KR20220166246A - 고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 물질을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 - Google Patents
고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 물질을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 만병초, 당삼, 또는 고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 물질을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀은 미토콘드리아의 기능을 개선하고 근원세포의 분화 및 근관세포의 형성을 촉진시킴으로써, 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 효과를 가지고 있어, 의약품, 식품 등의 소재로 활용가능하다.
본 발명의 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀은 미토콘드리아의 기능을 개선하고 근원세포의 분화 및 근관세포의 형성을 촉진시킴으로써, 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 효과를 가지고 있어, 의약품, 식품 등의 소재로 활용가능하다.
Description
본 발명은 만병초, 당삼, 또는 고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 물질을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
근육(muscle)은 인체를 구성하는 중요한 요소로, 중배엽의 줄기세포에서 발현되는 조직이다. 근육은 우리 몸의 40% 정도를 담당하며, 뼈와 힘줄에 지지해서 위치하고 근섬유 다발들로 이루어져 서로 움직이고 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육은 골격근육, 심장근육, 내장근육으로 구분되는데, 각각의 위치에서 힘을 만들어내고 움직임을 유발하며, 뼈, 관절, 내장 등의 신체기관을 보호하는 역할도 한다. 또한, 근육은 재생 능력을 가지고 있어, 근육이 손상을 받게 되면 위성세포와 그 주변 환경에 의해서 변성된 후 다시 원래의 수축 이완 능력을 가진 근육으로 재생될 수 있다.
근육질환은 선천적인 유전이나 환경적인 원인에 의해서 발생되며, 최근 고령화 사회 및 수명 연장의 흐름에 따라 근 감소와 관련된 질환이 증가하고 있다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소됨으로써, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다. 이러한 근육질환은 과거에 비해 전 세계적으로 증가 추세에 있다.
하지만, 근육질환은 그 원인이 다른 질환에 비해 다양하기 때문에 정확한 진단이 쉽지 않고, 그 종류에 따라 증상 및 질환의 강도도 다양하며, 희귀 질환의 형태로 정확한 메커니즘이 밝혀지지 못한 경우가 많다. 또, 근육질환은 그 증상이 급격하게 진행되고, 근육질환 환자들은 상기 질환이 진행됨에 따라 혼자서는 일상적인 생활이 어려울 정도로 고통 받고 있으나, 근본적인 관련 질환에 대한 치료제나 이를 예방할 수 있는 유효한 물질들은 거의 없는 실정이다.
한편, "만병초(Rhododendron brachycarpum)"는 진달래과에 속하는 식물로, 예로부터 천식, 기침, 가래 등 기관지 질환에 효능이 좋다고 알려져 있다. "당삼(Codonopsis pilosulate radix)"은 도라지과 식물로 예로부터 뿌리를 주로 사용하였으며 백혈구 증가, 폐암에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. "고삼(Sophora flavescens)"은 콩과에 속하는 식물로 예로부터 주로 뿌리부위를 사용하였으며 혈당을 낮추거나 항종양, 항균, 면역기능 억제 작용 등이 알려져 있다.
그러나, 만병초, 당삼, 고삼, 또는 이로부터 분리된 이카리사이드 비2, 크레오사이드 Ⅳ 또는 쿠라리디놀에 대하여 근육 관련 질환의 예방 또는 치료 효과, 근기능 개선에 대해서는 기존에 전혀 알려진 바가 없었다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 천연 소재 유래의 물질로부터 근육관련 질환의 예방 또는 치료나 근기능 개선에 효과가 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 만병초, 당삼, 고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 유효물질인 이카리사이드 비2, 크레오사이드 Ⅳ 또는 쿠라리디놀이 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초로부터 만병초 추출물을 수득하는 단계; 당삼으로부터 당삼 추출물을 수득하는 단계; 또는 고삼으로부터 고삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 만병초 추출물로부터 이카리사이드 비2를 분리하는 단계; 당삼 추출물로부터 크레오사이드 IV를 분리하는 단계; 또는 고삼 추출물로부터 쿠라리디놀을 분리하는 단계를 포함하는, 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 목적하는 물질, 예컨대 상기 만병초, 당삼 또는 고삼을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 만병초, 당삼, 고삼의 부위에 제한 없이, 예를 들어, 잎, 뿌리, 줄기 등으로부터 얻어지는 추출물일 수 있으며, 일 구현예로, 만병초의 잎, 당삼 뿌리 또는 고삼 뿌리 추출물일 수 있다.
상기 추출물은 물 또는 다양한 유기용매 등으로 추출하여 수득할 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 또는 이들의 혼합 용매로 추출할 수 있다. 또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 이의 건조물 또는 가공물 등을 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침 추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열 추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파 추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.
상기 추출용매는 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 10배 첨가하는 것이다. 추출온도는 10~45℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~5일인 것이 바람직하며, 3일이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 용어 "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 분획물은 상기 만병초, 당삼 또는 고삼 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득한 분획물로 해석될 수 있다. 상기 분획방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법 또는 크로마토그래피 분획법 등일 수 있다. 또한, 상기 용매 분획법에 사용되는 용매는 극성 용매 또는 비극성 용매를 특별한 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 '이카리사이드 비2'는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
상기 이카리사이드 비2는 C19H30O8의 화학식을 갖는 유기 화합물이다.
본 발명에 따른 이카리사이드 비2는 만병초의 잎, 줄기, 뿌리 등을 포함한 부위에서 분리될 수 있고, 일 구현예로, 만병초 잎 추출물로부터 분리된 것일 수 있다. 그외에도, 본 발명에 따른 이카리사이드 비2의 물질이 동일하다면, 동 기술분야에 알려진 화학적 합성, 또는 그외 다른 출처로부터의 수득, 제조과정에 제한없이, 본 발명의 범주에 포함된다. 또한 상기 이카리사이드 비2는 만병초 추출물을 단독 또는 혼합 용매로 추출하여 수득된 것일 수 있고, 당해 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 만병초 추출물은 이카리사이드 비2를 포함한 추출물일 수 있다.
본 발명에서 '크레오사이드 IV'는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
상기 크레오사이드 IV는 C17H32O10의 화학식을 갖는 유기 화합물이다.
본 발명에 따른 크레오사이드 Ⅳ는 당삼의 부위에 제한 없이 추출물을 수득한 후 그로부터 분리될 수 있고, 일 예로, 당삼 뿌리 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.
