KR20150088133A

KR20150088133A - 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 함유하는 인간 중간엽 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20150088133A
Application number: KR1020140008561A
Authority: KR
Inventors: 김고운
Original assignee: 김고운
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2015-07-31
Also published as: KR101565856B1

Abstract

상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 중간엽 줄기세포의 핵심 유지인자 및 항-세포사멸인자의 발현을 증가시켜 인간 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시키므로, 골관절염의 예방 또는 치료를 위한 의약품 및 식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 함유하는 인간 중간엽 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR PROMOTING OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS COMPRISING CORTEX MORI RADICIS EXTRACT, PATRINIA SANICULAEFOLIA EXTRACT OR MIXTURE THEREOF}

본 발명은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골관절염(Osteoarthritis, OA)은 가장 흔한 만성 관절 질환이며, 관절 통증, 기능소실 및 장애의 흔한 요인이다[Arden, N., Nevitt, M.C., Osteoarthritis: epidemiology, Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 20(3), 3-25, (2006)]. 종래 OA에 대한 많은 치료법이 제시되었으나, 이들은 모두 연골 재생 효과를 나타내지 않아 불만족스러운 임상 결과를 나타낸다[Hawker, G.A., et al., Osteoarthritis Cartilage, 19(4), 366-374 (2011)].

한편, 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal stem cell, MSC)는 연골세포, 조골세포 및 지방세포를 포함하여 다양한 세포 유형으로 분화되는 능력을 가지며, 상기 세포들은 골관절염 환자에서 손상된 조직을 재생시키는 데 일정한 역할을 할 수 있을 것으로 전망된다[Murphy, J.M., et al., Arthritis & Rheumatism, 46(3), 704-713 (2002)]. 이러한 중간엽 줄기 세포는 최근에 퇴행성 질환에 대한 치료제로서 이슈가 되고 있다.

MSC는 약간의 면역원성을 가질 때 이식편 대 숙주 질환(GVHD, graft-versus-host disease)의 치료와 같은 재생 치료 및 세포 치료에 사용될 수 있으며[Ozawa, K., et al., Journal of Autoimmunity, 30(3), 121-127 (2008)], 토끼, 래트, 돼지 및 기니피그 등의 동물 모델에서 MSC가 연골원성 복구에 효과를 나타냄이 입증되어 있다. 무릎 관절 내에 주입된 표지된 MSC는 이식하고 1주일 후에도 여전히 연골에 존재하고, 이동하고, 분화하고, 증식한다[Sato, M., et al., Arthritis Research & Therapy, 14(1), R31 (2012)]. 그러나, 이들은 수가 적고 정제방법이 어려워 이식에 적절한 공급원으로서 한계를 갖는다[Tuan, R.S., Arthritis Research & Therapy, 5(1), 32-45 (2003); Tropel, P., et al., Experimental Cell Research, 295(2), 395-406 (2004)].

최근에, 김 등(Kim, et al.)은 마우스 MSC에서 MSC 증식 및 분화를 조절하기 위해 한약재 선별 연구를 수행하였다[Kim, D.R., Doctoral dissertation, KyungHee University, Retrieved from http://www.dcollection.net/handler/khu/000000085280]. 그러나, 인간 OA MSC의 증식 또는 분화에 영향을 끼치는 생약에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

한편, 뽕나무(Morus alba L.)(뽕나무과(Moraceae))의 말린 근피인 상백피(cortex mori radicis, CMR)는 전통적으로 한의학에서 항염증제, 소염제(antiphologistic) 약제 및 이뇨제로서 처방되어온 한약재이다[Chung, K.O., et al., The Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55(12): 1695-1700 (2003)]. CMR은 적응 면역의 활성화, 세포 증식의 조절 및 세포사멸의 유도[Nam, S.Y., et al., Archives of Pharmacal Research, 25(2), 191-196 (2002)]에 의한 항-종양 효과를 갖는 것으로 밝혀져 있고, 또한, 여러 연구들에서 CMR의 추출물이 일산화질소, 도파민 및 산소 글루코스 결핍에 의해 유도된 세포 사멸에 예방 효과를 가짐이 입증되었다.

또한, 마타리 속(genus Patrinia)의 뿌리인 패장(Patrinia saniculaefolia, PS)은 염증 질환의 치료제로서 사용되어 왔다[Choi, E.K., et al., BioChip Journal, 5(3), 246-254 (2011)].

