CN113730449A - 药学组合物和保健食品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于预防或治疗神经退行性疾病的药学组合物和保健食品。具体地，本发明的蒸曝人参果实的发酵物的总人参皂苷及多酚的含量高，显出抗氧化活性，抑制乙酰胆碱脂酶，在痴呆动物模型中改善认知功能及空间知觉能力，在痴呆动物模型的脑组织中恢复乙酰胆碱的表达及抑制β‑淀粉样蛋白的积聚，抑制痴呆动物模型的脑损伤，在神经细胞株中促进与脑损伤相关的基因的表达，因此上述蒸曝人参果实的发酵物可以有效用于神经退行性疾病的治疗、认知功能的改善及脑保护。

Description

药学组合物和保健食品
技术领域
本发明涉及包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于预防或治疗神 经退行性疾病的药学组合物和保健食品。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.meyer)是五加科人参属的植物，从两千多年前就 开始在韩国、中国及日本等地用作预防疾病、延长寿命的生药。人参的功效及 效果迄今已知有对中枢神经系统的作用、抗致癌作用、抗癌活性、免疫功能调 节作用、抗糖尿病作用、肝功能亢进功效、心血管障碍改善、抗动脉硬化作用、 血压调节作用、更年期障碍改善、骨质疏松症改善效果、抗压力活性、抗疲劳 作用、抗氧化活性、抗老化活性等。
到三年生为止，人参果实尚未成熟，四年生以后果实才成熟，药材的名为 人参子。已知人参果实补充元气，在强化身体的同时延迟老化，对眩晕、气短、 脓疮、气力不足等有功效。但就是这样的人参果实，在农业上的利用度很低， 仅单纯地以获取栽培人参的种子为目的采种。而且，除了以栽培为目的而采种 的种子外，为了阻断活性成分分散到作为生殖器官的花和果实并诱导向根部聚 集，在5～6个月的时候会去除人参果实。据报告，虽然作为人参代表性的生理 活性成分的人参皂苷均匀地分布在人参的地上及地下部分，但人参果实的人参 皂苷的成分及含量与人参根不同。
据报告，人参皂苷有约三十多种以上，其中，将在第6位碳元素结合氢元 素的人参皂苷称为原人参二醇(protopanaxadiol)类皂苷，而将在第6位碳元素 结合氧元素的人参皂苷称为原人参三醇(protopanaxatriol)类皂苷。人参及山参 中的含量最丰富的Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re等之类的普通人参皂苷不直接被人 体吸收，而是一部分通过肠内菌群或酶分解而成分转化为人参皂苷F1、F2、Rg3、 化合物K等后被吸收。
因此，有关人参果实的药理学活性的多种研究正在进行。具体地，韩国专 利公开第10-2019-0126713号涉及包含人参果实多醣体作为有效成分的用于预防 或抑制流感病毒的感染的组合物，公开了具有特定成分及结构的人参果实多醣 体具有阻碍神经氨糖酸苷酶活性的效果。
另外，神经退行性疾病是指与老化一起发生的退行性疾病中发生在脑的疾 病，包括血管性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、莱维小体病及额颞痴呆等。 尤其是阿尔茨海默病和莱维小体病占全部痴呆患者的90％，尽管在持续进行很 多研究及开发，但也只有帮助改善认知及记忆力等症状的药物用于治疗中。因 此，迄今为止，世界性的治疗剂的开发在活跃地进行着，韩国也在进行天然物 药品、合成药品、干细胞治疗剂及肽药品的研究，但目前尚无可见的成果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：韩国专利公开第10-2019-0126713号
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供蒸曝人参果实的发酵物的神经退行性疾病的治疗 用途。
本发明的另一目的在于，提供蒸曝人参果实的发酵物的认知功能改善或脑 保护的用途。
用于解决问题的手段
为达成上述目的，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成 分的用于预防或治疗神经退行性疾病的药学组合物。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于预 防或改善神经退行性疾病的保健食品。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于改 善认知功能的保健食品。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的脑保护 用保健食品。
发明的效果
本发明的蒸曝人参果实的发酵物的总人参皂苷及多酚的含量高，显出抗氧 化活性，抑制乙酰胆碱脂酶，在痴呆动物模型中改善认知功能及空间知觉能力， 在痴呆动物模型的脑组织中恢复乙酰胆碱的表达及抑制β-淀粉样蛋白的积聚， 抑制痴呆动物模型的脑损伤，在神经细胞株中促进与脑损伤相关的基因的表达， 因此上述蒸曝人参果实的发酵物可以有效用于神经退行性疾病的治疗、认知功 能的改善及脑保护。
附图说明
图1为示出根据本发明一实施例制备蒸曝人参果实的发酵物的过程的示意 图。
图2为根据本发明一实施例来确认三年根(3YGB)或四年根(4YGB)的 蒸曝人参果实的发酵物中所包含的总人参皂苷含量的结果柱状图。
图3为在本发明一实施例中通过高效液相色谱(HPLC)分析来确认四年根 的蒸曝人参果实的发酵物中所包含的人参皂苷的结果曲线图。
图4为在本发明一实施例中确认三年根(3YGB)或四年根(4YGB)的蒸 曝人参果实的发酵物中所包含的总多酚含量的结果柱状图。