그외에도, 본 발명에 따른 크레오사이드 Ⅳ의 물질이 동일하다면, 동 기술분야에 알려진 화학적 합성, 또는 그외 다른 출처로부터의 수득, 제조과정의 제한없이, 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 상기 크레오사이드 Ⅳ는 당삼 뿌리 추출물의 단독 또는 혼합 용매로 추출하여 수득된 것일 수 있고, 당해 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 당삼 추출물은 크레오사이드 Ⅳ를 포함한 추출물일 수 있다.
본 발명에서 '쿠라리디놀'은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
본 발명에서, 쿠라리디놀은 C26H32O7의 화학식을 갖는 유기 화합물이다.
본 발명에 따른 쿠라리디놀은 고삼의 부위에 제한 없이 추출물을 수득한 후 그로부터 분리될 수 있으나, 일 구현예로, 쿠라리디놀은 고삼 뿌리 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.
그외에도, 본 발명에 따른 쿠라리디놀의 물질이 동일하다면, 동 기술분야에 알려진 화학적 합성, 또는 그외 다른 출처로부터의 수득, 제조과정의 제한없이, 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 상기 쿠라리디놀은 고삼 뿌리 추출물의 단독 또는 혼합 용매로 추출하여 수득된 것일 수 있고, 당해 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 고삼 추출물은 쿠라리디놀을 포함한 추출물일 수 있다.
본 발명에서 '근'은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭한다. '근력'은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘할 수 있는 능력을 의미하며, 상기 근력은 근육량에 비례한다. '근력개선'은 근원세포를 근육세포로 분화시켜 근육량을 증가시키고, 신체 수행능력의 개선, 최대 지구력의 개선, 근육 회복의 강화, 근육 피로의 감소, 에너지 수지를 개선시키는 것을 의미한다. 또한 이러한 근력은 신체의 '운동성' 또는 '운동수행능력'과 관련이 있다. '운동수행능력'이란 일상생활이나 스포츠에서 수행되는 신체동작을 빠르게, 강하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 능력을 말하며, '운동수행능력 개선'이란 근력, 근지구력과 같은 근 기능 개선 효과를 의미한다. 또한, '근력 약화'는 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 '근육 질환'은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육질환으로 당업계에 보고된 질병 또는 상태를 말한다. 상기 근육 소모 또는 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 이와 관련된 질환의 예로는 근손실, 근감소, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia), 심위축증(cardiotrophy) 및 근육감소증(sarcopenia) 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 근육량 증대 효과가 있으며, 근육은 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명의 조성물은 일 예로, 근원세포의 분화 촉진을 통해, 근감소증, 근위축증 등 상기 언급된 질환 또는 상태의 예방, 개선, 치료 효능을 가지고 있다.
이러한 본 발명의 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 약학적 조성물, 식품(식품 첨가제 포함) 조성물, 의약외품 조성물, 사료(사료 첨가제) 조성물, 화장료 조성물 등의 외용형태의 다양한 조성물의 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다.
또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 임의의 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS (phosphate buffered saline)), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물과 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크(Talc) 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS 또는 주사용 멸균수, 10 % 에탄올, 40 % 프로필렌 글리콜 및 5 % 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 여기에서 '경피 투여'는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975 Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병행하여 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 일 구체예로 내복용 제제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives), 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(버터, 치즈 등), 식용식물 유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 유효성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 영양보조제로는 캡슐, 정제, 환 등에 상기 유효성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 건강음료로 음용할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 만병초, 고삼 또는 당삼을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 근력개선에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 만병초 추출물, 당삼 추출물, 고삼 추출물, 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV, 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 사료 조성물은, 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있고, 알려진 사료성분을 함께 포함할 수 있다. 또한, 사용되는 사료에 첨가제 형태로 가미되는, 사료첨가제로서도 사용될 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 만병초로부터 만병초 추출물을 수득하는 단계; 당삼으로부터 당삼 추출물을 수득하는 단계; 또는 고삼으로부터 고삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 만병초 추출물은 이카리사이드 비2를 유효성분으로 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 당삼 추출물은 크레오사이드 IV를 유효성분으로 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 고삼 추출물은 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 만병초 추출물로부터 이카리사이드 비2를 분리하는 단계; 당삼 추출물로부터 크레오사이드 IV를 분리하는 단계; 또는 고삼 추출물로부터 쿠라리디놀을 분리하는 단계를 포함하는, 근육 질환 예방 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 만병초, 당삼, 또는 고삼 추출물 또는 이로부터 분리된 물질은 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 효과를 가지고 있어, 의약품, 식품 등의 소재로 활용가능하다.
도 1은 이카리사이드 비2(icariside B2)의 구조(도 1A) 및 분리 모식도(도 1B)를 나타낸 것이다.
도 2는 크레오사이드 Ⅳ(creoside Ⅳ)의 구조(도 2A) 및 분리 모식도(도 2B)를 나타낸 것이다.
도 3은 쿠라리디놀(kuraridinol)의 구조(도 3A) 및 분리 모식도(도 3B)를 나타낸 것이다.
도 4는 이카리사이드 비2 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 4A: 1H NMR, 도 4B: 13C NMR).
도 5는 크레오사이드 Ⅳ 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 5A: 1H NMR, 도 5B: 13C NMR).
도 6은 쿠라리디놀 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 6A: 1H NMR, 도 6B: 13C NMR).
도 7은 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 이카리사이드 비2 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 7A) 및 정량 분석 결과(도 7B)를 나타낸 것이다.
도 8은 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 8A) 및 정량 분석 결과(도 8B)이다.
도 9는 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 쿠라리디놀 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 9A) 및 정량 분석 결과(도 9B)이다.
도 10은 이카리사이드 비2 처리에 따른 MyoD(도 10A), myogenin(도 10B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 MyoD(도 11A), myogenin(도 11B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 12는 쿠라리디놀 처리에 따른 MyoD(도 12A), myogenin(도 12B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 13은 이카리사이드 비2 처리에 따른 Myh1(도 13A), Myh2(도 13B), Myh4(도 13C), Myh7(도 13D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 Myh1(도 14A), Myh2(도 14B), Myh4(도 14C), Myh7(도 14D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 15는 쿠라리디놀 처리에 따른 Myh1(도 15A), Myh2(도 15B), Myh4(도 15C), Myh7(도 15D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 16은 이카리사이드 비2 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 16A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 비율(도 16B)을 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 17A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포(도 17B)를 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과이다.
도 18은 쿠라리디놀 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 18A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포 및 비율(도 18B)을 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과이다.
도 19는 이카리사이드 비2 처리에 따른 COX2(도 19A), ATPase6(도 19B) 및 SIRT3(도 19C)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 SDHA(도 20A), DRP1(도 20B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 2는 크레오사이드 Ⅳ(creoside Ⅳ)의 구조(도 2A) 및 분리 모식도(도 2B)를 나타낸 것이다.