본 발명자들은 골관절염의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 식품에 관하여 예의 연구한 결과, 상백피와 패장이 중간엽 줄기세포의 핵심 유지인자 및 항-세포사멸 인자의 발현을 증가시켜 인간 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시키므로 골관절염의 예방 및 치료에 유용할 것임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 한약을 이용하여 인간 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시킴으로써 골관절염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 식품 조성물을 제공한다.

도 1은 인간 MSC에서 분화 클러스터(cluster of differentiation, CD) 마커의 발현을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 MSC의 골분화를 광현미경으로 분광 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 8은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물의 OCT4 , SOC2 , NANOG, BAK , BAX , 및 BCL2의 상대 mRNA 발현에 대한 효과를 각각 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 상백피(cortex mori radicis, CMR) 추출물, 패장(Patrinia saniculaefolia, PS) 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상백피 및 패장 추출물의 혼합물은, 상백피 추출물 및 패장 추출물을 1: 0.1 내지 10의 중량비, 바람직하게는 1: 1 내지 5의 중량비(예를 들어 1:1 중량비)로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 100중량% 미만, 바람직하게는 0.5중량% 내지 15중량%의 양으로 포함한다.

상기 상백피 추출물 또는 패장 추출물은, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 또는 통상적인 방법에 따라 한약(이하, "생약"으로도 지칭함) 자체를 그대로 또는 세절 또는 분말 형태로 하여, 통상적인 추출 방법, 예를 들면 열수 추출 또는 유기 용매로 추출하여 사용할 수 있다. 추출물 제조시에 한약은 건조한 것, 건조하지 않은 것 또는 이들을 서로 혼합한 상태의 것을 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 상기 추출물을 건조시켜 얻어진 건조 분말, 또는 시판되는 한약 추출물 분말의 혼합물을 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 추출물은, 예를 들어, 건조시킨 한약을 세절한 후, 약 1배 내지 20배 중량(예를 들어, 약 2배 내지 4배 중량)의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 증류수로, 60℃ 내지 100℃의 추출온도에서 약 2시간 내지 2일 동안 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출 또는 환류냉각 추출 등의 추출방법에 의하여 1회 내지 3회 반복하여 추출한 후, 추출물을 여과, 감압농축 또는 동결 건조하여 제조될 수 있다. 상기 유기용매로는 C_1-4저급알콜, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산, 디클로로메탄 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상백피의 껍질 부분 및 패장의 뿌리 부분을 각각 증류수(D.W.)로 추출한 후, 여과, 증발 및 동결 건조를 차례로 수행하여 각각의 추출물을 제조하고, 이렇게 제조된 추출물을 증류수에 희석하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 조성물이 나타내는 것과 동일하거나 유사한 효과를 갖는 것으로 당업계에 알려져 있는 다른 한약의 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 본 발명의 실시예 5에서 확인되는 바와 같이, 중간엽 줄기 세포의 핵심 유지 인자들인 OCT4 , SOX2 및 NANOG, 및 항-세포사멸 인자인 BCL2 등의 발현이 대조군에 비해 높은 수준으로 증가됨을 알 수 있다(도 3 내지 8 참고). 따라서 본 발명의 약학 조성물은 인간 중간엽 줄기 세포의 골 분화를 촉진시킬 수 있으므로 골관절염 등의 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

이러한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 엑스제, 현탁제, 유제, 시럽제, 내용액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 및 패치제와 같은 외용제, 비수성용제, 동결건조제제 및 주사제와 같은 다양한 비경구형 제형의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보조제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제 등의 첨가제를 필요에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.1 내지 10 g의 양, 바람직하게는 1 내지 5 g의 양을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 상기 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 골관절 기능을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함되는 상백피 및 패장 추출물의 중량비 및 제조 방법은 상기 약학적 조성물과 같다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 한약 추출물을 전체 조성물의 0.01 내지 95중량%, 바람직하게는 0.5 내지 15중량%의 양으로 포함한다.