图5为在本发明一实施例中确认三年根(A)或四年根(B)的蒸曝人参果 实的发酵物的自由基去除能力的结果柱状图。
图6为在本发明一实施例中确认三年根(3YGB)或四年根(4YGB)的蒸 曝人参果实的发酵物的金属离子催化剂氧化抑制能力的结果图。
图7为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)的乙酰胆碱 酯酶抑制活性的结果柱状图。
图8为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在痴呆动物 模型中的认知功能改善活性的结果曲线图。
图9为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在痴呆动物 模型中的空间知觉能力改善活性的结果曲线图。
图10为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在痴呆动 物模型中的脑组织内乙酰胆碱恢复活性的结果柱状图。
图11为在本发明一实施例中通过蛋白质印迹法(A)或酶联免疫吸附测定 (ELISA)(B)来确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在痴呆动物模型中的脑组 织内β-淀粉样蛋白的表达调节的结果图。
图12为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在痴呆动 物模型中的脑组织损伤抑制活性的结果图。
图13为在本发明一实施例中确认蒸曝人参果实的发酵物(SGF)在神经细 胞株中的脑损伤相关基因的胆碱乙酰转移酶(ChAT)(A)、囊泡乙酰胆碱转运 体(VAChT)(B)或脑源性神经营养因子(BDNF)(C)的表达促进活性的结 果图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于预防或治 疗神经退行性疾病的药学组合物。
在本说明书中说使用的术语“蒸曝”是指蒸和晒干药材的过程，反复这样的过 程九次就是所谓的九蒸九曝。蒸曝通常是用来强化或弱化生药的活性、使坚硬 的变软、去除毒性的过程。将药材放入盛有水的铁锅内用温火加热谓之“蒸”，将 其放在阳光下干燥谓之“曝”。
上述蒸曝可通过普通技术领域中熟知的次数及方法来进行，上述次数及方 法可通过普通技术人员进行变形。上述蒸曝人参果实，可单独使用蒸曝特定次 数的人参果实，也可以将分别蒸曝不同次数的人参果实混合来使用。
上述蒸曝人参果实的发酵物可以为对蒸曝人参果实提取物进行发酵的。上 述蒸曝人参果实提取物可以通过下述常规的方法来制备：
1)向蒸曝人参果实添加提取溶剂来制备提取物的步骤；
2)过滤步骤1)的提取物的步骤；
3)将步骤2)中过滤的过滤物减压浓缩后进行干燥的步骤。
并且，上述提取溶剂可以为水、醇类或它们的混合物。上述醇类可以为C1至C2的低级醇类，具体地，上述醇类可以为乙醇、甲醇或酒精。上述提取溶剂 可以添加蒸曝的人生果实质量的5倍至30倍、5倍至25倍、5倍至20倍，10 倍至25倍、10倍至20倍。
上述提取方法可以为震荡提取、索氏(Soxhlet)提取或回流提取。其中， 提取时间可以为1小时至70小时、30小时至60小时、40至50小时。上述提 取可以反复一次以上。
另外，上述步骤3)的减压浓缩可以使用真空减压浓缩机或真空旋转蒸发器。 并且，上述干燥可以为减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥， 具体地，可以为冷冻干燥。
本发明的保健饮料可以单独使用通过一种溶剂提取的蒸曝人参果实提取物 来制备，或者可以混合分别使用不同溶剂提取的提取物来制备。其中，上述蒸 曝人参果实提取物还可以包含将提取剩下的残渣放入提取溶剂来提取的提取 物。
上述蒸曝人参果实提取物可以使用普通技术领域中公知的方法进行发酵， 上述发酵可以由普通技术人员通过适当变形来执行。具体地，上述发酵可以由 选自由乳杆菌(Lactobacillus)属及杆菌(Bacillus)属菌株组成的组中的一种以 上的菌来进行。作为一例，上述乳杆菌属菌株可以包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株。另外，上述杆菌属菌株可以 包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilius)菌株。在本发明的一实施例中，上述发酵 可以使用以保藏编号为KCTC14392BP保藏的植物乳杆菌菌株进行。
为了制备本发明的蒸曝人参果的发酵物，上述菌株能够以常规的量来接种， 在适当的时间及温度下进行发酵。
上述神经退行性疾病可以包括普通技术领域公知的所有神经退行性疾病， 具体地，上述神经退行性疾病可以为因乙酰胆碱的表达抑制及β-淀粉样蛋白的 积聚而发生的神经退行性疾病。作为一例，上述神经退行性疾病可以为阿尔茨 海默病(Alzheimer'sdisease)、帕金森病(Parkinson's disease)、亨廷顿病 (Huntington disease)、轻度认知障碍(mild cognitive impairment)、大脑淀粉样 血管病变、唐氏综合征、淀粉样脑卒中(stroke)、全身性淀粉样变性病、老年 性痴呆、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)、脊髓小脑性共济失调 (spinocerebellar atrophy)、妥瑞氏症(Tourette'ssyndrome)、弗里德里希共济失 调(Friedrich's ataxia)、莱维小体病(Lewy Bodydementia)、进行性核上麻痹 (progressive supranuclear palsy)或额颞痴呆(frontotemporal dementia)。