도 3은 쿠라리디놀(kuraridinol)의 구조(도 3A) 및 분리 모식도(도 3B)를 나타낸 것이다.
도 4는 이카리사이드 비2 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 4A: 1H NMR, 도 4B: 13C NMR).
도 5는 크레오사이드 Ⅳ 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 5A: 1H NMR, 도 5B: 13C NMR).
도 6은 쿠라리디놀 구조 확인을 위한 핵자기공명(NMR)측정 결과를 나타낸 것이다(도 6A: 1H NMR, 도 6B: 13C NMR).
도 7은 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 이카리사이드 비2 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 7A) 및 정량 분석 결과(도 7B)를 나타낸 것이다.
도 8은 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 8A) 및 정량 분석 결과(도 8B)이다.
도 9는 항암제로 유도된 근위축 제브라피쉬모델에서 쿠라리디놀 처리에 따른 근위축에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 영향을 확인한 EGFP 형광발현 이미지(도 9A) 및 정량 분석 결과(도 9B)이다.
도 10은 이카리사이드 비2 처리에 따른 MyoD(도 10A), myogenin(도 10B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 MyoD(도 11A), myogenin(도 11B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 12는 쿠라리디놀 처리에 따른 MyoD(도 12A), myogenin(도 12B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 13은 이카리사이드 비2 처리에 따른 Myh1(도 13A), Myh2(도 13B), Myh4(도 13C), Myh7(도 13D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 Myh1(도 14A), Myh2(도 14B), Myh4(도 14C), Myh7(도 14D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 15는 쿠라리디놀 처리에 따른 Myh1(도 15A), Myh2(도 15B), Myh4(도 15C), Myh7(도 15D)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
도 16은 이카리사이드 비2 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 16A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 비율(도 16B)을 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 17A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포(도 17B)를 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과이다.
도 18은 쿠라리디놀 처리에 따른 MHC-양성 근관세포 이미지(도 18A)와 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포 및 비율(도 18B)을 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 확인한 결과이다.
도 19는 이카리사이드 비2 처리에 따른 COX2(도 19A), ATPase6(도 19B) 및 SIRT3(도 19C)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 크레오사이드 Ⅳ 처리에 따른 SDHA(도 20A), DRP1(도 20B)의 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 만병초 추출물 및 이카리사이드 비2(Icariside B2) 준비
만병초 25 kg을 95% 메탄올로 1주일 동안 2회에 걸쳐 실온 25℃에서 침지 추출하였다. 농축된 메탄올 추출물에 증류수 3 L를 넣어 현탁하였다. 분액 깔대기를 이용하여 동량의 노르말헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform) 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 노르말부탄올(n-butanol)을 이용하여 용매분획을 수행하였다. 노르말부탄올 분획물 320 g에 대하여 컬럼 크로마토 그래피를 수행하였다. 노르말부탄올 분획물 320 g을 실리카 겔 70-230 메쉬(mesh)에 흡착시켜 고체화 한 후에 이를 컬럼에 로딩하고, 전개용매는 클로로포름 및 메탄올을 사용하여 극성을 증가시키는 비율로 진행하여 총 6개의 소분획들을 얻었다(이하 'B1 ~ B6'이라 명명함).
수득한 B2 22 g에 대하여 RP-C18 충진제를 MPLC로 수행하였고, 전개용매는 아세톤 및 메탄올 및 물을 이용하여 29개의 소분획들을 얻었다(이하 'B2-1 ~ B2-29'이라 명명함). 소분획 중 B2-27 2 g에 대하여 실리카 겔 230-400 메쉬(mesh) 충진제를 MPLC로 수행하였고, B2-27-3 300 mg에서 흰색의 결정형태 물질을 얻었으며, 그 결과, 상기 이카리사이드 비2를 수득하였다(도 1 및 도 4).
흰색 비정질 분말; 전자 이온화 질량 분석기 (EI-MS) m/z 386.19 [M]+; 분자식 C19H30O8; 1H-NMR (500 MHz, pyridine-d 5) δ 7.18 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-7), 6.52 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-8), 4.96 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'), 4.41 (1H, dd, J = 11.2, 4.2 Hz, H-3), 4.54-3.95 (6H, m, H-2'-H-6'), 2.60 (1H, dd, J = 14.6, 4.8 Hz, H-4a), 2.28 (3H, s, H-10), 1.97 (2H, d, J = 14.6 Hz, H-2a, H-4b), 1.53 (1H, dd, J = 12.3, 10.7 Hz, H-2b), 1.12 (6H, s, H-12, H-13), 0.96 (3H, s, H-11); 13C-NMR (250 MHz, pyridine-d 5) δ 197.4 (C-9), 143.3 (C-7), 133.6 (C-8), 103.4 (C-1'), 79.0 (C-5'), 78.8 (C-3'), 75.6 (C-2'), 71.9 (C-4'), 71.7 (C-3), 70.1 (C-6), 67.4 (C-5), 63.0 (C-6'), 45.0 (C-2), 38.3 (C-4), 35.4 (C-1), 29.3 (C-11), 28.0 (C-10), 25.6 (C-12), 20.2 (C-13).
실시예 2: 당삼 추출물 및 크레오사이드 Ⅳ(Creoside Ⅳ) 준비
당삼 뿌리 7 kg을 80% 메탄올로 환류냉각하여 3시간동안 3회에 걸쳐 추출하였다. 감압회전 진공농축기를 이용하여 농축된 메탄올 추출물에 MCI 겔을 물에 현탁하여 메탄올을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 용매분획을 수행하였다. 메탄올 분획물 100 g을 실리카 겔 230-400 메쉬(mesh)에 흡착시켜 고체화 한 후에 이를 컬럼에 로딩하고, 전개용매는 메틸클로라이드 : 메탄올 = 30 : 1 내지 0 : 100을 사용하여 극성을 증가시키는 비율로 진행하여 총 5개의 소분획들을 얻었다(이하 'M1 ~ M5'이라 명명함).
수득한 M3 15 g에 대하여 RP-C18 충진제로 컬럼 크로마토그래피를 수행하였고, 전개용매는 메탄올 : 물 = 40 : 60 내지 0 : 100을 이용하여 10개의 소분획들을 얻었다(이하 'M3-1 ~ M3-10'이라 명명함). 이 소분획 중 M3-5 100 mg에 메탄올로 재결정화하여 흰색의 결정형태 물질을 얻었으며, 그 결과, 상기 크레오사이드 Ⅳ를 수득하였다(도 2 및 도 5).