본 발명의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있으며, 골관절 기능 개선을 위한 기타의 천연 또는 합성 물질 및 제품화를 위한 식품학적으로 허용가능한 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물이 건강 음료 형태인 경우, 이러한 건강음료는 100 ㎖를 기준으로 상기 한약 추출물을 0.1 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g의 비율로 함유할 수 있다. 또한, 필수 성분으로서 상기 추출물을 지시된 비율로 함유하는 외에 추가될 수 있는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등) 디사카라이드(예를 들어 말토스, 슈크로스 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 적절히 선택되는 것이 일반적이다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 약칭은 다음과 같다:

OCT4: 옥타머-결합 전사 인자 4(Octamer-binding transcription factor 4)

SOX2: 성별-결정 영역 Y-박스 2(Sex-determining region Y-box 2)

BAK: Bcl-2 동종 길항물질 킬러(Bcl-2 homologous antagonist killer)

BAX: Bcl-2-연관 X 단백질(Bcl-2-associated X protein)

BCL2: B-세포 림프종 2(B-cell lymphoma 2)

FBS: 소 태아 혈청(Fetal bovine serum)

CD: 분화 클러스터(Cluster of diffentiation)

EDTA: 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid)

FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate)

MHC: 주조직적합성 복합체(Major histocompatibility complex)

IgG: 면역글로불린 G(Immunoglobulin G)

RNA: 리보핵산(Ribonucleic acid)

cDNA: 상보성 데옥시리보핵산(Complementary deoxyribonucelic acid)

GAPDH: 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

실시예 1: 시료의 제조

CMR 추출물 및 PS 추출물은 경희 한약물 연구소에서 입수하였다. 상기 추출물은 CMR의 껍질 부분 및 PS의 뿌리 부분을 각각 증류수(D.W.)로 추출하고 여과, 증발 및 동결 건조를 차례로 수행하여 제조된 것을 입수하였다[Choi, E.K., et al., BioChip Journal, 5(3), 246-254 (2011); Kim, K.S., et al., BioChip Journal, 5(4), 333-342 (2011); Yang, H.J., et al., Molecular & Cellular Toxicology, 7(3), 299-310 (2011)]. CMR 및 PS 추출물의 수율은 각각 15% 및 9%이었다. 이렇게 수득한 CMR 및 PS 추출물을 모두 증류수로 1,000 배로 희석하여 시료를 준비하였다[Shin, M.H., BioChip Journal, 6(2), 114-119 (2012)]. 또한, CMR 추출물과 PS 추출물을 1: 1의 중량비로 혼합한 혼합물 시료도 함께 준비하였다.

이렇게 준비한 시료들은 각각 1 ㎍/ml의 양으로 이하 실시예 2에 따라 배양된 MSC 계대 2에서 계대 3까지 1주일 동안 격일로 처리하였다.

실시예 2: 골관절염 환자로부터 MSC의 분리 및 MSC 배양

골관절염 환자의 골수로부터 활액 유래 중간엽 줄기 세포(SF-MSC)를 분리한 다음, 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 식염수(D-PBS)와 섞어 400×g에서 40분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상등액을 제외한 현탁액을 400 ㎛ 체로 여과시켰다.

이렇게 분리한 MSC를 38℃에서 5% CO₂, 가습 하에 10% FBS 및 페니실린 100유닛/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 함유하는 A-DMEM(Advanced-Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다[Park, B.W., et al., Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine, 6(2), 113-124 (2012); Ock, S.A., Jeon, et al., Tissue Engineering: Part C, methods, 16(6), 1481-1491 (2010); Kumar, B.M., et al., Research in Veterinary Science, 93(2), 749-757 (2011)].

실시예 3: 형광 활성화 세포 분류에 의한 세포 표면 마커 분석

상기 실시예 2에서 수득한 MSC를 유세포 분석기(flow cytometry)(FACS Calibur, BD Biosciences, USA)를 사용하여 CD 마커에 대해 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2의 A-DMEM 배양배지에서 90% 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포를 0.25% 트립신 EDTA 용액을 사용하여 수거하고, 10% FBS로 보충한 D-PBS로 2회 세척하였다. 이렇게 수득한 세포를 1차 항체, CD44, CD90, CD105 및 비멘틴(vimentin)과 4℃에서 4% 파라폼알데하이드 용액으로 밤새 고정시키고, CD34 및 CD45에 대한 2차 항체를 38.5℃에서 동일 용액으로 30분 동안 고정시켰다. 1 x 10⁴ 세포를 FACS를 이용하여 분석하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

FACS 분석을 위한 항체에 대한 상세한 정보를 하기 표 1에 나타내었다[Park, B.W., et al., Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine, 6(2), 113-124 (2012); Ock, S.A., et al., Tissue Engineering: Part C, methods, 16(6), 1481-1491 (2010); Kumar, B.M., et al., Research in Veterinary Science, 93(2), 749-757 (2011)].

