸杞子寡糖通过促进所述HepG2细胞的早期凋亡和晚期凋亡而发挥作用。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述组合物被配制成口服制剂或注射制剂。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述组合物被配制成冻干粉针剂。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂。
13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。
14.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包括一种或多种抗肝癌药。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述抗肝癌药选自以下的一种或多种：索拉非尼、瑞戈菲尼、乐伐替尼、纳武单抗、卡博替尼和雷莫芦单抗。
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枸杞多糖诱导Ｔ细胞增殖和对肝癌细胞的抑制作用;袁征等;《中国实用医药》;第5卷(第4期);第21-22页 *

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