흰색 비정질 분말; 전자 이온화 질량 분석기 (EI-MS) m/z 396 [M]+; 분자식 C17H32O10; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 0.87 (3H, t, J = 6.9, H-6), 1.28 (6H, m, H-3 ~ H-5), 1.57 (2H, m, H-2), 3.15~3.86 (m), 4.07 (1H, dd, J = 11.4, 1.7), 4.23 (1H, d, J = 7.8), 4.29 (1H, d, J = 6.5); 13C-NMR (250 MHz, CD3OD) δ 105.1 (C-1"), 104.3 (C-1´), 77.8 (C-3´), 76.7 (C-5´), 74.9 (C-2´), 74.1 (C-3"), 72.3 (C-2"), 71.5 (C-4´), 70.9 (C-1), 69.4 (C-6´ and C-4"), 66.7 (C-5"), 32.8 (C-4), 30.7 (C-2), 26.7 (C-3), 23.6 (C-5), 14.4 (C-6).
실시예 3: 고삼 추출물 및 쿠라리디놀(Kuraridinol) 준비
고삼 뿌리 10 kg을 99.9% 메탄올로 환류냉각하여 3시간동안 3회에 걸쳐 추출하였다. 감압회전 진공농축기를 이용하여 농축된 메탄올 추출물에 증류수 3 L를 넣어 현탁하였다. 분액 깔대기를 이용하여 동량의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 노르말부탄올(n-butanol)을 이용하여 용매분획을 수행하였다. 에틸아세테이트 분획물 250 g에 대하여 컬럼 크로마토 그래피를 수행하였다. 노르말부탄올 분획물 320 g을 실리카 겔 70-230 메쉬(mesh)에 흡착시켜 고체화 한 후에 이를 컬럼에 로딩하고, 전개용매는 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 = 20 : 1 내지 0 : 100 을 사용하여 극성을 증가시키는 비율로 진행하여 총 35개의 소분획들을 얻었다 (이하 'E1 ~ E35'이라 명명함).
수득한 E15 32 g에 대하여 실리카 겔 230-400 메쉬(mesh) 충진제를 사용하였고, 전개용매는 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 = 20 : 1 내지 1 : 1 을 이용하여 6개의 소분획들을 얻었다(이하 'E15-1 ~ E15-6'이라 명명함). 소분획 중 E15-3 2.77 g에 대하여 실리카 겔 230-400 메쉬(mesh) 충진제를 사용하였고, 전개용매는 헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 1 내지 0 : 100 을 이용하여 E15-3-3 1.08 g에서 노란색의 결정형태 물질을 얻었으며, 그 결과, 상기 쿠라리디놀을 수득하였다(도 3 및 도 6).
노란색 비정질 분말; 전자 이온화 질량 분석기 (EI-MS) m/z 456 [M]+; 분자식 C26H32O7; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 14.86 (1H, s, OH-9), 10.17 (1H. s, OH-7), 7.94 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-2), 7.86 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-3), 7.43 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-6'), 6.38 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-3'), 6.32 (1H, dd, J = 2.2, 8.6 Hz, H-5'), 6.04 (1H, s, H-6), 4.57 (1H, br s, H-9"a), 4.47 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-9"b), 3.83 (3H, s, OCH3), 2.55 (2H, m, H-1"), 2.35 (1H, m ,H-2"), 1.64 (3H, s ,H-10"), 1.35 (2H, m, H-3"), 1.19 (2H, m, H-4"), 1.02 (3H, s, H-6"), 1.01 (3H, s, H-7"); 13C-NMR (250 MHz, DMSO- d 6 ) δ 191.96 (C-4), 165.28 (C-9), 162.75 (C-7), 161.14 (C-4'), 160.27 (C-5), 159.02 (C-2'), 148.00 (C-8"), 138.63 (C-2), 130.31 (C-6'), 122.79 (C-3), 113.74 (C-1'), 110.92 (C-9"), 108.05 (C-5'), 106.73 (C-8), 104.41 (C-10), 102.58 (C-3'), 90.66 (C-6), 68.64 (C-5"), 55.49 (OCH3), 46.41 (C-2"), 41.57 (C-4"), 29.55 (C-6"), 29.00 (C-7"), 27.10 (C-1"), 26.65 (C-3"), 17.85 (C-10").
실험예 1: 이카리사이드 비2의 항암제 유도 근위축 제브라피쉬 모델에서 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화 효과 확인
본 연구실에서 제작된 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬들은 숙명여자대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(live Brine shrimp (artemia)와 Tetramin, 16106, Germany)를 급여를 통해 사육되었으며, 실험에 사용된 배아는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬의 교배를 통해 얻어졌다.
근위축 제브라피쉬모델을 통해 이카리사이드 비2의 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화효과를 확인하기 위해, 수정 후 1일 경과한 배아에 항암제(FOLFIRI; 5-Fluorouracil, Leucovorin, Irinotecan)를 처리하여 근위축 제브라피쉬모델을 만들고, 실시예 1에서 만병초 추출물로부터 분리된 이카리사이드 비2를 1, 10, 100 ng/ml를 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP (MLS-EGFP)의 실시간 형태관찰을 통해 미토콘드리아의 생리적 활성을 보여주는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬 배아를 이용하여 근육세포에서의 미토콘드리아 이미지를 공초점현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.
그 결과, FOLFIRI 처리된 제브라피쉬 배아의 근육세포에서 미토콘드리아의 손상에 의해 대조군보다 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP의 밝기가 유의하게 감소함을 확인하였고, 이카리사이드 비2를 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리함에 따라 그 발현량이 점차 증가하여 특히 FOLFIRI에 의한 미토콘드리아의 손상 정도가 100 ng/ml의 농도에서 유의하게 완화됨을 확인하였다(도 7). 따라서 위의 결과들을 통해 이카리사이드 비2가 항암제(FOLFIRI) 처리에 의한 근육세포의 미토콘드리아 손상을 회복시켜 근위축 발생을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2: 크레오사이드 IV의 항암제 유도 근위축 제브라피쉬 모델에서 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화 효과 확인
본 연구실에서 제작된 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬들은 숙명여자대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(live Brine shrimp (artemia)와 Tetramin, 16106, Germany)를 급여를 통해 사육되었으며, 실험에 사용된 배아는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬의 교배를 통해 얻어졌다.
근위축 제브라피쉬모델을 통해 크레오사이드 Ⅳ의 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화효과를 확인하기 위해, 수정 후 1일 경과한 배아에 항암제(FOLFIRI; 5-Fluorouracil, Leucovorin, Irinotecan)를 처리하여 근위축 제브라피쉬모델을 만들고, 실시예 2에서 당삼 뿌리 추출물로부터 분리된 크레오사이드 Ⅳ를 1, 10, 100 ng/ml를 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP (MLS-EGFP)의 실시간 형태관찰을 통해 미토콘드리아의 생리적 활성을 보여주는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬 배아를 이용하여 근육세포에서의 미토콘드리아 이미지를 공초점현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.