인간 MSC의 FACS 분석을 위한 항체 목록

명칭	타입	회사	희석률
FITC 마우스 항-인간 CD34	IgG1, k	BD Biosciences, USA	1:100
FITC 래트 항-마우스 CD44	IgG1, k	BD Biosciences, USA	1:100
FITC 마우스 항-인간 CD90	IgG1, k	BD Biosciences, USA	1:100
FITC 마우스 항-인간 CD105	IgG1, k	BD Biosciences, USA	1:100
FITC 마우스 이소타입 대조군	IgG1, k	BD Biosciences, USA	1:100
항-비멘틴	단클론성	SIGMA, USA	1:100
마우스 단클론성 MHC 부류II	IgG2b	SIGMA, USA	1:100
토끼 항-염소	IgG	Jackson Immunoresearch Inc. USA	1:100
토끼 항-마우스	IgG1, k	Jackson Immunoresearch Inc. USA	1:100

도 1에서 보는 바와 같이, MSC 마커인 CD44, CD90, CD105 및 비멘틴은 CD90을 제외하고 본 발명의 분리된 인간 MSC 중에서 상당량 측정된 반면, CD34 및 CD45는 음성으로 검출되었다.

실시예 4: 골 분화

상기 실시예 2에서 수득한 인간 MSC를, 10% FBS, 0.1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 아스코르브산 2-포스페이트 및 10 mM 글리세롤 2-포스페이트를 함유하는 A-DMEM으로 이루어진 골분화 유도 배지에서 3주 동안 38℃에서 5% CO₂, 가습 하에서 배양하여 골형성 분화를 유도하였다.

MSC의 골형성 분화를 확인하기 위해, 본 코사(Von Kossa) 및 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색을 수행하였다[Park, B.W., et al., Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine, 6(2), 113-124 (2012); Ock, S.A., Jeon, B.G., Tissue Engineering: Part C, methods, 16(6), 1481-1491 (2010); Kumar, B.M., et al., Research in Veterinary Science, 93(2), 749-757 (2011)]. 방법은 상기 골분화 유도 배지에서 배양된 MSC를 4℃에서 4% 파라폼알데하이드 중에서 밤새 고정시킨 다음, D.W.로 2회 세척하였다. 이어 2% 알리자린 레드 S 용액 및 5% 질산은을 첨가하고, MSC를 실온에서 30분 동안 배양한 후 D.W.로 4회 세척하였다. 광현미경(Nikon TE300)을 사용하여 분광 분석한 결과를 도 2에 나타내었으며, 칼슘 침적물이 무기질화되었음을 확인할 수 있었다(100x, 스케일바 = 100 ㎛).

실시예 5: mRNA 발현 수준 평가

(1) RNA 분리

RNA 추출 절차는 하이브리드-R(Hybrid-R)^TM(GeneAll Biotechnology, 한국)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 수행하였다. 1 x 10⁷ 세포 당 1 ml의 리보엑스(RiboEX) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양하여 핵단백질 복합체를 완전히 용해시켰다. RiboEXTM 1 ml 당 0.2 ml의 클로로포름을 첨가한 다음, 혼합물을 15초 동안 강하게 진탕시키고 실온에서 2분간 저장하였다. 나노드롭(NanoDrop) 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 RNA 품질을 검사하였다.

(2) cDNA 합성

cDNA 합성 키트(LeGene Biosciences, Inc.)를 사용하여 상기 (1)에서 전체 정제된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 각 시편의 전체 RNA 1 ㎍를 5 ㎕의 RNA 어닐링 완충액 OT에 용해시켰다. 뉴클레아제를 함유하지 않는 물을 가하여 총 10 ㎕의 현탁액을 맞추었다. 현탁액을 65 ℃에서 3분 동안 배양하였다. 현탁액을 배양하는 동안, RT 반응 혼합물(9 ㎕의 cDNA 합성 완충액 및 1 ㎕의 RnaUs Script RT 및 RNase 저해제 혼합물)을 제조하였다.

상기에서 제조한 10 ㎕의 RT 반응 혼합물을 각각의 추출물 시료에 가하였다. 각각의 혼합물을 24℃에서 5분 동안 저장하고 37 ℃에서 50분 동안 배양하였다. 혼합물을 85℃에서 불활성 RT로 5분 동안 가열하였다.