本发明的药学组合物可以包含相对于组合物的总重量的10重量百分比至95 重量百分比的作为有效成分的蒸曝人参果实的发酵物。并且，本发明的药学组 合物除上述有效成分以外，还可以包含一种以上的表现出相同或相似功能的有 效成分。
本发明的药学组合物可以包含在生物学制剂中通常使用的载体、稀释剂、 赋形剂或它们的混合物。药学上可接受的载体只要是适于将组合物传达至生物 体内的就都可以使用。具体地，上述载体可以为现有技术文献(Merck Index， 13th ed.，Merck&Co.Inc.)中记载的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、 葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或它们的混合物。并且，还可以根 据需要添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等普通的添加剂。
将上述组合物制剂化时，可以添加通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、 湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂。
本发明的组合物可以剂型化为口服制剂或胃肠外制剂。口服制剂可以包括 固体制剂及液体制剂。上述固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊 剂或含片，这些固体制剂可以通过向上述组合物添加至少一种以上的赋形剂来 制备。上述赋形剂可以为淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶或它们的混合物。 并且，上述固体制剂还可以包含润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉等。另外，上 述液体制剂可以为悬浮液、内用液剂、油剂或糖浆。其中，上述液体制剂可以 包含湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等之类的赋形剂。
上述胃肠外制剂可以包括注射剂、栓剂、呼吸道吸入用粉末、喷雾用气溶 胶、粉末以及霜剂等。上述注射剂可以包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮 溶剂、油剂等。其中，可以将丙二醇、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油或者油 酸乙酯之类的可以注射的之类用作非水性溶剂或悬浮溶剂。
本发明的组合物可以根据所要达成目的的方法经口服或胃肠外给药。胃肠 外给药可以包括腹腔内、直肠内、皮下、静脉、肌肉内或胸部内注射方式。
上述组合物能够以药学上的有效量给药。这可以根据疾病的种类、重症度、 药物的活性、患者对药物的敏感度、给药时间、给药途径、治疗期间、同时使 用的药物等的不同而不同。但是，为了优选的效果，本发明的药学组合物所包 含的有效成分的量可以为0.0001mg/kg至1000mg/kg，具体地，可以为0.001mg/kg 至500mg/kg。上述给药可以为一日一次。
本发明的组合物可以单独给药，或者与其他治疗剂联合来给药。联合给药 时，可以依次或同时给药。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于预 防或改善神经退行性疾病的保健食品。
上述蒸曝人参果实的发酵物可以具有如上述的特征。例如，上述蒸曝人参 果实的发酵物可以为对蒸曝人参果实提取物进行发酵的，上述蒸曝人参果实提 取物可以通过如上所述的方法制备。并且，上述蒸曝人参果实提取物可以通过 如上所述的方法发酵，上述发酵可以由普通技术人员适当变形来进行。
上述神经退行性疾病可以具有如上所述的特征，具体地，上述神经退行性 疾病可以为因乙酰胆碱的表达抑制及β-淀粉样蛋白的积聚而发生的神经退行性 疾病。
本发明的蒸曝人参果实的发酵物可以直接添加至食品，或者可以与其他食 品或食品成分一起使用。其中，添加的有效成分的含量可以根据目的来决定， 通常可以为食品总重量的0.01重量份至90重量份。
保健食品的形态及种类没有特别限制。具体地，上述保健食品可以为片剂、 胶囊、粉末、颗粒、液体及丸的形态。上述保健食品可以包含多种香味剂、甜 味剂或天然碳水化合物作为附加成分。上述甜味剂可以为天然或合成甜味剂， 天然甜味剂的例有索马甜、甜菊糖提取物等。另外，合成甜味剂的例有糖精、 阿巴斯甜等。并且，上述天然碳水化合物可以为单糖、双糖、多糖、寡糖以及 糖醇等。
本发明的保健食品除上述附加成分外，还可以包含营养剂、维生素、电解 质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增 稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇等。这些成分可以单独或组合 来使用。上述添加剂的比例可以在本发明组合物的每100重量份中的0.01重量 份至0.1重量份的范围内选择。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的用于改 善认知功能的保健食品。
上述蒸曝人参果实的发酵物可以具有如上所述的特征。例如，上述蒸曝人 参果实的发酵物可以为对蒸曝人参果实提取物进行发酵的，上述蒸曝人参果实 提取物可以通过如上所述的方法制备。并且，上述蒸曝人参果实提取物可以通 过如上所述的方法发酵，上述发酵可以由普通技术人员适当变形来进行。