그 결과, FOLFIRI 처리된 제브라피쉬 배아의 근육세포에서 미토콘드리아의 손상에 의해 대조군보다 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP의 밝기가 유의하게 감소함을 확인하였고, 크레오사이드 Ⅳ를 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리함에 따라 그 발현량이 점차 증가하여 FOLFIRI에 의한 미토콘드리아의 손상 정도가 특히 10, 100 ng/ml의 농도에서 유의하게 완화됨을 확인하였다(도 8). 따라서 위 결과들을 통해 크레오사이드 Ⅳ이 항암제(FOLFIRI) 처리에 의한 근육세포의 미토콘드리아 손상을 회복시켜 근위축 발생을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 쿠라리디놀의 항암제 유도 근위축 제브라피쉬 모델에서 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화 효과 확인
본 연구실에서 제작된 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬들은 숙명여자대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(live Brine shrimp (artemia)와 Tetramin, 16106, Germany)를 급여를 통해 사육되었으며, 실험에 사용된 배아는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬의 교배를 통해 얻어졌다.
근위축 제브라피쉬모델을 통해 쿠라리디놀의 근위축에 의한 미토콘드리아 손상 완화효과를 확인하기 위해, 수정 후 1일 경과한 배아에 항암제(FOLFIRI; 5-Fluorouracil, Leucovorin, Irinotecan)를 처리하여 근위축 제브라피쉬모델을 만들고, 실시예 3에서 고삼 뿌리 추출물로부터 분리된 쿠라리디놀을 0.01, 0.1, 1 ng/ml를 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP (MLS-EGFP)의 실시간 형태관찰을 통해 미토콘드리아의 생리적 활성을 보여주는 Tg (Xla.Eef1a1:mlsEGFP) 제브라피쉬 배아를 이용하여 근육세포에서의 미토콘드리아 이미지를 공초점현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.
그 결과, FOLFIRI 처리된 제브라피쉬 배아의 근육세포에서 미토콘드리아의 손상에 의해 대조군보다 미토콘드리아에서 발현되는 EGFP의 밝기가 감소함을 확인하였고, 쿠라리디놀을 0.01, 0.1. 1 ng/ml의 농도로 처리함에 따라 그 발현량이 점차 증가하여 FOLFIRI에 의한 미토콘드리아의 손상정도가 모든 농도에서 유의하게 완화됨을 확인하였다(도 9). 따라서 위 결과들을 통해 쿠라리디놀이 항암제(FOLFIRI) 처리에 의한 근육세포의 미토콘드리아 손상을 회복시켜 근위축 발생을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4: 이카리사이드 비2의 근원세포 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과 확인
상기 실험예 1 결과를 기반으로 이카리사이드 비2가 근원세포 분화(myoblast differentiation) 및 근관세포(myotube) 형성에 미치는 영향을 확인하고자 C2C12 근원세포(myoblast)를 이용하여 다음과 같은 세포실험을 진행하였다. C2C12 근원세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 15% fetal bovine serum (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's Media (GenDEPOT, Barker, TX, USA)로 6-웰 플레이트에 2 x 105 cells/ml 농도로 seeding 하였다. 24시간 배양 후 cell의 confluency가 약 90% 되었을 때, 2% horse serum (HyClone, Logan, UT, USA)을 함유한 분화 배지(differentiation medium, DM)로 교환하여 약 72시간 동안 분화를 유도하였다. 실험군은 DM에 이카리사이드 비2를 0.1, 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 함께 처리하였고, 대조군은 DM에 vehicle인 DMSO를 처리하여 동일한 조건으로 배양하였다.
4-1: 이카리사이드 비2의 근원세포 분화 촉진 효과
이카리사이드 비2가 근원세포 분화에 미치는 효과를 확인하고자, C2C12 근원세포의 근관세포로의 분화 유도 과정과 관련된 지표들인 MyoD, myogenin 및 MHC (myosin heavy chain) isoforms의 mRNA 발현을 RT-qPCR로 측정하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 방법으로 C2C12에 이카리사이드 비2를 처리하고 배양하여 분화를 유도한 후, Trizol 용액을 첨가해 세포를 용해시키고 원심분리하였다. 그 상층액에 클로로포름(chloroform)과 이소프로파놀(isopropanol)을 각각 첨가하고 원심분리를 한 후 상층액을 제거하였다. 남은 용액을 다 제거한 후 RNA 펠렛(pellet)을 nuclease free water를 사용하여 용해시켰다. 추출된 RNA의 농도를 측정하고 순도를 확인한 후 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCR Biosystems Ltd., London, UK)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystem Ltd.)를 이용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열(primer sequence)은 표 1에 나타내었다.
| Gene description | Primers | Sequences (5' →3') | 서열번호 |
| ATPase6 | F | ACACACCAAAAGGACGAACA | 1 |
| R | GAAGGAAGTGGGCAAGTGAG | 2 | |
| COX2 | F | ATGGCCTACCCATTCCAACT | 3 |
| R | CGGGGTTGTTGATTTCGTC | 4 | |
| GAPDH | F | CGTGCCGCCTGGAGAAAC | 5 |
| R | TGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG | 6 | |
| Myh1 | F | GAGGGACAGTTCATCGATAGCAA | 7 |
| R | GGGCCAACTTGTCATCTCTCAT | 8 | |
| Myh2 | F | CCGCAATGCAGAAGAGAAA | 9 |
| R | TTCACGGTCTGCTCCATGT | 10 | |
| Myh4 | F | CAGGACTTGGTGGACAAACTACA | 11 |
| R | TTTAGTGTGAACCTCTCGGCTC | 12 | |
| Myh7 | F | CTCAAGCTGCTCAGCAATCTATTT | 13 |
| R | GGAGCGCAAGTTTGTCATAAGT | 14 | |
| MyoD | F | AAACCCCAATGCGATTTATCAGG | 15 |
| R | TAAGCTTCATCTTTTGGGCGTGA | 16 | |
| Myogenin | F | ACAGCATCACGGTGGAGGATATGT | 17 |
| R | CCCTGCTACAGAAGTGATGGCTTT | 18 | |
| SIRT3 | F | CGTTGTGAAACCCGACATTG | 19 |
| R | TCCCCTAGCTGGACCACATC | 20 |
그 결과, 근원세포 분화 초기단계 지표 MyoD 및 중기단계 지표 myogenin의 발현량이 대조군에 비해 이카리사이드 비2를 0.1, 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리한 모든 군에서 유의적으로 증가하였다(도 10). 근원세포 분화 말기 마커이자 근육의 수축 속도 및 기능과 관련 있는 MHC isoforms의 발현량을 측정한 결과, 모든 MHC isoforms (Myh1, Myh2, Myh4, Myh7)의 유전자 발현량이 이카리사이드 비2를 처리한 군에서 농도 의존적으로 증가하였다. 특히 Myh1, Myh2 유전자 발현은 모든 농도에서 대조군 대비 유의하게 증가하였고, Myh4, Myh7 발현량은 1, 10, 100 ng/ml로 처리한 군에서 유의하게 증가함을 확인하였다(도 13). 이상의 결과는 이카리사이드 비2가 C2C12 근원세포의 분화 촉진 효과를 지님을 보여준다.