(3) 실시간 PCR

MSC의 골분화에 대한 본 발명의 추출물의 효과를 측정하기 위하여, 실시간 PCR을 이용하여 OCT4, SOX2, NANOG, BAK, BAX 및 BCL2에 대한 상대 mRNA 발현량을 측정하였다.

먼저, 유니버셜 SYBR 그린 마스터 믹스(Universal SYBR Green Master Mix)(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하였다. cDNA의 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 95 ℃에서 15 분후에, 95 ℃에서 30 초씩 40 주기, 59 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 30 초.

GAPDH를 내인성 대조군으로 이용하였으며, 실시간 PCR 분석에 사용된 유전자 및 프라이머 서열을 하기 표 2에 열거하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 스텝원 시스템(Applied Biosystems StepOne system)(Applied Biosystems, USA) 상에서 수행하여 분석하였다. 상기 연구에서, GAPDH 유전자에 대한 표적 유전자의 상대 발현량을 기준으로 상대 정량화(2^-ΔΔCt)를 이용하여 mRNA 발현 수준 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 3 내지 8에 나타내었다.

유전자 기호	서열번호	프라이머 서열	생성물 크기 (bp)	어닐링 온도 (℃)
OCT4	1	F-AAGCAGCGACTATGCACAAC	140	60
	2	R-AGTACAGTGCAGTGAAGTGAGG
SOX2	3	F-TCCACACTCACGCAAAAACC	77	60
	4	R-AGTCCCCAAAAAGAAGTCCAG
NANOG	5	F-AGTCCCAAAGGCAAACAACC	107	60
	6	R-TGGGTGGAAGAGAACACAGTTC
BAK	7	F-GGCACCTCAACATTGCATGG	144	60
	8	R-CAGTCTCTTGCCTCCCCAAG
BAX	9	F-TCTGACGGCAACTTCAACTG	127	60
	10	R-AGTCCAATGTCCAGCCCATG
BCL2	11	F-GGCTGGGATGCCTTTGTG	66	60
	12	R-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA
GAPDH (대조군)	13	F-AGTCAGCCGCATCTTCTTTT	97	60
	14	R-CCAATACGACCAAATCCGTTG

OCT4 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 OCT4의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 3에 나타내었다. 그 결과, OCT4 발현이 CMR 추출물, 및 CMR과 PS 추출물의 혼합물을 처리한 MSC에서 대조군과 비교하여 약 1.5배 및 4.5배 증가함을 알 수 있었다.

SOX2 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 SOX2의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 4에 나타내었다. MSC 유지를 나타내는 마커와 관련된 SOX2는 CMR 추출물, PS 추출물, 및 CMR과 PS 추출물의 혼합물을 처리한 MSC에서 모두 상향-조절되었다. 특히 CMR과 PS 추출물의 혼합물을 처리한 경우 약 100 배나 우수한 상승작용 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

NANOG 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 NANOG의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 5에 나타내었다. NANOG는 SOX2 mRNA 발현 정도와 유사하게 CMR 추출물, PS 추출물, 및 CMR과 PS 추출물의 혼합물을 처리한 MSC에서 모두 상향-조절되었다. CMR 추출물의 경우 대조군과 비교하여 약 10배, PS 추출물의 경우 약 3배 정도 상승된 효과를 나타내었으며, CMR과 PS 추출물의 혼합물의 경우 약 70배 이상 상승된 효과를 나타내었다.

BAK 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 BAK의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, CMR과 PS 추출물의 혼합물을 처리한 MSC에서는 약 3배 정도 상승된 효과를 나타내었다. 상기 결과는 인간 MSC의 세포사멸이 CMR과 PS 추출물의 혼합물에 의해 유도되었음을 입증한다.

BAX 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 BAX의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 7에 나타내었다. BAK mRNA 발현과 대조적으로, BAX는 모든 약초 샘플에 의해 하향-조절되었다. BAX 발현도 또한 BAK와 동일하게 세포의 세포사멸에 관련된다. 특히, BAX는 CMR 추출물 처리에 의해 상당히 감소되었다.

BCL2 의 상대 mRNA 발현 수준 변화

본 발명의 추출물로 처리된 MSC에서 BCL2의 상대 mRNA 발현 수준 변화를 도 8에 나타내었다. BCL2 mRNA 발현은 모든 샘플에 의해 영향을 받았다. CMR 추출물의 경우 대조군과 비교하여 약 20배, PS 추출물의 경우 약 15배 이상의 BCL2 mRNA 발현 증가를 나타내었으며, CMR과 PS 추출물의 혼합물은 약 200배나 증가된 발현 효과를 나타내었다.