上述保健食品可以具有如上所述的特征。
并且，本发明提供一种包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分的脑保护 用保健食品。
上述蒸曝人参果实的发酵物可以具有如上所述的特征。例如，上述蒸曝人 参果实的发酵物可以为对蒸曝人参果实提取物进行发酵的，上述蒸曝人参果实 提取物可以通过如上所述的方法制备。并且，上述蒸曝人参果实提取物可以通 过如上所述的方法发酵，上述发酵可以由普通技术人员适当变形来进行。
上述保健食品可以具有如上所述的特征。
以下，通过下述实施例详细说明本发明，但是，下述实施例仅用于例示本 发明，而不是要以此来限制本发明。凡是具有与本发明的发明要求保护范围中 所记载的技术思想具有实际上相同的结构且实现相同的作用效果的都应包括在 本发明的技术范围内。
实施例1.利用四年根人参的蒸曝人参果的提取物的制备。
利用采摘的人参果实通过如下方法制备蒸曝人参果实提取物。
首先，于2018年5月下旬从4年生的人参采摘马上要成熟的人参果实(京 畿道，韩国)，使用干净的水洗涤后，使用热风干燥机(JW-500ED型，Jinwoo Electronic Co.,韩国)在50℃的温度下干燥15小时。将干燥的人参果实在95℃ 的温度下蒸5小时，然后在50℃的温度下干燥1小时，反复这样的蒸曝过程4 次至7次得到四蒸四曝或七蒸七曝的人参果实。将所得的四蒸四曝及七蒸七曝 的人参果实以1：1的重量比混合后加入30倍容量的蒸馏水在95℃的温度下进 行24小时的热水提取，从而得到蒸曝人参果实的热水提取物。
并且，向获得热水提取物后剩余的残余物加入其10倍容量的65％的酒精(京 畿道，韩国)，在常温下提取24小时，进行这个提取过程两次，得到蒸曝人参 果实的酒精提取物。
实施例2.利用三年根人参的蒸曝人参果的提取物的制备。
除使用三年根代替四年根的人参外，以与上述实施例1相同的方法及条件 利用三年根的人参制备蒸曝人参果实的热水提取物及酒精提取物。
实施例3.利用四年根人参的蒸曝人参果实提取物的发酵物制备
向上述的利用四年根人参制备的蒸曝人参果实提取物接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，KCTC14392BP)菌株来制备发酵物。
其中，本发明的发明人于2016年9月5日将上述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国全罗北道)， 其保藏编号为KCTC21084，并且，于2020年11月30日请求将上述菌株转换成 根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的专利保藏，其被赋予了保藏编号 KCTC14392BP(保藏机构仍为韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，其地址为韩 国全罗北道)。
具体地，将实施例1中制备的人参果实的热水提取物及酒精提取物全部混 合后，向其中加入蒸馏水稀释至3白利度(brix)。向稀释的混合物接种1×107CFU/ml的量的植物乳杆菌菌株。将其在30℃的温度下发酵72小时后，进 行离心分离后浓缩至17.5白利度，从而制备利用从四年根人参获取的人参果实 的蒸曝人参果实提取物的发酵物。
然后，为了去除上述制备的发酵物中所包含的极性残余物而进行固相萃取(solid phase extraction)。固相萃取使用YMC-Triart C18(YMC公司，日本)， 参照韩国技术标准院的标准编号KS H2153中记载的人参及人参制品-人参皂苷 含量检测-高速液体层析法进行。其中，使用5ml的甲醇及20ml的水进行事前 洗涤，注入试样使其达到100mg/5ml的浓度，使用20ml的水及15ml的30％ 甲醇进行事后洗涤，使用10ml的甲醇使其溶出，以32.3％的收益率得到蒸曝人 参果实的发酵物的固相萃取物(图1)。
实施例4.利用三年根人参的蒸曝人参果实提取物的发酵物制备
除使用制备例2制备的利用三年根的人参果实制备的蒸曝人参果实提取物 之外，以与实施例3相同的条件及方法，以33.1％的收益率得到利用从三年根 人参获取的人参果实的蒸曝人参果实的发酵物的固相萃取物(图1)。
实验例1.蒸曝人参果实的发酵物的人参皂苷含量确认-(1)
1-1.总人参皂苷的含量确认
使用香草醛-硫酸(vanilin-sulfuric acid)分析法确认上述制备的人参果实的发酵物中所包含的总人参皂苷的含量。
首先，将8％的香草醛和72％的硫酸溶液以6：84的体积比混合后，放置 在冰上保管使其冰凉直至使用前。另外，以10mg/ml的浓度准备实施例3及实 施例4中得到的从四年根或三年根人参得到的蒸曝人参果实提取物的发酵物， 向0.2ml的试管中加入10μl。向其中加入90μl的上述香草醛-硫酸溶液，在55℃ 的温度下反应20分钟。将反应结束的反应物放置在冰上冷却，然后移至96孔 板，在545nm的波长下检测吸光度。其中，将标准品的人参皂苷Re以1/2的方 式由500μg/ml的浓度稀释至62.5μg/ml的浓度来绘制用于定量总人参皂苷含量 的校正曲线。利用绘制的校正曲线来计算本发明的蒸曝人参果实的发酵物中包 含的人参皂苷的含量结果如图2所示。
如图2所示，从四年根或三年根人参果实获取的蒸曝人参果实的发酵物都 包含有很高含量的人参皂苷。尤其是从四年根人参果实获取的蒸曝人参果实的 发酵物比三年根的总人参皂苷含量高出约1.7倍。
1-2.主要人参皂苷的含量确认
以与上述实验例1-1相同的条件及方法对上述制备的蒸曝人参果实的发酵 物中所包含的主要人参皂苷F4、Rg3(S)、Rg3(R)及Rg5的含量进行确认， 其结果如下述表1所示。