4-2: 이카리사이드 비2의 근관세포 형성 촉진 효과
면역형광 염색(immunofluorescence staining)을 통해 이카리사이드 비2에 의한 MHC-양성 근관세포 형성 정도를 확인하고자 하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 조건에서 분화된 세포에 DM을 제거한 후 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100으로 30분간 투과시킨 후 PBS로 세척하였다. 5% horse serum 용액에서 블로킹한 후 항-MHC (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, IA, USA)로 염색하였다. PBS로 세척한 후 Alexa Fluor 568-접합 2차 항체와 DAPI (D9542, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 이미지는 형광현미경(Logos Biosystem, Anyang, South Korea)으로 촬영하였다. 촬영한 이미지 내 무작위로 선택된 부위에서 다핵성 근관세포(multinucleated MHC-expressing myotubes)를 산출하였다(Scale bar = 100 μm). MHC-양성이며, 다핵성(multinucleated)인 근관세포수를 분석한 후, 총 세포 수(total cells)를 적용하여 multinucleated-MHC-양성 근관세포수(MHC-positive myotubes)를 백분율로 나타내었다.
그 결과, 적색 형광으로 발현되는 MHC-양성 근관세포 이미지와 DAPI 염색을 통해 관찰한 다핵성 MHC-양성 근관세포 비율을 도 16A와 도 16B에 각각 나타내었다. 이카리사이드 비2 처리에 의해 대조군 대비 MHC-양성 근관세포 형성이 촉진됨을 확인하였다(도 16A). 또한 이카리사이드 비2 처리에 의해 3개 이상의 핵을 가진 다핵의 MHC-양성 근관세포의 형성이 농도 의존적으로 증가하여 1, 10, 100 ng/ml 처리한 실험군에서 대조군 대비 다핵의 MHC-양성 근관세포의 비율이 유의하게 증가하였다(도 16B). 이상의 결과는 이카리사이드 비2가 C2C12 근원세포의 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과를 지님을 보여준다.
4-3: 이카리사이드 비2의 미토콘드리아 기능 관련 유전자 발현 조절 확인
이카리사이드 비2의 C2C12 근원세포 분화 및 근관세포 형성 촉진 효과가 미토콘드리아의 기능과 관련이 있는지 확인하기 위하여, 근원세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 전자전달계 복합체 및 미토콘드리아 기능 관련 마커의 유전자 발현량을 RT-qPCR로 측정하였다. 사용된 프라이머 서열(primer sequence)은 표 1에 나타내었다. 그 결과, 특히 0.1, 10, 100 ng/ml 처리군에서 미토콘드리아 내막 전자전달계 복합체 IV를 구성하는 COX2의 발현량이 대조군보다 유의적으로 증가하였다(도 19A). 또한 미토콘드리아 ATP 생성을 위한 산화적 인산화 과정의 마지막 과정에 관여하는 전자전달계 복합체 V 마커인 ATPase 6 발현은 이카리사이드 비2를 처리한 모든 군에서 대조군 대비 유의하게 증가하였다(도 19B). 미토콘드리아 에너지 대사의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 SIRT3 역시 이카리사이드 비2를 처리한 모든 군에서 대조군 대비 농도 의존적으로 유의하게 그 발현이 증가하였다(도 19C). 이러한 결과는 이카리사이드 비2의 근원세포 분화 및 근관세포 형성 촉진 효과가 미토콘드리아의 에너지 대사 활성화와 항상성 유지를 통한 미토콘드리아의 기능 개선과 관련이 있음을 보여준다.
실험예 5: 크레오사이드 Ⅳ의 근원세포 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과 확인
상기 실험예 2 결과를 기반으로 크레오사이드 Ⅳ이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 및 근관세포(myotube) 형성에 미치는 영향을 확인하고자 C2C12 근원세포(myoblast)를 이용하여 다음과 같은 세포실험을 진행하였다. C2C12 근원세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 15% fetal bovine serum (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's Media (GenDEPOT, Barker, TX, USA)로 6-웰 플레이트에 2 x 105 cells/ml 농도로 seeding 하였다. 24시간 배양 후 cell의 confluency가 약 90% 되었을 때, 2% horse serum (HyClone, Logan, UT, USA)을 함유한 분화 배지(differentiation medium, DM)로 교환하여 약 72시간 동안 분화를 유도하였다. 실험군은 DM에 크레오사이드 Ⅳ을 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 함께 처리하였고, 대조군은 DM에 vehicle인 DMSO를 처리하여 동일한 조건으로 배양하였다.
5-1: 크레오사이드 IV의 근원세포 분화 촉진 효과
크레오사이드 Ⅳ이 근원세포 분화에 미치는 효과를 확인하고자, C2C12 근원세포의 근관세포로의 분화 유도 과정과 관련된 지표들인 MyoD, myogenin 및 MHC (myosin heavy chain) isoforms의 mRNA 발현을 RT-qPCR로 측정하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 방법으로 C2C12에 크레오사이드 Ⅳ를 처리하고 배양하여 분화를 유도한 후, Trizol 용액을 첨가해 세포를 용해시키고 원심분리하였다. 그 상층액에 클로로포름(chloroform)과 이소프로파놀(isopropanol)을 각각 첨가하고 원심분리를 한 후 상층액을 제거하였다. 남은 용액을 다 제거한 후 RNA 펠렛(pellet)을 nuclease free water를 사용하여 용해시켰다. 추출된 RNA의 농도를 측정하고 순도를 확인한 후 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCR Biosystems Ltd., London, UK)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystem Ltd.)를 이용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열(primer sequence)은 표 2에 나타내었다.
