CN110882236B

CN110882236B - 一种抗肿瘤组合物、治疗癌症的药物制剂及其应用

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Publication number: CN110882236B
Application number: CN201911176718.5A
Authority: CN
Inventors: 钱碧云; 张奇; 朱滕滕; 冯铁男; 杨雨晴; 钱颖; 谢丽
Original assignee: Shanghai Tong Ren Hospital
Current assignee: Shanghai Tong Ren Hospital
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN110882236A

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤组合物、治疗癌症的药物制剂及其应用，所述抗肿瘤组合物包括含有治疗有效量的d‑柠檬烯，以及用于增强d‑柠檬烯治疗效果的月桂烯、芳樟醇、癸醛和3‑蒈烯。与现有技术相比，本发明的抗肿瘤组合物以及对应药物制剂对肿瘤细胞(特别是肺癌细胞)具有明显的增殖抑制活性，并抑制细胞的迁移与侵袭，影响癌细胞相关蛋白与基因水平的表达从而促进肿瘤细胞凋亡等。

Description

一种抗肿瘤组合物、治疗癌症的药物制剂及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，涉及一种抗肿瘤组合物、治疗癌症的药物制剂及其应用。

背景技术

癌症是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。恶性肿瘤生长速度快，呈侵润性生长，易发生出血、坏死、溃疡，并常伴有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及严重的脏器功能受损，最终造成患者死亡。我国癌症发病形式严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。目前，从植物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物，已成为国内外抗肿瘤药物研究的重点。

柠檬烯(D-limonene)，又称苎烯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯、对

-1,8-二烯、白千层萜，存在于柠檬草油、松针油、香草油、松节油中，有新鲜橙子香气及柠檬样香气。具有良好的镇咳、祛痰、抑菌作用，复方柠檬烯在临床上可用于利胆、溶石、促进消化液分泌和排除肠内积气。月桂烯(Myrcene)亦称香叶烯，A月桂烯在自然界中的存在较少，在香料工业中经常用的是B月桂烯。B月桂烯为无色或淡黄色液体，具有清淡的香脂香气。不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂中。在肉桂油、枫茅油、柏木油、云杉油、松节油、柠檬草油、柠檬油等中均有存在。

芳樟醇(Linalool)，分子式为C₁₀H₁₈O，属于链状萜烯醇类，有α-和β-两种异构体。无色液体，具有抗菌、镇静等生物活性。

癸醛(Decanal)又称十碳醛、正癸醛。常用于有机合成及调配食用香料，存在于柑橘、柠檬、西红柿、草莓中。

3-蒈烯(3-carene)是精油中单萜烯的主要组分，具有强烈的松木样香气，可应用于多种食用香精中，亦可作为合成香料的原料。

现有很多文献中均记载了将d-柠檬烯或单独或与其他增效成分复合用于治疗癌症，如中国专利CN106890140A公开了一种d-柠檬烯抗癌增效组合物及其制备方法，其中，d-柠檬烯抗癌增效组合物包括，0.5～10％的d-柠檬烯，0.1-5‰的壳寡糖，0.5-10％的植物源表面活性剂。但是，目前未见以d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的混合物为原料制备药物剂型并用于治疗肿瘤疾病的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种抗肿瘤组合物、治疗癌症的药物制剂及其应用，其表现在：对肺癌细胞具有明显的增殖抑制活性，并抑制细胞的迁移与侵袭，影响肺癌细胞相关蛋白与基因水平的表达从而促进肿瘤细胞凋亡。因此该组合物可用于抗肺癌临床药物或肿瘤化学预防药物的开发和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一在于提供了一种抗肿瘤组合物，包括含有治疗有效量的d-柠檬烯，以及用于增强d-柠檬烯治疗效果的月桂烯、芳樟醇、癸醛和3-蒈烯。

进一步的，d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛和3-蒈烯的体积配比为(80-99)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。

更进一步的，d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的体积配比为96：1：1：1：1。

本发明的技术方案之二在于提供了一种治疗癌症的药物制剂，包括治疗有效量的如上述的抗肿瘤组合物和药学上可接受的药物赋形剂。

进一步的，药物赋形剂可包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂等，以将所述抗肿瘤组合物制成各种制剂。