表1
试样 F4 Rg3(S) Rg3(R) Rg5 合计
三年根 30.36 10.60 5.54 5.94 52.44
四年根 34.69 13.85 6.47 8.69 63.70
如表1所示，从四年根人参果实获取的蒸曝人参果实的发酵物的含量显著 地高出从三年根人参果实获取的蒸曝人参果实的发酵物的含量。
实验例2.蒸曝人参果实的发酵物的人参皂苷含量确认-(2)
使用高效液相色谱(HPLC，high-performance liquid chromatography)分析 方法确认上述制备的四年根蒸曝人参果实的发酵物中所包含的人参皂苷的含 量。实验使用ultimate 3000高效液相色谱系统(ultimate 3000HPLC system， Thermo Scientific公司，美国)及YMC-Triart C18色谱柱(YMC公司，日本) 来进行。使用0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)注射式过滤器(Hyundai Micro公 司，韩国)过滤溶解为10mg/ml的浓度的从实施例3中获取的四年根蒸曝人参 果实的发酵物后，各注入10μl进行分析。其中，分析条件如下述表2及表3所 示。
表2
Figure BDA0002812879400000111
Figure BDA0002812879400000121
表3
时间(分钟) 水(％) 乙腈(％)
0-10 80 20
10-40 80→68 20→32
40-55 68→50 32→50
55-70 50→35 50→65
70-72 35→10 65→90
72-82 10 90
82-84 10→80 90→20
84-90 80 20
并且，作为对照组，将人参皂苷Rg3(S)、Rg3(R)、Rg5、F4、Rg1、Re、 Rb1、Rc、Rd以及Rk1(Biopurity公司，中国)稀释为125μg/ml至2000μg/ml 的浓度范围来绘制标准校正曲线以供使用。
其结果，如图3所示，从四年根人参获取的蒸曝人参果实的发酵物均匀地 包含多个种类的人参皂苷。
实验例3.蒸曝人参果实的发酵物的总多酚含量确认
应用福林酚(folin-ciocalteu)分析法确认上述制备的蒸曝人参果实的发酵物中所包含的总多酚的含量。
首先，将实施例3及实施例4中获取的从四年根及三年根获取的蒸曝人参 果实提取物的发酵物准备为10mg/ml的浓度，向0.2ml的试管加入10μl。向其 中混合160μl的三次蒸馏水及10μl的福林酚试剂(folin-ciocalteu's phenol reagent，Sigma-aldrich公司，美国)，在暗室中反应5分钟。反应结束后将反应 物移至96孔板，加入20％的Na2CO3并在暗室再反应20分钟。反应后，在765 nm的波长下对上述96孔板进行吸光度检测。其中，将标准品的棓酸以1/2的方 式由500μg/ml的浓度稀释至62.5μg/ml的浓度来绘制用于定量总多酚含量的校 正曲线。利用绘制的校正曲线来计算本发明的蒸曝人参果实的发酵物中所包含 的总多酚的含量的结果如图4所示。
如图4所示，从四年根或三年根人参果实获取的蒸曝人参果实的发酵物都 包含有很高含量的多酚，尤其是从四年根人参果实获取的蒸曝人参果实的发酵 物包含更高量的多酚。
实验例4.蒸曝人参果实的发酵物的抗氧化活性确认
4-1.自由基去除能力确认
以如下方式通过确认自由基去除能力来确认上述制备的蒸曝人参果实的发 酵物的抗氧化活性。
首先，制备包含0.3mM的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)的甲醇溶液，向其中加入1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、 50μg/ml或100μg/ml的实施例3或实施例4的蒸曝人参果实的发酵物。在室温 下使其反应十分钟后，在517nm的波长下检测吸光度来计算自由基去除能力的 结果如图5所示。
如图5所示，从三年根或四年根获取的蒸曝人参果实的发酵物分别显出 383.7μg/ml及174.6μg/ml的DPPH IC50。尤其是从四年根人参果实获取的蒸曝 人参果实的发酵物表现出比三年根高出约两倍的抗氧化活性。
4-2.金属离子催化剂氧化抑制能力确认
通过金属离子催化剂氧化抑制方法以如下方式确认上述制备的蒸曝人参果 实的发酵物的抗氧化活性。
具体地，向包含0.5μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)(bovine serum albumin， sigma-aldrich公司，美国)的溶液加入100μM的Cu2+及2.5mM的H2O2来生成 羟基自由基(hydroxylradical)。向其中加入10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml的 实施例3或实施例4的蒸曝人参果实的发酵物进行反应。反应结束后，将反应 物在10％的十二烷基硫酸钠(SDS，sodiumdodecyl sulfate)聚丙烯酰胺凝胶 (polyacrylamide gel)中进行电泳来确认通过蒸曝人参果实的发酵物的牛血清白 蛋白分解阻碍水平。其中，使用50μM的抗坏血酸作为阳性对照组。
其结果，如图6所示，可知从三年根或四年根人参果实获取的蒸曝人参果 实的发酵物表现出优秀的抗氧化活性。尤其确认到，从四年根人参果实获取的 蒸曝人参果实的发酵物即使在10μg/ml的低浓度下也以与阳性对照组相似的水 平保护牛血清白蛋白，其抗氧化活性显著优秀。
实验例5.蒸曝人参果实的发酵物的乙酰胆碱酯酶抑制活性确认