| Gene description | Primers | Sequences (5' →3') | 서열번호 |
| Drp1 | F | TCTGCAGCTAGTCCACGTTTC | 21 |
| R | ACCCCATTCTTCTGCTTCAA | 22 | |
| GAPDH | F | CGTGCCGCCTGGAGAAAC | 23 |
| R | TGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG | 24 | |
| Myh1 | F | GAGGGACAGTTCATCGATAGCAA | 25 |
| R | GGGCCAACTTGTCATCTCTCAT | 26 | |
| Myh2 | F | CCGCAATGCAGAAGAGAAA | 27 |
| R | TTCACGGTCTGCTCCATGT | 28 | |
| Myh4 | F | CAGGACTTGGTGGACAAACTACA | 29 |
| R | TTTAGTGTGAACCTCTCGGCTC | 30 | |
| Myh7 | F | CTCAAGCTGCTCAGCAATCTATTT | 31 |
| R | GGAGCGCAAGTTTGTCATAAGT | 32 | |
| MyoD | F | AAACCCCAATGCGATTTATCAGG | 33 |
| R | TAAGCTTCATCTTTTGGGCGTGA | 34 | |
| Myogenin | F | ACAGCATCACGGTGGAGGATATGT | 35 |
| R | CCCTGCTACAGAAGTGATGGCTTT | 36 | |
| SDHA | F | CAGAAGTCGATGCAGAACCA | 37 |
| R | CGACCCGCACTTTGTAATCT | 38 |
그 결과, 근원세포 분화 초기단계 지표 MyoD 및 중기단계 지표 myogenin의 발현량이 대조군에 비해 크레오사이드 Ⅳ을 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리한 군에서 모두 유의적으로 증가하였다(도 11). 근원세포 분화 말기 마커이자 근육의 수축 속도 및 기능과 관련 있는 MHC isoforms의 발현량을 측정한 결과, Myh1, Myh2, Myh4, Myh7의 유전자 발현량이 대조군 대비 크레오사이드 Ⅳ을 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리한 모든 군에서 유의하게 증가하였다(도 14). 이상의 결과는 크레오사이드 Ⅳ가 C2C12 근원세포의 분화 촉진 효과를 지님을 보여준다.
5-2: 크레오사이드 IV의 근관세포 형성 촉진 효과
면역형광 염색(immunofluorescence staining)을 통해 크레오사이드 Ⅳ에 의한 MHC-양성 근관세포 형성 정도를 확인하고자 하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 조건에서 분화된 세포에 DM을 제거한 후 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100으로 30분간 투과시킨 후 PBS로 세척하였다. 5% horse serum 용액에서 블로킹한 후 항-MHC (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, IA, USA)로 염색하였다. PBS로 세척한 후 Alexa Fluor 568-접합 2차 항체와 DAPI (D9542, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 이미지는 형광현미경(Logos Biosystem, Anyang, South Korea)으로 촬영하였다. 촬영한 이미지 내 무작위로 선택된 부위에서 다핵성 근관세포(multinucleated MHC-expressing myotubes)를 산출하였다(Scale bar = 100 μm). MHC-양성이며, 다핵성(multinucleated)인 근관세포수를 분석한 후, 총 세포 수(total cells)를 적용하여 multinucleated-MHC-양성 근관세포수(MHC-positive myotubes)를 백분율로 나타내었다.
그 결과, 적색 형광으로 발현되는 MHC-양성 근관세포 이미지와 DAPI 염색을 통해 관찰한 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포를 도 17A와 도 17B에 각각 나타내었다. 크레오사이드 Ⅳ 처리에 의해 대조군 대비 MHC-양성 근관세포 형성이 촉진됨을 확인하였다(도 17A). 크레오사이드 Ⅳ를 1, 10, 100 ng/ml 처리한 실험군에서 다핵의 MHC-양성 근관세포의 형성이 증가하여 특히 2~4개의 핵을 가진 MHC-양성 근관세포의 수가 100 ng/ml 농도에서 유의적으로 증가하였고, 5개 이상의 핵을 가진 MHC-양성 근관세포의 수는 대조군 대비 크레오사이드 Ⅳ를 1, 10 ng/ml의 농도로 처리한 군에서 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 17B). 이상의 결과는 크레오사이드 Ⅳ이 C2C12 근원세포의 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과를 가짐을 보여준다.
5-3: 크레오사이드 Ⅳ의 미토콘드리아 기능 관련 유전자 발현 조절 확인
크레오사이드 Ⅳ의 C2C12 근원세포 분화 및 근관세포 형성 촉진 효과가 미토콘드리아의 기능과 관련이 있는지 확인하기 위하여, 근원세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 전자전달계 복합체 Ⅱ를 구성하는 SDHA와 미토콘드리아 분열(mitochondrial fission)을 조절하는 DRP1의 유전자 발현량을 RT-qPCR로 측정하였다. 사용된 프라이머 서열(primer sequence)은 표 2에 나타내었다. 그 결과, 특히 10, 100 ng/ml 처리군에서 SDHA는 대조군보다 그 발현량이 유의적으로 증가하고 반대로 미토콘드리아 분열에 관여하는 DRP1 유전자 발현은 유의하게 감소하였다(도 20). 이러한 결과는 크레오사이드 Ⅳ의 C2C12 근원세포 분화 및 근관세포 형성 촉진 효과가 미토콘드리아의 에너지 대사 활성화 및 미토콘드리아 손상 완화를 통한 미토콘드리아의 기능 개선과 관련이 있음을 보여준다.
실험예 6: 쿠라리디놀의 근원세포 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과 확인
상기 실험예 3 결과를 기반으로 쿠라리디놀이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 및 근관세포(myotube) 형성에 미치는 영향을 확인하고자 C2C12 근원세포(myoblast)를 이용하여 다음과 같은 세포실험을 진행하였다. C2C12 근원세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 15% fetal bovine serum (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's Media (GenDEPOT, Barker, TX, USA)로 6-웰 플레이트에 2 x 105 cells/ml 농도로 seeding 하였다. 24시간 배양 후 cell의 confluency가 약 90% 되었을 때, 2% horse serum (HyClone, Logan, UT, USA)을 함유한 분화 배지(differentiation medium, DM)로 교환하여 약 72시간 동안 분화를 유도하였다. 실험군은 DM에 고삼 뿌리 추출물 및 이에 분리된 쿠라리디놀을 0.01, 0.1, 1 ng/ml의 농도로 함께 처리하였고, 대조군은 DM에 vehicle인 DMSO를 처리하여 동일한 조건으로 배양하였다.