进一步的，其剂型为口服制剂或非肠道给药制剂。

更进一步的，所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂中的任一种。

更进一步的，所述非肠道给药制剂为注射液、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型中的任一种。

本发明的技术方案之三在于提供了一种上述抗肿瘤组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

进一步的，所述癌症为肺癌。

本发明的技术方案之四在于提供了一种上述药物制剂在制备治疗癌症的药物中的应用。进一步的，所述癌症优选为肺癌。

本发明上述技术方案中，抗肿瘤组合物中，除含有d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯外，还可以含有其它抗肿瘤药物，譬如为顺铂和/或雷帕霉素。也可以添加具有抗肿瘤活性的黄酮或生物碱等成分。

附图说明

图1为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的体外增殖抑制作用；

图2为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞H1975的体外增殖抑制作用；

图3为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549、H1975的侵袭抑制作用；

图4为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的侵袭抑制结果；

图5为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的侵袭抑制结果；

图6为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549、H1975的迁移抑制作用；

图7为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的迁移抑制结果；

图8为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的迁移抑制结果；

图9为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549、H1975的细胞克隆抑制作用；

图10为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的细胞克隆抑制结果；

图11为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的细胞克隆抑制结果；

图12为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549、H1975的促凋亡作用；

图13为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞H1975的促凋亡结果；

图14为柠檬烯与组合物对肿瘤细胞A549的促凋亡结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中：所用A549、H1975细胞购与中国科学院上海生命科学研究院保藏中心，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

主要溶液的配置(所有溶液配置用水均为超纯水)：

(1)细胞培养基(完全培养基)：DMEM培养基(高糖无血清)+10％FBS(胎牛血清)+1％PIS(双抗)，即体积比为89：10：1；封口膜封口，4℃保存备用。

(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：KH₂PO₄ 0.20g、Na₂HPO₄.12H₂O 3.56g、NaCl 8.00g、KCl0.20g，加超纯水至1000ml，调PH至7.2～7.4，高压灭菌4℃保存。

(3)抗肿瘤组合物：将d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯以一定比例混合后溶于DMSO，封口膜封口，4℃保存。

而其余未具体说明的原料、工艺、仪器以及操作方法等均为本领域的常规市售原料或常规技术。

实施例1：

抗肿瘤组合物对肿瘤细胞的增殖抑制效果研究

1.1实验方法

(1)细胞培养

1)细胞复苏

①从-80℃冰箱中取出分别装有A549、H1975细胞的冻存管，立即投入37℃温水中，并摇动，使其快速融化。

②待冻存液完全溶解，吸出细胞悬液，加入到细胞培养基中，吹打均匀，1000rpm*3min离心；

③弃去上清液，加入10ml培养基，吹打细胞，移入10mm培养皿，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

2)细胞培养

①细胞生长于含有10％FBS的DMEM培养基中，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养；2天换液传代一次，实验时取对数生长期细胞；

②细胞传代：待细胞长满培养皿时，弃去培养液，PBS冲洗一次，向培养皿中加入胰蛋白酶1ml，摇动培养皿，使胰酶均匀分布；放入培养箱2min，加入完全培养基终止消化，吹打细胞，分装至3个培养皿中。

(2)检测组合物对肿瘤细胞的增殖抑制效果

1)将对数生长期细胞用胰酶消化后，用完全培养基终止消化并稀释至80000细胞/ml，将细胞加入96孔板中，每孔100μl；放入培养箱培养。

2)培养24h后将96孔板取出，加入含药培养基，并设置阴性对照组，每个给药组设三复孔，含药培养基的配置方法为：

①将DMSO用培养基稀释为含1％DMSO的培养基溶液。

②将d-柠檬烯用DMSO进行稀释，使d-柠檬烯在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含d-柠檬烯的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使d-柠檬烯在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。

③将月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照1：1：1：1进行混合，为混合物A；混合后加入DMSO稀释，使混合物A在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基A。

④将d-柠檬烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照96：1：1：1进行混合，为混合物B；混合后加入DMSO稀释，使该组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基B。

⑤将d-柠檬烯、月桂烯、癸醛、3-蒈烯按照96：1：1：1进行混合，为混合物C；混合后加入DMSO稀释，使该组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基C。

⑥将d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、3-蒈烯按照96：1：1：1进行混合，为混合物D；混合后加入DMSO稀释，使该组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基D。

⑦将d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛按照96：1：1：1进行混合，为混合物E；混合后加入DMSO稀释，使该组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基E。