以如下方式确认总皂苷含量及多酚含量高、抗氧化活性优良的从四年根人 参果实获取的蒸曝人参果实的发酵物的乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase， AChE)抑制活性。
首先，通过吸入乙醚麻醉7周龄的雄性ICR小鼠(Daehan Bio Link，韩国)， 向心脏灌流10ml的灭菌生理盐水来实施安乐死。使用通常的方法从安乐死的小 鼠摘出脑组织，向其中加入100mM的凉的磷酸盐缓冲液(PBS)后，使用组织 破碎仪(polytron PT-MR 2100型，Luzern公司，瑞士)破碎获得5％的匀质液 体。另外，分别将碘代硫代乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide，Sigma-aldrich公 司，美国)及5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，5，5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，Sigma-aldrich公司，美国)溶解于磷酸盐缓冲液及乙醇中，准备为0.5mM 的浓度。另外，将实施例4的蒸曝人参果实的发酵物准备为1μg/ml、3μg/ml、 6μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml或100μg/ml的浓度，使用磷酸盐缓冲 液作为阴性对照组。
在透明小容器中混合10μl的碘代硫代乙酰胆碱溶液、10μl的5，5'-二硫代 双(2-硝基苯甲酸)溶液、30μl的破碎的小鼠脑匀质液体及50μl的准备的上述蒸 曝人参果实的发酵物，加入磷酸盐缓冲液使其最终体积达到500μl。将其在412 nm的波长下，以间隔1分钟的方式共检测3分钟的吸光度的变化(ΔOD/min)， 以阴性对照组的值为100％来计算其值，这样计算乙酰胆碱脂酶活性抑制率的结 果如图7所示。
如图7所示，本发明的蒸曝人参果实的发酵物依赖浓度抑制乙酰胆碱酯酶， 尤其是在以25μg/ml、50μg/ml或100μg/ml的浓度处理的蒸曝人参果实的发酵 物的组中呈现显著效果。
因此，从上述内容可知，本发明的蒸曝人参果实的发酵物可以通过抑制乙 酰胆碱酯酶表现出认知功能改善效果。
实验例6.蒸曝人参果实的发酵物的认知功能改善确认
6-1.痴呆动物模型的制备及蒸曝人参果实的发酵物的给药
为了确认蒸曝人参果实的发酵物的认知功能，首先以如下方法制备痴呆动 物模型。
首先，购入体重为25g左右的6周龄的ICR雄性小鼠(C57BL/6J，DBL公 司，韩国)，将上述小鼠以每组8只的方式随机分为6组。小鼠是在调节空气的 半-无特定病原(semi-SPF)的室内，以23±2℃的温度、55±10％的相对湿度、 12次/小时的换气次数、12小时的照明周期以及150Lux至300Lux的照明度的 条件饲养的。本实验是在忠北大学实验动物研究支援中心的动物试验伦理委员 会的认可(CBNUR-1287-19)下根据该机构的标准操作指南进行的。
饲养1周后开始向小鼠给药试验物质。每天以100mg/kg、300mg/kg或500 mg/kg的给药量经口服给药蒸曝人参果实的发酵物6周。其中，使用100mg/kg 的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，epigallocatechin gallate)处理的组作为 阳性对照组，将不做任何处理的组作为阴性对照组，还有只给药β-淀粉样蛋白 (amyloid-β，Aβ1-42)的组作为β-淀粉样蛋白处理组(表5)。
表5
Figure BDA0002812879400000151
在给药试验物质的最后一天，通过吸入乙醚麻醉小鼠，并将其固定于立体 定向支架(stereotaxic frame，Stoelting公司，美国)。向固定的小鼠的脑室内(AP： 0.6，ML：1.1，DV：2.0mm)给药5μl的5mg/ml的β-淀粉样蛋白来诱发痴呆。
虽然在上述给药期间通过检测体重来判断异常症候，但未观察到显著的体 重变化。
6-2.被动回避试验(passive avoidance test，PAT)
通过被动回避试验确认实验例6-1中给药蒸曝人参果实的发酵物及诱发痴 呆的物质β-淀粉样蛋白的小鼠的认知功能改善效果。被动回避试验从给药β-淀 粉样蛋白后第48小时开始以间隔2小时的方式检测6次。
首先，将小鼠放在分为黑暗的房间和明亮的房间的被动回避箱中的明亮的 房间内，若上述小鼠向黑暗的房间移动则施加2秒钟的1mA强度的电流冲击， 反复该方式检测小鼠滞留在明亮的方面的时间来评价小鼠的记忆力。尤其，当 小鼠待在明亮的房间180秒以上时，确认上述小鼠形成了记忆力。
其结果，如图8所示，未做任何处理的无处理组的小鼠随着次数的增加， 滞留在明亮的房间的时间逐渐增长，第5次的时候滞留了180秒钟以上，记忆 力完全形成。相反地，只用β-淀粉样蛋白处理的β-淀粉样蛋白处理组经过6次 的学习形成的记忆也很低。
使用本发明的蒸曝人参果实的发酵物处理的组对通过β-淀粉样蛋白而减少 的认知功能低下依赖给药量的增加而增加。尤其是以500mg/kg的给药量给药蒸 曝人参果实的发酵物的给药组的记忆力恢复为正常水平，表现出与阳性对照组 的表没食子儿茶素没食子酸酯相似的很高的功效。
6-3.水迷宫试验(morris water-maze test，MWMT)
通过水迷宫试验确认实验例6-1中给药蒸曝人参果实的发酵物及诱发痴呆 的物质β-淀粉样蛋白的小鼠的空间知觉能力的改善效果。水迷宫试验在给药蒸 曝人参果实的发酵物的6天内每天进行一次。