상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 CMR 추출물, PS 추출물, 및 CMR과 PS 추출물의 혼합물은 인간 MSC의 유지의 활성화 및 MSC 세포사멸의 방지를 통하여 OA 환자에게 유용한 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

하기에 상기 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 농축 액제의 제조

실시예 1의 상백피 추출물, 패장 추출물, 또는 이의 혼합물 각 600 mg

올리고당 600 mg

배농축액 500 mg

혼합 비타민 30 mg

딸기향 적량

정제수를 가하여 전체 30 ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 폴리에틸렌 재질의 포에 충전하고 멸균시켜 농축액제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 상백피 추출물, 패장 추출물, 또는 이의 혼합물 각 300 mg

락토스 85 mg

옥수수전분 110 mg

미결정셀룰로오스 63 mg

카복시메틸셀룰로오스 칼슘 적량

전분글리콘산나트륨 적량

실리콘디옥사이드 적량

스테아린산마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 코팅한 후 정제를 제조하였다.

제제예 3. 연질 캡슐제의 제조

콩기름 480 mg

팜유 90 mg

황납 30 mg

통상의 연질 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 호박산 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 경질 캡슐제의 제조

락토스 85 mg

옥수수전분 110 mg

미결정셀룰로오스 63 mg

카복시메틸셀룰로오스 칼슘 10 mg

통상의 경질 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 경질 캡슐제를 제조하였다.

제제예 5. 건강 증진 식품의 제조

실시예 1의 상백피 추출물, 패장 추출물, 또는 이의 혼합물 각 150 mg

락토스 120 mg

유청칼슘 30 mg

비타민 D3 30 mg

비타민 C 20 mg

녹차추출물분말 적량

판토텐산칼슘 적량

L-시스틴 적량

자일리톨 적량

스테아린산마그네슘 적량

통상의 식품 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 건강 증진 식품을 제조하였다.

제제예 6. 건강 증진 음료의 제조

실시예 1의 상백피 추출물, 패장 추출물, 또는 이의 혼합물 각 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 87℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2㎖ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강 증진 음료를 제조하였다.

<110> KIM, Koh-Woon <120> COMPOSITIOIN FOR PROMOTING OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS COMPRISING CORTEX MORI RADICIS EXTRACT, PATRINIA SANICULAEFOLIA EXTRACT OR MIXTURE THEREOF <130> FPD201312-0086 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for OCT4 <400> 1 aagcagcgac tatgcacaac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for OCT4 <400> 2 agtacagtgc agtgaagtga gg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for SOX2 <400> 3 tccacactca cgcaaaaacc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for SOX2 <400> 4 agtccccaaa aagaagtcca g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for NANOG <400> 5 agtcccaaag gcaaacaacc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for NANOG <400> 6 tgggtggaag agaacacagt tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for BAK <400> 7 ggcacctcaa cattgcatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for BAK <400> 8 cagtctcttg cctccccaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for BAX <400> 9 tctgacggca acttcaactg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for BAX <400> 10 agtccaatgt ccagcccatg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for BCL2 <400> 11 ggctgggatg cctttgtg 18 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for BCL2 <400> 12 cagccaggag aaatcaaaca ga 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for GAPDH <400> 13 agtcagccgc atcttctttt 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for GAPDH <400> 14 ccaatacgac caaatccgtt g 21

Claims

상백피(cortex mori radicis, CMR) 추출물, 패장(Patrinia saniculaefolia, PS) 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 혼합물이 상백피 추출물 및 패장 추출물을 1: 0.1 내지 10의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 상백피 추출물 또는 패장 추출물이 생약의 용매 추출물 또는 그의 분말인 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 100 중량% 미만의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물이 산제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 엑스제, 현탁제, 유제, 시럽제, 내용액제, 에어로졸, 패치제, 비수성용제, 동결건조제제 및 주사제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 약제학적 제제로 제제화되는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 혼합물이 상백피 추출물 및 패장 추출물을 1: 0.1 내지 10의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 상백피 추출물 또는 패장 추출물이 생약의 용매 추출물 또는 그의 분말인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 상백피 추출물, 패장 추출물 또는 이의 혼합물이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 95 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 식품 조성물이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.