⑧d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照96：1：1：1：1进行混合，为混合物F；混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％；为含药培养基F。

加入含药培养基24h后，96孔板每孔加入CCK-8 10μl，孵育2h，孵育完成后检测各孔450nm处吸光值OD值；

3)计算各组对细胞的增殖抑制情况

细胞存活率(％)＝(OD_处理组—OD_{阴性对照组})/(OD_{阳性对照组}—OD_{阴性对照组})*100％

1.2实验结果：

如图1、2所示柠檬烯及柠檬烯与月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯分别组合的配合物均具有对肿瘤细胞A549或H1975的增殖抑制作用。但各给药组只有含有柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的组合物对肿瘤细胞的增殖抑制效果(A549为30.6％，H1975为33.8％)相对于单独柠檬烯给药(A549为49.1％，H1975为49.3％)的提升最为明显，且具有统计学意义；由于各组给药总浓度相同，可以推测出柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯针对肿瘤细胞的增殖抑制作用具有协同性，其组成的混合物可以有效提升柠檬烯的抗肿瘤效果。

实施例2：

抗肿瘤组合物对细胞侵袭能力的影响

2.1实验方法

(1)包被基底膜

1)用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶。

2)取100μl稀释胶加到24-well transwell上室中。

3)37℃孵育transwell 3h。

4)用无血清培养基轻洗凝胶

(2)准备细胞悬液和小室

1)消化对数生长期的细胞，用培养基洗3遍。

2)用含药培养基重悬细胞为5*10⁵cells/ml，含药培养基配置方法为：

①将DMSO用培养基稀释为含1％DMSO的培养基溶液。

③d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照80：5：5：5：5进行混合，混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。并设置阴性对照。

3)上室加入200μl细胞悬液。

4)下室中加入600μl完全培养基。

(3)孵育及染色、计数

1)将处理后的24孔板放入培养箱培养24h。

2)将24孔板取出，拿出transwell小室，用棉签擦去上室的非侵袭细胞

3)移去transwel小室，倒置，风干。

4)取新24孔板并加入500μl/孔的0.1％结晶紫，将transwell小室置于其中，使膜浸没在结晶紫中，30min后取出小室，并用PBS清洗。

5)显微镜下观察并计数细胞量

2.2实验结果

肿瘤细胞可以降解基质胶，并进行迁移；如图3、图4、图5所示柠檬烯及柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的组合物都具有抑制细胞侵袭的能力，柠檬烯及组合物组的肿瘤细胞侵袭至transwell下室的细胞明显较Control组及DMSO组较少；且组合物组的细胞侵袭能力较柠檬烯组明显较弱，从侵袭细胞的数据显示其差异具有统计学意义。

上述结果表明柠檬烯具有抑制肿瘤细胞侵袭的能力，而与月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯与柠檬烯配成的组合物能有效增强柠檬烯的抗肿瘤细胞侵袭能力。

实施例3：

组合物对细胞迁移能力的影响：

3.1实验方法

(1)将细胞培养至对数生长期。

(2)用胰酶消化细胞，1000rpm/min离心3分钟。

(3)用培养基吹打细胞，铺入6孔板，使细胞铺满整个孔板。

(4)24小时后用枪头垂直划痕，并用PBS清洗6孔板3次。

(5)加入含药的无血清培养基培养细胞，并在0h、24h拍照记录细胞划痕。

无血清培养基的配置方法如下：

①将DMSO用培养基稀释为含1％DMSO的培养基溶液。

③d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照92：2：2：2：2进行混合，混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。

并设置阴性对照。

3.2实验结果

肿瘤细胞A549、H1975具有细胞迁移能力；如图6、图7、图8所示柠檬烯及柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的组合物都具有抑制细胞迁移的能力，柠檬烯及组合物组的划痕愈合程度明显较Control组及DMSO组较低；且组合物组的细胞迁移能力较柠檬烯组明显较弱，且细胞划痕愈合的结果显示其差异具有统计学意义。

上述结果表明柠檬烯具有抑制肿瘤细胞迁移的能力，而与月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯与柠檬烯配成的组合物能有效增强柠檬烯的抗肿瘤细胞迁移的能力。