首先，在圆形的水槽内装满温度为22±2℃的水，放入聚苯乙烯泡沫塑料在 水面以下隔出避身用避台以备使用。将小鼠放入水中，检测从上述小鼠记忆水 槽周边的标记物后找到位于水槽内一定位置的避台所需的时间。其中，若小鼠 在经过180秒钟的时间后仍找不到避台，则让其在避台待30秒来诱导其记忆。
其结果，如图9所示，未做任何处理的无处理组的小鼠随着反复的次数的 增加，找到避台的时间逐渐缩短，到了第4天，可以达到30秒以内。相反地， 只使用β-淀粉样蛋白处理的β-淀粉样蛋白组直到第6天都没有恢复空间知觉能 力。
使用本发明的蒸曝人参果实的发酵物处理的组对通过β-淀粉样蛋白而减少 的空间知觉能力依赖给药量而恢复。尤其是以500mg/kg的给药量给药蒸曝人参 果实的发酵物的给药组的空间知觉能力恢复为正常水平，表现出与阳性对照组 的表没食子儿茶素没食子酸酯相似的很高的功效。
因此，由上述内容可以确认本发明的蒸曝人参果实的发酵物可以改善认知 功能或空间知觉能力，可以用于痴呆的治疗。
实验例7.蒸曝人参果实的发酵物的脑组织内乙酰胆碱恢复效果确认
通过如下方式确认蒸曝人参果实的发酵物能否增加脑组织内乙酰胆碱(acetylcholine)的浓度。
具体地，在所有的实验结束后，使用凉的生理盐水充分灌流在实验例6中 给药蒸曝人参果实的发酵物的小鼠的脑后摘出。使用液氮保管摘出的脑组织， 在实验当天称重后，将脑组织放入其10倍体积的凉的磷酸盐缓冲液中，使用匀 质仪将其匀质化。使用荧光红染料乙酰胆碱/乙酰胆碱脂酶分析试剂盒(Amplex Red acethylcholine/acethylcholine esterase assay kit，Invitrogen，美国)根据制造 商的说明书对匀质化的匀质液体进行分析，其结果如图10所示。
如图10所示，β-淀粉样蛋白处理组脑内的乙酰胆碱浓度相对于无处理组显 著地减少了。但是，减少的乙酰胆碱的浓度却依赖蒸曝人参果实发酵物的处理 浓度而增加，以500mg/kg的给药量给药蒸曝人参果实的发酵物的给药组的乙酰 胆碱浓度恢复到正常水平。
实验例8.蒸曝人参果实的发酵物的脑组织内β-淀粉样蛋白的表达调节确认
通过如下方法确认蒸曝人参果实的发酵物能否调节脑组织内β-淀粉样蛋白 的表达。实验利用实验例7中摘出的脑组织，以通常的方法进行蛋白质印迹法， 或者使用Aβ1-42酶联免疫吸附测定(ELSIA)试剂盒(IBL公司，日本)根据制 造商的说明书来执行。其结果，通过蛋白质印迹法确认β-淀粉样蛋白表达量的 结果如图11的A部分所示，通过酶联免疫吸附测定确认β-淀粉样蛋白表达量的 结果如图11的B部分所示。
如图11的A部分及图11的B部分所示，通过β-淀粉样蛋白处理而增加的 脑内β-淀粉样蛋白的量以来蒸曝人参果实的发酵物的处理浓度而减少。尤其在 以300mg/kg以上的给药量给药蒸曝人参果实的发酵物的小鼠的脑组织中，β- 淀粉样蛋白的量显著地减少了。
从上述内容可以确认，本发明的蒸曝人参果实的发酵物通过抑制β-淀粉样 蛋白在脑组织内的积聚来表现出脑保护活性。
实验例9.蒸曝人参果实的发酵物的脑损伤抑制活性确认
通过作为损伤的脑的生物标记物的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的变化来确 认蒸曝人参果实的发酵物是否表现出抑制脑损伤的活性。
具体地，将以与实验例7中的记载相同的方法及条件摘出的脑组织在4％的 多聚甲醛溶液中固定后制备冷冻组织切片。将抗胶质纤维酸性蛋白(Abcam公 司，美国)用作一次抗体对上述切片使用，使用结合有Alexa Fluor-488荧光染 料的二次抗体(MolecularProbes公司，美国)进行免疫染色，使用4'，6-二脒 基-2-苯基吲哚(DAPI，4'-6-diamidino-2-phenylindole)对细胞核进行染色。使用 长队的方法进行免疫染色，对染色的细胞进行拍摄的结果如图12所示。
如图12所示，β-淀粉样蛋白处理组的脑组织内的胶质纤维酸性蛋白表达的 星形胶质细胞(astrocyte)平均为412个，这比无处理组的87个增加了4.7倍。 但是，这却依赖蒸曝人参果实的发酵物的处理浓度而减少，尤其是以500mg/kg 的给药量给药蒸曝人参果实的发酵物的给药组的胶质纤维酸性蛋白的表达恢复 到正常水平。
实验例10.蒸曝人参果实的发酵物的脑保护基因表达调节确认
通过实时荧光定量聚合酶链式反应的方法来确认蒸曝人参果实的发酵物对 作为与脑损伤抑制相关的基因的胆碱乙酰转移酶(ChAT，choline acetyltransferase)、囊泡乙酰胆碱转运体(VAChT，vasicular acetylcholine transporter)以及脑源性神经营养因子(BDNF，brain-derived neurotrophic factor) 基因的表达变化。
首先，使用包含胎牛血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium， Hyclone公司，美国)，以37℃、5％CO2的条件培养作为小鼠神经细胞株的 Neuro-2a(N2a)细胞株以备使用。其中，当培养的细胞增殖至培养皿的约90％ 时使用，以不超过20passage的方式进行调节。将上述准备的细胞以每孔1.5×106个的数量分株在6孔板，培养过夜。第二天，使用蒸曝人参果实的发酵物处理 培养的细胞，使其浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml，对其再进行 24小时的培养。其中，将无处理对照组用作对照组。