6-1: 쿠라리디놀의 근원세포 분화 촉진 효과
쿠라리디놀이 근원세포 분화에 미치는 효과를 확인하고자, C2C12 근원세포의 근관세포로의 분화 유도 과정과 관련된 지표들인 MyoD, myogenin 및 MHC (myosin heavy chain) isoforms의 mRNA 발현을 RT-qPCR로 측정하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 방법으로 C2C12에 쿠라리디놀을 처리하고 배양하여 분화를 유도한 후, Trizol 용액을 첨가해 세포를 용해시키고 원심분리하였다. 그 상층액에 클로로포름(chloroform)과 이소프로파놀(isopropanol)을 각각 첨가하고 원심분리를 한 후 상층액을 제거하였다. 남은 용액을 다 제거한 후 RNA 펠렛(pellet)을 nuclease free water를 사용하여 용해시켰다. 추출된 RNA의 농도를 측정하고 순도를 확인한 후 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCR Biosystems Ltd., London, UK)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystem Ltd.)를 이용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열(primer sequence)은 표 3에 나타내었다.
| Gene description | Primers | Sequences (5' →3') | 서열번호 |
| GAPDH | F | CGTGCCGCCTGGAGAAAC | 39 |
| R | TGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG | 40 | |
| Myh1 | F | GAGGGACAGTTCATCGATAGCAA | 41 |
| R | GGGCCAACTTGTCATCTCTCAT | 42 | |
| Myh2 | F | CCGCAATGCAGAAGAGAAA | 43 |
| R | TTCACGGTCTGCTCCATGT | 44 | |
| Myh4 | F | CAGGACTTGGTGGACAAACTACA | 45 |
| R | TTTAGTGTGAACCTCTCGGCTC | 46 | |
| Myh7 | F | CTCAAGCTGCTCAGCAATCTATTT | 47 |
| R | GGAGCGCAAGTTTGTCATAAGT | 48 | |
| MyoD | F | AAACCCCAATGCGATTTATCAGG | 49 |
| R | TAAGCTTCATCTTTTGGGCGTGA | 50 | |
| Myogenin | F | ACAGCATCACGGTGGAGGATATGT | 51 |
| R | CCCTGCTACAGAAGTGATGGCTTT | 52 |
그 결과, 근원세포 분화 초기단계 지표 MyoD 및 중기단계 지표 myogenin의 발현량이 대조군에 비해 쿠라리디놀을 0.01, 0.1, 1 ng/ml의 농도로 처리한 군에서 모두 유의적으로 증가하였으며, 특히 1 ng/ml 처리군에서는 다른 농도에서보다 유의적으로 그 발현량이 높았다(도 12).
또한, 근원세포 분화 말기 마커이자 근육의 수축 속도 및 기능과 관련 있는 MHC isoforms의 발현량을 측정한 결과, 대조군과 비교했을 때 Myh1, Myh2, Myh4의 mRNA 발현량 역시 쿠라리디놀 처리군 (0.01, 0.1, 1 ng/ml)에서 모두 유의적으로 증가하였고, slow muscle fiber 관련 유전자인 Myh7 역시 대조군 대비 모든 농도에서 유의적으로 그 발현량이 증가하였다(도 15). 이상의 결과는 쿠라리디놀이 C2C12 근원세포의 분화 촉진 효과를 가짐을 보여준다.
6-2: 쿠라리디놀의 근관세포 형성 촉진 효과
면역형광 염색(immunofluorescence staining)을 통해 쿠라리디놀에 의한 MHC-양성 근관세포 형성 정도를 확인하고자 하였다. 이를 위해 상기 기재된 동일한 조건에서 분화된 세포에 DM을 제거한 후 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100으로 30분간 투과시킨 후 PBS로 세척하였다. 5% horse serum 용액에서 블로킹한 후 항-MHC (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, IA, USA)로 염색하였다. PBS로 세척한 후 Alexa Fluor 568-접합 2차 항체와 DAPI (D9542, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 이미지는 형광현미경(Logos Biosystem, Anyang, South Korea)으로 촬영하였다. 촬영한 이미지 내 무작위로 선택된 부위에서 다핵성 근관세포(multinucleated MHC-expressing myotubes)를 산출하였다(Scale bar = 100 μm). MHC-양성이며, 다핵성(multinucleated)인 근관세포수를 분석한 후, 총 세포 수(total cells)를 적용하여 multinucleated-MHC-양성 근관세포수(MHC-positive myotubes)를 백분율로 나타내었다.
그 결과, 적색 형광으로 발현되는 MHC-양성 근관세포 이미지와 DAPI 염색을 통해 관찰한 다핵성 MHC-양성 근관세포 분포를 도 18A와 도 18B에 각각 나타내었다. 쿠라리디놀 처리에 의해 대조군 대비 MHC-양성 근관세포 형성이 촉진됨을 확인하였다(도 18A). 또한 쿠라리디놀을 0.01, 0.1, 1 ng/ml 처리한 실험군에서 단핵의 MHC-양성 근관세포는 대조군보다 유의하게 감소한 반면, 다핵의 MHC-양성 근관세포의 형성은 증가하였다. 특히 6개 이상의 핵을 가진 MHC-양성 근관세포의 비율은 쿠라리디놀을 처리한 모든 농도에서 대조군 대비 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(도 18B). 이상의 결과는 쿠라리디놀이 C2C12 근원세포의 분화 유도 및 근관세포 형성 촉진 효과를 가짐을 보여준다.
본 명세서에서 설명되는 실험예와 첨부된 도면은 이카리사이드 비2, 크레오사이드 IV 또는 쿠라리디놀의 유효물질의 효과를 나타내며, 상기 유효물질을 분리한 추출물 또한 그 효과를 내는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 약학적 조성물.
- 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 의약외품 조성물.
- 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 또는 근기능 개선용 식품 조성물.
- 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 또는 근기능 개선용 사료 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고삼 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 유기용매, 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것인, 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 고삼 추출물은 냉침, 가열, 초음파 및 환류 추출로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 방법에 의해 추출된 것인, 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 근육질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인하여 유발된 근육 질환인 것인, 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 근육질환은 근손실, 근감소, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia), 심위축증(cardiotrophy) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀은 미토콘드리아 손상 완화, 근원세포 분화 유도 또는 근관세포 형성 촉진 활성을 갖는 것인, 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고삼 추출물 또는 쿠라리디놀은 MyoD, myogenin, Myh1, Myh2, Myh4 및 Myh7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인, 조성물. - 제3항, 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 식품 조성물을 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 또는 근기능 개선용 건강기능식품.
- 고삼으로부터 고삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법.
- 고삼 추출물로부터 쿠라리디놀을 분리하는 단계를 포함하는, 근육질환 예방 또는 치료용 또는 근기능 개선용 조성물 제조방법.
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