实施例4：

组合物对细胞克隆能力的影响：

4.1实验方法

(1)将细胞培养至对数生长期。

(2)用胰酶消化细胞，1000rpm/min离心3分钟。

(3)用培养基吹打细胞，铺入30mm细胞培养皿，使细胞密度为300细胞/孔板。

(4)加入含药的培养基培养细胞，并在5day后加入结晶紫染色。

(5)染色后进行拍照，记录细胞集团数量。

含药培养基的配置方法如下：

①将DMSO用完全培养基稀释为含1％DMSO的培养基溶液。

②将d-柠檬烯用DMSO进行稀释，使d-柠檬烯在DMSO中的体积百分比为0.025％，将含d-柠檬烯的DMSO溶液用含10％血清的培养基稀释100倍，使d-柠檬烯在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。

③d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照88：3：3：3：3进行混合，混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用含10％血清的培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。

并设置阴性对照。

4.2实验结果

如图9、图10、图11所示柠檬烯及柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的组合物都具有抑制细胞克隆形成细胞集落的能力；且组合物组的抑制细胞形成细胞集落的能力较柠檬烯组明显较强，结果显示其差异具有统计学意义。

上述结果表明柠檬烯具有抑制肿瘤细胞形成细胞集落的能力，而月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯与柠檬烯配成的组合物能有效增强柠檬烯的抗肿瘤细胞形成集落能力。

实施例5：

组合物对细胞凋亡的影响：

5.1实验方法

(1)将细胞培养至对数生长期。

(2)用胰酶消化细胞，1000rpm/min离心3分钟。

(3)用培养基吹打细胞，铺入六孔板。

(4)加入含药的培养基培养细胞，并加入含药培养基。

(5)24h后胰酶消化细胞，取1*10^5细胞加入100μl Binding Buffer(结合缓冲液)，再加入5μl FITC Annexin和5μl PI染料。

(6)孵育15min后，加入400μl Binding Buffer，使用流式细胞仪对各组细胞的凋亡程度进行检测。

含药培养基的配置方法如下：

①将DMSO用完全培养基稀释为含1％(体积分数)DMSO的培养基溶液。

②将d-柠檬烯用DMSO进行稀释，使d-柠檬烯在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含d-柠檬烯的DMSO溶液用含10％血清的培养基稀释100倍，使d-柠檬烯在含药培养基中的体积百分比为0.00125％。

③d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照60：10：10：10：10进行混合，混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用含10％血清的培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％，为含药培养基A。

④d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯按照87：3：4：3：3进行混合，混合后加入DMSO稀释，使组合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含该组合物的DMSO溶液用含10％血清的培养基稀释100倍，使其在含药培养基中的体积百分比为0.0025％，为含药培养基B。

并设置阴性对照。

5.2实验结果

如图12(其中，图中Q1-UL区为：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。有少数的晚期凋亡细胞和某些机械损伤的细胞也包含其中；Dead:(AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞；Apoptotic：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞；Live：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞)、图13、图14所示柠檬烯及柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的组合物具有促进细胞凋亡的能力；组合物的促细胞凋亡能力较单独的柠檬烯更强，且组合物组的配比不在所限定的配比范围内时的促细胞凋亡能力较差，结果显示其差异具有统计学意义。

上述结果表明柠檬烯具有促细胞凋亡的能力，而月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯与柠檬烯配成的组合物在所限定的配比范围内能有效增强柠檬烯的促细胞凋亡能力。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括含有治疗有效量的d-柠檬烯，以及用于增强d-柠檬烯治疗效果的月桂烯、芳樟醇、癸醛和3-蒈烯；

d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛和3-蒈烯的体积配比为(80-99)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。

2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤组合物，其特征在于，d-柠檬烯、月桂烯、芳樟醇、癸醛、3-蒈烯的体积配比为96：1：1：1：1。

3.一种治疗癌症的药物制剂，其特征在于，包括治疗有效量的如权利要求1或2所述的抗肿瘤组合物和药学上可接受的药物赋形剂。

4.根据权利要求3所述的一种治疗癌症的药物制剂，其特征在于，其剂型为口服制剂或非肠道给药制剂。

5.根据权利要求4所述的一种治疗癌症的药物制剂，其特征在于，所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂中的任一种。

6.根据权利要求4所述的一种治疗癌症的药物制剂，其特征在于，所述非肠道给药制剂为注射液、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型中的任一种。

7.如权利要求1或2所述的抗肿瘤组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用。

8.如权利要求3所述的药物制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。