向培养的细胞加入1ml的trizol(Life Technologies公司，美国)试剂来溶 解细胞，在室温下放置。5分钟后，向其中加入200μl的三氯甲烷，在13500rpm 的条件下离心分离15分钟后去上层液。向500μl的上层液加入等量的异丙醇， 在13500rpm的条件下离心分离10分钟来沉降核糖核酸(RNA)。使用0.75ml 的由焦碳酸二乙酯(DEPC，diethylpyrocarbonate，Sigma-Aldrich公司，美国) 稀释为75％的乙醇洗涤沉降的核糖核酸，通过在空气中干燥来获取核糖核酸。 以1μg的核糖核酸为模板，使用Improm-II逆转录系统(Improm-II reverse transcription system，Promega公司，美国)及Oligo dT引物进行逆转录反应。 以获取的互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板，使用下述表6中记载的引物及Rotor-Gene 6000(Qiagen公司，美国)进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)， 以定量的方式确认胆碱乙酰转移酶、囊泡乙酰胆碱转运体以及脑源性神经营养 因子基因的表达。确认的基因的表达量以β-肌动蛋白(β-actin)基因的表达量标 准化(normalization)的相对数值在图13中示出。
表6
Figure BDA0002812879400000191
Figure BDA0002812879400000201
如图13所示，胆碱乙酰转移酶、囊泡乙酰胆碱转运体以及脑源性神经营养 因子基因的表达依赖蒸曝人参果实的发酵物的浓度而增加。
<110> 人类科学有限公司
<120> 药学组合物和保健食品
<130> OP-2020-0054
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一氧化氮合成酶_正向
<400> 1
tgcccctgga agtttctctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一氧化氮合成酶_逆向
<400> 2
actgccccag tttttgatcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胆碱乙酰转移酶_正向
<400> 3
cctgccagtc aactctagcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胆碱乙酰转移酶_逆向
<400> 4
ggaagccggt atgatgagaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 囊泡乙酰胆碱转运体_正向
<400> 5
ttgatcgcat gagctacgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 囊泡乙酰胆碱转运体-逆向
<400> 6
ccactaggct tccaaagctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脑源性神经营养因子_正向
<400> 7
atgctcagca gtcaagtgcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脑源性神经营养因子_逆向
<400> 8
ttttatctgc cgctgtgacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白_正向
<400> 9
tacagcttca ccaccacagc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白_逆向
<400> 10
aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims (9)

1.一种药学组合物，其用于预防或治疗神经退行性疾病，其特征在于，包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，上述蒸曝人参果实的发酵物发酵蒸曝人参果实提取物而成。
3.根据权利要求2所述的药学组合物，其特征在于，上述发酵通过以保藏编号KCTC14392BP保藏的植物乳杆菌菌株进行。
4.根据权利要求2所述的药学组合物，其特征在于，上述蒸曝人参果实提取物通过水、C1至C2的低级醇类或它们的混合物提取。
5.根据权利要求4所述的药学组合物，其特征在于，上述C1至C2的低级醇类为乙醇、甲醇或酒精。
6.根据权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，上述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、轻度认知障碍、大脑淀粉样血管病变、唐氏综合征、淀粉样脑卒中、全身性淀粉样变性病、老年性痴呆、肌萎缩侧索硬化、脊髓小脑性共济失调、妥瑞氏症、弗里德里希共济失调、莱维小体病、进行性核上麻痹或额颞痴呆。
7.一种保健食品，其用于预防或改善神经退行性疾病，其特征在于，包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分。
8.一种保健食品，其用于改善认知功能，其特征在于，包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分。
9.一种保健食品，其用于保护脑，其特征在于，包含蒸曝人参果实的发酵物作为有效成分。
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